CN108796111B - 用于猕猴桃金梅品种鉴定的分子标记引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃金梅品种鉴定的分子标记引物及应用，所述的引物为：Geo23‑104‑F:GCAAACATCACGATCCAAAA和Geo23‑104‑R:AACCCATGATCAGGTTGCTC。利用本发明提供的引物对金梅DNA进行扩增，仅金梅可特异性的扩增出261bp的条带；根据不同条带的大小和数目，本发明提供的引物也可对：‘川猕3号’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘金农’、‘金霞’、‘金艳’、‘金圆’、‘满天红’、‘秦美’、‘QS‑5’、‘通山5号’、‘徐香’、‘豫皇一号’或‘江山娇’猕猴桃品种进行区分。

Description

用于猕猴桃金梅品种鉴定的分子标记引物及应用
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物及应用。
背景技术
中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃遗传资源的原始起源中心。近年来，我国猕猴桃产业稳步扩增，截至2017年全国栽培面积达240万亩，产量290万吨，均居世界首位。在品种格局上，我国立足于本土猕猴桃遗传资源研究，选育出了一系列猕猴桃新品种，在全球范围广泛栽培，彻底改变了世界猕猴桃产业唯‘海沃德’品种的单一格局，推动了猕猴桃市场多样化和消费的多元化。
随着猕猴桃新品种的日益推出，新品种的鉴定是亟待解决的一大难题。目前，对猕猴桃专利品种的鉴定仅通过树势、叶片形态、花期、花形态、果实外观等传统手段，难免受到环境和其他人为因素的影响。对猕猴桃品种的不确定性，限制了产业的健康持续发展，且苗木品种不纯甚至错误将造成果农经济效益严重受损。
分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。选择适宜的分子标记及其配套检测技术,建立一套简便、经济、准确而高效的品种鉴定和指纹图谱技术体系,是打击假冒伪劣种苗、保护植物遗传育种工作者和农民的合法权益，规范我国农业市场的迫切需要。
分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。在植物种质资源鉴定及育种中，对分子标记的应用已日趋成熟。SSR分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已应用于大豆、苹果和葡萄等品种鉴定方面。在猕猴桃中，分子标记技术应用于猕猴桃雄性系列品种的鉴定，已为多个优异猕猴桃品种准确提供授粉雄株，提升猕猴桃的育种效率。
‘金梅’果实长扁椭圆形，平均果重90克，果肉黄色或黄绿色，味浓甜、香气浓郁，质嫩，多汁，口感佳。果实软熟后含平均可溶性固形物16％、维生素C含量125-140毫克/100克，富含矿质元素，较耐贮藏。开发适用于猕猴桃‘金梅’品种的分子鉴定标记，有利于从分子水平上明确界定专利品种，利于对猕猴桃品种进行鉴定和品种保护。
发明内容
本发明的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物，所述的分子标记命名为Geo23-104，针对其设计的引物为Geo23-104-F:GCAAACA TCACGATCCAAAA和Geo23-104-R:AACCCATGATCAGGTTGCTC。
本发明的另一个目的在于提供了用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSRFinder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘金梅’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo23-104，针对其设计的引物为Geo23-104-F:GCAAACATCACGATCCAAAA和Geo23-104-R:AACCCA TGATCAGGTTGCTC。
用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用，包括利用本发明的引物用于猕猴桃育种，或是利用本发明的引物对猕猴桃品种，特别是‘金梅’品种进行鉴定，仅‘金梅’猕猴桃可特异性的扩增得到261bp的特异条带；或是根据条带大小和数目，对不同品种包括：‘川猕3号’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘金农’、‘金霞’、‘金艳’、‘金圆’、‘满天红’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘武植3号’、‘徐香’、‘豫皇一号’或‘江山娇’猕猴桃进行区分。
与现有技术相比，本发明的优点：
1.形态标记简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便，在植物体的各个组织和发育时期，均可检测，不受季节和环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，品种间存在许多等位变异。
2.本发明的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的DNA片段。该分子标记扩增稳定性，能用于进行猕猴桃‘金梅’品种的鉴定。
3.本发明提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可从40多个不同品种的猕猴桃中对‘金梅’品种进行鉴定，利用分子标记Geo23-104引物对‘金梅’DNA进行扩增，可特异性的获得261bp的条带。
4.除了根据特异性条带鉴定‘金梅’，还可根据条带大小和数目，对‘川猕3号’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘金农’、‘金霞’、‘金艳’、‘金圆’、‘满天红’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘武植3号’、‘徐香’、‘豫皇一号’或‘江山娇’猕猴桃进行区分。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。
实施例1：
用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物的获得：
申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSR Finder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘金梅’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo23-104，针对其设计的引物为Geo23-104-F:GCAAACATCACGATCCAAAA和Geo23-104-R:AACCCATGATCAGGTTGCTC。
实施例2：
用于猕猴桃‘金梅’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用：
(1)按照CTAB法分别提取40多个不同品种猕猴桃的DNA样品(具体品种名称如表1所示)。
(2)使用加样器吸取990ul HIDI和10ul ROX500或LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10ul。
(3)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。
(4)在96孔板对应的孔中分别加入各样本DNA，每个样品50pg。
(5)参照以下PCR反应体系加入相应试剂到96孔板，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。按照以下程序进行PCR反应。
a.PCR反应体系
25μl体系的配制
Figure BDA0001699373410000031
Figure BDA0001699373410000041
所述的引物F和引物R为：Geo23-104-F:GCAAACATCACGATCCAAAA和Geo23-104-R:AACCCATGATCAGGTTGCTC。
b.PCR反应条件
Figure BDA0001699373410000042
(6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却，再将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停。
(7)使用3730xl测序分析仪(美国ABI公司)检测扩增片段。
(8)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用STR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。
(9)利用标记Geo23-104引物扩增猕猴桃不同品种DNA，仅‘金梅’猕猴桃扩增得到261bp的特异条带，同时根据不同条带对不同品种包括：‘川猕3号’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘金农’、‘金霞’、‘金艳’、‘金圆’、‘满天红’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘徐香’、‘豫皇一号’或‘江山娇’猕猴桃进行区分。具体扩增结果如表1所示。
表1不同品种猕猴桃名称及Geo23-104引物PCR扩增结果
Figure BDA0001699373410000043
Figure BDA0001699373410000051
序列表
<110> 中国科学院武汉植物园
<120> 用于猕猴桃金梅品种鉴定的分子标记引物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaaacatca cgatccaaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacccatgat caggttgctc 20

Claims (4)

1.用于猕猴桃金梅品种鉴定的分子标记引物，所述的引物为： Geo23-104-F:GCAAACATCACGATCCAAAA和Geo23-104-R:AACCCATGATCAGGTTGCTC。
2.权利要求1所述的引物在猕猴桃金梅品种鉴定中的应用。
3.权利要求1所述的引物在‘川猕3号’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘金农’、‘金霞’、‘金艳’、‘金圆’、‘满天红’、‘秦美’、‘通山5号’、‘徐香’、‘豫皇一号’或‘江山娇’猕猴桃品种鉴定中的应用。
4.一种用于猕猴桃金梅品种鉴定的试剂盒，包括引物：Geo23-104-F:GCAAACATCACGATCCAAAA和Geo23-104-R:AACCCATGATCAGGTTGCTC。
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