JP2013515458A - 細胞培養試料中のマイコプラズマ汚染の迅速な検出 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、すべての目的のために参照によって組み込まれる、2009年10月29日に出願された米国仮特許出願第61/256,216号の優先権利益を主張するものである。
いくつかの実施形態では、本方法は、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
このアリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにDNAポリメラーゼを用いてリアルタイム核酸増幅反応を実施するステップであって、
アリコート中の核酸がさらに精製されることがなく、
この増幅反応が、二本鎖DNAの存在下で蛍光シグナルを生成する、インターカレートする蛍光色素を含むステップと、
増幅反応の増幅産物の融解温度を検出するステップであって、この増幅産物の存在が、細胞培養中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含む。
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)
を含むか、またはこれからなる第1の縮重プライマー、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)
を含むか、またはこれからなる第2の縮重プライマーを用いて、この部分を増幅するステップを含む。ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表す。
試料(細胞培養培地を含むがこれに限定されない)のアリコートを得るステップと、
このアリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにDNAポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を実施するステップであって、
(a)この実施ステップが第1および第2のプライマーを用いて部分を増幅することを含み、
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)
を含むまたはこれからなる第1の縮重プライマー、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)を含むまたはこれからなる第2の縮重プライマーを含み、ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表し、
(b)増幅反応の増幅産物の有無を検出し、増幅産物の存在が試料中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含む。
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)を含む第1の縮重プライマー、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)を含む第2の縮重プライマー
を含み、
ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表す。
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)からなり、
第2のプライマーはCCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)からなる。
ポリメラーゼ;
インターカレートする蛍光色素;
配列番号1または配列番号2によりプライムされる、ポリメラーゼにより増幅可能なポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド(すなわち、配列番号1および配列番号2からそれぞれなるプライマーにより増幅条件下でポリヌクレオチドの介在部分が増幅できるほど十分相補的な(場合によっては100%相補的な)配列を、このポリヌクレオチドが含む)
の少なくとも1つまたは複数をさらに含む。
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、リボ核酸(RNA)ポリマーおよびデオキシリボ核酸(DNA)ポリマーまたはそれらのアナログに相当し得る、モノマーのポリマーを互換的に指す。これには、RNAおよびDNAならびにそれらの改変形態、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA(商標))等の、ヌクレオチドのポリマーが含まれる。特定の用途では、核酸は、複数のモノマータイプ、例えばRNAサブユニットおよびDNAサブユニットの両方を含むポリマーとすることもできる。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、最小限の阻害または阻害なしで、未精製の培養培地試料中にいる数多くの様々なマイコプラズマ種を検出することができるという驚くべき発見に一部分は基づいている。本発明は、細胞培養培地で通常見出されるポリメラーゼ阻害物質に抵抗性があるポリメラーゼ酵素と組み合わせると特に有用である。さらに、本発明者らは、1つのプライマー対による、数多くのマイコプラズマ種の増幅および検出を可能にする特定のプライマーセットを同定した。このプライマーを、阻害物質抵抗性のポリメラーゼと組み合わせると、細胞培養培地中のマイコプラズマの迅速で効率的な検出を可能にする、強力な組合せが誕生する。
マイコプラズマ起源の任意の標的核酸を、増幅をベースとした本発明のアプローチの標的として使用することができる。マイコプラズマ核酸は他の生物と共通ではないものが好ましい。例えば、いくつかの実施形態では、特定の標的核酸は、哺乳類細胞(例えばヒト、ラット、マウス等)には存在しないか、または少なくとも、マイコプラズマの有無のためのアッセイの解釈を変えるのに十分なほど本方法の間に増幅することはない。本発明のプライマーはまた、非マイコプラズマ細菌の核酸を有意には増幅しないことが一般には望ましいが、これは常に可能または必要であるとは限らない。いくつかの実施形態では、常在細菌種に由来する核酸も本発明のプライマーにより増幅可能な場合、いくつかの実施形態では、その核酸は、そのアンプリコンの融解温度または(これらに限定されないが、アンプリコンの長さの測定またはヌクレオチドシークエンシングを行うことを含む)他の検出できる特徴によってマイコプラズマのアンプリコンと識別することができる。
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)
ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表す。「縮重」プライマーとは、類似であるが同一ではないプライマーの混合物を指す。したがって、上記のプライマーについては、配列番号1を含む順方向プライマーは、関連するプライマーの混合物を含み、W、Y、R、およびMは、関連するプライマーで異なる1つまたは複数の位置を表わす。本発明のいくつかの実施形態では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、それぞれ配列番号1および配列番号2からなるか、または基本的にそれらからなる。例えば多くの最新のオリゴヌクレオチド合成機を使用して、縮重プライマー混合物を生成することができる。
本発明はいかなる種類の核酸増幅方法を使用しても実施することができる。
本発明に有用なDNAポリメラーゼは、DNA分子を複製することができる任意のポリメラーゼとすることができる。典型的なDNAポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼであり、それらはPCRに特に有用である。耐熱性ポリメラーゼは、サーマス・アクティカス(Thermus aquaticus)(Taq)、サーマス・ブロキアヌス(Thermus brockianus)(Tbr)、サーマス・フラバス(Thermus flavus)(Tfl)、サーマス・ルーバー(Thermus ruber)(Tru)、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)(Tth)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(Tli)、およびサーモコッカス(Thermococcus)属の他の種、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)(Tac)、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)(Tne)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Tma)、サーモトガ(Thermotoga)属の他の種、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、パイロコッカス・ヴェッセイ(Pyrococcus woesei)(Pwo)、およびパイロコッカス(Pyrococcus)属の他の種、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus sterothermophilus)(Bst)、スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)(Sso)、ピロディクティウム・オカルタム(Pyrodictium occultum)(Poc)、ピロディクティウム・アビシ(Pyrodictium abyssi)(Pab)、およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)、ならびにそれらの突然変異体、変異体、または誘導体など多種多様な好熱性細菌から単離されている。
上述の説明および実施例にあるように、本発明の一態様では、標的マイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅させる前に、細胞培養物から核酸を精製する必要も、細胞培養物中に存在する阻害物質を除去する必要もない。したがって、本発明は、場合によっては哺乳類または他の非原核細胞を含有する細胞培養培地のアリコートを増幅反応に加え、マイコプラズマ核酸の存在に向けて増幅する態様を提供する。簡潔にいえば、特に、本明細書に記載のrpoBプライマーを使用する場合、かつ/あるいは安定化添加物(例えばオスモライトおよび/もしくはヘパリン)および/または異種のDNA結合ドメインを含むハイブリッドポリメラーゼを使用する場合、細胞培養培地のアリコートを増幅に直接使用することができるという点で試料調製の必要性はない。
本発明はまた、例えば、細胞培養中の可能なマイコプラズマ汚染を検出するためのキットを提供する。キットは、場合によっては、書面の説明書または電子説明書(例えばCD−ROMまたはDVD上)を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、キットの中に試薬を保持するためのケースまたは容器を含むことになる。これらは別々にまたは一緒に含むことができる。
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)を含む(またはこれからなる)第1のプライマー(すなわちプライマーの縮重混合物)、ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表わす;
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)を含む(またはこれからなる)第2のプライマー(すなわちプライマーの縮重混合物)、ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表わす;
ポリメラーゼ(本明細書に記載のハイブリッドポリメラーゼを含むが、これらに限定されない);
インターカレートする蛍光色素;
配列番号1または配列番号2によりプライムされ、ポリメラーゼにより増幅することができるポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド;ならびに/または
オスモライトおよび/もしくはヘパリン
の1つまたは複数を含むことになる。
以下の種に由来するゲノムDNAをATCCから購入した。A.ライドラウィー(A.laidlawii)(23206D);M.オラーレ(M.orale)(23714D);M.アルギニニ(M.arginini)(23838D);M.ファーメンタンス(M.fermentans)(19989D);M.ホミニス(M.hominis)、株PG21(23114D));M.ピルム(M.pirum)(25960D);M.ヒオリニス(M.hyorhinis)(17981D);カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)(10231D−5);ラクトバチルス・カゼイ(lactobacillus casei)(334D);バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)(23857D)。M.サルバリウム(M.salivarium)(NCTC010113)のゲノムDNAはMinerva BioLabsから購入した。Iscoves培地はATCC、FBSはHyclone、EGM2はLonza、およびEsgro completeはChemicon、L15はSigmaから購入した。RPMI、Neurobasal培地、DMEM、DMEM/F12、F12K、KSFM、OPTIMEM、MEM、およびMEM ALPHAは、Gibcoから入手した。すべての培地(KSF、Neurobasal、ESGRO complete、OPTIMEM以外)に10%のFBSを添加した。汚染および非感染の培養細胞株を、様々な共同研究者から入手した。プライマーはIDTから入手した。プライマーの配列は次のとおりである。順方向プライマー5’−GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG−3’;逆方向プライマー5’−CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG−3’。リアルタイムPCR反応は、Bio−Rad CFX96リアルタイムPCR検出システム上で容量20μl中にて、SsoFast EvaGreen Supermix(Bio−Rad)、指定の鋳型、および最終濃度0.5マイクロモルのプライマーを用いて、以下の条件下で実施した。最初の変性:94℃、3分、および94℃、10秒、58℃、30秒、72℃、30秒の40サイクル。データはCFXデータマネージャーソフトウェアを用いて分析した。
リアルタイムPCRのための汎用rpoBプライマーの設計
rpoB遺伝子は、従来のPCRにより細胞培養物中のマイコプラズマ汚染を検出するためにこれまで述べられてきた(Kong、H.ら(2007)Appl Microbiol Biotechnol、77、223〜232)。リアルタイムPCRに適したプライマーを設計するために、マイコプラズマ8種(M.ピルム(M.pirum)、A.ライドラウィー(A.laidlawii);M.アルギニニ(M.arginini);M.オラーレ(M.orale);M.サルバリウム(M.salivarium);M.ホミニス(M.hominis);M.ファーメンタンス(M.fermentans);M.ヒオリニス(M.hyorhinis))の配列を、Accelrysにより開発されたソフトウェアを用いてアライメントした。細胞培養汚染に見出される最も一般的な8種を検出するために、400〜600bpにわたる2つの保存領域をプライマー結合部位として選択し、保存性が低い様々な位置に混合塩基を用いた(図1)。
マイコプラズマ種の間でrpoB遺伝子の配列に相違があるため、PCRアッセイの感度によっては種の間に様々な検出限界が生み出される可能性がある。アッセイの感度を調べるために、本発明人らは、代表的なマイコプラズマ2種に対する検出限界を測定した。A.ライドラウィー(A.laidlawii)のrpoB遺伝子の配列は、保存性が低くかつ本発明人らのプライマーとミスマッチを示し(図1B、ラベルL)、他の種よりも遅いCt値を生じさせた(図2A、円を伴う線)ので、A.ライドラウィー(A.laidlawii)を選択した。M.ファーメンタンス由来のrpoB遺伝子のDNA配列(図1B、ラベルF)は、プライマー配列とほぼ同一であり、本発明人らの方法では早いCtで検出された。(図2A、クロスを伴う線)。アッセイがこれら2種に対して成功する範囲を決定するために、ゲノムDNAの10倍の系列希釈(100pg〜1fg)を、rpoB PCRアッセイに供した。保存性が低い種であるA.ライドラウィー(A.laidlawii)に対しては、10fgが検出限界であり(図3A)、これは、ゲノムサイズを1497kb(NC_010163.1)とすれば、約6コピーのゲノムに相当する。M.ファーメンタンス(M.fermentans)由来のゲノムDNAを鋳型として用いた場合は(図3B)、1245bpのゲノムサイズに基づいて、約1コピーに相当する、1fgのゲノムDNAが検出された(Schaeverbeke,T.ら(1998)J Clin Microbiol、36、1226〜1231)。極めて低いコピー数の評価は、コピー数を決定するために、Ctよりもむしろ、数多くの複製の中で成功した増幅の数を用いるアプローチ(Sykes,P.J.ら(1992)Biotechniques、13、444〜449)のようなデジタルPCRによって行うのが最善である。この方法では、鋳型分子のポアソン分布が仮定され、単コピー反応の66%のみが標的を含有し、したがって増幅し、1未満のコピーを有するものはそれより少ないことに相当する(Sykes,P.J.ら(1992)Biotechniques、13、444〜449)。単コピーの検出を確認するために、本発明人らは、鋳型としてM.ファーメンタンス(M.fermentans)ゲノムDNA 1fgを用いて75の複製試料を増幅した。rpoBアンプリコンは、反応の53%で増幅に成功し、これは0.8のゲノム当量に基づいた予測と一致する(データを示さず)。したがって、本発明人らの方法は、高感度であり、PCR反応当たり約1〜6のゲノムコピーを検出することができる。
SsoFast EvaGreen Supermixの有用な特性の1つは、血液または血清などの粗試料中に存在するPCR阻害物質に対するその抵抗性である。本発明人らは、FBSを含む様々な細胞培養培地の存在下でSsoFast EvaGreen Supermixの性能を試験した。培地は10%の最終濃度でリアルタイムPCR反応に含めた。このmixの性能特性を試験するために、本発明人らは、マイコプラズマ感染試料に由来する精製されたゲノムDNAをPCRのための鋳型として用いた。表1に示すように、精製されたDNA単独の増幅から、平均27のCtが得られた。様々な培地調製物をPCR反応に加えた場合は、本発明人らはCtのわずかな遅延(0.5Ct未満)を観察した。FBSのみが、ほぼ1Ctの遅延を示した。これらのデータより、SsoFast EvaGreen Supermixは、様々な組織培養培地の存在下で、また10%のFBS(最終濃度)の存在下で極めて効率的なPCR増幅を生み出すことが示される。
マイコプラズマは組織培養において誤った結果に導く恐れのある深刻な問題である。容易に判断することができる典型的な細菌または真菌の汚染物質と異なり、マイコプラズマ汚染は特異的な試験なしでは容易に検出できないため、検出されないままになることが簡単に起こり得る。したがって、定期的な試験が、強く推奨されるが、現在の試験方法が有する問題のために、試験を常に行うわけにはいかない。本発明人らは、ここで、細胞培養上清中のマイコプラズマを検出するための新規のリアルタイムPCRアッセイを提示する。本発明人らのプロトコルの主な利点は、改善された特異性および感度、広範囲な試料調製の回避、HT試料スループット、簡単な反応セットアップ、および速度である。これらの利点によりマイコプラズマ汚染の試験がはるかに実用的なものになる。
非公式配列表
配列番号1
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG
配列番号2
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG
配列番号3
配列番号4
配列番号5
TGC ATT TTG TCA TCA ACC ATG TG
配列番号6
CCT TCA CGT ATG AAC AT
配列番号7
M ピルム(M pirum)
順方向
GAAGATATGCCGCATTTAGAAGATGGC
配列番号8
M ピルム(M pirum)
逆方向
CAACAACCATTGGGTGGTAAATCACAAAATGGT
配列番号9
A.ライドラウィー(A.laidlawii)
順方向
GAAGATATGCCATATTTAGCAGATGGA
配列番号10
A.ライドラウィー(A.laidlawii)
逆方向
CAACAACCAATGGGTGGTAAAGCTCAAAACGGT
配列番号11
M.アルギニニ(M.arginini)
順方向
GAAGAAATGCCATACTTAGAAGATGGA
配列番号12
M.アルギニニ(M.arginini)
逆方向
CAACAACCACTTGGTGGTAAATCACAAAATGGT
配列番号13
M.オラーレ(M.orale)
順方向
GAAGAAATGCCTTATTTAGAAGATGGT
配列番号14
M.オラーレ(M.orale)
逆方向
CAACAACCTCTTGGTGGTAAAAGTCAAAACGGT
配列番号15
M.サルバリウム(M.salivarium)
順方向
GAAGATATGCCTTATTTAGAAGATGGA
配列番号16
M.サルバリウム(M.salivarium)
逆方向
CAACAACCACTTGGTGGAAAGAGTCAAAATGGT
配列番号17
M.ホミニス(M.hominis)
順方向
GAAGAAATGCCTTATTTAGCAGATGGA
配列番号18
M.ホミニス(M.hominis)
逆方向
CAACAACCACTTGGTGGAAAGAGTCAAAATGGT
配列番号19
M.ファーメンタンス(M.fermentans)
順方向
GAAGATATGCCTTATTTAGAAGATGGT
配列番号20
M.ファーメンタンス(M.fermentans)
逆方向
CAACAACCTCTTGGAGGTAAGAGTCAAAACGGT
配列番号21
M.ヒオリニス(M.hyorhinis)
順方向
GAAGATATGCCATTTTTAGAAGATGGA
配列番号22
M.ヒオリニス(M.hyorhinis)
逆方向
CAACAACCACTTGGAGGAAAAAGTCAAAACGGT
配列番号23
図1順方向コンセンサス
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG
配列番号24
図1逆方向コンセンサス
CAACAACCACTKGGTGGWAARAGTCAAAAYGG
Claims (33)
- 細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するために熱安定性DNAポリメラーゼを用いてリアルタイム核酸増幅反応を実施するステップであって、
前記アリコート中の核酸がさらに精製されることがなく、
前記増幅反応が、二本鎖DNAの存在下で蛍光シグナルを生成する、
インターカレートする蛍光色素を含むステップと、
前記増幅反応の増幅産物の融解温度を検出するステップであって、前記増幅産物の存在が、前記細胞培養中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記増幅反応がマイコプラズマ・アルギニニ(Mycoplasma arginini)、M.ピルム(M.pirum)、M.ホミニス(M.hominis)、M.ファーメンタンス(M.fermentans)、M.サルバリウム(M.salivarium)、M.オラーレ(M.orale)、M.ヒオリニス(M.hyorhinis)、およびアコレプラズマ・ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)のいずれでも、前記アリコート中に存在する場合に増幅することができることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記マイコプラズマ核酸が、少なくとも50ヌクレオチドのrpoB遺伝子部分を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記実施ステップが、以下の縮重プライマー:
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)、
を用いて、前記部分を増幅することを含み、
ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表わす
ことを特徴とする方法。 - 請求項4に記載の方法において、前記反応が、1つの順方向プライマーおよび1つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的DNA結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、前記配列非特異的DNA結合ドメインが、Sso7DNA結合ドメインであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記アリコートが、Taqポリメラーゼの活性を少なくとも10%阻害するために十分量の増幅阻害物質を含むことを特徴とする方法。
- 請求項10に記載の方法において、前記阻害物質が、細胞片、細胞老廃物(例えば多糖またはタンパク質)、およびウシ胎児血清またはその増幅阻害物質成分からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび/またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンN−オキシド(TMAO)、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにDNAポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を実施するステップであって、
(a)前記実施ステップが第1および第2のプライマーを用いて前記部分を増幅することを含み、前記第1のプライマーが次の縮重配列:
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)
を含み、かつ前記第2のプライマーが次の縮重配列:
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)
を含み、
ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表し、
(b)前記増幅反応の増幅産物の有無を検出し、増幅産物の存在が細胞培養物中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項14に記載の方法において、前記増幅反応が、リアルタイムでモニターされることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記増幅反応が、二本鎖DNAの存在下で、一本鎖DNAのみの存在下で生成する蛍光シグナルの少なくとも2倍の蛍光シグナルを生成するインターカレートする蛍光色素を含むことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記第1および第2のプライマーが、それぞれ以下の縮重配列:
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)
からなることを特徴とする方法。 - 請求項14に記載の方法において、前記アリコート中の核酸がさらに精製されないことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記反応が、rpoB遺伝子にハイブリダイズするように設計された、1つの順方向プライマーおよび1つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的DNA結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
- 請求項22に記載の方法において、配列非特異的DNA結合ドメインが、SsoDNA結合ドメインであることを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび/またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
- 請求項24に記載の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンN−オキシド(TMAO)、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 細胞培養培地からのマイコプラズマDNAを、存在する場合に増幅するためのキットであって、
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)を含む第1の縮重プライマー、および
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)を含む第2の縮重プライマー
を含み、
ここで、WはAまたはTを表し、YはCまたはTを表し、RはAまたはGを表し、MはAまたはCを表す
ことを特徴とするキット。 - 請求項26に記載のキットにおいて、前記第1のプライマーが、
GAAGAWATGCCWTATTTAGAAGATGG(配列番号1)からなり、
前記第2のプライマーが、
CCRTTTTGACTYTTWCCACCMAGTGGTTGTTG(配列番号2)
からなることを特徴とするキット。 - 請求項26に記載のキットにおいて、
ポリメラーゼ;
インターカレートする蛍光色素;
配列番号1または配列番号2によりプライムされる、ポリメラーゼにより増幅可能なポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド
の少なくとも1つまたは複数をさらに含むことを特徴とするキット。 - 請求項26〜28のいずれか1項に記載のキットにおいて、前記キットが、マイコプラズマrpoB遺伝子の少なくとも50の連続したヌクレオチドを含む核酸を含む陽性対照試料をさらに含むことを特徴とするキット。
- 請求項26に記載のキットにおいて、オスモライトおよび/またはヘパリンをさらに含むことを特徴とするキット。
- 請求項30に記載のキットにおいて、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンN−オキシド(TMAO)、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とするキット。
- 請求項28に記載のキットにおいて、前記ポリメラーゼが、配列非特異的DNA結合ドメインに連結されることを特徴とするキット。
- 請求項32に記載のキットにおいて、前記配列非特異的DNA結合ドメインが、Sso7DNA結合ドメインであることを特徴とするキット。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
US10640834B2 (en) | 2014-09-10 | 2020-05-05 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Method for detecting mycoplasma |
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