KR101790771B1 - 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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문수윤
정종욱
구창덕
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호를 판별할 수 있는 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공한다. 본 발명을 이용하여 상기 표고버섯 15개 품종을 신속 정확하게 구분할 수 있으며, 개발한 표고버섯 품종의 보호 및 균주들간의 구별 및 품종의 불법유통을 막을 수 있다.

Description

표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer Sets for Discrimination of Shiitake Mushroom Cultivar and Use Thereof}
본 발명은 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
표고버섯은 2014년 국내 임산버섯 생산량의 약 91%, 약 1,858억 원을 차지하고 있고, 그 독특한 맛과 향기 때문에 동서양의 요리 재료로 사용될 뿐만 아니라 항종양효과, 항바이러스 효과 등 의학적 가치가 입증되고 있다. 국내의 표고버섯 생산량과 생산액은 그동안 꾸준히 증가해 왔으며, 2011년에는 37,000여 톤 생산으로 약 2,220여억 원의 생산액을 기록하였다.
현재 한중 FTA의 영향으로 중국산 표고의 수입이 증가하고 있고, 표고의 생산량보다 소비량이 많은 일본에서 중국산 표고보다 한국산을 선호하고 있어, 동북아 3국의 표고버섯 시장이 급속히 변화하고 있다. 이에 따라 직접적인 버섯의 수출입 이외에 품종의 수출도 이루어 질 것으로 판단된다. 그리고 2010년 10월 제 10차 생물다양성협약 당사국 총회를 통해 나고야 의정서가 채택됨에 따라 각국은 현재 보유하고 있는 유전자원에 대한 보호를 강화할 것으로 생각된다.
현재 국내의 종자원에 등록된 표고버섯 품종은 49개이고 이중 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 출원한 품종은 총 21개로 약 43%를 차지하고 있다. 따라서 국내에서 보급되고 있는 표고버섯 품종 중 산림버섯연구센터에서 개발한 품종을 SSR 마커로 구분하는 것은 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입품종과의 구별에 있어 매우 중요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허공보 10-2016-0098969
Won-Mok Park et al., The Korean Journal of Mycology Vol. 25, No 3, p176-190 Sep. 1997
본 발명자들은 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 표고버섯 15개 품종을 구별 가능한 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 PCR을 실시함으로써 시료(바람직하게는, 버섯톱밥배지, 버섯 종균, 버섯)로부터 상기 15종에 대한 표고버섯 품종을 판별할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 표고버섯 품종 판별 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트로 구성된 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명자들은 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고 그 결과, 상기 표고버섯 15개 품종을 구별 가능한 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 PCR을 실시함으로써 시료(바람직하게는, 버섯톱밥배지, 버섯 종균, 버섯)로부터 상기 15종에 대한 표고버섯 품종을 판별할 수 있음을 규명하였다.
하기 실시예에서 확인하는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 시료로부터 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호를 쉽고 빠르게 판별할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트로 구성된 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 제1프라이머 세트 내지 제5프라이머 세트 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 표고버섯 품종 판별 방법을 제공한다:
(a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 DNA를 주형으로 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트로 구성된 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계; 및
(c) PCR 산물의 크기를 분석하여 표고버섯의 품종을 판별하는 단계.
상기 (a) 단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
표고버섯 품종 판별을 위해 DNA를 추출하는 시료는 표고버섯 배지, 표고버섯 종균, 표고버섯일 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 버섯에서 추출된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 실시하는 PCR 조건은 90 내지 97℃, 3 내지 7분간 반응하고 다시 90 내지 97℃에서 20초 내지 1분, 56 내지 58℃에서 20초 내지 1분, 72℃ 30초 내지 1분으로 30 내지 40 사이클로 증폭하고 72℃ 5분간 추가로 반응시켜 실시할 수 있으나, 당업자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 상기 (b) 단계에서 PCR을 수행한다.
본 발명의 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트를 이용하여 표고버섯 품종 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호, 산조 710호에 대해 PCR 증폭을 실시할 경우, 증폭된 PCR 산물의 크기는 표 2와 같다.
각 프라이머 세트로부터 증폭된 PCR 산물의 크기를 분석하여 표고버섯의 품종을 판별한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호를 판별할 수 있는 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명을 이용하여 상기 표고버섯 15개 품종을 신속 정확하게 구분할 수 있으며, 개발한 표고버섯 품종의 보호 및 균주들간의 구별 및 품종의 불법유통을 막을 수 있다.
도 1은 프라이머 서열을 이용한 PCR 방법으로 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호, 산조 710호를 결정할 수 있는 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 프라이머 세트에 대한 표고버섯 15개 품종의 단편 분석 결과를 나타낸다.
(a) RL-LE-001 산조101호 (162bp), (b) RL-LE-001 산조103호 (160/182bp), (c) RL-LE-001 산조109호 (157bp), (d) RL-LE-001 산조302호 (160bp), (e) RL-LE-001 산조501호 (167bp), (f) RL-LE-004 산조110호 (194bp), (g) RL-LE-004 산조706호 (183bp), (h) RL-LE-005 산조702호 (200bp), (i) RL-LE-005 산조704호 (200/209bp), (j) RL-LE-007 산조102호 (178/198bp), (k) RL-LE-007 산조108호 (201bp), (l) RL-LE-007 산조111호 (200bp), (m) RL-LE-010 산조301호 (198/212bp), (n) RL-LE-010 산조709호 (203/215bp), (o) RL-LE-010 산조710호 (199/253bp).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 표고버섯 품종 판별을 위한 프라이머 제작
산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호, 산조 710호를 판별하기 위해 상기 15개 품종이 구분되는 염기서열을 찾았고, 이를 이용하여 프라이머를 제작하였다(도 1).
품종구분을 위한 프라이머 서열
프라이머 서열(5’-3’)
RL-LE-001F GTGTGACAGATTACACGGGTC
RL-LE-001R ACTCAAGTAGGTCCAAGTCGC
RL-LE-004F TGAGCTATGGTGCTACTCCTTC
RL-LE-004R GCGCCTATATCCGATGGT
RL-LE-005F GGCAGAACAGAACCTAGCTCAT
RL-LE-005R AGTCCATATGGCTTCCACCT
RL-LE-007F CTACCACTCGTCACTCCTTAGGT
RL-LE-007R GAAGGAGTGTGAAGCTGAAACC
RL-LE-010F GTAAGCTCATGGTAACAGTGCC
RL-LE-010R AACTTGGAAGCCTTCTCCC
실시예 2: 제작된 프라이머를 이용한 표고버섯 품종 판별
PDB 배지에서 배양한 표고버섯 품종 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호, 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호, 산조 710호의 균사를 미라클로스에 여과시킨 후 PBS 버퍼(NaCl 135 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM, KH2PO4 1.4 mM)를 부어 씻어내고 키친타올로 물기를 제거하였다. 건조된 균사를 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후 GeneAll® GenEx™ Plant kit를 이용해 Genomic DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL 버퍼 500 μl를 넣고 65℃에서 10분간 가열해준 후 파이펫을 이용해 잘 섞어주었다. 13,000 rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮겨준 후 PP 버퍼를 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 섞어주었다. 얼음에서 5분간 방치 후 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮기고 동량의 PCI(phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1)를 넣어준 후 뒤집어 섞어주었다. 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮기고, 동량의 이소프로파놀을 넣어준 후 뒤집어 섞어주었다. 얼음에 10분간 방치 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1 ml를 넣어 DNA 펠렛을 살짝 띄우고 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 13,000 rpm에서 1분간 한 번 더 원심분리하였다. 남은 에탄올을 전부 제거하고 DNA 펠렛을 상온에서 5분간 건조시킨 후, RE 버퍼 100 μl를 넣어 DNA 펠렛을 녹인다. 추출한 Genomic DNA 20ng을 주형으로 본 발명에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 3분, 다시 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 35사이클을 증폭한 후, 추가로 72℃에서 20분간 반응시킴으로써 수행되었다.
상기 프라이머들에 의해 상기 15개 품종이 구분되는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 각 품종에 따라 프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물의 크기는 표 2와 같다. 상기 각 프라이머에서 대표적으로 구분되는 품종을 나타냈다(도 2).
PCR 산물의 크기
품종 RL-LE-001
프라이머 세트		 RL-LE-004
프라이머 세트		 RL-LE-005
프라이머 세트		 RL-LE-007
프라이머 세트		 RL-LE-010
프라이머 세트
산조101호 162 - 200/210 201 198/213
산조102호 161/169 185 201/204 178/198 198/210
산조103호 160/182 - 209 - 198/210
산조108호 159 - 200/209 201 198/210
산조109호 157 186 199 200 191/203
산조110호 159/167 194 200/209 197 201/215
산조111호 156 188 200/209 200 198/212
산조301호 160/165 191 197/207 201 198/212
산조302호 160 - 200/209 200 198/210
산조501호 167 - 200/206 186/201 202/214
산조702호 160 - 200 183/197 203/214
산조704호 159 188 200/209 201 198/212
산조706호 158 183 199/209 203 203/214
산조709호 159 191 200/209 203 203/215
산조710호 161 - 199 178/198 199/253
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer Sets for Discrimination of Shiitake Mushroom Cultivar and Use Thereof <130> PN160322 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> RL-LE-001F <400> 1 gtgtgacaga ttacacgggt c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> RL-LE-001R <400> 2 actcaagtag gtccaagtcg c 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> RL-LE-004F <400> 3 tgagctatgg tgctactcct tc 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> RL-LE-004R <400> 4 gcgcctatat ccgatggt 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> RL-LE-005F <400> 5 ggcagaacag aacctagctc at 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> RL-LE-005R <400> 6 agtccatatg gcttccacct 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> RL-LE-007F <400> 7 ctaccactcg tcactcctta ggt 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> RL-LE-007R <400> 8 gaaggagtgt gaagctgaaa cc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> RL-LE-010F <400> 9 gtaagctcat ggtaacagtg cc 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> RL-LE-010R <400> 10 aacttggaag ccttctccc 19

Claims (4)

  1. 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트로 구성된 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트로서 상기 표고버섯 품종은 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 표고버섯 품종인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트로서 상기 표고버섯 품종은 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 표고버섯 품종인 것을 특징으로 하는 표고버섯 품종 판별용 키트.
  4. 다음 단계를 포함하는 산조 101호, 산조 102호, 산조 103호, 산조 108호, 산조 109호, 산조 110호, 산조 111호 산조 301호, 산조 302호, 산조 501호, 산조 702호, 산조 704호, 산조 706호, 산조 709호 및 산조 710호로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 표고버섯 품종을 판별하는 방법:
    (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 DNA를 주형으로 서열목록 제1서열 및 제2서열의 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 제2프라이머 세트, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 제3프라이머 세트, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 제4프라이머 세트 및 서열목록 제9서열 및 제10서열의 제5프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계; 및
    (c) PCR 산물의 크기를 분석하여 표고버섯의 품종을 판별하는 단계.
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Non-Patent Citations (3)

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Title
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