KR102605843B1 - 고온 내성 특성을 지니는 표고버섯 품종 판별을 위한 caps 마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
고온 내성 특성을 지니는 표고버섯 품종 판별을 위한 caps 마커 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고온 내성을 갖는 표고버섯 품종 판별을 위한 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 고온 내성을 가지고 있는 품종인 산마루1호, 산마루2호와 고온 내성을 가지고 있지 않은 품종인 산조501호, 산조502호, 균흥135호를 유전체 재분석 기술을 통해 선발된 고온 내성 품종 특이적 SNP 유래 CAPS 마커를 이용하여 신속하게 판별하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 고온 내성 특성을 지니는 표고버섯 품종 판별을 위한 CAPS 마커 조성물 및 이의 용도 관한 것이다.
본 발명은 고온 내성을 갖는 표고버섯 품종 판별을 위한 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 고온 내성을 가지고 있는 품종인 산마루1호, 산마루2호와 고온 내성을 가지고 있지 않은 품종인 산조501호, 산조502호, 균흥135호를 유전체 재분석 기술을 통해 선발된 고온 내성 품종 특이적 SNP 유래 CAPS 마커를 이용하여 신속하게 판별하는 방법에 관한 것이다.
표고 (Lentinula edodes)는 활엽수 고목에서 발생하는 백색 부후균으로, 풍부한 영양과 약리학적 효능으로 잘 알려져 있고, 농업 폐기물의 효과적인 생물전환 (bio-conversion)에도 이용될 수 있는 귀중한 가치를 지닌 버섯이다. 현재 전세계에서 가장 많이 생산되고 있으며 2019년 국내 임산버섯 생산량의 약 98%, 약 2,018억 원의 생산액을 기록하고 있어 경제적 가치 또한 높다.
표고버섯은 단핵균사, 이핵균사, 원기, 자실체의 발생단계를 지닌 전형적인 담자균류이다. 단핵균사에서 이핵균사로의 발달, 원기의 형성과 자실체로의 성숙 과정에서는 현저한 변화가 관찰되는데, 이 과정에서는 세포와 조직의 분화가 일어나고 느슨한 미분화 균사가 조밀한 구조의 다중 균사 구조로 변화한다.
온도는 표고버섯의 생장과 발달, 수확량 및 품질에 결정적인 영향을 주는 환경요인이다. 표고버섯 균사는 24-27 ℃ 온도 조건에서 최적의 생장을 보이고 38 ℃ 이상의 온도에서는 사멸한다. 표고버섯은 중저온에서 자실체를 형성하는 버섯으로 알려져 있지만, 표고버섯 주요 생산지의 여름 온도는 25 ℃를 훨씬 웃돈다. 여름철의 고온은 표고버섯 균사의 생존력을 감소시키는데, 이로 인해 원목이나 톱밥 배지에 다른 병원균이 감염되어 썩은 부위가 발생하면 수확량과 품질 저하가 초래된다.
고온은 세포벽의 무결성 (integrity)을 파괴하고 세포막을 손상시켜 원형질막 구조의 기능을 바꿈으로써 유동성을 증가시키고 투과성을 감소시킬 수 있다. 고온 스트레스로 인해 유도된 산화적 손상은 Para-aminobenzoic acid (PABA) 합성효소와 산화질소가 reactive oxygen species (ROS)를 감소시킴으로써 완화시킨다고 보고되어 있고, 식용 균류에서는 catalase, trehalose, heat shock protein (HSP), 그리고 칼슘-칼모듈린이 고온 스트레스에 대한 반응 조절에 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있다.
Single nucleotide polymorphism (SNP)는 단일 염기 서열의 변이로 유전체 전반에 걸쳐 매우 풍부하게 존재한다. 차세대 염기서열 분석 기술 (next generation sequencing)의 발달로 단기간에 많은 양의 SNP를 발굴하는 것이 가능해졌고, SNP는 다른 마커에 비해 분석 비용이 낮아 분자 마커에 널리 사용되고 있다. 전통적인 SNP 유전형 분석 방법 중 하나인 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)는 DNA 염기서열의 변이로 인해 생성되거나 제거된 제한효소 인식부위를 탐지하여 마커로 이용하는 방법으로, 전기영동법을 기반으로 이루어진다. PCR 증폭 산물의 제한효소 절단 유무에 따라 품종간의 차이를 구별할 수 있고, 분석 과정이 간단할 뿐만 아니라 결과가 안정적이고 명확하다는 장점이 있다.
일반적으로 표고버섯 품종은 버섯이 발생되는 시기에 따라 저온성, 중온성, 고온성의 3가지 계통으로 나뉜다. 국립산림과학원에서 개발된 품종인 산마루1호와 산마루2호는 자실체 주발생온도가 20~29℃인 고온성 품종이고, 산림조합 중앙회 산림버섯연구센터에서 개발된 산조501호와 산조502호, 그리고 일본 품종인 균흥135호는 저온성 품종으로 알려져 있다. 산조501호, 산조502호, 균흥135호의 자실체 주발생온도는 각각 7~18℃, 8~20℃, 그리고 7~15℃이다.
본 발명자들은 고온 내성을 지닌 표고버섯 품종 산마루1호와 산마루2호, 그리고 고온 내성이 없는 산조501호, 산조502호, 균흥135호의 유전체 서열을 분석하여 고온 내성 특이적 SNP를 발굴하고 이를 이용한 CAPS 마커를 개발하였다. 각 프라이머 쌍을 이용하여 상기의 5개 균주에서 마커 서열을 증폭한 후 제한효소를 처리하여 고온 내성을 지닌 표고버섯 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 고온 내성 특성을 지닌 표고버섯 품종을 판별하기 위한 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 고온 내성 특성을 지닌 표고버섯 품종을 빠르고 정확하게 판별할 수 있는 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 표고버섯 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용해 고온 내성 특성을 지닌 표고버섯 품종의 PCR 산물은 제한효소 처리에 따라 다른 표고버섯 품종들과 구분됨을 특징으로 한다.
본 발명은 서열번호 1의 148번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 4의 232번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 7의 215번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 10의 142번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 13의 133번째 뉴클레오타이드 위치 및 182번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 16의 183번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 19의 78번째 뉴클레오타이드 위치, 93번째 뉴클레오타이드 위치 및 94번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 또는 서열번호 22의 55번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 고온 내성 표고버섯 품종 판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제”는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “프라이머 세트”는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 또는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 고온 내성 표고버섯 품종 판별을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “키트”는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 더 포함하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “제한효소”는 Hpa Ⅱ, ScrF I, Alu I, Bgl Ⅱ, Nla Ⅲ 및 Hae Ⅲ 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및
(b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 148번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 4의 232번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 7의 215번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 10의 142번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 13의 133번째 및 182번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 16의 183번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 19의 78번째, 93번째 및 94번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 또는 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 22의 55번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 를 포함하는, 고온 내성 표고버섯 품종 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “(b) 단계”는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적서열을 증폭한 후, 증폭산물에 제한효소를 처리하여 결과물을 검출하는 과정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “프라이머 세트”는 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 21의 프라이머 세트; 또는 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “제한효소”는 Hpa Ⅱ, ScrF I, Alu I, Bgl Ⅱ, Nla Ⅲ 및 Hae Ⅲ 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 “결과물의 크기”는 5 bp, 89 bp 및 145 bp인 경우; 304 bp인 경우; 112 bp 및 214 bp인 경우; 329 bp인 경우; 179 bp 및 216 bp인 경우; 36 bp 및 156 bp인 경우; 또는 53 bp, 54 bp 및 252 bp인 경우 고온 내성 표고버섯으로 판별하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 고온 내성 특성을 지닌 표고버섯 품종을 판별할 수 있는 키트 조성물에 대해 제공하는 것이다. 표고버섯 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 제한효소를 이용하여 고온 내성을 지닌 표고버섯 품종과 내성이 없는 품종을 선별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
도 1은 표고버섯 5종에서 얻어낸 증폭 산물에 제한효소를 처리한 후 전기영동을 통해 구분한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에서 본 발명은 서열번호 1의 148번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 4의 232번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 7의 215번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 10의 142번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 13의 133번째 뉴클레오타이드 위치 및 182번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 16의 183번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 서열번호 19의 78번째 뉴클레오타이드 위치, 93번째 뉴클레오타이드 위치 및 94번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 또는 서열번호 22의 55번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 고온 내성 표고버섯 품종 판별용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 또는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 사용되는 용어 “단일염기다형성(SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 단일염기는 폴리뉴클레오티드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제"란, 시료에 포함된 해당 SNP를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머 또는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
일 측면에서, 상기 조성물을 포함하는 고온 내성 표고버섯 품종 판별을 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 더 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제한효소는 Hpa Ⅱ, ScrF I, Alu I, Bgl Ⅱ, Nla Ⅲ 및 Hae Ⅲ 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 고온 내성 표고버섯 품종 판별용 키트는 유전자 증폭 방식에 의해 실시될 수 있다.
본 명세서에서 유전자 증폭 키트를 설명하면서 기재된 용어, "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다.
다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195,4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA,WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다.
본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다. 본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 제한효소 처리하여 산물의 크기를 비교함으로써 표고버섯 품종을 구별한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 크기를 조사한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커”는 단일염기다형성(SNP) 중 제한효소 자리에 위치한 SNP를 일컫는다. CAPS 마커를 이용하는 경우 유전자좌에 특이적인 프라이머로 PCR 증폭을 한 후 제한효소로 잘라준 뒤 나타나는 다형성을 분석할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및 (b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 148번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 4의 232번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 7의 215번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 10의 142번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 13의 133번째 및 182번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 16의 183번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 19의 78번째, 93번째 및 94번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계; 또는 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 22의 55번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 고온 내성 표고버섯 품종 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 상기 키트와 동일한 방식, 프라이머 및/또는 제한효소를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
<실시예 1> 시퀀싱을 통한 고온 내성 표고버섯의 SNP 확인
고온 내성을 지닌 표고버섯 품종에 특이적인 SNP를 선별하기 위해 산마루1호, 산마루2호, 산조501호, 산조502호, 균흥135호 균주의 genomic DNA를 resequencing하여 표고버섯의 표준유전체 B17을 기준으로 서열을 정렬(alignment)하여 비교했다. DNA 추출 방법은 다음과 같다.
PDB배지에서 약 10일간 배양한 표고버섯 균사체를 미라클로스에 여과시킨 후 PBS버퍼(NaCl 135mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)를 부어 씻어내고 키친타올로 물기를 제거한다. 건조된 균사를 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후 GeneAll® GenEx™ Plant kit를 이용해 Genomic DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL버퍼 500ul를 넣고 65℃에서 10분간 가열해준 후 파이펫을 이용해 잘 섞어준다. 13000rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮겨준 후 PP버퍼를 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 섞어준다. 얼음에서 5분간 방치 후 13000rpm으로 5분간 원심분리한다. 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮기고 동량의 PCI(phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1)를 넣어준 후 뒤집어 섞어준다. 13000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮기고, 동량의 isopropanol을 넣어준 후 뒤집어 섞어 준다. 얼음에 10분간 방치 후 13000rpm에서 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1ml를 넣어 DNA 펠렛을 살짝 띄우고 13000rpm에서 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 13000rpm에서 1분간 한 번 더 원심분리한다. 남은 에탄올을 전부 제거하고 DNA 펠렛을 상온에서 5분간 건조시킨 후, RE버퍼 100ul를 넣어 DNA 펠렛을 녹인다.
서열 비교를 통해 산마루1호와 산마루2호에 특이적으로 존재하는 SNP를 선별했다 (표 1).
| #CHROM | POS | High-temperature | Effect | GENE | Desc | Marker | |
| Sensitive | Tolerant | ||||||
| Scaffold17 | 188726 | A | G | missense | GENE00389 | hypothetical protein BOTBODRAFT_177780 | RL-LE-306 |
| Scaffold8 | 297628 | G | A | synonymous | GENE03306 | ataxin-10-like protein | RL-LE-307 |
| Scaffold8 | 320954 | T | C | missense | slc16a10 | GENE03317.1 | RL-LE-310 |
| Scaffold8 | 321470 | C | T | missense | slc16a10 | GENE03317.1 | RL-LE-311 |
| Scaffold8 | 330914 | G | A | synonymous | GENE03321 | GENE03321.1 | RL-LE-312 |
| Scaffold8 | 330963 | A | G | intron variant | |||
| Scaffold8 | 338459 | T | C | missense | GENE03324 | - | RL-LE-314 |
| Scaffold8 | 342161 | T | G | missense | GENE03326 | rho guanine nucleotide exchange factor scd1 | RL-LE-316 |
| Scaffold8 | 342176 | A | T | missense | |||
| Scaffold8 | 342177 | C | T | missense | |||
| Scaffold8 | 362766 | T | C | missense | MNS3 | Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase MNS3 | RL-LE-319 |
<실시예 2>
표고버섯 염기서열 및 프라이머 제작
선별된 총 11개의 SNP는 8개의 missense SNP와 2개의 synonymous SNP, 그리고 intron 부위에 존재하는 1개의 SNP를 포함하고 있었다. 각 SNP를 중심으로 flanking sequence를 추출했고, SNP들의 위치를 고려하여 마커서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 제작했다. 마커 서열에 특이적인 제한효소를 동정하기 위해 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)를 이용했고, 제한효소의 이용 가능성과 비용에 기초하여 CAPS 마커 개발에 이용할 제한효소를 선별했다 (표 2).
| Primer name | Sequence (5'-3') | Product size (bp) | Restriction enzyme | Digested fragment size | |
| High-temperature sensitive |
High-temperature tolerant |
||||
| RL-LE-306 F | GGTAACAGTCGTCAGGTGAAAG | 239 | HpaII (+) | 5/234 | 5/89/145 |
| RL-LE-306 R | CTCCGGGATCAAAGGTTACTAC | ||||
| RL-LE-307 F | GAACCTAGCTAGACTGACGCAT | 304 | ScrFI (-) | 74/230 | 304 |
| RL-LE-307 R | GATAGATAGTCATACGGCCCTC | ||||
| RL-LE-310 F | ATTCGACTCTCTCTCTTCCTCC | 326 | AluI (+) | 326 | 112/214 |
| RL-LE-310 R | CTTCTTGTCCACTCTGAGTTCC | ||||
| RL-LE-311 F | GACTAGCAACAGGTTACCTCTCC | 330 | AluI (-) | 141/189 | 330 |
| RL-LE-311 R | CCTATACCACGAGAGAAGAGTAGG | ||||
| RL-LE-312 F | GACAGCCTACATGGTGATGAG | 329 | BglII (-) | 132/197 | 329 |
| RL-LE-312 R | CTAGTGTCAAGAATGCACTCCC | ||||
| RL-LE-314 F | GGGATACTACTTCTCTCCAACG | 395 | BglII (+) | 395 | 179/216 |
| RL-LE-314 R | CTACCGGACGACTGAACTTCT | ||||
| RL-LE-316 F | CTACACGCCTAGCTCAGAAGTT | 192 | NlaIII (-) | 36/61/95 | 36/156 |
| RL-LE-316 R | CTAACAGCTCTAGGATAGGCAGAC | ||||
| RL-LE-319 F | CTAAAACCCTTACCCTGTCCC | 359 | HaeIII (+) | 107/252 | 53/54/252 |
| RL-LE-319 R | GAGACGGTGATAAGATACCTCG | ||||
<실시예 3> 키트를 사용한 고온 내성을 지닌 표고버섯 품종 판별
고온 내성을 지닌 표고버섯 품종에서 증폭한 RL-LE-306은 HpaⅡ 제한효소에 의해 절단되어 5 bp, 89 bp, 145 bp 크기의 밴드로 나뉜 반면 고온 내성이 없는 표고버섯 품종의 경우에는 5 bp, 234 bp 크기의 밴드로 나뉘었다. RL-LE-307의 경우에는 제한효소 ScrFⅠ을 처리했을 때 고온 내성 표고버섯 품종에서는 제한효소에 의해 절단되지 않은 304 bp 크기의 밴드가, 고온 내성이 없는 표고버섯 품종에서는 74 bp, 230 bp 크기를 가진 2개의 밴드가 관찰되었다. 마커 서열 RL-LE-310, RL-LE-311의 경우 제한효소 AluⅠ을 처리하여 구분하는데, RL-LE-310의 경우 고온 내성 표고버섯 품종에서 112 bp, 214 bp의 2개 밴드, 고온 내성이 없는 표고버섯 품종에서는 제한효소에 의해 절단되지 않은 326 bp 크기의 밴드를 나타냈다. 또한 고온 내성 표고버섯 품종에서 증폭된 RL-LE-311의 경우에는 제한효소에 의해 절단되지 않은 329 bp 크기의 밴드가 관찰되었고 고온 내성이 없는 표고버섯 품종에서는 141, bp, 189 bp 크기를 가진 2개의 밴드가 관찰되었다. RL-LE-312, RL-LE-214 마커 서열의 경우에는 BglⅡ 제한효소를 이용하여 구분을 하는데, RL-LE-312의 경우 고온 내성이 없는 표고버섯 품종에서 증폭된 마커서열만을 절단하여 132 bp, 197 bp 크기의 2개 밴드를 나타냈고, 고온 내성을 지닌 표고버섯 품종에서는 329 bp 크기의 밴드를 나타냈다. RL-LE-314의 경우에는 고온 내성을 지닌 표고버섯 품종의 증폭산물만을 절단하여 179 bp, 216 bp 크기의 2개 밴드가 관찰되었고, 고온 내성이 없는 표고버섯 품종에서는 제한효소에 의해 절단되지 않은 395 bp 크기의 밴드가 관찰되었다. 마커 서열 RL-LE-316의 경우에는 고온 내성 품종 특이적인 SNP에 의해 마커 서열 내에 존재하는 2개 제한효소 NlaⅢ 인식 부위 중 하나가 소실되어 제한효소 처리 시 36 bp, 156 bp 크기를 가진 2개 밴드를 나타냈고, 고온 내성이 없는 품종의 경우에는 36 bp, 61 bp, 195 bp 크기를 가진 3개 밴드를 나타냈다. RL-LE-319의 경우에는 고온 내성 품종 특이적 SNP에 의해 마커 서열 내에 HaeⅢ 인식부위가 하나 더 생성되어 53 bp, 54 bp, 252 bp 크기의 3개 밴드가 관찰되었고, 고온 내성이 없는 품종의 경우에는 107 bp, 252 bp 크기를 가진 2개 밴드가 관찰되었다.
결과적으로 도 1은 제작된 프라이머 서열을 이용하여 상기 5개 균주에서 얻어낸 증폭 산물에 제한효소를 처리한 후 전기영동을 통해 구분한 결과이다. 개발한 8개 CAPS 마커를 이용하여 고온 내성을 지닌 표고 품종인 산마루1호와 산마루2호가 고온 내성이 없는 표고 품종인 산조501호, 산조502호, 균흥135호와 구분되는 것을 확인할 수 있다.
| 서열 번호 |
염기서열 | bp | |
| RL-LE-306의 염기서열 | 1 | GGTAACAGTCGTCAGGTGAAAGaaactcagagctaaaagcttcacgagcggagccaccaagtaaggcaaaaaaatacttcaaatagttgggtgattgctcgaatgattggaaatgacgcctaaaaggaatggtcttgaatgagtccg---A/G---gagcgaagagtcaattggttcatgtaaataccctaaaaggagctccttgacggtccactccttcatgtaGTAGTAACCTTTGATCCCGGAG | 239 |
| RL-LE-306 F | 2 | GGTAACAGTCGTCAGGTGAAAG | 22 |
| RL-LE-306 R | 3 | CTCCGGGATCAAAGGTTACTAC | 22 |
| RL-LE-307의 염기서열 |
4 | GAACCTAGCTAGACTGACGCATaacgagctcagagaatgctgtttcttcctttctttgatactacccgcatcgtctccgtcgtccgagtcatcgccatcccaaaagtaactgtgctgcacgagatctcgccacagcttgtgtatctccgtccacacctcgcctacaccaaactgtattctacagcgcaattgtagttgaggagctagtggattgtatgaaacgacaaacct---G/A---gtttctccatctttgcccagatctccggcaagcgcgtcaagagtttcacaGAGGGCCGTATGACTATCTATC | 304 |
| RL-LE-307 F | 5 | GAACCTAGCTAGACTGACGCAT | 22 |
| RL-LE-307 R | 6 | GATAGATAGTCATACGGCCCTC | 22 |
| RL-LE-310의 염기서열 | 7 | ATTCGACTCTCTCTCTTCCTCCccctcgtagcattgctctacattccctgcatgtcttatctatccgaatggttcaatcgcaagcgtggatttgctaatggcgcagtcttcgccggaacagcagtgggaggcatcctcctccccctcattttaccctcgttattatcctcacatggtcctcccaaaacattgcgaattctatccattgcaacag---T/C---tcttcttattgtacccctgcttcctctaatcaaaggccgtttgcctgaatctcgcatacgagccatgggaccaaccccacggggtcgagGGAACTCAGAGTGGACAAGAAG | 326 |
| RL-LE-310 F | 8 | ATTCGACTCTCTCTCTTCCTCC | 22 |
| RL-LE-310 R | 9 | CTTCTTGTCCACTCTGAGTTCC | 22 |
| RL-LE-311의 염기서열 | 10 | GACTAGCAACAGGTTACCTCTCCgataaaatcaatccctggctcttgggactctcaacattagcctccacatctgcagtaacatttatactttggggtgttttatcatataatctcgctggattgctatcgttcagtttag---C/T---ttacgggatcgttgctggaggctggtcgagcacatggaacgggtttattaagcctttgagcggtaagcagatgttttcatccactggtatcattctaaatattcgattaattccttcaaaccacaagtcaatgatccgaatctctccaccactctttttggagtCCTACTCTTCTCTCGTGGTATAGG | 330 |
| RL-LE-311 F | 11 | GACTAGCAACAGGTTACCTCTCC | 23 |
| RL-LE-311 R | 12 | CCTATACCACGAGAGAAGAGTAGG | 24 |
| RL-LE-312의 염기서열 | 13 | GACAGCCTACATGGTGATGAGaggaaatttacgagtttatgattgtgaacctacattttcgatgtcccgccagtcgtacggtatgagatttgcggtagagacgactacccgcaggcgacctgttttatagaa---G/A---atctactgtgtactgattagatccctgcaatgaccgatgcattgcaat---A/G---cataccagcataaactgtaaaaccgttagagaaaagttgaagccgactttcaacaaagacagcacaccttcatgtgcatacaaccatatccgcccctgagaaaaggcgttgttttgatccaatttGGGAGTGCATTCTTGACACTAG | 329 |
| RL-LE-312 F | 14 | GACAGCCTACATGGTGATGAG | 21 |
| RL-LE-312 R | 15 | CTAGTGTCAAGAATGCACTCCC | 22 |
| RL-LE-314의 염기서열 | 16 | GGGATACTACTTCTCTCCAACGtataggcgtagcagtgtattatttctctccgctgtggccttacaacgtttccactgtggtatccctcgacggtggaaacaatattactgtaaatttgatggatatgagcgctacccccgcaagcgttggttctcccctacagcatcttctgcagcaagat---T/C---tggactcactggactgtccaatagttcacatacgttgagtatgttcgtgttacaaggtctcaattatagtgatccaaatgtcaatgggtatattgtcgtcgatgggttcaagtgtgttcctcccattacttgttcaaattacgatctcatttcggtctcatgtatagcgtgaccattgatgatggagtacaAGAAGTTCAGTCGTCCGGTAG | 395 |
| RL-LE-314 F | 17 | GGGATACTACTTCTCTCCAACG | 22 |
| RL-LE-314 R | 18 | CTACCGGACGACTGAACTTCT | 21 |
| RL-LE-316의 염기서열 | 19 | CTACACGCCTAGCTCAGAAGTTatacaatgaacatgctcttacaaacccaccttgtacgcgcctaaattcagatcta---T/G---tgacacttgtaatg---A/T---C/T---atgtataggaatatgatccttgatataaagcgtgtcatttctggagggcggaatagaagccgaagacaccttgcGTCTGCCTATCCTAGAGCTGTTAG | 192 |
| RL-LE-316 F | 20 | CTACACGCCTAGCTCAGAAGTT | 22 |
| RL-LE-316 R | 21 | CTAACAGCTCTAGGATAGGCAGAC | 24 |
| RL-LE-319의 염기서열 | 22 | CTAAAACCCTTACCCTGTCCCcaccatcgctttttccagtaaactttgcgaggg---T/C---cgtgtattccatctgcaagcttgccatttcagcaagtattccaatctcggggccaactacatttccactaaggtaaaggtatttagttaatcggaggatggactttgaaactggggggatcacggtaggactggggctggcacccacacttactttgggtttaccccaaaagtggaaacccactaggggttgcgaagacatgatctagcttctcagcaagctcatccgcacgtctaagaaggaggtcgtcttttctaagagcatacgcagacagcagtcctcCGAGGTATCTTATCACCGTCTC | 359 |
| RL-LE-319 F | 23 | CTAAAACCCTTACCCTGTCCC | 21 |
| RL-LE-319 R | 24 | GAGACGGTGATAAGATACCTCG | 22 |
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
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high-temperature tolerant Pyogo mushroom cultivar
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<160> 24
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<210> 1
<211> 239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-306
<400> 1
ggtaacagtc gtcaggtgaa agaaactcag agctaaaagc ttcacgagcg gagccaccaa 60
gtaaggcaaa aaaatacttc aaatagttgg gtgattgctc gaatgattgg aaatgacgcc 120
taaaaggaat ggtcttgaat gagtccgaga gcgaagagtc aattggttca tgtaaatacc 180
ctaaaaggag ctccttgacg gtccactcct tcatgtagta gtaacctttg atcccggag 239
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-306 F
<400> 2
ggtaacagtc gtcaggtgaa ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-306 R
<400> 3
ctccgggatc aaaggttact ac 22
<210> 4
<211> 304
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-307
<400> 4
gaacctagct agactgacgc ataacgagct cagagaatgc tgtttcttcc tttctttgat 60
actacccgca tcgtctccgt cgtccgagtc atcgccatcc caaaagtaac tgtgctgcac 120
gagatctcgc cacagcttgt gtatctccgt ccacacctcg cctacaccaa actgtattct 180
acagcgcaat tgtagttgag gagctagtgg attgtatgaa acgacaaacc tggtttctcc 240
atctttgccc agatctccgg caagcgcgtc aagagtttca cagagggccg tatgactatc 300
tatc 304
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RL-LE-307 F
<400> 5
gaacctagct agactgacgc at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-307 R
<400> 6
gatagatagt catacggccc tc 22
<210> 7
<211> 326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-310
<400> 7
attcgactct ctctcttcct ccccctcgta gcattgctct acattccctg catgtcttat 60
ctatccgaat ggttcaatcg caagcgtgga tttgctaatg gcgcagtctt cgccggaaca 120
gcagtgggag gcatcctcct ccccctcatt ttaccctcgt tattatcctc acatggtcct 180
cccaaaacat tgcgaattct atccattgca acagttcttc ttattgtacc cctgcttcct 240
ctaatcaaag gccgtttgcc tgaatctcgc atacgagcca tgggaccaac cccacggggt 300
cgagggaact cagagtggac aagaag 326
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-310 F
<400> 8
attcgactct ctctcttcct cc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-310 R
<400> 9
cttcttgtcc actctgagtt cc 22
<210> 10
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-311
<400> 10
gactagcaac aggttacctc tccgataaaa tcaatccctg gctcttggga ctctcaacat 60
tagcctccac atctgcagta acatttatac tttggggtgt tttatcatat aatctcgctg 120
gattgctatc gttcagttta gcttacggga tcgttgctgg aggctggtcg agcacatgga 180
acgggtttat taagcctttg agcggtaagc agatgttttc atccactggt atcattctaa 240
atattcgatt aattccttca aaccacaagt caatgatccg aatctctcca ccactctttt 300
tggagtccta ctcttctctc gtggtatagg 330
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-311 F
<400> 11
gactagcaac aggttacctc tcc 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-311 R
<400> 12
cctataccac gagagaagag tagg 24
<210> 13
<211> 329
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-312
<400> 13
gacagcctac atggtgatga gaggaaattt acgagtttat gattgtgaac ctacattttc 60
gatgtcccgc cagtcgtacg gtatgagatt tgcggtagag acgactaccc gcaggcgacc 120
tgttttatag aagatctact gtgtactgat tagatccctg caatgaccga tgcattgcaa 180
tacataccag cataaactgt aaaaccgtta gagaaaagtt gaagccgact ttcaacaaag 240
acagcacacc ttcatgtgca tacaaccata tccgcccctg agaaaaggcg ttgttttgat 300
ccaatttggg agtgcattct tgacactag 329
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-312 F
<400> 14
gacagcctac atggtgatga g 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-312 R
<400> 15
ctagtgtcaa gaatgcactc cc 22
<210> 16
<211> 395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-314
<400> 16
gggatactac ttctctccaa cgtataggcg tagcagtgta ttatttctct ccgctgtggc 60
cttacaacgt ttccactgtg gtatccctcg acggtggaaa caatattact gtaaatttga 120
tggatatgag cgctaccccc gcaagcgttg gttctcccct acagcatctt ctgcagcaag 180
atttggactc actggactgt ccaatagttc acatacgttg agtatgttcg tgttacaagg 240
tctcaattat agtgatccaa atgtcaatgg gtatattgtc gtcgatgggt tcaagtgtgt 300
tcctcccatt acttgttcaa attacgatct catttcggtc tcatgtatag cgtgaccatt 360
gatgatggag tacaagaagt tcagtcgtcc ggtag 395
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-314 F
<400> 17
gggatactac ttctctccaa cg 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-314 R
<400> 18
ctaccggacg actgaacttc t 21
<210> 19
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-316
<400> 19
ctacacgcct agctcagaag ttatacaatg aacatgctct tacaaaccca ccttgtacgc 60
gcctaaattc agatctattg acacttgtaa tgacatgtat aggaatatga tccttgatat 120
aaagcgtgtc atttctggag ggcggaatag aagccgaaga caccttgcgt ctgcctatcc 180
tagagctgtt ag 192
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-316 F
<400> 20
ctacacgcct agctcagaag tt 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-316 R
<400> 21
ctaacagctc taggataggc agac 24
<210> 22
<211> 359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-319
<400> 22
ctaaaaccct taccctgtcc ccaccatcgc tttttccagt aaactttgcg agggtcgtgt 60
attccatctg caagcttgcc atttcagcaa gtattccaat ctcggggcca actacatttc 120
cactaaggta aaggtattta gttaatcgga ggatggactt tgaaactggg gggatcacgg 180
taggactggg gctggcaccc acacttactt tgggtttacc ccaaaagtgg aaacccacta 240
ggggttgcga agacatgatc tagcttctca gcaagctcat ccgcacgtct aagaaggagg 300
tcgtcttttc taagagcata cgcagacagc agtcctccga ggtatcttat caccgtctc 359
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-319 F
<400> 23
ctaaaaccct taccctgtcc c 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RL-LE-319 R
<400> 24
gagacggtga taagatacct cg 22
Claims (11)
- 서열번호 1의 148번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
서열번호 4의 232번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
서열번호 7의 215번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
서열번호 10의 142번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
서열번호 13의 133번째 뉴클레오타이드 위치 및 182번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
서열번호 16의 183번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
서열번호 19의 78번째 뉴클레오타이드 위치, 93번째 뉴클레오타이드 위치 및 94번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위; 또는
서열번호 22의 55번째 뉴클레오타이드 위치의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위;
를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별용 바이오마커 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별용 바이오마커 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트;
서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트;
서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머 세트;
서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트;
서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트;
서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트;
서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 또는
서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는,
고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별용 바이오마커 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별을 위한 키트.
- 제4항에 있어서,
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 더 포함하는 키트. - 제5항에 있어서,
상기 제한효소는 Hpa Ⅱ, ScrF I, Alu I, Bgl Ⅱ, Nla Ⅲ 및 Hae Ⅲ 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트. - (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및
(b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 148번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 4의 232번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 7의 215번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 10의 142번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 13의 133번째 및 182번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 16의 183번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 19의 78번째, 93번째 및 94번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 22의 55번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계;
를 포함하는, 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별 방법. - 제7항에 있어서,
상기 (b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적서열을 증폭한 후, 증폭산물에 제한효소를 처리하여 결과물을 검출하는 과정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별 방법. - 제8항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트;
서열번호 5 및 6의 프라이머 세트;
서열번호 8 및 9의 프라이머 세트;
서열번호 11 및 12의 프라이머 세트;
서열번호 14 및 15의 프라이머 세트;
서열번호 17 및 18의 프라이머 세트;
서열번호 20 및 21의 프라이머 세트; 또는
서열번호 23 및 24의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별 방법. - 제8항에 있어서,
상기 제한효소는 Hpa Ⅱ, ScrF I, Alu I, Bgl Ⅱ, Nla Ⅲ 및 Hae Ⅲ 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별 방법. - 제8항에 있어서,
상기 결과물의 크기가 5 bp, 89 bp 및 145 bp인 경우;
304 bp인 경우;
112 bp 및 214 bp인 경우;
329 bp인 경우;
179 bp 및 216 bp인 경우;
36 bp 및 156 bp인 경우; 또는
53 bp, 54 bp 및 252 bp인 경우;
고온 내성 표고버섯으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 고온 내성 표고버섯 품종인 산마루 1호 및 산마루 2호 판별 방법.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020210107819A KR102605843B1 (ko) | 2021-08-17 | 2021-08-17 | 고온 내성 특성을 지니는 표고버섯 품종 판별을 위한 caps 마커 조성물 및 이의 용도 |
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ID=85330036
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| KR101971591B1 (ko) | 2017-07-13 | 2019-04-24 | 산림조합중앙회 | 표고버섯 품종 판별용 ssr 마커 및 이의 용도 |
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2021
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Patent Citations (3)
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