KR101905980B1

KR101905980B1 - 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101905980B1
Application number: KR1020160125768A
Authority: KR
Inventors: 류호진; 문수윤; 정종욱; 구창덕; 이화용
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2018-10-08
Also published as: KR20180035543A

Abstract

본 발명은 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호를 판별할 수 있는 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하면 중국에서 배지상태로 수입되고 있는 향고 808 품종을 판별할 수 있고, 이에 따라 불법 유통되어 재배되고 있는 향고 808에 대한 확인이 가능하며, 시료로부터 향고 808과 우리나라에서 개발된 산마루 1호, 산조 705호를 신속 정확하게 구분할 수 있다.

Description

표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer Sets for Discrimination of Shiitake Mushroom Cultivar Comprising Hyanggo-808, Sanmaru-1 and Sanjo-705 and Use Thereof}

본 발명은 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

중국 식용균 협회(中食用菌所)에서 2012년에 발표한 중국 식용균 총생산량 통계에 의하면, 인공 재배 식용균 품종 중, 표고버섯은 연생산량이 느타리버섯 다음으로 2위를 차지하는 품종이다. 그리고 중국은 세계에서 가장 큰 표고버섯 생산국이며, 최근에는 중국 표고버섯 재배지역과 규모가 끊임없이 확대되고 있다. 2012년 중국의 총생산량은 635만 톤으로 세계 총 생산량의 70% 이상을 차지했다. 2013년 10월 현재 표고버섯은 중국 버섯제품 전체 수출 물량의 30%를 차지하였다.

2015년 12월 11일 우리나라에서는 농수산물 원산지표시 요령 일부개정(안)이 재행정예고 되었다. 이는 국내에서 수입산 톱밥배지로 생산한 표고의 원산지를 국내산으로 본다는 것이다. 현재 우리나라에 수입되고 있는 표고버섯의 톱밥배지는 계속 늘어나고 있는 상황이고, 중국에서 들어오는 표고톱밥배지는 향고 808 품종이 주를 이루고 있는 것으로 판단되고 있다.

표고버섯은 참나무류 톱밥을 이용하여 종균을 만든 후, 이것을 또 참나무류 톱밥에 접종하여 톱밥배지 상태로 또는 나무에 접종하여 자실체를 생산한다. 따라서 중국으로부터 수입되고 있는 표고버섯 배지는 종균으로도 이용될 수 있는 것이다. 우리나라에서는 처음으로 수입되는 품종의 종자를 판매하거나 보급하기위해 수입할 경우 종자산업법에 따라 반드시 “수입적응성시험”을 이행해야하고, 품종의 종자를 생산하거나 수입하여 판매를 하려는 경우 반드시 “품종의 생산·수입 판매신고”를 해야 한다. 하지만 국내로 들어오는 중국산 표고톱밥배지는 국내 시장에서 문제가 되고 있어 2015년 국립품종관리센터에서 수입표고버섯종균 접종 배지를 불법 판매한 업체를 적발하여 경찰에 고발하는 일이 발생하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허공보 10-2016-0098969

Won-Mok Park et al., The Korean Journal of Mycology Vol. 25, No 3, p176-190 Sep. 1997

본 발명자들은 표고버섯 가운데 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 품종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 표고버섯 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 품종을 구별 가능한 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 PCR을 실시함으로써 시료(바람직하게는, 버섯톱밥배지, 버섯 종균, 버섯)로부터 상기 3종에 대한 표고버섯 품종을 판별할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 표고버섯 품종 판별 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트로 구성된 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명자들은 표고버섯 가운데 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 품종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고 그 결과, 표고버섯 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호 품종을 구별 가능한 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 PCR을 실시함으로써 시료(바람직하게는, 버섯톱밥배지, 버섯 종균, 버섯)로부터 상기 3종에 대한 표고버섯 품종을 판별할 수 있음을 규명하였다.

하기 실시예에서 확인하는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 시료로부터 중국의 표고버섯 품종 향고 808과 한국의 표고 품종인 산마루 1호 및 산조 705호를 쉽고 빠르게 판별할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 표고버섯 품종 판별 방법을 제공한다:

(a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) 추출된 DNA를 주형으로 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계; 및

(c) PCR 산물의 크기를 분석하여 표고버섯의 품종을 판별하는 단계.

상기 (a) 단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

표고버섯 품종 판별을 위해 DNA를 추출하는 시료는 표고버섯 배지, 표고버섯 종균, 표고버섯일 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 버섯에서 추출된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg²⁺가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg² ⁺가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 실시하는 PCR 조건은 90 내지 97℃, 2 내지 7분간 반응하고 다시 90 내지 97℃에서 20초 내지 1분, 56 내지 60℃에서 20초 내지 1분, 72℃ 200초 내지 1분으로 30 내지 40 사이클로 증폭하고 72℃ 20분간 추가로 반응시켜 실시할 수 있으나, 당업자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.

상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 상기 (b) 단계에서 PCR을 수행한다.

표 2를 참조하여 설명하면, 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트(RL-LE-003 프라이머 세트)를 이용하여 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호에 대해 PCR 증폭을 실시할 경우, 증폭된 PCR 산물은 각각 182 bp, 194 bp 및 194 bp의 크기를 나타낸다. 또한, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트(RL-LE-012 프라이머 세트)를 이용하여 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호에 대해 PCR 증폭을 실시할 경우, 증폭된 PCR 산물은 각각 197 bp, 184 bp 및 195 bp의 크기를 나타낸다.

따라서, 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 182 bp이고 제2프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 197 bp인 경우, 표고버섯의 품종은 향고 808, 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 194 bp이고 제2프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 184 bp인 경우, 표고버섯의 품종은 산마루 1호, 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 194 bp이고 제2프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 195 bp인 경우, 표고버섯의 품종은 산조 705호인 것으로 판별한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호를 판별할 수 있는 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명을 이용하면 중국에서 배지상태로 수입되고 있는 향고 808 품종을 판별할 수 있고, 이에 따라 불법 유통되어 재배되고 있는 향고 808에 대한 확인이 가능하며, 시료로부터 향고 808과 우리나라에서 개발된 산마루 1호, 산조 705호를 신속 정확하게 구분할 수 있다.

도 1은 프라이머 서열을 이용한 PCR 방법으로 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호를 결정할 수 있는 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 프라이머 세트에 대한 각 표고버섯 품종(품종 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호)들의 단편 분석 결과를 나타낸다.
(a) RL-LE-003 향고 808, (b) RL-LE-003 산마루1호, (c) RL-LE-003 산조 705호, (d) RL-LE-012 향고 808, (e) RL-LE-012 산마루 1호, (f) RL-LE-012 산조 705호.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 표고버섯 품종 판별을 위한 프라이머 제작

표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호, 산조 705호를 판별하기 위해 상기 3개 품종이 구분되는 염기서열을 찾았고, 이를 이용하여 프라이머를 제작하였다(도 1).

품종구분을 위한 프라이머 서열

프라이머	서열(5’-3’)
RL-LE-003F	CGTTTGCTTGCCCTTTTC
RL-LE-003R	GGGAGATACCAACACCACTACTAC
RL-LE-012F	CTGAAGACGTGGAAAAACGC
RL-LE-012R	GCGTCAGCTTCTTACTCCTTAC

실시예 2: 제작된 프라이머를 이용한 표고버섯 품종 판별

PDB 배지에서 배양한 표고버섯 품종 향고 808, 산마루 1호, 산조 705호의 균사를 미라클로스에 여과시킨 후 PBS 버퍼(NaCl 135 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄ 4.3 mM, KH₂PO₄ 1.4 mM)를 부어 씻어내고 키친타올로 물기를 제거하였다. 건조된 균사를 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후 GeneAll® GenEx™ Plant kit를 이용해 Genomic DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL 버퍼 500 μl를 넣고 65℃에서 10분간 가열해준 후 파이펫을 이용해 잘 섞어주었다. 13,000 rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮겨준 후 PP 버퍼를 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 섞어주었다. 얼음에서 5분간 방치 후 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮기고 동량의 PCI(phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1)를 넣어준 후 뒤집어 섞어주었다. 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮기고, 동량의 이소프로파놀을 넣어준 후 뒤집어 섞어주었다. 얼음에 10분간 방치 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1 ml를 넣어 DNA 펠렛을 살짝 띄우고 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 13,000 rpm에서 1분간 한 번 더 원심분리하였다. 남은 에탄올을 전부 제거하고 DNA 펠렛을 상온에서 5분간 건조시킨 후, RE 버퍼 100 μl를 넣어 DNA 펠렛을 녹였다. 추출한 Genomic DNA 20 ng을 주형으로 본 발명에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 3분, 다시 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 35사이클을 증폭한 후, 추가로 72℃에서 20분간 반응시킴으로써 수행되었다.

상기 프라이머들에 의해 향고 808, 산마루 1호, 산조 705호가 구분되는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 각 품종에 따라 프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기는 표 2와 같다.

PCR 산물의 크기

품종	RL-LE-003 프라이머 세트	RL-LE-012 프라이머 세트
향고808	182	197
산마루1호	194	184
산조705호	194	195

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer Sets for Discrimination of Shiitake Mushroom Cultivar Comprising Hyanggo-808, Sanmaru-1 and Sanjo-705 and Use Thereof <130> PN160319 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> RL-LE-003F <400> 1 cgtttgcttg cccttttc 18 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> RL-LE-003R <400> 2 gggagatacc aacaccacta ctac 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> RL-LE-012F <400> 3 ctgaagacgt ggaaaaacgc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> RL-LE-012R <400> 4 gcgtcagctt cttactcctt ac 22

Claims

서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트로 구성된 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트로서 상기 표고버섯 품종은 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 표고버섯 품종인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
삭제
서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트로서 상기 표고버섯 품종은 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 표고버섯 품종인 것을 특징으로 하는 표고버섯 품종 판별용 키트.
다음 단계를 포함하는 향고 808, 산마루 1호 및 산조 705호로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 표고버섯 품종을 판별하는 방법:
(a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 DNA를 주형으로 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계; 및
(c) PCR 산물의 크기를 분석하여 표고버섯의 품종을 판별하는 단계.
제 4 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 (i) 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 182 bp이고 제2프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 197 bp인 경우, 표고버섯의 품종은 향고 808이고, (ⅱ) 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 194 bp이고 제2프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 184 bp인 경우, 표고버섯의 품종은 산마루 1호이며, (ⅲ) 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 194 bp이고 제2프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기가 195 bp인 경우, 표고버섯의 품종은 산조 705호인 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법.