KR102298035B1 - 역병균의 진단 방법 - Google Patents

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KR102298035B1
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이승환
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이병철
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Abstract

본 발명은 역병균인 파이토프쏘라 칵토럼 진단용 프로브 및 프라이머에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머 세트를 사용한 식물의 역병균 진단 방법은 식물 재배 기간 중에 식물체를 채취하여 감염 여부를 확인함으로써 조기 진단이 가능하고, 따라서 적기에 방제를 통해 발병 확산을 억제함으로써 경제적 손실을 예방할 수 있다.

Description

역병균의 진단 방법{Method For Diagnosing Phytophthora Cactorum}
본 발명은 식물의 역병균 진단 방법에 관한 것이다.
우리나라의 인삼은 오가과(Araliaceae)에 속하는 다년생 숙근초로 의약품의 원료이자 건강식품으로써 널리 알려져 있다. 하지만 인삼은 동일 장소에서 3~5년 동안 재배되는 특성으로 인해 각종 병해충 피해가 발생한다.
전국적으로 인삼에 발생하는 주요 병해충은 병해 11종, 해충 18종이 보고되어 있어 단일 작물로는 병해충이 많고 발생양상도 특이하고, 병해충 피해에 의하여 매년 약 10%씩 6년생까지는 약 50% 빈 포기(결주)가 발생한다. 따라서, 인삼에 병을 일으키는 미생물을 진단하는 방법은 지속적으로 연구되고 있으며, 예를 들면 특허문헌 1에는 인삼점무늬병을 일으키는 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)를 검출할 수 있는 특이적 프라이머가 개시되어 있다.
역병균의 일종인 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum)은 인삼 재배 중 잎뿐만 아니라 뿌리를 썩힘으로서 경제적 손실을 일으키는 중요한 병원균으로 일단 병이 발생하면 빠르게 확산되고 치료가 어렵다. 또한, 사과, 배, 복숭아 열매에 발생하는 역병도 인삼 역병과 동일한 병원균인 파이토프쏘라 칵토럼에 의해 발생된다.
식물이 역병균에 감염되는 경우 육안만으로 정확하게 진단하기 어렵고, 특히 뿌리에 발생하는 역병의 경우 뿌리 썩음 증상이 상당히 진행되어야 지상부(잎)에서 병징이 나타나기 때문에 조기에 병을 진단하는 것이 쉽지 않다.
이병 식물체에서 병원균을 분리 및 배양하여 진단하는 전통적인 방법에 따르면 시간이 오래 걸리며(대략 7일 이상 소요), 다양한 병원균에 복합적으로 감염된 경우 신속, 정확하게 진단하기 어려운 문제점이 있다. 한편, 역병균 감염 초기에 약제를 살포하면 방제가 가능한 만큼, 방제의 성패 여부는 병의 조기 진단에 달려 있다고 봐도 무방하다. 따라서, 역병에 의한 경제적 손실을 최소화하기 위해서 역병균에 의한 썩음 증상을 신속하게 진단하는 방법을 개발할 필요성이 존재했다.
본 발명자들은 이병 식물체로부터 미량의 파이토프쏘라 칵토럼의 DNA도 효율적으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구하였으며, 파이토프쏘라 칵토럼에 특이적인 프로브 및 프라이머를 설계하여 파이토프쏘라 칵토럼을 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 등록특허 10-0744699
본 발명은 이병 식물체로부터 역병균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 이를 위하여, 역병균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단할 수 있는 역병균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 역병균 검출용 조성물 및 이를 포함하는 역병균 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 식물의 역병균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 식물의 역병균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 역병균 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 역병균 검출용 조성물을 포함하는 역병균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 1) 식물 또는 식물 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 1의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계;를 포함하는 식물의 역병균의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머 세트를 사용한 식물의 역병균 진단 방법에 따르면 식물 재배 기간 중에 식물체의 일부를 채취하여 감염 여부를 확인함으로써 조기 진단이 가능하다. 또한, 조기 진단 결과에 따라 적기에 방제를 수행하여 발병 확산을 억제함으로써 경제적 손실을 예방할 수 있다.
도 1은 역병균인 파이토프쏘라 칵토럼 특이적인 프로브 및 프라이머 세트인 세트 1(PC-R-TM, PC-R-F/PC-R-R)의 민감도를 확인한 결과이다.
도 2는 주형 DNA의 양에 따른 역병균인 파이토프쏘라 칵토럼 특이적인 세트 1(PC-R-TM, PC-R-F/PC-R-R)의 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 역병균인 파이토프쏘라 칵토럼과 인삼 주요 병원균으로부터 분리된 DNA를 주형 DNA로 하고 세트 1(PC-R-TM, PC-R-F/PC-R-R)을 사용하여 실시간(real time) PCR한 결과이다.
도 4는 역병균에 감염된 식물 조직으로부터 DNA를 분리하고 세트 1(PC-R-TM, PC-R-F/PC-R-R)로 증폭시킨 결과이다.
도 5는 본 발명에서 개발된 프로브/프라이머 세트 이외의 다른 프로브/프라이머 세트인 세트 2(PC-R-1-TM, PC-R-1-F/R)를 사용하여 실시간 PCR한 결과이다.
먼저, 본 발명에서 사용된 용어를 설명한다.
본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 하기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하는 것을 허용하도록 설계된다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "PCR"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적"은 다른 병원균에 결합하지 않고 역병균에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 식물의 역병균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 식물의 역병균은 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum), 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 파이토프쏘라 캡사이시(Phytophthora capsici)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 식물의 역병균은 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum)이다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 프라이머는 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 충분한 상보성을 가질 수 있는 것이면 본 발명에 적용할 수 있으므로, 프라이머는 주형인 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없다. 또한 본 발명의 프라이머는 파이토프쏘라 칵토럼의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드 유사체(analogue), 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 또는 퀀쳐가 프로브의 말단에 부착될 수 있다.
상기 프로브의 5' 말단에는 리포터(Reporter)로서 Hex가 부착되어 있을 수 있고, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa Fluor), ROX, Hex, Fam, 텍사스 레드(texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐(Quencher)로서 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1)이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 BHQ-2, BH3-3, ROX(carboxy-X-rhodamine), 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐(Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 상기 프로브는 5' 말단이 Hex로 표지되고, 프로브가 표적 서열에 혼성화되면, 3' 말단에 퀀쳐로서 존재하는 BHQ-1의 작용에 의해 5' 말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, PCR의 연장(extension) 단계에서, Taq 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5' 말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 퀀쳐에 의한 형광 억제로부터 벗어나 형광을 방출한다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것일 수 있고, 상기 프라이머 세트는 PCR에 사용하기 위한 것일 수 있다.
상기 식물은 인삼, 무, 파, 갓, 수박, 배추, 오이, 호박, 가지, 참외, 고추, 양파 및 토마토로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 인삼일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식물의 역병균 검출용 조성물을 제공한다. 상기 검출용 조성물은 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는 식물의 역병균 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징으로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 식물 또는 식물 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 1의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계를 포함하는 식물의 역병균의 진단 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 혼합물에 서열번호 3의 프로브를 추가로 첨가하여 실시간 PCR로 식물의 역병균을 검출할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있으며, 예를 들면 PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction, IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 사용될 수 있다.
상기 PCR을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들이 과량으로 제공될 수 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공될 수 있다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 제조되어 첨가될 수 있다.
상기 방법은 상기 단계 2) 후에 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출 또는 정량은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한 실시예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용하고, 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum), 피시움 실바티쿰(Pythium sylvaticum), 스크레로티니아 니바리스(Sclerotinia nivalis), 실린드로카폰 데스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 라이족토니아 솔라니 AG2-1(Rhizoctonia solani AG2-1), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 알타나리아 파낙스(Alternaria panax) 및 콜렉토트리쿰 파나시콜라(Colletotrichum panacicola)에서 각각 분리된 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR로 상기 프라이머 및 프로브의 특이성을 확인하였을 때, 다른 병원균에는 특이성을 나타내지 않고, 파이토프쏘라 칵토럼에만 특이성을 나타낸다(도 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서, Beacon Designer Program(Premier Biosoft)을 이용하여 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트 외의 다른 프로브 및 프라이머 세트(이하, 세트 2로 기재함)를 제작하고 그 민감도를 확인한 결과, 파이토프쏘라 칵토럼 외의 다른 균주에도 시그널을 보여, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브 세트에 비해서 파이토프쏘라 칵토럼에 대해서 민감도가 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 5 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
공시균주로부터 DNA 추출
본 발명에 사용한 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum) 및 기타 균주는 KGC 인삼공사 한국인삼연구원에서 분리, 보관 중인 공시균주를 사용하였다. 공시균주의 genomic DNA를 분리하기 위해 potato dextrose agar (Difco)에 각 균주를 접종하여 20℃에서 배양하였다. DNA 분리는 MACHEREY-NAGEL의 NucleoSpinⓡ plantⅡ protocol에 준하였으며, 분리된 DNA는 -20℃에 보관하였다.
본 발명에 사용한 파이토프쏘라 칵토럼 균주 및 기타 균주를 하기 표 1에 나타낸다.
병원균 균주번호 분리지역
Phytophthora cactorum KGC-PC1701 경기도 이천시
KGC-PC1901 충남 공주시
Pythium sylvaticum KGC-PS1301 강원도 춘천시
KGC-PS1501 충남 공주시
Sclerotinia nivalis KGC-S0680 강원도 홍천군
KGC-S0707 강원도 철원군
Cylindrocarpon destructans KGC-CY9801 경기도 수원시
KGC-CY1405 충남 당진시
Rhizoctonia solani AG2-1 KGC-RH9801 경기도 수원시
KGC-RH0203 충남 예산시
Botrytis cinerea KGC-BC0407 경기도 수원시
KGC-BC0725 경기도 여주군
Fusarium solani KGC-F0503 경기도 수원시
Fusarium oxysporum KGC-F1410 강원도 홍천군
Alternaria panax KGC-AP0507 경기도 수원시
Colletotrichum panacicola KGC-C1040 강원도 원주시
파이토프쏘라 칵토럼 특이적 프로브 및 프라이머 설계
실시예 1에서 분리된 파이토프쏘라 칵토럼 균주의 genomic DNA를 주형으로 하고 프라이머쌍 fRPB2-7F(서열번호 4) 및 fRPB2-11aR(서열번호 5)을 사용하여 RNA Polymerase Ⅱ 영역을 증폭하여 829bp의 증폭산물을 얻었다.
fRPB2-7F(서열번호 4) (ATG GG(C/T) AA(A/G) CAA GC(C/T) ATG GG)
fRPB2-11aR(서열번호 5) (GC(A/G) TGG ATC TT(A/G) TC(A/G) TC(C/G) ACC)
염기서열 분석을 수행하였으며, Beacon Designer Program(Premier Biosoft)을 이용하여 역병균인 파이토프쏘라 칵토럼에 특이적인 TaqMan 프로브 PC-R-TM 및 프라이머 PC-R-F/PC-R-R(이하, '세트 1'로 기재함)을 설계하였다. 설계된 프로브 및 프라이머를 하기 표 2에 나타낸다.
프로브 및 프라이머 이름 염기서열(5'→3')
세트 1 PC-R-F(서열번호 1) CGACATTATCATCGGCAAGAC
PC-R-R(서열번호 2) GGAACTCGAATGTTACGGAAG
PC-R-TM(서열번호 3) Hex-TCAGCATGACACTGTCGATAATACCATTCT-BHQ-1
실시예 2에서 제조된 프로브 및 프라이머의 민감도 확인
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트의 파이토프쏘라 칵토럼에 대한 민감성 정도를 알아보기 위하여 pBHA 벡터에 상기 실시예 2에서 파이토프쏘라 칵토럼에 대하여 증폭된 RNA 폴리머라제 Ⅱ 영역 염기서열을 삽입하여 플라스미드를 제작하였다. 합성한 플라스미드 DNA의 카피 수를 다음과 같이 계산하였다(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html에 게시된 프로그램을 이용함, Andrew Staroscik, 2004).
카피 수 = (amount×6.022×1023)/(length×1×109×650)
플라스미드 DNA 농도를 8단계(4.22×108~4.22×101copies/㎕)로 연속 희석하여 PCR 반응에 사용하였다. 설계된 프로브 및 프라이머 세트의 실시간 PCR 반응 조성물은 real time master mix(Toyobo, Japan) 10㎕, 프로브(5pmol) 1㎕, 프라이머(5pmol) 각각 0.5㎕, DNA 1㎕에 멸균수를 첨가하여 총 20㎕로 수행하였다. 95℃에서 1분 초기 변성 후, 95℃에서 15초 변성, 60℃에서 1분 결합하는 과정을 40회 반복하였다. 실시간 PCR 분석시에는 CFX96 TouchTMReal-TimePCRDetectionSystem 장치를 이용하였다. 분석 결과를 표 3에 나타낸다.
Copies/㎕ Ct±SD(n=3)
4.22×108 11.43±0.10
4.22×107 14.93±0.08
4.22×106 18.38±0.09
4.22×105 21.87±0.09
4.22×104 25.61±0.14
4.22×103 29.23±0.11
4.22×102 32.53±0.26
4.22×101 35.75±0.39
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 프로브 및 프라이머 세트를 이용하였을 때 4.22×101copies/㎕ 플라스미드 DNA 농도까지 반응이 나타났으며, 각각의 Ct (Threshold cycle) 값은 표 3과 같다. 표준 곡선은 도 2와 같다(slope: -3.519, Y-inter: 11.668, R2: 0.999, Efficiency: 92.4%). 이와 같은 결과로부터 실시예 2에서 제작된 프로브 및 프라이머 세트가 파이토프쏘라 칵토럼에 특이적이며 극미량의 파이토프쏘라 칵토럼의 DNA도 탐지할 수 있는 것을 알 수 있었다.
인삼 주요 병원균 DNA에 대한 프로브 PC-R-TM 및 프라이머 PC-R-F/PC-R-R의 특이성 확인
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트의 인삼 주요 병원균에 대한 특이성은 파이토프쏘라 칵토럼 외에 피시움 실바티쿰, 스크레로티니아 니바리스, 실린드로카폰 데스트럭턴스, 라이족토니아 솔라니 AG2-1, 보트리티스 시네레아, 푸사리움 솔라니, 푸사리움 옥시스포룸, 알타나리아 파낙스, 콜렉토트리쿰 파나시콜라 균주에 대해서도 확인하였다. 실시예 1에서 분리된 각 균주의 genomic DNA를 이용한 것 이외에는 실시예 3의 실시간 PCR 반응 조건과 동일하게 하여 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타낸다.
그 결과, 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트는 역병균인 파이토프쏘라 칵토럼 균주(표 1의 KGC-PC1701, KGC-PC1901)에 대해서만 특이적으로 반응을 나타내고, 파이토프쏘라 칵토럼 외의 인삼 주요 병원균에는 특이성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
인삼 역병균에 감염된 식물 조직을 직접 이용한 파이토프쏘라 칵토럼의 진단 방법
개발된 프로브 및 프라이머 세트를 이용하여 이병 식물체의 역병균 감염 여부를 진단하기 위해서 인삼 역병 이병 잎과 뿌리 및 건전 잎과 뿌리로부터 MACHEREY-NAGEL의 NucleoSpin plantⅡ protocol에 준하여 DNA를 분리하였다. Real time PCR 반응 조성물은 real time master mix(Toyobo) 10㎕, 프로브(5pmol) 1㎕, 프라이머(5pmol) 각 0.5㎕, DNA 1㎕에 멸균수를 첨가하여 총 20㎕로 수행하였다. 95℃에서 1분 초기 변성기 후, 95℃에서 15초 변성, 60℃에서 1분 결합하는 과정을 40회 반복하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 인삼 역병 이병 조직에서만 반응을 확인할 수 있었다. 따라서 감염이 의심되는 인삼 조직을 사용하여 본 발명 프로브 및 프라이머 세트로 real time PCR을 수행함으로써 파이토프쏘라 칵토럼에 의한 감염 여부를 쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 개발된 프로브/프라이머 세트 이외 다른 프로브/프라이머 세트의 비교
실시예 2의 프로브 및 프라이머 세트 이외의 다른 세트(이하, '세트 2'로 기재함)를 Beacon Designer Program을 통해 설계하여 파이토프쏘라 칵토럼 균주에 대한 검출 특이성의 정도 차이를 비교하였다.
구체적으로 Beacon Designer Program(Premier Biosoft)를 이용하여 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트 외의 다른 프로브 및 프라이머 세트를 제작하였다. 표 4에 세트 2의 프로브 및 프라이머 세트를 나타낸다. 상기 표 1의 공시 균주 16개를 실험에 사용하였다. 설계된 프로브 및 프라이머 세트(PC-R-1-TM, PC-R-1-F/R)의 실시간 PCR 반응 조성물 및 반응 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타낸다.
프로브 및 프라이머 이름 염기서열(5'→3')
세트 2 PC-R-1-F(서열번호 6) CTTCCGTTCTACATTCTACCG
PC-R-1-R(서열번호 7) GTCGTTATCCAGCTTGTGGTA
PC-R-1-TM(서열번호 8) Hex-CGCCAGGACCGCCGTG-BHQ-1
그 결과, 세트 2(PC-R-1-TM, PC-R-1-F/R)의 경우 파이토프쏘라 칵토럼 이외에 피시움 실바티쿰을 제외한 모든 공시 균주에서도 시그널을 보여 특이성이 낮은 것으로 확인되었다. 위와 같은 결과로부터, 본 발명에서 개발된 프로브 및 프라이머 세트가 다른 서열을 포함하는 프로브 및 프라이머 세트에 비해서 파이토프쏘라 칵토럼 균주에 대해서 특이성이 높아 파이토프쏘라 칵토럼 검출에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
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Claims (13)

  1. 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 식물의 역병균 검출용 프라이머 세트로서,
    상기 역병균은 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum)인 것인, 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는 프라이머 세트.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것인 프라이머 세트.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 식물은 인삼, 무, 파, 갓, 수박, 배추, 오이, 호박, 가지, 참외, 고추, 양파 및 토마토로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 프라이머 세트.
  7. 청구항 1 및 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 식물의 역병균 검출용 조성물로서,
    상기 역병균은 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum)인 것인, 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 청구항 7의 역병균 검출용 조성물을 포함하는 역병균 검출용 키트로서,
    상기 역병균은 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum)인 것인, 키트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  11. 1) 식물 또는 식물 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 1의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
    2) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계;를 포함하는 식물의 역병균의 진단 방법으로서,
    상기 역병균은 파이토프쏘라 칵토럼(Phytophthora cactorum)인 것인, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 단계 1)의 혼합물에 서열번호 3의 프로브를 추가로 첨가하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 PCR은 실시간 PCR인 방법.
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