CN109207629B - 一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049及其应用 - Google Patents

一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049及其应用 Download PDF

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Abstract

一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049及其应用，属于分子标记技术领域，涉及一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记及其应用。是要解决现有缺乏甜菜种子粒性相关的分子标记，不易于鉴定种子粒性的问题。用于PCR扩增该分子标记的引物对为BvRE049 S和BvRE049 A。本发明的分子标记BvRE049在所有个体中，标记检测结果与种子粒性性状表现的一致性达到71.67％，在单粒与多粒个体中分别达到83.33％和60％。本发明用于甜菜种子粒性检测。

Description

一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049及其应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，涉及一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记及其应用。
背景技术
甜菜(Beta Vulgaris)的果实外包被着宿存的木质化花萼，形成比较特殊的“种球”结构：当花单生时，种球内为单个的瘦果，而当多个无柄小花聚生成聚伞花序时，种球内多个果实紧密相连形成含有多个瘦果的聚花果。描述甜菜种质资源时，以“种子粒性”性状进行描述，分为单粒种(又称单胚种)与多粒种(又称多胚种)。
多粒种出苗率高，利于保苗，单粒种则利于机械化栽培，且节省间苗工作量。同时，单粒种易于控制株距，有助于提高丰产性和整齐度。随着播种、管理机械化程度的提高，以及种子包衣和丸粒化技术的进步，生产上对甜菜单粒种的需求正在不断提高。
目前，我国的单粒种甜菜种质大部分通过引进与引种获得，也自主培育了少数单粒种，但是甜菜种子粒性相关分子标记、基因及分子机理的研究尚无报道。
开发种子粒性标记，应用于种子粒性预测，有利于我国甜菜单粒种种质的鉴定、开发与利用，也有利于提高单粒种培育工作的效率，同时有助于寻找粒性相关基因，供育种应用与分子机理研究。
发明内容
本发明是要解决现有缺乏甜菜种子粒性相关的分子标记，不易于鉴定种子粒性的问题，提供一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049及其应用。
本发明利用高通量测序技术开发了简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)候选标记，利用F2分离群体从中筛选出了与甜菜种子粒性相关的SSR分子标记BvRE049，获得了标记扩增区域的序列并进行了基因组定位。该分子标记可用于检测甜菜种子单粒/多粒个体。
本发明检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049，用于PCR扩增该分子标记的引物对为BvRE049 S和BvRE049 A，具体序列为：
BvRE049 S：5'-AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'
BvRE049 A：5'-TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'。
上述检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049的应用，它用于检测种子粒性。
具体检测方法为：
一、从甜菜幼嫩组织中分离提取总DNA；所述幼嫩组织为幼嫩叶片、幼嫩花序、幼嫩叶柄、幼嫩花薹、萌发期种子、幼苗期根或整株幼苗；
二、以步骤一得到的DNA为模板，采用引物BvRE049 S和BvRE049 A进行PCR扩增，
三、将步骤二得到的PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果除了检测到219bp的条带外，还检测到243bp的条带和507bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。
进一步的，步骤二所述引物BvRE049 S为5'-AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'，引物BvRE049 A为5'-TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'。
进一步的，步骤二所述的PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。
本发明的有益效果：
本发明获得了与甜菜种子粒性相关的SSR分子标记BvRE049，可单独使用或者与其它引物联合使用，通过PCR检测，可对甜菜的种子粒性进行预先判断；可在甜菜任何生长时期，取甜菜幼嫩叶片或其它幼嫩组织提取基因组DNA作为材料，减少工作量，缩短种子粒性判断的周期；可对多株甜菜个体进行检测，判断种质在粒性性状上的纯合度。
本发明分别对分离世代多粒种与单粒种个体进行基因分型，验证标记与种子粒性表现的一致性。发现本发明的分子标记BvRE049在所有个体中，标记检测结果与种子粒性性状表现的一致性达到71.67％，在单粒与多粒个体中分别达到83.33％和60％，表明BvRE049与种子粒性有连锁关系，可用于种子粒性的检测。
将标记扩增区域的序列与甜菜基因组进行比对，对标记进行基因组定位。结果表明BvRE049分子标记定位于甜菜基因组中2号染色体的1154678-1154895区域。
BvRE049分子标记用于甜菜单粒种/多粒种种质的辅助选择和甜菜个体与后代粒性的预测，并辅助甜菜开花与种球形成的理论研究及甜菜种子粒性相关基因的挖掘。
附图说明
图1为甜菜种子单粒个体的基因分型结果；
图2为甜菜种子多粒个体的基因分型结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049，用于PCR扩增该分子标记的引物对为BvRE049 S和BvRE049 A，具体序列为：
BvRE049 S：5'-AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'
BvRE049 A：5'-TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'。
本实施方式的分子标记可用于判断甜菜种质或个体的种子粒性。在使用时，直接取一年生植株幼嫩叶片或其它幼嫩组织进行DNA提取与标记检测，不需要进行耗时两年的播种-母根培育-母根栽植-二年生植株性状调查工作；也可取二年生植株幼嫩叶片、幼嫩花序或其它幼嫩组织进行DNA提取与标记检测。用于判断整个种质的粒性时，可直接根据PCR结果结合统计学分析进行判断，或对其中重点个体进行性状调查作为补充，而不需要对全部个体进行检测。用于判断甜菜个体的育性时，也可根据PCR结果在一年生阶段或二年生抽薹初期、现蕾初期取幼嫩叶片、幼嫩花序或其它幼嫩组织即进行预判，缩小性状调查个体的范围，提前淘汰不需要的单粒/多粒个体。
具体实施方式二：本实施方式检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049的应用，它用于检测种子粒性。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：具体检测方法为：
一、从甜菜幼嫩组织中分离提取总DNA；
二、以步骤一得到的DNA为模板，采用引物BvRE049 S和BvRE049 A进行PCR扩增，
三、将步骤二得到的PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果除了检测到219bp的条带外，还检测到243bp的条带和507bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：步骤一中所述幼嫩组织为幼嫩叶片、幼嫩花序、幼嫩叶柄、幼嫩花薹、萌发期种子、幼苗期根或整株幼苗。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤二所述引物BvRE049 S为5'-AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'，引物BvRE049 A为5'-TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤二所述的PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。其它与具体实施方式二至五之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
通过高通量测序获得了大量甜菜序列，从中挖掘出了未经报道的SSR标记，筛选出质量与多态性良好的候选标记一百余个，同时构建了甜菜种子粒性的F2分离群体。
自分离世代中选取多粒种与单粒种个体构建混池，用集团混合分离分析(bulkedsegregation analysis,BSA)的方法对候选标记进行筛选，获得了在混池间表现出多态性的SSR标记。并从中选择出了与甜菜种子粒性相关的SSR分子标记，命名为BvRE049。
(一)标记对种子粒性的检测
一、分别提取30株甜菜幼嫩叶片的DNA；
二、以步骤一得到的DNA为模板，采用引物BvRE049 S和BvRE049 A进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：
BvRE049 S：5'-AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'
BvRE049 A：5'-TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'
表1
Figure BDA0001857386420000041
Figure BDA0001857386420000051
PCR扩增反应的条件为：
94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。
三、结果的检测方法：
将步骤二得到的PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，凝胶交联度8％，电泳时电压100V，时间5h。电泳后用10mg/L溴化乙锭(EB)溶液染色15～20min。
对分离世代种子粒性进行调查后，分别对单粒与多粒个体各30株进行了标记的基因分型。单粒的基因分型结果如图1所示，其中M表示DNA 50bp marker，P1表示母本(单粒)，P2表示父本(多粒)，编号1-30为30个单粒个体。多粒的基因分型结果如图2所示，其中M表示DNA 50bp marker，P1表示母本(单粒)，P2表示父本(多粒)，编号1-30为30个多粒个体。
分别对分离世代多粒种与单粒种个体进行基因分型，验证标记与种子粒性表现的一致性。发现分子标记BvRE049在所有个体中，标记检测结果与种子粒性性状表现的一致性达到71.67％，在单粒与多粒个体中分别达到83.33％和60％。表明BvRE049与种子粒性有连锁关系，可用于种子粒性的检测。
表2种子粒性相关标记对不同粒性植株的检测结果
Figure BDA0001857386420000052
根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果除了检测到219bp的条带外，还检测到243bp的条带和507bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。
(二)标记扩增区域序列的获得
通过PCR产物回收、T-A克隆和sanger测序，获得了标记的扩增序列。
经测序，BvRE049扩增序列如下(划线部分为SSR重复单元)：
单粒相关条带：219bp
AACCATGCTAAACCTGTGCCTGTGCCTGAGGCTGAGCCTGAGCCTGTCCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCT GAGCGAGCTGTGCCTCTAGCGATAATGGGGACAAAGGAAGAGAATGGAGCTGAAGCTGACATTGTAGAGGATTCTCGGGTTAAAATGGAAACTGAAAGTGCAGCAGATGTTAAACCTGAAAAGGAGGAAAAGCCGGTGAAAGCAGAACTA
多粒相关条带1：243bp
AACCATGCTAAACCTGTGCCTGTGCCTGAGGCTGAGCCTGAGCCTGTCCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCT GAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCGAGCTGTGCCTCTAGCGATAATGGGGACAAAGGAAGAGAATGGAGCTGAAGCTGACATTGTAGAGGATTCTCGGGTTAAAATGGAAACTGAAAGTGCAGCAGATGTTAAACCTGAAAAGGAGGAAAAGCCGGTGAAAGCAGAACTA
多粒相关条带2：507bp
AACCATGCTAAACCTGTGCCTGTGCCTGAGGCTGAGCCTGAGCCTGTCCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCT GAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCC TGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGC CTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAG CCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCCTGAGCGAGCTGTGCCTCTAGCGATAATGGGGACAAAGGAAGAGAATGGAGCTGAAGCTGACATTGTAGAGGATTCTCGGGTTAAAATGGAAACTGAAAGTGCAGCAGATGTTAAACCTGAAAAGGAGGAAAAGCCGGTGAAAGCAGAACTA
(三)标记扩增区域序列的分析与基因组定位
将扩增产物与植物非冗余核酸数据库进行BlastN比对分析，结果表明BvRE049的扩增产物与甜菜一条预测的细胞核抗原的序列相似，相似部分为扩增片段的第301-507bp，该部分的序列相似性为98％。
根据序列相似性将标记在甜菜基因组中进行定位，结果表明BvRE049定位于甜菜基因组中2号染色体的1154678-1154895区域。
序 列 表
<110> 黑龙江大学
<120>一种检测甜菜种子粒性的SSR分子标记BvRE049及其应用
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物BvRE049 S
<400> 1
aaccatgctaaacctgtgcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物BvRE049 A
<400> 2
tagttctgctttcaccggct 20
<210> 3
<211> 219
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 单粒相关条带对应扩增序列
<400> 3
aaccatgcta aacctgtgcc tgtgcctgag gctgagcctg agcctgtccc tgagcctgag 60
cctgagcctg agcgagctgt gcctctagcg ataatgggga caaaggaaga gaatggagct 120
gaagctgaca ttgtagagga ttctcgggtt aaaatggaaa ctgaaagtgc agcagatgtt 180
aaacctgaaa aggaggaaaa gccggtgaaa gcagaacta 219
<210> 4
<211> 243
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>多粒相关条带1对应扩增序列
<400> 4
aaccatgcta aacctgtgcc tgtgcctgag gctgagcctg agcctgtccc tgagcctgag 60
cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag cctgagcgag ctgtgcctct agcgataatg 120
gggacaaagg aagagaatgg agctgaagct gacattgtag aggattctcg ggttaaaatg 180
gaaactgaaa gtgcagcaga tgttaaacct gaaaaggagg aaaagccggt gaaagcagaa 240
cta 243
<210> 5
<211> 507
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>多粒相关条带2对应扩增序列
<400> 5
aaccatgcta aacctgtgcc tgtgcctgag gctgagcctg agcctgtccc tgagcctgag 60
cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag 120
cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag 180
cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag 240
cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag 300
cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag cctgagcctg agcctgagcc tgagcctgag 360
cgagctgtgc ctctagcgat aatggggaca aaggaagaga atggagctga agctgacatt 420
gtagaggatt ctcgggttaa aatggaaact gaaagtgcag cagatgttaa acctgaaaag 480
gaggaaaagc cggtgaaagc agaacta 507

Claims (6)

1.一种与甜菜种子粒性相关的SSR分子标记BvRE049，其特征在于用于PCR扩增该分子标记的引物对为BvRE049 S和BvRE049 A，具体序列为：
BvRE049 S：5'- AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'
BvRE049 A：5'- TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'；
其中种子多粒相关分子标记的检测序列如序列表中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，种子单粒相关分子标记的检测序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
2.检测如权利要求1所述的SSR分子标记BvRE049试剂的应用，其特征在于用于检测种子粒性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于具体的检测方法为：
一、从甜菜幼嫩组织中分离提取总DNA；
二、以步骤一得到的DNA为模板，采用引物BvRE049 S和BvRE049 A进行PCR扩增；
三、将步骤二得到的PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据扩增产物大小判定结果，如果只检测到219bp的条带，则判定为甜菜种子单粒；如果除了检测到219bp的条带外，还检测到243bp的条带和507bp的条带，则判定为甜菜种子多粒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤一中所述幼嫩组织为幼嫩叶片、幼嫩花序、幼嫩叶柄、幼嫩花薹、萌发期种子、幼苗期根或整株幼苗。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤二所述引物BvRE049 S为5'-AACCATGCTAAACCTGTGCC-3'，引物BvRE049 A为5'- TAGTTCTGCTTTCACCGGCT-3'。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤二所述的PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃再延伸5min。
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