KR102526584B1 - 양송이 품종 새아, 새정, 다향을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양송이 품종 새아, 새정, 다향을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 CAPS 분자마커는 저비용, 고효율로 국내에서 개발된 양송이 신품종 새아, 새정 또는 다향을 효과적으로 판별할 수 있으므로, 양송이의 품종 보호 및 분자육종 연구 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

양송이 품종 새아, 새정, 다향을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating Agaricus bisporus cultivar Sae-Ah, Sae Jeong, Dahyang and uses thereof}

본 발명은 양송이 품종 새아, 새정, 다향을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

양송이(Agaricus bisporus)는 담자균류 주름버섯과의 식용버섯 중 하나로, 당질, 단백질, 비타민, 무기질 등과 같은 영양소가 골고루 함유되어 있고 독특한 맛과 향을 지니고 있다. 양송이의 성양식은 담자포자(basidiospore)를 형성하여 이루어진다. 양송이의 담자기(basidium)에서 형성되는 담자포자 중 95%는 2개의 담자포자를 형성하고, 4.5%는 3개, 0.5%는 4개를 형성한다. 95%의 2개의 담자포자를 형성하는 개체 중에서 63%는 2개의 이질핵체를 가지고, 32%는 2개의 동질핵체를 가진다. 나머지 5% 중에서 4.5%는 포자의 수가 3개이고 핵을 1개 또는 동질핵체 2개를 가지며, 0.5%만 포자의 수가 4개이고 포자내 핵의 수가 1개인 것으로 알려져 있다. 이처럼 복잡한 양송이 버섯의 성양식은 품종육성에 제한요인이 되고 있으며, 다양한 품종이 육성되어 있는 느타리버섯과 달리 양송이 균사에는 꺽쇠연결(clamp connection)이 존재하지 않기 때문에 교잡 후 균사의 형태에 의한 교잡확인이 쉽지 않아 품종육성속도가 느린편이다.

양송이는 느타리, 팽이, 큰느타리(새송이), 표고에 이어 5번째로 많이 재배되고 있고, 국내 버섯 총 생산량의 약 5.3%를 차지한다. 과거에는 미국, 유럽, 호주에 있는 거대 종균회사로부터 종균을 수입하여 국내 농가에서 양송이를 재배하였으나, 농촌진흥청에서 국내 최초로 단포자 교잡방법으로 개발된 새아(Sae-Ah)를 시작으로 새정(Sae Jeong), 새연(Saeyeon), 새도(Saedo), 새한(Saehan), 다향(Dahyang), 호감(Hogam) 등과 같이 우리나라 재배환경에 적합한 국산 양송이 품종을 개발하였다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡한 단점이 있으나, CAPS 마커는 공우성(co-dominant)이고 결과를 쉽게 해석할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 국내 양송이 품종의 개발 및 육종을 위해 저비용, 고효율로 국내 양송이 품종을 구별할 수 있는 분자마커의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 한국등록특허 제2163233호에 '양송이 품종 새정, 새아, 설강 구별을 위한 SSR 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2029016호에 '양송이 균주 구별을 위한 SSR 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 양송이 품종 새아, 새정, 다향을 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 양송이 품종 '새아, 새정 및 다향'의 게놈 서열 간 SNP에 기반한 CAPS 분자마커 AB-gCAPs-066 및 AB-gCAPs-072를 개발하였고, 상기 AB-gCAPs-066 마커를 이용하면 새아와 다향으로부터 새정을 구별할 수 있고, AB-gCAPs-072 마커를 이용하면 새아와 새정으로부터 다향을 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 양송이(Agaricus bisporus) 품종 구별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 양송이 품종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 양송이 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 양송이 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 CAPS 분자마커는 저비용, 고효율로 국내에서 개발된 양송이 신품종 새아, 새정 또는 다향을 효과적으로 판별할 수 있으므로, 양송이의 품종 보호 및 분자육종 연구 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기재된다.

도 1은 본 발명의 CAPS 분자마커 AB-gCAPs-066 및 AB-gCAPs-072를 개발하기 위해 양송이 품종 새아, 새정 및 다향의 게놈 서열을 비교하고, 제한효소 XcmI 또는 BstNI의 인식부위를 확인한 결과이다.
도 2는 양송이 품종 새아, 새정 및 다향에 대한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 CAPS 분자마커를 이용하여 양송이 품종 새아, 새정 및 다향을 대상으로 PCR을 수행한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 양송이(Agaricus bisporus) 품종 구별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 양송이 품종은 국내에서 개발된 새아(Sae-Ah), 새정(Sae Jeong) 및 다향(Dahyang)일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)용 프라이머 세트일 수 있다. CAPS는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 다형성 PCR 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편을 의미한다. 사전에 품종 간에 염기서열의 차이가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차이가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차이를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA 를 가지는 품종과의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.

본 발명의 상기 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 양송이 품종을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 양송이 품종 새아와 다향으로부터 새정을 구별할 수 있고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 양송이 품종 새아와 새정으로부터 다향을 구별할 수 있다. 또한, 상기 2개의 프라이머 세트를 동시에 사용하면 양송이 품종 새아, 새정 및 다향을 모두 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 4의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(21개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는 서열번호 1 내지 4의 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 양송이 품종 구별용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명의 양송이 품종 구별용 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 양송이 품종은 국내에서 개발된 새아(Sae-Ah), 새정(Sae Jeong) 및 다향(Dahyang)일 수 있다.

본 발명의 양송이 품종 구별용 조성물 또는 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 제한효소는 바람직하게는 XcmI 및/또는 BstNI일 수 있다. 또한, 본 발명의 양송이 품종 구별용 조성물 또는 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

양송이 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 양송이 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 양송이 품종은 국내에서 개발된 새아(Sae-Ah), 새정(Sae Jeong) 및 다향(Dahyang)일 수 있다.

본 발명의 방법은 양송이 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 양송이 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 양송이 품종을 구별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다. 본 발명의 양송이 품종 구별 방법에 있어서, 상기 제한효소는 XcmI 및/또는 BstNI일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 일 구현 예에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함할 수 있고, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 제한효소 XcmI 처리에 의해 절단되면 양송이 품종 새아(286 bp)와 다향(286 bp)으로부터 새정(119/167 bp)을 구별할 수 있고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 제한효소 BstNI 처리에 의해 절단되면 양송이 품종 새아(294 bp)와 새정(294 bp)으로부터 다향(135/159 bp)을 구별할 수 있다(표 1 참고). 또한, 본 발명의 프라이머 세트 2개를 동시에 이용하면 양송이 품종 새아, 새정 및 다향을 모두 구별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 양송이 균사체의 DNA 추출

퇴비 추출 배지(compost dextrose agar; CDA)의 상면에 셀로판을 깔고 60일간 암배양한 양송이 품종 '새아, 새정 및 다향'의 균사체를 수확하여 액체질소에 얼린 후 막자사발로 곱게 갈아 GeneAll^® GenEx™ Plant 키트(GeneAll, 한국)로 게놈 DNA를 추출하였다.

우선, 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL 버퍼 400 ㎕를 넣고 65℃에서 10분간 가열해준 후 파이펫으로 섞고, PD 버퍼 140 ㎕를 넣어 잘 섞어주었다. 얼음에서 5분간 방치한 후 14,000 rpm으로 5분간 원심분리하고, 상층액을 분리하여 EzSep^TM filter(blue)로 옮겨준 다음 14,000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 분리하여 새로운 튜브에 넣고 1.5배의 BD를 함께 넣어 흔들어 섞어주었으며, 상기 혼합물을 GeneAll SV column(green)에 넣어 14,000 rpm에서 30초간 원심분리하였다. 통과된 버퍼는 버리고 CW 버퍼 700 ㎕를 사용하여 SV column을 14,000 rpm에서 30초간 원심분리한 후, 다시 통과된 버퍼를 버리고 CW 버퍼 300 ㎕를 사용하여 SV column을 14,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 세척된 SV column에 AE 버퍼 100 ㎕를 넣어 5분간 반응시킨 후 14,000 rpm에서 1분간 원심분리하는 과정을 2회 반복하였다.

2. CAPS 마커 개발

양송이 품종 새아, 새정 또는 다향을 구별할 수 있는 마커 염기서열을 확보하기 위해서 선행연구(Mycobiology, 2018, 46(4), 421-428)의 전장유전체 분석 자료를 이용하여, 양송이의 전장유전체들의 비교를 통하여 SNP들을 선발하였다. 선발된 SNP들에서 새아, 새정 및 다향의 게놈 서열 간 SNP를 확인하였으며, 이 중 제한효소 XcmI 또는 BstNI의 인식서열에 포함되는 SNP에 기반한 CAPS 마커를 개발하였다(도 1 및 표 1).

본 발명의 CAPS 마커 정보

명칭	프라이머 서열(5'→3') (서열번호)	제한효소	expected size (bp)
AB-gCAPS-066	F: AAGTCCGCAATTGACCTACTAA (1)	XcmI	286 (119/167)
	R: AGTGTGCAAAATTGAGGAGAGT (2)
AB-gCAPS-072	F: TTGTAGCTTATGACATGGTTCG (3)	BstNI	294 (135/159)
	R: GGAATTATTTTGACGGTTTGAA (4)

3. 중합효소연쇄반응(PCR)

상기 추출한 게놈 DNA 20 ng을 주형으로 하고, 상기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 하기 표 2의 조건으로 PCR을 수행하였다. AB-gCAPS-066를 이용하여 증폭된 증폭 산물에 제한효소 XcmI를 처리하거나, AB-gCAPS-072를 이용하여 증폭된 증폭 산물에 제한효소 BstNI를 처리한 후 겔 전기영동을 수행하여 다형성을 확인하였다. 제한효소 처리 방법은 제조사(NEB, 미국)의 프로토콜에 따라 수행하였다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	95	2분
변성	95	20초
결합	55	40초
신장	72	45초
변성 단계로 돌아가 30회 추가 반복
최종 신장	72	10분
보관	4	∞

4. 계통수 작성

양송이 품종 새아, 새정 및 다향의 게놈 서열 간 SNP 정보를 기반으로 MEGA 프로그램(version 7.0)을 이용하여 UPGMA(unweighted pair group method using the arithmetic averages) 방법으로 계통수를 작성하였다(도 2).

실시예 1. 본 발명의 CAPS 분자마커를 이용한 양송이 품종의 구별

본 발명의 CAPS 마커를 이용하여 양송이 품종 '새아, 새정 및 다향'을 대상으로 PCR을 수행한 후 PCR을 통해 증폭된 산물을 유전자 단편 분석하여 PCR 산물의 크기를 비교하였다.

그 결과, AB-gCAPS-066을 이용한 경우 새아와 다향에서는 제한효소 XcmI에 의해 절단되지 않아 286 bp 크기의 밴드가 검출되었고, 새정에서는 XcmI에 의해 절단되어 119/167 bp 크기의 밴드가 검출되었다.

또한, AB-gCAPS-072를 이용한 경우 새아와 새정에서는 제한효소 BstNI에 의해 절단되지 않아 294 bp 크기의 밴드가 검출되었고, 다향에서는 BstNI에 의해 절단되어 135/159 bp 크기의 밴드가 검출되었으며, BstNI에 의해 절단된 135 bp와 159 bp의 두 단편은 크기 차이가 적어 단일 밴드로 보였다. 이를 통해, AB-gCAPS-066는 새아와 다향으로부터 새정을 구별할 수 있고, AB-gCAPS-072는 새아와 새정으로부터 다향을 구별할 수 있음을 확인하였다.

즉, AB-gCAPS-066을 이용한 경우에는 새아와 다향의 크기가 동일하게 나타났고, AB-gCAPS-072를 이용한 경우에는 새아와 새정의 크기가 동일하게 나타났으므로, AB-gCAPS-066과 AB-gCAPS-072를 모두 이용하면 국내 양송이 품종 새아, 새정 및 다향을 명확하게 구별할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discriminating Agaricus bisporus cultivar Sae-Ah, Sae Jeong, Dahyang and uses thereof <130> PN21141 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aagtccgcaa ttgacctact aa 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtgtgcaaa attgaggaga gt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttgtagctta tgacatggtt cg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggaattattt tgacggtttg aa 22

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트 조성물; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소 XcmI 및 BstNI;을 포함하는 양송이(Agaricus bisporus) 품종 새아(Sae-Ah), 새정(Sae Jeong) 및 다향(Dahyang) 구별용 키트.
5. 삭제
6. 양송이 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
   상기 증폭 단계의 산물을 제한효소 XcmI 및 BstNI으로 절단하는 단계; 및
   상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 양송이(Agaricus bisporus) 품종 새아(Sae-Ah), 새정(Sae Jeong) 및 다향(Dahyang)을 구별하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제

Images