KR101836741B1 - 잿빛곰팡이병균 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아 진단용 프로브 및 프라이머에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머 세트를 사용한 식물의 잿빛곰팡이병균 진단 방법은 DNA 농도 1fg까지 검출할 수 있고, 식물 재배기간 중에 식물체를 채취하여 감염 여부를 확인할 수 있어 조기진단을 통한 발병 확산을 억제할 수 있는 효과가 있다.

Description

잿빛곰팡이병균 진단 방법{Diagnosis method for Botrytis cinerea}
본 발명은 잿빛곰팡이병균 진단 방법에 관한 것이다.
오가과(Araliaceae) 식물에 속하는 인삼(Panax ginseng)은 한 장소에서 3~5년 동안 재배되므로 생육기간 동안 여러 가지 병해충이 발생하며, 이로 인해 매년 결주율이 증가하게 되어 고년생 수량 감소에 지대한 영향을 미치게 된다. 2008년 조 등의 보고에 의하면 고년생 결주율이 40~50%나 된다(비특허문헌 1).
고년생 결주의 주원인으로 작용하는 잿빛곰팡이병은 출아기와 6, 7월 지제부(soil surface) 줄기, 잎 및 뇌두 썩음 피해를 일으키는 병해로서 전국 각지의 인삼 포지에서 쉽게 관찰할 수 있다.
국내에서 인삼 잿빛곰팡이병원균은 1976년 처음으로 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea)로 보고되었으며, 이 균은 기주 범위가 넓은 다범성균으로 과일나무, 관상용 식물 및 채소를 포함하는 경제적으로 크게 중요한 다수의 식물 종들을 감염시키는 식물병원성 진균이다(특허문헌 1). 이 진균은, 딸기, 라즈베리, 사과, 배, 밤, 키위 및 포도 등에서 수확 전후에 심각한 문제를 발생시키며, 2차적으로 저장, 수송, 판매중의 과일 및 채소류에 발생하여 큰 피해를 일으킨다.
또한 식물체가 죽거나 노쇠한 부위에서 발병되기 시작하여 일단 발병되면 병원균의 생육 적온이 아니더라도 병이 진전된다.
보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 의한 인삼 뇌두썩음은 대표적인 토양 병해로서 결주율 증가의 주원인이 될 뿐만 아니라 수삼 등급 저하로 인해 농민들에게 경제적으로 큰 손실을 주고 있다. 토양 병해의 경우 병이 상당히 진전된 이후에야 육안으로 확인이 가능하며 화학제 사용이 제한되어 있어서 방제에 상당한 어려움이 있다.
인삼 품질 및 생산량을 높이기 위해서 인삼 잿빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)를 조기 진단하여 미리 예방하는 것이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명자들은 미량의 보트리티스 시네레아도 효율적으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구하였으며, 보트리티스 시네레아에 특이적인 프로브 및 프라이머를 설계하여 보트리티스 시네레아를 진단할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 등록특허 제795421호
Journal of Ginseng of Research, Vol.32, No.1, pp.26-32(2008)
본 발명자들은 종래에 잿빛곰팡이병균을 방제하는 방법에서, 감염이 확산된 후에서야 방제가 가능하다는 문제점을 착안하여, 이병 식물체로부터 미량의 보트리티스 시네레아가 존재하여도 신속하게 검출할 수 있는 방법을 연구하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 프라이머 및 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 식물 또는 식물 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 1의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계;를 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머 세트를 사용한 식물의 잿빛곰팡이병균 진단 방법은 DNA 농도 1fg까지 검출할 수 있고, 인삼 재배 기간 중에 식물체를 채취하여 감염 여부를 확인할 수 있어 조기 진단을 통한 발병 확산을 억제할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아 특이적 프로브 및 프라이머 세트의 민감도를 확인한 결과이다.
도 2는 주형 DNA의 양에 따른 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아 특이적 프로브 및 프라이머 세트의 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아와 인삼 주요 병원균으로부터 분리된 DNA를 주형 DNA로 하여 실시간(real time) PCR한 결과이다.
도 4는 잿빛곰팡이병균에 감염된 식물조직으로부터 DNA를 분리하고 BC-R-TM 프로브 및 BC-R-F/BC-R-R 프라이머 세트로 증폭시킨 결과이다.
도 5a는 본 발명에서 개발된 프로브/프라이머 세트 이외의 다른 프로브/프라이머 세트(세트 1)를 사용하여 실시간 PCR한 결과이다.
도 5b는 본 발명에서 개발된 프로브/프라이머 세트 이외의 다른 프로브/프라이머 세트(세트 2)를 사용하여 실시간 PCR한 결과이다.
먼저, 본 발명에서 사용된 용어를 설명한다.
본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 하기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하도록 설계된다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "PCR"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적"은 다른 병원균에 결합하지 않고 잿빛곰팡이병균에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 4의 프라이머 및 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 식물의 잿빛곰팡이병균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 보트리티스 칼태(Botrytis calthae), 보트리티스 파배(Botrytis fabae), 보트리티스 페라르고니(Botrytis pelargonii), 보트리티스 패오니애(Botrytis paeoniae), 보트리티스 포리(Botrytis porri), 보트리티스 시노알리(Botrytis sinoallii) 및 보트리티스 콘볼루타(Botrytis convoluta)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 상기 식물의 잿빛곰팡이병균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)이다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 프라이머는 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 충분한 상보성을 가질 수 있는 것이면 본 발명에 적용할 수 있으므로, 프라이머는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없다. 또한 본 발명의 프라이머는 보트리티스 시네레아의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 또는 퀀쳐가 프로브의 말단에 부착될 수 있다.
상기 프로브의 5' 말단에는 리포터(Reporter)로서 Cy5가 부착되어 있을 수 있고, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa Fluor), FAM, ROX, HEX, 텍사스 레드(texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐(Quencher)로서 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1)이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 BHQ-2, BH3-3, ROX(carboxy-X-rhodamine), 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐(Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 상기 프로브는 5' 말단이 Cy5로 표지되고, 프로브가 표적 서열에 혼성화되면, 3' 말단에 퀀쳐로서 존재하는 BHQ-1의 작용에 의해 5' 말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, PCR의 연장(extension) 단계에서, Taq 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5' 말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 퀀쳐에 의한 형광 억제로부터 벗어나 형광을 방출한다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것일 수 있고, 상기 프라이머 세트는 PCR에 사용하기 위한 것일 수 있다.
상기 식물은 인삼, 딸기, 라즈베리, 사과, 배, 밤, 키위 및 포도로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 인삼일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 한 실시예에서는, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브와, 재배 중인 인삼에서 잿빛곰팡이병 이병 뿌리와 건전 뿌리에서 분리한 각각의 DNA와, 그 외에 실시간 PCR에 필요한 재료를 혼합하여, 혼합물을 실시간 PCR한 결과, 잿빛곰팡이병 이병 뿌리에서만 반응이 나타나는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균 검출용 조성물을 제공한다. 상기 검출용 조성물은 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징으로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 식물 또는 식물 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 1의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계를 포함하는 식물의 잿빛곰팡이병균을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 혼합물에 서열번호 3의 프로브를 추가로 첨가하여 실시간 PCR로 식물의 잿빛곰팡이병균을 검출할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있으며, 예를 들면 PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction, IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 사용될 수 있다.
상기 PCR을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공될 수 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공될 수 있다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 제조되어 첨가될 수 있다.
상기 방법은 상기 단계 2) 후에 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한 실시예에서, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용하고, 보트리티스 시네레아, 스크레로티니아 니바리스, 실린드로카폰 데스트럭턴스, 라이족토니아 솔라니, 푸사리움 솔라니, 푸사리움 옥시스포룸, 알타나리아 파낙스, 콜렉토트리쿰 파나시콜라에서 각각 분리된 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR로 상기 프라이머 및 프로브의 특이성을 확인하였을 때, 다른 병원균에는 특이성을 나타내지 않고, 보트리티스 시네레아에만 특이성을 나타낸다(도 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서, 보트리티스 시네레아의 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호 2를 사용하여 RNA polymerase Ⅱ 영역을 균주별로 증폭한 후, 염기서열 분석을 수행하였으며, Beacon Designer Program(Premier Biosoft)를 이용하여 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트 외의 다른 프로브 및 프라이머 세트(이하, 세트 1 및 세트 2로 기재함)를 제작하였다. 제작된 세트 1 및 세트 2의 민감도를 확인한 결과, 보트리티스 시네레아 외의 다른 균주에도 시그널을 보여, 본 발명의 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브 세트에 비해서 보트리티스 시네레아에 대해서 민감도가 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 5a 및 도 5b 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
공시균주로부터 DNA 추출
본 발명에 사용한 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea, 보트리티스 시네레아) 및 기타 균주는 (주)한국인삼공사 한국인삼연구원에서 분리, 보관 중인 공시균주를 사용하였다. 공시균주는 potato dextrose agar(Difco)에 각 균주를 접종하여 20℃에서 배양하였다. 배양된 공시균주로부터 genomic DNA 분리는 MACHEREY-NAGEL의 NucleoSpin　 plantⅡ protocol에 준하였으며, 분리된 DNA는 -20℃에 보관하였다. 본 발명에 사용한 보트리티스 시네레아 균주 및 기타 균주를 하기 표 1에 나타낸다.
병원균 균주번호 분리지역
Botrytis cinerea

KGC-BC0407 경기도 수원시
KGC-BC0725 경기도 여주군
KGC-BC0736 충남 예산시
Sclerotinia nivalis

KGC-S0608 강원도 홍천군
KGC-S0707 강원도 철원군
KGC-S1001 강원도 양구군
Cylindrocarpon destructans

KGC-CY9801 경기도 수원시
KGC-CY1405 충남 당진시
KGC-CY1412 전남 장수군
Rhizoctonia solani AG2-1

 KGC-RH9801 경기도 수원시
KGC-RH0203 충남 예산시
KGC-RH0702 경기도 화성시
Fusarium solani KGC-F0503 경기도 수원시
Fusarium oxysporum KGC-F1410 강원도 홍천군
Alternaria panax KGC-AP0507 경기도 수원시
Colletotrichum panacicola KGC-C1040 강원도 원주시
보트리티스 시네레아 특이적 프로브 및 프라이머 설계
실시예 1에서 분리된 각 균주의 genomic DNA를 주형으로 하고 프라이머쌍 fRPB2-7F(서열번호 1) 및 fRPB2-11aR(서열번호 2)을 사용하여 RNA Polymerase Ⅱ 영역을 균주별로 증폭하였다.
fRPB2-7F(서열번호 1) (ATG GG(C/T) AA(A/G) CAA GC(C/T) ATG GG)
fRPB2-11aR(서열번호 2) (GC(A/G) TGG ATC TT(A/G) TC(A/G) TC(C/G) ACC)
각 균주별 염기서열 분석을 수행하였으며, Beacon Designer Program(Premier Biosoft)을 이용하여 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아에 특이적인 TaqMan 프로브 BC-R-TM 및 프라이머 BC-R-F/BC-R-R를 설계하였다. 설계된 프로브 및 프라이머를 하기 표 2에 나타낸다.
프로브 및 프라이머 이름 염기서열(5‘→3’)
BC-R-TM(서열번호 3) 5'-Cy5-CACTATTCCATCATCGTCAAGTTTATCGTATG-BHQ-2-3'
BC-R-F(서열번호 4) 5'-GTTGCTATCATGTGTTATTCTG-3'
BC-R-R(서열번호 5) 5'-GCAGTCTTTCCAATAATGATA-3'
실시예 2에서 제조된 프로브 및 프라이머의 민감도 확인
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트의 보트리티스 시네레아에 대한 민감성 정도를 알아보기 위하여 pBHA 벡터에 상기 실시예 2에서 보트리티스 시네레아에 대하여 증폭된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 영역 염기서열을 삽입하여 플라스미드를 제작하였다. 합성한 플라스미드 DNA의 카피 수를 다음과 같이 계산하였다(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html에 게시된 프로그램을 이용함, Andrew Staroscik, 2004).
카피 수 = (amount×6.022×1023)/(length×1×109×650)
플라스미드 DNA를 1㎕당 10ng에서 1fg까지 (4.07×109~4.07×102 copies/㎕) 8단계로 연속 희석하여 PCR 반응에 사용하였다. 설계된 프로브 및 프라이머 세트의 실시간 PCR 반응 조성물은 real time master mix(Toyobo, Japan) 10㎕, 프로브(7pmol) 1㎕, 프라이머(15pmol) 각각 0.5㎕, DNA 1㎕에 멸균수를 첨가하여 총 20㎕로 수행하였다. 95℃에서 1분 초기 변성 후, 95℃에서 15초 변성, 60℃에서 1분 결합하는 과정을 40회 반복하였다. 실시간 PCR 분석시에는 ABI 7500 Fast Real Time PCR System 장치를 이용하였다. 분석 결과를 표 3에 나타낸다.
Copies/㎕ Ct±SD(n=3)
4.07×109 12.38±0.06
4.07×108 15.68±0.17
4.07×107 18.96±0.02
4.07×106 22.52±0.08
4.07×105 25.25±0.11
4.07×104 28.98±0.09
4.07×103 32.12±0.19
4.07×102 35.99±0.77
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용하였을 때 1fg(4.07×102 copies/㎕) 플라스미드 DNA 농도까지 반응이 나타났으며, 각각의 Ct (Threshold cycle) 값은 표 3과 같다. 표준 곡선은 도 2와 같다(slope: -3.336, Y-inter: 15.643, R2: 1, Efficiency: 99.40%).
이와 같은 결과로부터 실시예 2에서 제작된 프로브 및 프라이머 세트가 보트리티스 시네레아에 특이적이며 극미량의 보트리티스 시네레아도 탐지할 수 있는 것을 알 수 있었다.
인삼 주요 병원균 DNA에 대한 프로브 BC-R-TM 및 프라이머 BC-R-F/BC-R-R의 특이성 확인
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트의 인삼 주요 병원균에 대한 특이성을 스크레로티니아 니바리스, 실린드로카폰 데스트럭턴스, 라이족토니아 솔라니, 푸사리움 솔라니, 푸사리움 옥시스포룸, 알타나리아 파낙스, 콜렉토트리쿰 파나시콜라 균주에 대해서도 확인하였다. 실시예 1에서 분리된 각 균주의 genomic DNA를 이용한 것 이외에는 실시예 3의 실시간 PCR 반응 조건과 동일하게 하여 확인하였다.
그 결과, 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트는 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 시네레아 균주(표 1의 KGC-BC0407, KGC-BC0725, KGC-BC0736)에 대해서만 특이적으로 반응이 나타내고, 보트리티스 시네레아 외의 인삼 주요 병원균에는 특이성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 3).
잿빛곰팡이병에 감염된 식물 조직을 직접 이용한 보트리티스 시네레아의 진단 방법
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트를 이용하여 이병(罹病) 식물체의 잿빛곰팡이병균 감염 여부를 진단하기 위해서 인삼 잿빛곰팡이병 이병 뿌리 및 건전(健全) 뿌리로부터 MACHEREY-NAGEL의 NucleoSpin　 plantⅡ protocol에 준하여 DNA를 분리하였다. 실시간(real time) PCR 반응조성물은 real time master mix(Toyobo) 10㎕, 프로브 (7pmol) 1㎕, 프라이머 (15pmol) 각 0.5㎕, DNA 1㎕에 멸균수를 첨가하여 총 20㎕로 수행하였다. 95℃에서 1분 초기 변성기 후, 95℃에서 15초 변성, 60℃에서 1분 결합하는 과정을 40회 반복하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이 인삼 잿빛곰팡이병 이병 조직에서만 반응을 확인할 수 있었다. 따라서 감염이 의심되는 인삼 조직을 사용하여 본 발명 프로브 및 프라이머 세트로 실시간 PCR을 수행함으로써 보트리티스 시네레아에 의한 감염 여부를 쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2의 프로브/프라이머 세트 이외의 다른 프로브/프라이머 세트의 보티리티스 시네레아 균주에 대한 검출 특이성 비교
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트 이외의 다른 세트(이하, "세트 1" 또는 "세트 2"로 기재함)를 Beacon Designer Program을 통해 설계하여 보티리티스 시네레아 균주에 대한 검출 특이성의 정도 차이를 비교하였다. 구체적으로 실시예 2에서와 같이 보트리티스 시네레아의 genomic DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1과 서열번호 2를 사용하여 RNA polymerase Ⅱ 영역을 증폭한 후, 염기서열 분석을 수행하였으며, Beacon Designer Program(Premier Biosoft)를 이용하여 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트 외의 다른 프로브 및 프라이머 세트(이하, 세트 1 및 세트 2로 기재함)를 제작하였다. 표 4에 세트 1 및 세트 2의 프로브 및 프라이머 세트를 나타낸다. 실험에 사용한 균주는 공시 균주 중 8개 대표 균주이고, 인삼 식물체의 DNA도 함께 사용하였다. 표 5에 사용한 보트리티스 시네레아 균주 및 기타 균주를 나타낸다. 설계된 프로브 및 프라이머 세트의 실시간 PCR 반응 조성물 및 반응 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다.
프로브 및 프라이머 이름
 염기서열(5'→3')
세트 1

 BC-R-1-TM(서열번호 6) 5'-Cy5-ACCAATGCCGAAGGTCTCCGATTTGTGAA-BHQ-2-3'
BC-R-1-F(서열번호 7) 5'-TGGTCTTGTTGATCAAGTACTTATTAC-3'
BC-R-1-R(서열번호 8) 5'-TGTCCTGTTGCATATATGTAATACC-3'
세트 2

 BC-R-2-TM(서열번호 9) 5'-Cy5- CATGTCAAGCGTGATGCGTCAACACCTCTT-BHQ-2-3'
BC-R-2-F(서열번호 10) 5'-ACTCCGAGGAAATGGGTC-3'
BC-R-2-R(서열번호 11) 5'-GGTTGATAATAAGATCTGGAACTACG-3'
병원균 균주번호 분리지역
Botrytis cinerea KGC-BC0407 경기도 수원시
Sclerotinia nivalis KGC-S0608 강원도 홍천군
Cylindrocarpon destructans KGC-CY9801 경기도 수원시
Rhizoctonia solani AG2-1 KGC-RH9801 경기도 수원시
Fusarium solani KGC-F0503 경기도 수원시
Fusarium oxysporum KGC-F1410 강원도 홍천군
Alternaria panax KGC-AP0507 경기도 수원시
Colletotrichum panacicola KGC-C1040 강원도 원주시
그 결과, 세트 1(BC-1-TM, BC-1-F/R)의 경우 보트리티스 시네레아 균주 이외에 라이족토니아 솔라니, 스크레로티니아 니발리스, 후사리움 옥시스포리움, 알타나리아 파낙스 균주에서도 시그널을 보여 프로브/프라이머의 특이성이 낮은 것으로 확인되었다(도 5a 참조). 세트 2(BC-2-TM, BC-2-F/R)의 경우에도 보트리티스 시네레아 균주 이외에 라이족토니아 솔라니 균주에서 시그널을 보여 특이성이 낮은 것으로 확인되었다(도 5b 참조).
위와 같은 결과로부터, 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트가 다른 서열을 포함하는 프로브 및 프라이머 세트에 비해서 보트리티스 시네레아 균주에 대해서 특이성이 높아 보트리티스 시네레아 검출에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
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Claims (15)

  1. 서열번호 4의 프라이머 및 서열번호 5의 프라이머를 포함하는 식물의 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 진단용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는 세트.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 프라이머 세트 및 프로브는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것인 세트.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 PCR에 사용하기 위한 것인 세트.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 식물은 인삼, 딸기, 라즈베리, 사과, 배, 밤, 키위 및 포도로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 세트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 식물은 인삼인 세트.
  9. 청구항 1의 프라이머 세트를 포함하는 식물의 보트리티스 시네레아 검출용 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 검출용 조성물은 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  11. 청구항 9의 검출용 조성물을 포함하는 식물의 보트리티스 시네레아 검출용 키트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 키트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  13. 1) 식물 또는 식물 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 1의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
    2) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계;를 포함하는 식물의 보트리티스 시네레아를 검출하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 단계 1)의 혼합물에 서열번호 3의 프로브를 추가로 첨가하는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 PCR은 실시간 PCR인 방법.
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