CN116732147A - 一种用于等温扩增的高特异性引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于等温扩增的高特异性引物及其应用，通过对引物结构进行设计，包括在模板杂交区和模板延长区之间间隔Abasic类碱基位点，模板延长区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基等进行封闭，并在等温扩增体系中添加具有Abasic类碱基位点切割活性的酶。在目标模板不存在时，因为引物末端被封闭，无法被聚合酶利用并延伸引物；而当存在目标序列时，封闭引物会通过链置换作用与目标序列结合，利用类碱基位点切割活性的酶切除3＇末端封闭序列，重新释放出可被DNA聚合酶作用的3＇羟基，引物被正确延伸扩增。进而极大避免了等温扩增过程中的非特异性扩增，从而有效实现了高特异性的等温扩增，显著提高对待检测核酸的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中基因扩增领域，具体而言，涉及一种高特异性引物，尤其涉及一种用于等温扩增的高特异性引物及其应用，可用于提高基于重组酶活性反应中的扩增和检测灵敏度。
背景技术
核酸是细胞中的基本分子，在生物体内起着编码和调节遗传信息表达的作用，对生物的生长、发育、繁殖、遗传、变异等重大生命现象起着至关重要的影响，因此快速准确的检测出核酸序列，对生物研究与疾病诊断都将具有重要的作用。
其中PCR技术应用最为广泛，不仅可以扩增和分离目的基因，通过该技术能够看到单核苷酸多肽性、基因组结构变异等重要的信息。它需要反复的热变性来解开DNA双链，随着技术的发展，有许多专家及实验室致力于研究无需热变性的等温DNA扩增技术。其中一类扩增技术时基于重组酶与单链结合蛋白相互作用的原理进行扩增的技术，如重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，酶促等温扩增技术(EnzymaticRecombinase Amplification，ERA)等，这些技术是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找与定位同源序列，并发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。
这类等温DNA扩增技术反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，这无疑能大大加快扩增检测的速度。此外，由于不需要温控设备，等温DNA扩增技术可以真正实现便携式的快速核酸检测。
但是DNA扩增过程中，非常容易产生大量非特异性扩增，包括扩增非目标片段和引物二聚体等。为了提高扩增的特异性，研究人员一般通过多种热启动方式改进扩增性能，包括如采用热启动聚合酶、采用对高温敏感的4-oxo-1-pentyl(OXP)phosphotriester(PTE)化学修饰的热激活引物、修饰的热激活dNTP、采用蒸汽或石蜡物理隔离热启动等等。但是热启动扩增仅适合于经过高温热变性的传统Q-PCR反应，并不适用于恒温扩增。而且通常情况下聚合酶连续发挥聚合效应，恒温扩增速度更快，时间也会更短。因此对于恒温扩增反应控制非特性反应更为挑战。
CN108753935A提供了一种能够降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体的引物，但该引物仅适用于多重PCR反应，需要每间隔10个碱基就有一个dSpacer或C3Spacer修饰，且dSpacer或C3Spacer后面的碱基为T时需替换为U，反应条件为先低退火温度后高退火温度，并在Taq类聚合酶或高保真类聚合酶参与下才能实现降低引物二聚体扩增，该引物并不适用于等温扩增，无法实现等温扩增的高特异性。
等温DNA扩增技术分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为基于重组酶反应的等温DNA扩增技术引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计等温DNA扩增技术引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。等温扩增所采用的扩增引物是影响反应特异性、灵敏度和可靠性的主要决定因素之一。
因此急需设计一种能用于等温扩增的高特异性引物，从而控制降低在等温核酸检测反应中的非特异性产物，并能提高扩增效率，提高对待检测核酸的灵敏度。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于等温扩增的高特异性引物，通过对引物结构进行设计，包括在模板杂交区和模板延长区之间间隔Abasic类碱基位点，模板延长区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基等末端封闭修饰，并在等温扩增体系中添加特定的具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点(Abasic位点)切割活性的酶，从而有效实现了高特异性的等温扩增，显著提高对待检测核酸的灵敏度。
在等温扩增体系中，采用普通的引物进行扩增时，非常容易产生非特异性扩增，包括扩增非目标片段和引物二聚体等。研究证明，当出现三个碱基的错配即可启动非特异性扩增。可见等温扩增的特异性较低，从而影响了核酸检测的灵敏度。
针对等温扩增的特异性低的问题，即使采用更长的引物，也无法避免非特异性扩增的发生。在实验中发现，当采用更长引物进行扩增时，不仅不能提高特异性，甚至还会促使启动更多的非特异性扩增。
本发明提供的高特异性引物，只有在反应中当引物碱基序列都完全配对的DNA模板时，引物才能被类碱基切割酶切割，并释放出能被DNA聚合酶作用的3末端羟基底物，从而启动扩增，任何错配的碱基或不能完全配对的序列，无法被类碱基切割酶切断，而引物的末端封闭而无法启动扩增，从而极大控制了非特异性扩增的发生。而当存在完全匹配的目标DNA模板与引物结合后，被封闭的引物被类碱基切割酶，如Escherichia coli exonucleaseIII切割，从而启动扩增，实现高特异性扩增。
本发明巧妙地运用了具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点(Abasic位点)切割活性的酶，在DNA合成过程中的校对功能，并结合引物被C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基等末端封闭修饰后无法扩增的特性，真正避免了等温扩增过程中的非特异性扩增。
具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点(Abasic位点)切割活性的酶，如Exonuclease III或endonuclease IV在DNA合成过程中的校对功能：即如果DNA合成过程中双链DNA链上，存在一个类碱基位点的核苷酸，破坏正常的碱基配对，ExonucleaseIII或endonuclease IV会立即执行校对功能，切割并移去错误的碱基。因此当修饰后的引物与完全匹配的目标DNA模板结合后，Exonuclease III或endonuclease IV会立即切割Abasic类碱基位点，如THF位点，因此使得THF位点和被封闭的模板延伸区都被移除，然后开始沿着完全匹配的目标DNA模板进行扩增。
本发明提供的修饰后的引物，并在体系中添加Exonuclease III或endonucleaseIV酶，相当于为等温扩增过程多增加了双保险来避免非特异性扩增，第一道保险是引物末端被封闭，在未找到完全匹配的DNA模板结合之前，无法进行扩增，也就不可能产生非特异性扩增；第二道是需要与引物的模板杂交区和模板延伸区都完全匹配的DNA模板，当apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点形成DNA双链后，Exonuclease III或endonuclease IV才会立即执行校对功能，使末端封闭被移除，并释放出聚合酶作用底物，即末端3’羟基，从而启动聚合反应，使引物由聚合酶特异性延伸扩增，添加正确的碱基，并继续聚合。
而当没有特异性目标模板存在时，引物无法特异性结合，具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点(Abasic位点)切割活性的酶，如Exonuclease III或endonuclease IV无法识别并切割处于单链状态的Abasic类碱基位点，如THF位点，而且此时引物的末端被C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基等末端封闭修饰，无法启动非特异性的聚合反应，从而避免了非特异性扩增的发生，大大提高了等温扩增的特异性。
一方面，本发明提供了一种引物，包括模板杂交区和模板延伸区，所述模板杂交区和模板延伸区都为模板互补序列，模板杂交区为用于扩增的碱基序列，模板延伸区为沿3＇延伸的碱基序列，模板杂交区和模板延伸区之间间隔Abasic类碱基位点，模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基中的任意一种进行封闭。
进一步地，所述模板杂交区和模板延伸区之间间隔1个Abasic类碱基位点。
进一步地，所述Abasic类碱基位点为四氢呋喃THF位点。
模板杂交区和模板延伸区之间采用任何Abasic类碱基位点进行间隔，都可以达到被具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点(Abasic位点)切割活性的酶识别并切割的效果，因此都在本发明的保护范围内。
进一步地，所述模板杂交区长度为25-35碱基；模板延伸区长度为5-20碱基。
模板杂交区和模板延伸区的碱基数量对阻止非特异性扩增的效果也存在一定的影响，碱基太少或太多时，阻止非特异性扩增的效果都会降低，因此需要选择合适的碱基长度。
另一方面，本发明提供了一种等温扩增体系，该等温扩增体系中包括有如上所述的引物，以及具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶，如Exonuclease III或endonuclease IV。
由于具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点(Abasic位点)切割活性的酶，如Exonuclease III或endonuclease IV都需要在特定条件下进行反应，如恒温30、35、37、40℃等，因此本发明提供的方法更适合于较低温度的等温扩增。
进一步地，所述具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶为Exonuclease III或endonuclease IV。
进一步地，该等温扩增体系优选采用Exonuclease III。
研究证明，Exonuclease III切割THF位点的过程更加高效，能更好地实现非特异性扩增。
再一方面，本发明提供了一种提高引物特异性的方法，该方法包括如下步骤：
(1)获取正向引物和反向引物，分别以正向引物和反向引物的序列作为模板杂交区；分别沿正向引物和反向引物的3＇端延长5-20碱基作为模板延长区；
(2)分别在正向引物和反向引物的模板杂交区和模板延伸区之间采用Abasic类碱基位点修饰，并在模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基中的任意一种封闭；
(3)在等温扩增体系中添加步骤(2)制备的引物，并添加具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶；
(4)等温扩增。
进一步地，步骤(2)所述的Abasic类碱基位点为THF位点，模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer封闭；步骤(3)所述的引物浓度为150-600nmol，所述具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶为ExonucleaseIII或endonuclease IV。
进一步地，步骤(3)为在扩增体系中添加Exonuclease III，添加浓度为8-800ng/ul。
进一步地，步骤(4)所述的等温扩增，需添加重组酶30-3000ng/ul，等温扩增温度为37-45℃。
进一步地，步骤(4)所述的等温扩增，需添加重组酶200ng/ul，等温扩增温度为40℃。
研究证明，当添加重组酶300ng/ul，在40℃条件下进行等温扩增时，更能充分发挥Exonuclease III的作用，精确切割THF位点，并移除THF位点和被C3Spacer封闭的模板延伸区，杜绝非特异性扩增的发生，从而显著提高等温扩增反应的特异性，真正提高对待检测核酸的灵敏度。
再一方面，本发明提供了一种引物用于制备等温扩增的高特异性引物的用途，所述引物的模板杂交区和模板延伸区之间间隔Abasic类碱基位点，模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基中的任意一种封闭。
本发明提供的用于等温扩增的高特异性引物及其使用方法，具有如下的有益效果：
1、只有当找到与引物碱基都完全配对的DNA模板，才能在特定的酶帮助下启动扩增，任何错配的碱基或不能完全配对的序列都会因为引物的末端封闭而无法启动扩增，从而极大程度杜绝了非特异性扩增的发生；
2、在DNA合成过程中发挥Exonuclease III或endonuclease IV活性执行校对功能，当人为引入脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点时，Exonuclease III或endonuclease IV立即移除双链中的脱嘌呤或脱嘧啶核苷酸，由聚合酶添加正确的碱基，并继续聚合，极大地提高了校对聚合酶的特异性。
附图说明
图1为实施例1中的修饰引物及其与DNA模板结合的结构示意图；
图2为实施例1中制备的修饰引物与常规引物扩增反应实时荧光曲线对比图；
图3为实施例2中制备的修饰引物与常规引物扩增反应实时荧光曲线对比图；
图4为实施例3中修饰引物与常规引物扩增不同高浓度样本的反应实时荧光曲线图；
图5为实施例3中修饰引物与常规引物扩增不同低浓度样本的反应实时荧光曲线图；
图6为实施例4中修饰引物扩增目标序列的特异性验证荧光曲线图；
图7为实施例5中修饰引物与常规引物扩增新冠RNA国家标准物质的实时荧光曲线图；
图8为实施例6中修饰引物与常规引物扩增肺炎支原体的电泳分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本发明具体实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
实施例1：本发明提供的末端封闭寡聚核苷酸引物与常规引物扩增特异性差异比较
本实施例提高基于重组酶活性的等温扩增反应中引物特异性的方法包括：获取正向引物和反向引物，正向引物和反向引物的长度为30-55bp，将所述正向引物和反向引物均设计为模板互补序列，在所述引物序列上间隔有1个THF修饰，THF距离3’端之间有5-20bp序列，并在所述引物序列3’端采用C3Spacer封闭，5’端至THF为模板杂交区，THF至3’端为模板延伸区(如图1所示)。在等温扩增过程中，在外切核酸酶Exonuclease III(购自NEBBiolabs，货号：#M0206L)的活性下，间隔的1个THF修饰和C3Spacer末端被主动消化，移除模板延伸区和去除错误掺入的碱基后，继续进行扩增。能够很大程度上提高了引物的特异性，提高了基于重组酶活性反应的特异性扩增，增强了基于重组酶活性反应的扩增能力。
用于非洲猪瘟(African swine fever virus)B646L基因引物探针检测的专利引物与普通引物的对比。参考NCBI基因组序列Sequence ID:MK128995.1进行设计。
1)本实施例设计的引物如下，分为A组合和B组，A组为未修饰的普通引物，B组为修饰后的末端封闭寡聚核苷酸引物：
A:未修饰的正向引物
ASFF1：CAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGAT
未修饰的反向引物
ASFR1：TGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAA
B：修饰后的末端封闭寡聚核苷酸引物互补对(标记下划线的为模板延伸区，非下划线的为模板杂交区)：
修饰后的正向引物
ASFF1M:CAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGAT(THF)TACGT(C3-SPACER)
修饰后的反向引物
ASFR1M:TGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAA(THF)GAAGAAA(C3-SPACER)
A组和B组都采用同样的探针序列
ASFBP1：TCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)GCTATTAACTTTCTT(C3-SPACER)
2)据上述引物进行扩增反应，按照如下所示制备每份样本的预混液：
反应试剂 终浓度(体系50μl)
三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0 50mM
乙酸钾 100mM
乙酸镁 14mM
二硫苏糖醇 3mM
聚乙二醇(分子量20000) 5％
ATP 3mM
磷酸肌酸 30mM
肌酸激酶 100ng/μl
uvsX 100ng/μl
gp32 480ng/μl
uvsY 60ng/μl
Bsu DNA聚合酶 120ng/μl
核酸外切酶Exonuclease III 50ng/μl
dNTP 450uM
正向引物(10μM) 2.1μl
反向引物(10μM) 2.1μl
模板(含有目标DNA序列质粒) 2ul，总100copies
模板为人工合成的DNA基因片段，通过平端连接至pUC57载体中。质粒编号为pUC-ASF。目标基因序列为：
TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATGTTTTTAATAATAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGGGGCTAATATCAGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCAGGTAGGTTTTAATCCTATAAACATATATTCAATGGGCCATTTAAGAGCAGACATTAGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGGGTCACCTGCGTTTTATGGACACGTATCAGCGAAAAGCGAACGCGTTTTACAAAAAGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGTAAAGTTCATTATTCGTGAGCGAGATTTCATTAATGACTCCTGGGATAAACCATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCTACTGGGGCGTCCAGCTATAAAACGTGACTGGCGTACAAAAAGTCCAGGAAATTCATTCACCAAATCCTTTTGCGATGCAAGCTTTATGGTGATAAAGCGCTCGCCGAAGGGAATGGATACTGAGGGAATAGCAAGGTTCACGTTCTCATTAAACCAAAAGCGCAACTTAATCCAGAGCGCAAGAGGGGGCTGATAGTATTTAGGGGTTTGAGGTCCATTACAGCTGTAATGAACATTACGTCTTATGTCCAGATACGTTGCGTCCGTGATAGGAGTAATATCTTGTTTACCTGCTGTTTGGATATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGCTGTGAAAGAAATTTCGGGTTGGTATGGCTACACGTTCGCTGCGTATCATTTTCATCGGTAAGAATAGGTTTGCTTTGGTGCGGCTTGTGCAAATCATGAATGTTGCATAGGAGAGGGCCACTGGTTCCCTCCACCGATACCTCCTGGCCAACCAAGTGCTTATATCCAGTCATTTTATCCCCTGGGATGCAAAATTTGCGCACAAGCGTTGTGACATCCGAACTATATTCGTCTAGGGAATTTCCATTTACATCGAATCTTACGTTTTCATAAAGTCGTTCTCCGGGGTATTCGCAGTAGTAAACCAAGTTTCGGTACGCATTCTTTGTGCCGGGTACAATGGGTCTTCCAAAAGGATCTACAAGCGTGTAAACGGCGCCCTCTAAGGGTGTTTGGTTGTCCCAGTCATATCCGTTGCGAGGAAACGTTTGAAGCTGCCCATGGGCCCCCATCTGGGACGTGCCCTGAATCGGAGCATCCTGCCAGGATGAATGACATGCACCCAATATATGATGGCCCACCATATCATGGAAAAAGTCTCCGTACTGGGGAATACCAAAGGTAAGCTTGTTTCCCAAGGTGGGGGTACCCGTATGCGGGCGTACTTTATTGTATTCAAACCCTACTGGAACATAAGGCTTAAAATGCGCATTAAAATGCACCAAATGTGTTTCTTCGATTTGACTCAAAGTGGGTTCGGGATCGGGTTTCCCATAACTTTTGTTCACATTTTTAATGTTAGAGATCCTGCTATTCAGCAAGTCTTGGGCCAATATAATCTTGTCGGCCTTCCCATCGTTAGCAATAAGACAAAAAGCTCCTCCTGATGCCAT
扩增检测条件：将反应管放入荧光定量PCR仪中，启动恒温40℃检测，持续20分钟(40s间隔/Cycle)，每40秒采集一次FAM通道荧光值。
制备反应实时荧光曲线图如图2所示，其中1、2、3为常规引物探针阳性模板实时荧光曲线，4为常规引物探针阴性模板实时荧光曲线；5、6、7为末端封闭引物探针阳性模板实时荧光曲线，8为末端封闭引物探针阴性模板实时荧光曲线。由图2的结果看出，采用本发明提供的末端封闭寡聚核苷酸扩增时，TT值(起峰时间)明显短于常规引物扩增，而且扩增后荧光值高度也明显高于常规引物，可见其等温扩增的特异性明显升高，因此能显著提高检测灵敏度。
大量实施例证明，引物末端封闭除了采用C3Spacer封闭，采用NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基等也都能达到同样的封闭效果，用于扩增时都能显著提升扩增的特异性，杜绝非特异性扩增，显著提升目标序列的检测灵敏度。
实施例2：末端封闭寡聚核苷酸扩增与常规引物扩增特异性差异比较
用于河流弧菌(Vibrio fluvialis)引物探针检测的专利引物与普通引物的对比。参考NCBI基因组序列Sequence ID:CP053664.1进行设计。
1)本实施例按照实施例1提供的方法设计引物如下：分为A组合和B组，A组为未修饰的普通引物，B组为修饰后的末端封闭寡聚核苷酸引物：
A:常规引物
VFF1：TAGGTGCTGGCTACGCTGACCAAGACAAAG
VFR1：TCAGTTTCAGCGTTGTTGTAAGTAGTAGTG
B、修饰后的末端封闭寡聚核苷酸引物互补对(标记下划线的为模板延伸区，非下划线的为模板杂交区)：
VFF1M：TAGGTGCTGGCTACGCTGACCAAGACAAAG(THF)TAACG(C3-SPACER)
VFR1M：TTCAGCGTTGTTGTAAGTAGTAGTG(THF)ATACAGTTTGGTTCAGAGTG(C3-SPACER)
A组和B组都采用同样的探针序列
VFBP1：
CAGCGTCTTACACCGTTTCTGATTTCTAC[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GCAGGTCTGTTTACT(C3-SPACER)
2)按照以下所述制备每份样本的预混液：
反应试剂 终浓度(体系50μl)
三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0 50mM
乙酸钾 100mM
二硫苏糖醇 3mM
聚乙二醇(分子量20000) 5％
ATP 3mM
磷酸肌酸 30mM
肌酸激酶 100ng/μl
大肠杆菌recA蛋白 400ng/μl
大肠杆菌SSB蛋白 200ng/μl
大肠杆菌recO蛋白 60ng/μl
大肠杆菌recR蛋白 40ng/μl
大肠杆菌recF蛋白 60ng/μl
Klenow聚合酶大片段(exo-) 8Units
核酸外切酶III 50ng/μl
dNTP 450uM
正向引物(10μM) 2.1μl
反向引物(10μM) 2.1μl
人工合成的含有目标片段的质粒样本 100copies/μl。
合成模板目标片段序列如下：
AGGTGGTCTGGGTGTGATCACTGACTTTACCGATATCATGGCTTACCACGGTAACTCAGCGGCAGACAAACTAGCAGTAGCCGATCGTACTGACAACATGATCGCTTACAAAGGCCAGTTTTCTGACCTGAGTATTAAGGCTTCTTACCGTTTTGCTGATCGCACTAAACTAGATGCGAATGGCAACGAAGTTACTGATAATGCAGATCACTACTCAGATAACAAAGCGGATGGTTACTCTCTGTCTGCTATCTACGCTATCGGCGATACTGGCGTGAAACTAGGTGCTGGCTACGCTGACCAAGACAAAGCTAACGAATACATGCTAGCAGCGTCTTACACCGTTTCTGATTTCTACTTCGCAGGTCTGTTTACTGACGGAGAGAAACAAGATTCAAGCCGCAACAAGTACGACTACACTGGTTACGAGCTGGCAGCAGCTTACACTCTGAACCAAACTGTATTCACTACTACTTACAACAACGCTGAAACTGAAAGTGAAACTTCAGCTGACAACCTGGCAGTAGACGCGACTTACTACTTCAAGCCTAACTTCCGTGCTTACGTATCGTACAACTTCAACCTGATCGATAAAGGCGATACTATCGGTACTTCAACTGGTAAAGGCACTGCAACTAAAGTTGACGCTGAAGACGAAATCGCACTGGGTCTGCGTTACGACTTC
3)对于每份样本，将48μl预混液转移至每管预混液中。振荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心。
4)对于每份样本，在反应管盖上加上2μl乙酸镁(乙酸镁终浓度14mM)，小心盖紧管盖，通过短暂离心使乙酸镁进入预混液中。短暂振荡混匀并再次快速离心。
5)将反应管放入恒温仪(37-40℃)中，启动检测，持续20分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。
制备的反应实时荧光曲线图3所示，其中1、2为常规引物探针阳性模板实时荧光曲线，5、6为常规引物探针阴性模板实时荧光曲线；3、4为末端封闭引物探针阳性模板实时荧光曲线，7、8为末端封闭引物探针阴性模板实时荧光曲线。由图3的结果看出，采用本发明提供的末端封闭寡聚核苷酸扩增时，TT值(起峰时间)明显短于常规引物扩增，而且扩增后荧光值高度也明显高于常规引物，可见其等温扩增的特异性明显升高，因此能显著提高检测灵敏度。
综合实施例1、2还可以看出，采用修饰后的引物扩增时，虽然不同序列的引物的荧光曲线不同，但修饰后的引物的TT值都整体短于未修饰引物扩增，而且修饰后的引物扩增后荧光值高度也都整体高于未修饰引物，可见经修饰后，不管引物的具体序列是怎样的，其等温扩增的特异性整体都会明显升高。
实施例3：末端封闭寡聚核苷酸与常规引物扩增对模板浓度灵敏度差异比较
用于非洲猪瘟(African swine fever virus)EP402R基因引物探针检测的专利引物与普通引物的对比。参考NCBI基因组序列NC_044943.1进行设计。
1)本实施例按照实施例1提供的方法设计引物如下：分为A组合和B组，A组为未修饰的普通引物，B组为修饰后的末端封闭寡聚核苷酸引物：
A:常规引物互补对
ASFVF：TAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTA
ASFVR：ATACTGATAACGACTGTAAGGCTTAGGAAG
B：末端封闭寡聚核苷酸互补对，其中标记下划线的为模板延伸区，非下划线的为模板杂交区
ASFVF1M:TAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTA(THF)TTCTTCTT(C3-SPACER)
ASFVR1M:ATACTGATAACGACTGTAAGGCTTAGGAAG(THF)TAATGGTTC(C3-SPACER)
ASFV-BP1:TTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)AATGAAGAAGAACA(C3-SPACER)
2)按照以下所述制备每份样本的预混液：
反应试剂 终浓度(体系50μl)
三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0 50mM
乙酸钾 100mM
乙酸镁 14mM
二硫苏糖醇 3mM
聚乙二醇(分子量20000) 5％
ATP 3mM
磷酸肌酸 30mM
肌酸激酶 100ng/μl
uvsX蛋白 400ng/μl
gp32蛋白 480ng/μl
uvsY蛋白 60ng/μl
Sau DNA聚合酶I(金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I) 200ng/μl
核酸外切酶III 50ng/μl
dNTP 450uM
正向引物(10μM) 2.1μl
反向引物(10μM) 2.1μl
模板(含有目标DNA序列质粒) 5μl
模板为人工合成的DNA基因片段，通过平端连接至pUC57载体中。质粒编号为pUC-ASF2。目标基因序列为：
ATGGAGTACTTTAAATCAAACTGTATTTTAAATAATATTTTTACAATTAATGATACATATGGTGGTCTATTTTGGAATACATATTATGATAATAATCGTAGTAATTTTACTTATTGTGGAATAGCAGGAAATTATTGTTCATGTTGTGGTCATAACATATCATTGTATAATACAACAAATAATTGTAGTTTAATTATTTTTCCTAACAATACAGAAATATTTAATAGAACATATGAATTAGTATATTTGGACAAAAAAATTAATTATACAGTAAAACTATTAAAATCTGTTGATTCCCCAACTATTACATATAATTGTACTAATTCTTTAATAACATGTAAAAATAATAATGGGACAAATGTTAATATATATTTAATTATTAACAATACAATTGTTAATGATACTAATGGAGATATCCTTAATTATTATTGGAATGGTAATAATAATTTTACAGCTACATGTATGATTAATAATACAATTAGTTCATTGAATGAAACAGAAAATATAAATTGTACTAATCCAATATTAAAATATCAAAATTATTTATCCACATTATTTTATATCATAATTTTTATTGTGAGTGGATTAATAATAGGTATTTTTATTTCAATCATATCTGTATTATCTATACGAAGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCCTCTGAATCTAATGAAGAAGATATTTCTCACGATGACACCACTTCCATACATGAACCATCCCCAGAGAACCATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGTATAATACACCTATTTACTACATGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACCCATTTCCCCTACCTAAACCATGCCCGCCACCTAAACCATGTCCTCCACCCAAGCCATGCCCGCCACCCAAACCTGTCCTCCACCTAA
3)模板处理过程：
为模拟使用场景，采用猪肉组织抽提的基因组DNA，加入一定浓度的目标基因质粒pUC-ASF，制备成模拟样本。基因组抽提采用Dzup基因组DNA快速抽提试剂(生工生物工程(上海)股份有限公司B518201-0100)，过程如下：
a、取25-50mg猪肉组织样本用液氮研磨成粉末，加入到1.5ml离心管中。加入1mlDzup，震荡混匀，室温放置10min至完全裂解；
b、离心：10,000rpm室温离心10min，将上清(约900μl)转移到新的1.5ml离心管中；
c、沉淀：加入500μl无水乙醇，颠倒混匀8次，室温放置3min，8,000rpm室温离心5min，弃上清；
d、漂洗：加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗3min，12,000rpm离心2min，弃上清。再重复此步骤一次；
e、晾干：开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。
f、溶解：得到的猪基因组用新鲜配制的TE Buffer溶解。
g、将得到的猪基因组与包含目的片段的质粒混合制备成混合样本
将获得的混合样本梯度稀释后进行检测的目标基因pUC-ASF，最终加样量对应测试编号如下：
样本1 5copies/T
样本2 10copies/T
样本3 50copies/T
样本4 100copies/T
样本5 200copies/T
样本6 500copies/T
样本7 1000copies/T
样本8 2000copies/T
4)将反应管放入恒温仪40℃中，启动检测，持续20分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。制备的反应实时荧光曲线图4、5所示，其中图4中，1-4为末端封闭寡聚核苷酸扩增结果；5-8为常规引物扩增结果；1、5为样本8扩增结果，2、6为样本7扩增结果，3、7为样本6扩增结果，4、8为样本5扩增结果；图5中，1-4为末端封闭寡聚核苷酸扩增结果；5-8为常规引物扩增结果；1、5为样本4扩增结果，2、6为样本3扩增结果，3、7为样本2扩增结果，4、8为样本1扩增结果。
由图4和图5的结果看出，对于不同浓度的样本，修饰后的引物的TT值都整体短于未修饰引物扩增，而且修饰后的引物扩增后荧光值高度也都整体高于未修饰引物，可见经修饰后，等温扩增的特异性整体都会明显升高，从而可以明显提升样本的检测灵敏度。
实施例4：末端封闭寡聚核苷酸对目标模板的特异性验证
1)本实施例按照实施例1提供的方法设计目标基因(样本8)的修饰后的引物互补对，其中标记下划线的为模板延伸区，非下划线的为模板杂交区；
修饰后的正向引物
ASFVF2:CAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGAT(THF)TACGT(C3-SPACER)
修饰后的反向引物
ASFVR2:TGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAA(THF)GAAGAAA(C3-SPACER)
探针ASFVBP2：TCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)GCTATTAACTTTCTT(C3-SPACER)
2)按照以下所述制备每份样本的预混液：
反应试剂 终浓度(体系50μl)
三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0 50mM
乙酸钾 100mM
乙酸镁 14mM
二硫苏糖醇 3mM
聚乙二醇(分子量20000) 5％
ATP 3mM
磷酸肌酸 30mM
肌酸激酶 100ng/μl
uvsX 320ng/μl
gp32 480ng/μl
uvsY 60ng/μl
Bsu DNA聚合酶 300ng/μl
核酸外切酶III 50ng/μl
dNTP 450uM
正向引物(10μM) 2.1μl
反向引物(10μM) 2.1μl
基因组样本(或混合模板样本) 5μl
最终加样拷贝数量如下：
样本1 猪基因组+SVDV质粒10000copies/T
样本2 猪基因组+猪细小病毒质粒10000copies/T
样本3 猪基因组+PRRSV质粒10000copies/T
样本4 猪基因组+SFV质粒10000copies/T
样本5 猪基因组+PCV质粒10000copies/T
样本6 猪基因组+猪乙型脑炎病毒基因组10000copies/T
样本7 猪基因组10000copies/T
样本8 猪基因组+ASFV质粒(同实施例1)20copies/T
3)将反应管放入恒温仪38℃中，启动检测，持续30分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。制得的反应实时荧光曲线图6所示。由图6可见，本实施例设计的引物具有非常好的特异性，只能扩增出目标样本(样品8)，其他样本都不能扩增。
实施例5：对比常规引物与末端封闭寡聚核苷酸对新冠RNA国家标准物质的检测效果
利用RPA试剂，使用新冠RNA国家标准物质(上海市计量测试技术研究院-GBW(E)091111)的扩增研究，本实施采用实施例1提供的方法，设计一对RPA引物，并将其改造为末端封闭寡聚核苷酸后进行阳性样本测试比较，采用同样的探针，具体信息如下：
常规引物：
COVF1：GCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCG
COVR1：GTTGTTGTTGGCCTTTACCAGACATTTTG
末端封闭寡聚核苷酸：
COVF1M：GCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTC(THF)CAACAGTTCAAGAAA(C3-SPACER)
COVR1M：GTTGTTGTTGGCCTTTACCAGACATTTTG(THF)TCTCAAGCTGGTTCA(C3-SPACER)
COV-BP1：AATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)GCTTGACAGATTGAAC(C3-SPACER)
使用NEB逆转录酶(货号：M0380S)及exo试剂盒(货号：TAEXO02KIT)
按照上所示序号组合，配置反应：
1.在1.5ml管中制备反应混合物并充分震荡混匀：
每反应：
2.将反应混合物加入冻干试剂中，充分震荡混匀。
3.加入2.5μl 280mM乙酸镁，并充分混合以开始反应。
4.将反应条件设置为39℃，20分钟并开始运行。(40s/Cycle)
荧光曲线如图7所示，其中1、2为常规引物探针阳性模板实时荧光曲线，5、6为常规引物探针阴性模板实时荧光曲线；3、4为末端封闭寡聚核苷酸探针阳性模板实时荧光曲线，7、8为末端封闭寡聚核苷酸探针阴性模板实时荧光曲线。由图7的结果看出，采用本发明提供的末端封闭寡聚核苷酸扩增检测新冠RNA时，TT值(起峰时间)明显短于常规引物扩增，而且扩增后荧光值高度也明显高于常规引物，可见其等温扩增的特异性明显升高，因此也能提高检测灵敏度。
实施例6：用ERA试剂对肺炎支原体扩增后，电泳分析结果验证特异性
本实施采用实施例1提供的方法，设计ERA引物再加以修饰，进行等温扩增反应并进行比较，共设计了2组引物，其中1组为常规ERA引物，2组为末端封闭寡聚核苷酸，扩增结束后使用琼脂糖凝胶电泳观察扩增效果。具体引物设计如下所示。
1组、常规引物：
MPPF1：TGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGGTACA
MPPR1：TTTGCAGCCCTAGACATAAGGGGCATGATGAT
2组、末端封闭寡聚核苷酸：
MPPF1M：TGGTGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGGTAC(THF)ACGAAAAACCTTACCT(C3-SPACER)
MPPR1M：TTTGCAGCCCTAGACATAAGGGGCATGATGA(THF)TTTGACGTCATCCCTT(C3-SPACER)
引物MIX(混合液)的制备，将每个引物及探针到10μM，按照如上所示序号组合，将引物按照1：1混合成Primer MIX，每条引物取2.1μl，并加入模板(肺炎支原体基因组DNA，10拷贝/ul)5μl及ddH2O混合至48μl，添加大肠杆菌核酸内切酶IV 100ng/ul。其它参照试剂盒说明书进行。基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)，产品目录号，KS101。反应试剂配制后，将反应管放入恒温仪40℃中，启动检测，持续20分钟，反应结束后使用2％琼脂糖进行电泳观察试验结果。
电泳结果如图8所示，可见，采用常规引物扩增时，会产生大量非特异性扩增产物而抑制特异性扩增，扩增结果在100bp、200bp附近都有条带产生，条带偏暗，扩增中有一定非特异性扩增；而在使用修饰后的引物扩增时，由于扩增特异性的增强，仅出现在小于300bp的目标序列条带(目标片段约270bp)，而且条带更亮，可见修饰后的引物对目的片段的扩增特异性明显提高，而且扩增产量大大增加，非常有效地防止了特异性扩增的产生。
本实施例还针对多种目标序列片段分别设计常规引物和末端封闭寡聚核苷酸，经扩增产物的电泳结果都能出现类似图8的结果，即采用修饰后的引物扩增时，由于扩增特异性的增强，仅出现目标序列条带，而且条带更亮，无明显非特异性扩增出现。
上述结果表明本发明提供的一种提高基于重组酶活性反应中引物特异性的方法，可以大大提高了引物的特异性，提高了基于重组酶活性反应的扩增特异性，增强了基于重组酶活性反应的扩增能力。
虽然上文中已经用一般性说明及较佳实施案例进行说明，但并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种引物，其特征在于，包括模板杂交区和模板延伸区，所述模板杂交区和模板延伸区都为模板互补序列，模板杂交区为用于扩增的碱基序列，模板延伸区为沿3＇延伸的碱基序列，模板杂交区和模板延伸区之间间隔Abasic类碱基位点，模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基中的任意一种进行封闭。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述模板杂交区和模板延伸区之间间隔1个Abasic类碱基位点。
3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述模板杂交区长度为25-35碱基；模板延伸区长度为5-20碱基。
4.一种等温扩增体系，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的引物，以及具有Abasic类碱基位点，如apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点。
5.如权利要求4所述的等温扩增体系，其特征在于，所述具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶为Exonuclease III或endonuclease IV。
6.一种提高引物特异性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取正向引物和反向引物，分别以正向引物和反向引物的序列作为模板杂交区；
分别沿正向引物和反向引物的3＇端延长5-20碱基作为模板延长区；
(2)分别在正向引物和反向引物的模板杂交区和模板延伸区之间采用Abasic类碱基位点修饰，并在模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基中的任意一种封闭；
(3)在等温扩增体系中添加步骤(3)制备的引物，并添加具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶；
(4)等温扩增。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的Abasic类碱基位点为THF位点，模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer封闭；步骤(3)所述的引物浓度为150-600nmol，所述具有apurinic/apyrimidinic脱嘌呤或脱嘧啶碱基位点等Abasic类碱基位点切割活性的酶为Exonuclease III或endonuclease IV。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)为在扩增体系中添加ExonucleaseIII或endonuclease IV，添加浓度为10-500ng/ul。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的等温扩增，需添加重组酶30-500ng/ul，等温扩增温度为37-45℃。
10.一种引物用于制备等温扩增的高特异性引物的用途，其特征在于，所述引物的模板杂交区和模板延伸区之间间隔采用Abasic类碱基位点，模板延伸区的3＇末端采用C3Spacer、NH2、磷酸化、BHQ、双脱氧末端碱基、反式碱基中的任意一种封闭。
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