KR100765412B1

KR100765412B1 - 제한효소절편길이다형성법을 이용한 녹용의 종간 유전자감별 키트

Info

Publication number: KR100765412B1
Application number: KR1020050080659A
Authority: KR
Inventors: 서정철; 임강현; 정주호; 신동훈; 최강덕; 양재하; 김상찬; 정승기; 이상훈; 김용석
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2005-08-31
Publication date: 2007-10-09
Also published as: KR20070024973A

Abstract

본 발명은 제한효소절편길이다형성 (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)법에 의한 녹용의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것으로써, 상세하게는 제한효소 절편 길이 다형성 법에 의하여 매화록 (Cervus Nippon Temminck), 마록 (Cervus elaphus), 대록 (Cervus canadensis) 및 순록 (Rangifer Tarandus)의 유전자형을 분석하고, 녹용의 종간 특이적 제한효소를 이용하여 녹용의 종간 연관성과 유전적 변이를 평가하기 위한 감별 키트에 관한 것이다. 본 발명의 감별 키트를 통하여 녹용의 종을 판별함으로써 정확한 녹용 원료를 공급할 수 있으며, 녹용의 품질관리 방법으로 활용할 수 있다.

녹용, 매화록, 마록, 대록, 순록, 제한효소 절편 길이 다형성, 감별 키트

Description

제한효소절편길이다형성법을 이용한 녹용의 종간 유전자 감별 키트 {A kit for discriminating genetical identification among Cervus species by Restriction Fragment Length Polymorphism method}

도 1 은 녹용의 종간 특이적 제한효소의 절단부분과 결과물의 실험계획안을 나타낸 도이고,

도 2 는 녹용 및 순록에 대한 제한효소 절편 길이 다형성 법을 수행한 결과를 아가로스 겔로 확인한 도이다.

본 발명은 제한효소절편길이다형성법 (RFLP method)에 의한 녹용의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것이다.

녹용 (Cornu Cervi Pantotrichum)은 녹과 (사슴과 ; Cervidae)에 속한 동물인 매화록 (梅花鹿, Cervus nippon Temminck), 마록 (馬鹿, C. elephus L.) 및 동속 근연동물의 미골화 (未骨化)된 어린 뿔을 잘라 건조한 것으로, 신농본초경 (神農本草經) 상품 (上品)에 “주루하악혈 (主漏下惡血), 한열경간 (寒熱驚癎), 익기강지 (益氣强志), 생치불로 (生齒不老).”라고 처음 기재된 이래, 달고 따뜻한 성미 (性味)와 장원양 (壯元陽), 보기혈 (補氣血), 익정수 (益精髓), 강근골 (强筋骨)의 효능으로 임상에서 상용되는 한약재이다 (지형준 외, 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해 제2개정, 한국메디칼인덱스사, 서울, pp154-155, 1999 ; 전국한의과대학 본초학교수 공편저, 본초학, 영림사, 서울, pp545-546, 1991).

국내에서 소비되는 녹용은 마록 (Cervus elaphus), 매화록 (Cervus Nippon Temminck) 및 대록 (Cervus canadensis) 등이 있으며, 이 중 주로 마록과 대록이 사용되고 있는데, 주로 뉴질랜드를 중심으로, 러시아, 중국, 캐나다 등에서 수입되고 있다 (한대석, 녹용의 생산 및 유통현황, 녹용에 관한 심포지움, pp1-11, 1996).

녹용의 수입량은 1978년에 1,913 ㎏에서 1983년 22,339 ㎏, 1988년 44,428 ㎏, 1993년 117,582 ㎏으로 점차 증가하고 있으며, 90년대 들어 우리나라의 평균 녹용 소비량은 전세계 생산량 175톤 중 140톤을 차지하고 있다. 95년도 국내 녹용 수입규모는 4,275만 달러로 전세계 녹용 무역량 5,350만 달러의 79.9 %를 차지하여, 우리나라가 전세계 녹용 생산량의 80 %를 소비하는 최대 소비국으로 나타났다. 1993년의 품종별 수입현황을 보면, 러시아에서 원용 (元茸) 17,592 ㎏, 매화록 98 ㎏, 순록 (馴鹿茸) 8,332 ㎏이 수입되었고, 중국에서 마록 17,128 ㎏, 매화록 5,512 ㎏이 수입되었으며, 뉴질랜드에서 적록 (赤鹿茸) 66,609 ㎏, 미국에서 대록 1,761 ㎏, 마록 400 ㎏이 수입되어, 그 품목이 원용, 매화록, 순록, 적록, 대록 등 매우 다양함을 알 수 있다 (한대석, 녹용의 생산 및 유통현황, 녹용에 관한 심포지움, pp1-11, 1996 ; 강희정, 일부지역의 녹용 복용율과 인식도 분석, 중앙대학교 사회개발대학원 석사학위논문, 1996).

녹용으로 사용되는 종들은 이렇게 매우 다양한데도 불구하고, 현재 녹용은 대부분 형태적으로 동정 (identification)되고 있다. 전형 (whole form)으로 유통될 때는 그 감별이 그래도 수월한 편이나, 절편된 상태에서는 그 형태가 매우 유사하여 전문가라도 정확한 감별을 하기가 쉽지 않다.

녹용에 대하여 진 등 (진대현 et al., 中藥材, 22(9), pp441-444, 1999 ; 진대현 et al., 中藥材, 22(10), pp504-506, 1999)의 형태학적 감별법에 대한 보고가 있기는 하지만, 그 서술은 매우 주관적이어서 이를 통하여 감별한다는 것은 쉬운 일이 아니다.

한약재의 감별에 대한 연구로 방풍류 한약재 (최호영 et al., 생약학회지, 28(1), pp1-8, 1997) 및 인삼류 한약재 (최호영, 대한본초학회지, 13(1), pp147-159, 1998)에서 각각 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) 방법과 RFLP (restriction flagment length polymorphism) 방법을 이용하여 그 감별방법의 타당성을 제시한 바 있으며, 녹용의 유전자 감별에 관한 연구로 왕 등 (왕건운 et al., 중국중약잡지, 22(10), pp597-583, 1997)은 녹편 및 녹용류의 털과 피에서 DNA를 추출하여, 염기서열을 분석한 결과 염기서열의 분석법은 동물류 약재의 감별에 유용할 것임을 제시하였고, 드래취 등 (Dratch P et al., R. Soc . N. Z. Bull., 22, pp37-40, 1985 ; Polziehn RO et al., Molecular Phylogenetics and Evolution, 10, pp249-258, 1998)은 28 유전자 좌 (loci)의 단백질 데이터를 UPGMA 방법으로 분석하여 wapiti와 C. elaphus를 분석하였으며, 크로닌 (Cronin M, J. Mammal, 73, pp70-82, 1992)은 mtDNA분석을 통하여 몽고의 wapiti와 북아메리카의 wapiti를 구분한 바 있다.

순록은 암수 모두 뿔이 나며 회분 함량 분석시 기준미달로 약재 시장에서 녹용으로 인정받지 못한다. 그러나 대부분 절편 상태로 유통되므로 확인하는 것이 매우 어려우며, 화학적 측면의 분석을 통한 확인 또한 사육 조건, 기후, 영양적 요소 등의 다양성 때문에 타녹용과의 구분이 매우 어려운 실정이다.

따라서 녹용으로 둔갑될 가능성이 많은 순록 (Rangifer tarandus)의 감식법을 개발하고, 이를 응용하여 절편 및 가루 중에 혼입된 순록의 구별법을 확립할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 최근 유전적 변이를 평가하는데 널리 사용되는 제한효소절편길이다형성법 (RFLP method)을 이용하여 녹용종들로부터 추출된 DNA로부터 단일 염기 형태의 변이를 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 유전자 분석법인 제한효소절편길이다형성법 (RFLP method)에 의해 녹용의 종간 유전적 변이를 분석하여 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹용의 종간 유전적 변이를 제한효소절편길이다형성법 (RFLP method)에 의한 녹용의 종 감별방법 및 감별 키트를 제공한다.

본 발명의 녹용 종 감별 방법은 녹용 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1 단계; 추출된 DNA 및 프라이머 (primer)의 반응 용액을 제조하는 제 2 단계; 상기 제조된 반응 용액을 증폭시키는 제 3 단계; 증폭된 DNA로 제한효소절편길이다형성법 (RFLP method)을 수행함으로써 얻어진 유전자형 분석 (genotyping)을 통하여 녹용의 종을 감별하는 제 4 단계를 포함하는 녹용의 종 감별 방법을 제공한다.

상기 제한효소절편길이다형성법은 서열번호 1의 센스 프라이머를 구성요소로 포함하고, 상기 제한효소절편길이다형성법은 서열번호 2의 안티센스 프라이머를 구성요소로 포함한다.

또한, 상기 제한효소절편길이다형성법은 녹용의 종간 특이적 제한효소를 구성요소로 포함하고, 상기 제한효소는 서열번호 3의 서열을 인지하는 SspI을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 감별 키트를 위한 녹용 시료로는 매화록 (Cervus Nippon), 마록 (Cervus Elaphus), 대록 (Cervus canadensis)과 순록 (Rangifer Tarandus)의 뿔, 혈액 또는 기타 신체 조직 등이 가능하다.

상기 감별 키트의 제 2단계에 사용되는 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 프라이머를 센스 (sense) 프라이머로 하고, 서열번호 2로 기재되는 일반 프라이머 를 안티센스 (antisense) 프라이머로 함으로서 DNA를 증폭시킨다.

상기 제 4단계의 제한효소절편길이다형성법을 수행시, 제한효소가 작용하는 과정을 통하여 녹용의 다형성 (polymorphism) 관찰을 통해 유전자형이 판별됨을 특징으로 한다.

본 발명은 DNA 추출시약, 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머를 포함하는 PCR용 시약 및 제한효소로 구성되는 제한효소절편길이다형성법 (RFLP method)에 의해 녹용의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 감별 키트를 제공한다.

상기 센스 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 프라이머을 포함하고, 상기 안티센스 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 포함하는 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

또한 상기 제한효소는 서열번호 3의 서열을 인지하는 SspI을 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 제한효소절편길이다형성법에 의해 얻어진 분석결과(도 2 참조)에 따른 종별 녹용 비교를 위한 표준 분석도 및 이를 분석한 분석표를 포함하는 녹용의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

본 발명의 감별 키트는 소량의 시료를 이용하여 감별이 가능하며, 재현성이 뛰어나며 정확한 진단이 가능하다.

또한, 본 발명의 감별 키트는 육안으로 감별이 어려운 녹용에 있어서 종간 특이적 프라이머와 제한효소를 이용하여 녹용의 종, 바람직하게는 순록의 뿔을 녹용과 감별할 수 있다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 녹용 시료의 준비

녹용 시료 준비를 위해 매화록 (Cervus Nippon)은 중국에서, 마록 (Cervus Elaphus)은 뉴질랜드에서, 대록 (Cervus canadensis)은 캐나다에서, 순록 (Rangifer Tarandus)은 알라스카에서 사육된 것을 한국의약품수출입협회로부터 검열 받은 표준화된 포장으로 구입하여 사용하였다. 모든 시료는 본초학 전공 교수가 확인한 것을 제공 받아 사용하였다.

실시예 1. 녹용의 DNA 정제

뿔 부분 전체가 포함된 형태의 녹용 3 g을 멸균된 작은 칼로 잘게 썰고, 멸균된 분쇄기로 분쇄하여 분말화 하였다. DNA 분리를 위해 키트 (DNeasy Tissue kit, No. 69504, Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하였으며 이때 제조사의 사용설명을 약간 변형하여 실행하였다. 분말화 된 녹용 시료 300 ㎎은 세정과정을 거쳐 사용하였다. 시료를 용출 (elution)하기 전에, 컬럼 (column)은 남은 에탄올을 증발시키기 위해 5분 동안 37 ℃에서 건조시켰다. 시료들은 TE 버퍼 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0))를 사용하여 총 부피 200 ㎕에서 용출시켰다.

실험예 1. PCR 법을 이용한 DNA 증폭

추출된 DNA의 증폭은 PCR법에 의하여 수행되었다. 각 녹용 시료의 미토콘드리아 게놈내 D-loop 구역을 증폭하기 위한 DNA 25 ng, 각 프라이머 (센스 (sense): 서열번호 1, 안티센스 (antisense): 서열번호 2) 5 pmol을 사용하여 증폭되었다. PCR 증폭은 0.5 단위 (unit) Taq 중합효소 (Taq polymerase ; HT Biotechnology Ltd., Cambridge, United Kingdom)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합물 30 ㎕는 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1.5 mM 마그네슘 클로라이드 (magnesium chloride), 50 mM 염화칼륨 (potassium chloride), 0.1% 트리톤-X 100 (triton-X 100), 0.01 % [v/v] 안정제 (stabilizer), 디옥시뉴클레오티드 삼인산 (deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 각 0.25 mM, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer) 각 0.1 mM로 구성되었다. PCR 과정은 PCR 시스템 (PCR System, Astec, Japan)을 이용하여 95 ℃에서 5분간 전과정을 거친 후, 1회당 95 ℃에서 30초간 변성 (denaturation), 60 ℃에서 30초간 결합 (annealing), 72 ℃에서 30초간 연장 (extension)의 구성으로 30회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물은 1.5 % 아가로스 겔 (agarose gel)을 이용하여 전기영동하여 확인하였다.

실험예 2. 제한효소절편길이다형성법 ( RFLP method)에 의한 유전자형 분석( Genotyping )

제한효소절편길이다형성법은 기존에 널리 공개된 실험계획안 (protocol)을 응용하여 수행하였다 (Wang CZ et al., Planta Med ., 71(4), pp384-386, 2005). PCR로 증폭된 산물은 제한효소 (SspI, 동양제철화학, 한국)을 이용하여 처리하였다. PCR 산물 10 ㎕에 제한효소 SspI (restriction enzyme)와 10X 반응완충용액 (buffer), 증류수를 첨가하여 최종 50㎕가 되도록 한 반응액을 37 ℃ 항온수조에 3시간 반응시켰으며, 반응동안 미토콘드리아 게놈 내 D-루프 (D-loop) 구역의 다형성 부분 중 제한효소인 SspI이 인식하는 서열인 "AATATT"가 존재하는 종에서 단편이 형성된다 (도 1참조).

도1의 A에서 나타난 바와 같이 제한효소가 작용하면 도1의 B에 나타난 바와 같이 잘린 단편이 만들어지지만, 매화록, 마록, 대록의 경우에는 도1의 A에 나타난 바와 같이 제한효소가 작용하지 못하여 도1의 B에 나타난 바와 같이 절단 산물인 단편이 만들어지지 않았으며, 이를 1.5 % 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인할 수 있었다.

매화록 (P1), 마록 (P2), 대록 (P3)은 모두 절단되지 않아, 유전자 밴드가 663-721 bp size에서 나타났으나, 순록 (P4)의 경우 제한효소 (SspI)에 의해 절단된 433 bp와 288 bp의 밴드가 나타났다 (도 2 참조).

상기 제한효소절편길이다형성법을 이용한 실험 결과, 순록은 매화록, 마록, 대록과 다른 형태를 보이는 명백한 차이를 나타내었다.

본 발명은 녹용에 대하여 제한효소절편길이다형성법을 이용하여 유전자형을 분석하고, 녹용의 종간 특이적 제한효소를 고안하여 녹용의 종간 연관성과 유전적 변이를 감별하는 녹용의 종간 확인시험법을 이용한 감별 키트를 제공함으로써 정확한 녹용 원료를 공급하며, 녹용의 품질관리 방법의 일환으로 활용할 수 있으며, 녹용 외에 기타 한약재 자원에 대한 신물질 탐색이나 품종간 감별에 대한 기초 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

녹용 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA, aaccaacctc cctaagactc aagga 및 tgctcacaca taactgtgg 프라이머를 포함하는 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 증폭시키는 제 3단계; 증폭된 DNA를 제한효소 SspI와 10X 반응완충용액, 증류수를 첨가하여 최종 50㎕가 되도록 한 반응액을 37℃ 항온수조에 3시간 반응시키고, 반응동안 미토콘드리아 게놈 내 D-루프 구역의 다형성 부분 중 제한 효소인 SspI이 인식하는 서열인 “aatatt"가 존재하는 제한효소절편길이다형성법 (RELP method)을 수행함으로써 얻어진 유전자형분석 (genotyping)을 통하여 녹용의 종을 감별하는 제 4단계를 포함하는 녹용의 종 감별 방법.
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DNA 추출시약, aaccaacctc cctaagactc aagga 및 tgctcacaca taactgtgg 프라이머를 포함하는 PCR용 시약 및 aatatt 프라이머를 인지하는 제한효소인 SspI를 포함하는 제한효소절편길이다형성법 (RELP method)에 의해 녹용의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 감별 키트.
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