CN109055602B - 用于猕猴桃东玫品种鉴定的分子标记引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物及应用，所述的引物为：Geo8‑228‑F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8‑228‑R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。利用本发明提供的引物对东玫DNA进行扩增，仅东玫可特异性的扩增出285bp、291bp和303bp的条带；根据不同条带的大小和数目，也可对：‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘YH‑H8’、‘华优’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金桃’、‘金圆’、‘魁蜜’、‘龙山红’、‘MBR’等猕猴桃进行区分。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃东玫品种鉴定的分子标记引物及应用。
背景技术
中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃遗传资源的原始起源中心。近年来，我国猕猴桃产业稳步扩增，截至2017年全国栽培面积达240万亩，产量290万吨，均居世界首位。在品种格局上，我国立足于本土猕猴桃遗传资源研究，选育出了‘金艳’、‘东红’等猕猴桃新品种，在全球范围广泛栽培，彻底改变了世界猕猴桃产业唯‘海沃德’品种的单一格局，推动了猕猴桃市场多样化和消费的多元化。
随着猕猴桃新品种的日益推出，新品种的鉴定是亟待解决的一大难题。目前，对猕猴桃专利品种的鉴定仅通过树势、叶片形态、花期、花形态、果实外观等传统手段，难免受到环境和其他人为因素的影响。对猕猴桃品种的不确定性，限制了产业的健康持续发展，且苗木品种不纯甚至错误将造成果农经济效益严重受损。
分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。选择适宜的分子标记及其配套检测技术,建立一套简便、经济、准确而高效的品种鉴定和指纹图谱技术体系,是打击假冒伪劣种苗、保护植物遗传育种工作者和农民的合法权益，规范我国农业市场的迫切需要。
分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。在植物种质资源鉴定及育种中，对分子标记的应用已日趋成熟。SSR分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已应用于大豆、苹果和葡萄等品种鉴定方面。在猕猴桃中，分子标记技术应用于猕猴桃雄性系列品种的鉴定，已为多个优异猕猴桃品种准确提供授粉雄株，提升猕猴桃的育种效率。
‘东玫’果实卵圆形，平均果重在50-70克，果皮黄褐色，密被黄褐色硬毛。果肉为黄白色，种子分布区域果肉显红色，果实风味品质表现优异，软熟后果肉黄白色，种子分布区域果肉鲜红色，软熟果实含可溶性固形物15-21％、总糖14％、有机酸1.4％、VC含量120mg/100g，干物质含量20-21％，风味浓甜，香气浓郁，肉略带粉质。2018年获得农业部植物新品种权证书。开发适用于猕猴桃‘东玫’品种的分子鉴定标记，有利于从分子水平上明确界定专利品种，利于对猕猴桃品种进行鉴定和品种保护。
发明内容
本发明的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物，所述的分子标记命名为Geo8-228，针对其设计的引物为Geo8-228-F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8-228-R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。
本发明的另一个目的在于提供了用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSRFinder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘东玫’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo8-228，针对其设计的引物为Geo8-228-F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8-228-R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。
用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用，包括利用本发明的引物用于猕猴桃育种，或是利用本发明的引物对猕猴桃品种，特别是‘东玫’品种进行鉴定，或是根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘YH-H8’、‘华优’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金桃’、‘金圆’、‘魁蜜’、‘龙山红’、‘MBR’、‘米良1号’、‘庆元秋翠’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘新观2号’、‘徐香’、‘早鲜’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金艳’、‘金霞’、‘满天红’、‘磨山4号’、‘豫皇一号’、‘江山娇’猕猴桃进行区分。
与现有技术相比，本发明的优点：
1.形态标记简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便，在植物体的各个组织和发育时期，均可检测，不受季节和环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，品种间存在许多等位变异。
2.本发明的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的DNA片段。该分子标记扩增稳定性，能用于进行猕猴桃‘东玫’品种的鉴定。
3.本发明提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可从40多个不同品种的猕猴桃中对‘东玫’品种进行鉴定，利用分子标记Geo8-228引物对DNA进行扩增，仅东玫可特异性的扩增出285bp、291bp和303bp的条带。
4.除了根据特异性条带鉴定‘东玫’品种，还可根据条带大小和数目对‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘YH-H8’、‘华优’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金桃’、‘金圆’、‘魁蜜’、‘龙山红’、‘MBR’、‘米良1号’、‘庆元秋翠’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘新观2号’、‘徐香’、‘早鲜’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金艳’、‘金霞’、‘满天红’、‘磨山4号’、‘豫皇一号’、‘江山娇’猕猴桃进行区分。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。
实施例1：
用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物的获得：
申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSR Finder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘东玫’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo8-228，针对其设计的引物为Geo8-228-F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8-228-R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。
实施例2：
用于猕猴桃‘东玫’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用：
(1)按照CTAB法分别提取40多个不同品种猕猴桃的DNA样品(具体品种名称如表1所示)。
(2)使用加样器吸取990ul HIDI和10ul ROX500或LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10ul。
(3)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。
(4)在96孔板对应的孔中分别加入各样本DNA，每个样品50pg。
(5)参照以下PCR反应体系加入相应试剂到96孔板，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。按照以下程序进行PCR反应。
a.PCR反应体系
25μl体系的配制
所述的引物F和引物R为：Geo8-228-F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8-228-R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。
b.PCR反应条件
(6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却，再将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停。
(7)使用3730xl测序分析仪(美国ABI公司)检测扩增片段。
(8)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用STR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。
(9)利用标记Geo8-228扩增猕猴桃品种，仅‘东玫’可特异性的扩增出285bp、291bp和303bp的条带，同时根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘YH-H8’、‘华优’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金桃’、‘金圆’、‘魁蜜’、‘龙山红’、‘MBR’、‘米良1号’、‘庆元秋翠’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘新观2号’、‘徐香’、‘早鲜’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金艳’、‘金霞’、‘满天红’、‘磨山4号’、‘豫皇一号’、‘江山娇’猕猴桃进行区分。具体扩增结果如表1所示。
表1不同品种猕猴桃名称及Geo8-228引物PCR扩增结果
序列表
<110> 中国科学院武汉植物园
<120> 用于猕猴桃东玫品种鉴定的分子标记引物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcaccctc tacttttggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggttttgta tccccagctt 20
Claims (4)
1.用于猕猴桃东玫品种鉴定的分子标记引物，所述的引物为：Geo8-228-F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8-228-R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。
2.权利要求1所述的引物在猕猴桃东玫品种鉴定中的应用。
3.权利要求1所述的引物在猕猴桃‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘华优’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金桃’、‘金圆’、‘魁蜜’、‘龙山红’、‘米良1号’、‘庆元秋翠’、‘通山5号’、‘武植3号’、‘湘麻6号’、‘厦亚1号’、‘新观2号’、‘徐香’、‘早鲜’、‘华光2号’、‘海沃德’、‘金艳’、‘金霞’、‘满天红’、‘磨山4号’、‘豫皇一号’或‘江山娇’猕猴桃品种鉴定中的应用。
4.一种用于猕猴桃东玫品种鉴定的试剂盒，包括引物：Geo8-228-F:CCTCACCCTCTACTTTTGGG和Geo8-228-R:GGGTTTTGTATCCCCAGCTT。
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