CN107406842A - 检测基因组编辑 - Google Patents
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Abstract
提供了用于对基因组编辑进行定量的方法、组合物和试剂盒。在一个方面中,本发明提供了一种同时对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物定量的方法,其中所述细胞样品已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点的特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2015年1月9日提交的美国临时专利申请62/101,828,2015年8月5日提交的美国临时专利申请62/201,446的优先权,这两份申请的内容被纳入本文作为参考。
联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HL100406和HL098179资助完成。政府享有本发明的某些权利。
序列表提交的引用
本申请包括2016年1月8日生成的名为“0968442_ST25.txt”的文本文件的序列表并且含有9,073个字节。该文本文件中含有的内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。
发明背景
生物技术和药学界对基因组编辑的方法和组合物有极大兴趣。事实上,精确编辑基因组的能力被认为是多种治疗应用开发的限速步骤。最近的技术已经拓展了可用于基因组编辑的多个工具。这类工具包括锌指核酸酶(参见,例如,Kim等,Proc Natl Acad Sci US A.1996年2月6日;93(3):1156-60);转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)(参见,例如,Miller等,Nat Biotechnol.2011年2月;29(2):143-8);CRISPR-Cas(参见,例如,Mali等,Nat Methods.2013年10月;10(10):957-63)核酸酶;及其缺刻酶形式。
发明内容
在一个方面中,本发明提供了一种同时对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物定量的方法,其中所述细胞样品已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点的特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触,或所述细胞样品包含已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞,所述方法包括:a)形成多个具有平均体积的混合物划分产物(mixture partitions),其中混合物划分产物包含:i)靶基因组区;ii)DNA-依赖性DNA聚合酶;iii)正向和反相寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反应引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区,并且其中引物设置成在聚合酶存在下扩增靶基因组区;iv)可检测标记的寡核苷酸参考探针,其中参考探针与野生型靶基因组区,含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的同源定向修复引入的HDR突变的靶基因组区,和含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的NHEJ修复引入的NHEJ突变的靶基因组区杂交;v)可检测标记的寡核苷酸HDR探针,其中HDR探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交;并且vi)可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落(drop-off)探针,其中所述NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区杂交,并且其中所述NHEJ脱落探针不与含有NHEJ突变的靶基因组区杂交;b)扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区;和c)通过检测多个混合物划分产物中标记的探针与靶基因组区的杂交来确定野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量、和含有NHEJ突变的靶基因组区的量。
在一些实施方式中,细胞样品包含已经与设置成在靶基因组区中切割或切开DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞。在一些情况中,接触的细胞的至少一部分已被编辑,所述编辑由通过同源定向修复将HDR模板核酸插入位点特异性基因组编辑试剂的切割位点中来进行。在一些实施方式中,细胞样品包含已经与设置成在靶基因组区切割或切开DNA的位点特异性基因组编辑试剂接触(例如,没有与HDR模板核酸接触)的细胞。在一些情况中,已经通过在位点特异性基因组编辑试剂的切割位点处的非同源末端连接修复编辑了接触的细胞的至少一部分。
在一些实施方式中,参考和HDR探针包括相同的可检测标记物。在一些实施方式中,HDR探针不与野生型靶基因组区杂交。在一些实施方式中,NHEJ脱落探针不与含有HDR突变的靶基因组区杂交。在一些实施方式中,NHEJ脱落探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交。在一些实施方式中,DNA依赖性DNA聚合酶包含5’至3’外切核酸酶活性和c)包括检测多个混合物划分产物中由对杂交的标记的探针的5’至3’外切核酸酶消化导致的荧光增加。在一些实施方式中,多个混合物划分产物还包括HDR暗寡核苷酸探针,其中HDR暗探针包括不可由DNA聚合酶延伸的3’末端,并且其中HDR暗探针与HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。
在一些实施方式中,NHEJ脱落探针与HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。在一些实施方式中,位点特异性基因组编辑试剂是CRISPR-Cas9试剂、TALEN、或锌指核酸酶。在一些实施方式中,位点特异性基因组编辑试剂包括2种位点特异性基因组缺刻酶,其中各缺刻酶设置成在其他缺刻酶的不到约1kb以内切开细胞基因组中的靶DNA。在一些实施方式中,该方法包括,在形成多个混合物划分产物之前,提供已经与位点特异性基因组编辑试剂接触的细胞样品并提取靶基因组区。在一些实施方式中,该方法包括,在形成多个混合物划分产物之前,提供细胞样品并提取靶基因组区。
在一些情况中,所述提供包括使多个细胞与位点特异性基因组编辑试剂接触。在一些情况中,向患者给予与位点特异性基因组编辑试剂接触的多个细胞,并且所述提供包括提供来自已经向其给予细胞的患者的细胞样品。在一些情况中,所述提供还包括使多个细胞与HDR模板核酸接触,其中所述HDR模板核酸包含靶基因组区的部分的突变并且设置成在对靶基因组区的同源定向修复期间发挥模板作用,从而将HDR突变引入靶基因组区。在一些情况中,HDR模板核酸包含DNA。在一些情况中,HDR模板核酸是单链DNA寡核苷酸。
在一些实施方式中,多个混合物划分产物包含多个结构上不同的可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针,其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区的不同亚区杂交。在一些情况中,所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交。在一些情况中,其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且不与HDR突变的亚区杂交。在一些情况中,其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且与含有HDR突变的靶基因组区杂交。
在一些实施方式中,c)包括通过对以下进行检测并计数来确定样品中具有NHEJ突变的靶基因组区的浓度:i)不含靶基因组区的混合物划分产物的总数;和ii)以下部分的总数:-其中仅检测到含NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;和-不含靶基因组区的混合物划分产物,其中浓度计算为多个混合物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。
在一些实施方式中,c)包括通过对以下进行检测和计数以确定样品中具有HDR突变的靶基因组区的浓度:i)以下的总数:-不含靶基因组区的混合物划分产物;-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物;和-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;并且ii)以下的总数:-i);和-其中检测到HDR突变的混合物划分产物,其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。
在一些实施方式中,c)包括通过对以下进行检测和计数以确定样品中野生型靶基因组区的浓度:i)以下的总数:-不含靶基因组区的混合物划分产物;和-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;和ii)以下的总数:-i);-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物;和-其中检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;并且其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。
在另一个方面中,本发明提供了一种鉴定细胞的基因组编辑的优化条件的方法,该方法包括:a)在第一组条件下对多个细胞进行位点特异性基因组编辑以提供第一细胞样品;b)在第二组条件下对多个细胞进行位点特异性基因组编辑以提供第二细胞样品;c)进行权利要求的方法中的任一种以对第一和第二细胞样品中NHEJ编辑的靶基因组区和HDR编辑的靶基因组区的数量进行定量以确定第一和第二组条件的基因组编辑效率;d)比较第一和第二组条件的基因组编辑效率以鉴定提供较高基因组编辑效率的一组条件;和e)选择提供较高基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。
在一些实施方式中,a)包括使第一细胞样品与第一浓度的基因组编辑试剂接触;和b)包括使第二细胞样品与第二浓度的基因组编辑试剂接触。在一些实施方式中,a)包括使第一细胞样品与第一基因组编辑试剂接触;和b)包括使第二细胞样品与第二结构上不同的基因组编辑试剂接触。在一些实施方式中,c)包括确定第一组条件的HDR基因组编辑效率并确定第二组条件的HDR基因组编辑效率;d)包括比较第一和第二组条件的HDR基因组编辑效率以鉴定提供较高HDR基因组编辑效率的一组条件;和e)包括选择提供较高HDR基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。
在一些情况中,c)包括确定第一组条件的NHEJ基因组编辑效率并确定第二组条件的NHEJ基因组编辑效率;d)包括比较第一和第二组条件的NHEJ基因组编辑效率以鉴定提供较低NHEJ基因组编辑效率的一组条件;和e)包括选择提供较高HDR基因组编辑效率和较低NHEJ基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。
在一些实施方式中,在前述方法之一中,细胞样品来自已经向其给予基因组编辑的细胞的患者,并且该方法还包括从确定的野生型靶基因组区的量、确定的含有HDR突变的靶基因组区的量、和/或确定的含有NHEJ突变的靶基因组区的量估计患者中基因组编辑的细胞的数量。
在一个方面中,本发明提供了监测患者中细胞群的方法,其中所述细胞包括编辑的基因组的群(例如,编辑的基因组的克隆群),所述方法包括:提供来自已经向其给予(例如,作为治疗的部分)包含编辑的基因组的群的细胞的个体的样品;分析所述样品以确定所述样品中编辑的基因组或其片段的数量;和从样品中编辑的基因组或其片段的数量估计患者中包含编辑的基因组的群(例如,编辑的基因组的克隆群)的细胞的数量。在一些实施方式中,分析样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括对样品中同源定向修复(HDR)、非同源末端连接(NHEJ)、同时HDR和NHEJ、和/或野生型(即,未编辑)的基因组或其片段的数量进行定量。
在一些情况中,该方法包括通过施用前述HDR和/或NHEJ定量方法中的任一种对HDR、NHEJ或HDR和NHEJ进行定量来分析样品以确定编辑的基因组或其片段的数量。在一些情况中,分析样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括对含有通过基因组编辑诱导的多态性的基因组的数量进行定量。在一些情况中,定量包括液滴数字核酸扩增。在一些情况中,分析样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括大规模平行测序、高通量测序、或单分子测序。
在一些情况中,前述方法之一还包括基于对患者中包含编辑的基因组的群的细胞的估计数量确定是否向患者给予包含编辑的基因组的群(例如,编辑的基因组的克隆群)的额外的细胞。在一些情况中,前述方法之一还包括比较患者中编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的估计数量与已经给予患者的基因组编辑的细胞的数量。在一些情况中,患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量和已经给予患者的细胞的数量之间的差表示治疗是否成功或是否将要成功。在一些情况中,该方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品的患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆的)群的细胞数量的变化确定治疗成功或失败的风险因数(例如,让步比)。
在一些情况中,如果从给予细胞到从患者获得样品在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量降低,或显著降低(例如,降低至少约25%、50%、75%、90%或更多),则该方法包括确定以向该患者给予包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的额外的细胞。在一些情况中,从给予细胞到从患者获得样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量降低,或显著降低(例如,降低至少约25%、50%、75%、90%或更多)表明治疗将不会成功。在一些情况中,从给予细胞到从患者获得样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量增加或基本没有降低表明治疗将会成功。在一些情况中,从给予细胞到从患者获得样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量降低或显著降低指示向所述患者给予药物或化疗剂,或指示调整药物方案(例如,给予的药物的变化或剂量变化)。
在一些情况中,该方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的额外的细胞。在一些情况中,从给予细胞到从患者获得样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量的减少表明需要向所述患者给予包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的额外的细胞。在一些情况中,该方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含替代编辑的基因组的第二(例如,结构上不同)群(例如,克隆群)的细胞。
在一些实施方式中,该方法还包括:分析第二样品以估计患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的第二数量,其中第二样品是在比第一样品晚的时间点从所述患者获取的样品;并且比较来自第一与第二样品的患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量变化。在一些情况中,基因组编辑的细胞的数量变化表明治疗是否成功或是否将要成功。在一些情况中,从第一样品到第二样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量降低(例如,显著降低至少约25%、50%、75%、90%或更多)表明治疗不成功或将不会成功。在一些情况中,从第一样品到第二样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量增加(例如,显著增加至少约25%、50%、75%、90%或更多)表明治疗成功或将会成功。在一些情况中,从第一到第二样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量增加或降低的速率(rate)分别表明治疗成功或不成功或者将会成功或不成功。
在一些情况中,该方法包括从第一到第二样品,基于患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆的)群的细胞数量的变化(例如,增加或降低)或变化速率确定治疗成功或失败的风险因数。在一些情况中,风险因数是让步比。
在一些实施方式中,该方法包括基于从第一到第二样品在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的额外的细胞。在一些情况中,从第一到第二样品,在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量的减少表明需要向所述患者给予包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的额外的细胞。在一些情况中,该方法包括基于从第一到第二样品在患者中包含编辑的基因组的(例如,克隆)群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含替代编辑的基因组的第二(例如,结构上不同)群(例如,克隆群)的细胞。例如,从第一到第二样品的基因组编辑的细胞数量降低可表明需要向该患者给予替代编辑的基因组的第二群。
在另一个方面中,本发明提供了体外监测细胞群的方法,其中所述细胞包括编辑的基因组的群(例如,编辑的基因组的克隆群),该方法包括:提供包含编辑的基因组的群(例如,编辑的基因组的克隆群)的细胞,对所述群的样品中的编辑的基因组的第一数量进行定量,选择细胞群,对所述群的样品中的编辑的基因组的第二数量进行定量,并且比较所述第一和第二数量以确定对选择的响应。在一些实施方式中,定量包括对样品中同源定向修复(HDR)、非同源末端连接(NHEJ)、同时HDR和NHEJ、和/或野生型(例如,未编辑)基因组或其片段的数量进行定量。
在一些情况中,选择包括使细胞群与药物或化疗剂接触。在一些情况中,选择包括使细胞群与生长因子或细胞因子接触。在一些情况中,选择包括培养细胞或传代细胞。
在一些情况中,定量包括使用前述HDR和/或NHEJ定量方法中的任一种对HDR、NHEJ、或HED和NHEJ进行定量。在一些情况中,定量对含有通过基因组编辑诱导的多态性的基因组的数量进行定量。在一些情况中,定量包括液滴数字核酸扩增。在一些情况中,定量包括大规模平行测序、高通量测序、或单分子测序。
另一方面,本发明提供生成特定剂量的基因组编辑的细胞的方法,该方法包括:提供包含编辑的基因组的群(例如,编辑的基因组的克隆群)的细胞群,对所述群的样品中编辑的基因组的数量进行定量,混合包含编辑的基因组的群的细胞群与未经位点特异性基因组编辑试剂编辑的(例如,野生型)细胞的群以获得具有特定剂量的基因组编辑的细胞的群。在一些情况中,基因组编辑的细胞的特定剂量是含有或含有约1%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、或75%基因组编辑的细胞的剂量。在一些情况中,基因组编辑的细胞的特定剂量是含有或含有约20%基因组编辑的细胞至约50%基因组编辑的细胞的剂量。
定义
除非另有说明,本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常,本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸合成。按照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤(通常参见,Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第2版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.),其通过引用纳入本文),全文中提供这些参考文献。
术语“扩增反应”指用于以线性或指数方式倍增核酸靶序列拷贝的各种体外方法。这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR);DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR方案:方法和应用指南)(Innis等编,1990))(LCR);基于QBeta RNA复制酶和基于RNA转录的扩增反应(例如,涉及T7、T3或SP6引导的RNA聚合),例如转录扩增系统(TAS),基于核酸序列的扩增(NSABA),和自主维持序列复制(3SR);等温扩增反应(例如,单引物等温扩增(SPIA));以及本领域技术人员已知的其它方法。
“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括,例如,一种或多种引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”一般是指靶核酸的指数型增长。然而,本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长,如由循环测序或线性扩增所得。扩增产生扩增产物,或“扩增子”。
术语“扩增反应混合物”指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些试剂包括酶、水性缓冲剂、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。扩增反应混合物还可包含稳定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。根据上下文,混合物可以是完全或是不完全的扩增反应混合物。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的;参见例如,美国专利号4,683,195和4,683,202;和《PCR方案:方法和应用指南》,Innis等编,1990。示例性PCR反应条件一般包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤,之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤,之后是杂交步骤,之后是独立的延伸步骤。
“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的并且通常长度小于50个核苷酸,例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列,参见例如Innis等(同上)。引物可以是DNA、RNA或DNA部分与RNA部分的嵌合体。在一些情况中,引物可包括一个或多个带修饰或非天然的核苷碱基。在一些情况中,引物被标记。引发靶多核苷酸序列的扩增(例如,PCR)的引物被称为“扩增引物”。
术语“探针”指与目标分子特异性相互作用或特异性结合,并因此检测靶多核苷酸的分子(例如蛋白质、核酸、适体等)。与目标分子特异性相互作用或特异性结合靶多核苷酸的分子的非限制性示例包括核酸(如寡核苷酸)、蛋白质(如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架等)和适体。一般而言,用可检测标记物标记探针。探针可通过来自可检测标记物的信号的增加或减少来表示靶多核苷酸的水平或存在。在一些情况中,探针通过用DNA依赖性DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性消化来检测扩增反应中的靶多核苷酸。
示例性的探针包括具有发夹结构的寡核苷酸引物,使荧光分子保持靠近银光猝灭剂直至通过引物延伸被强制拉开,例如,Whitecombe等,Nature Biotechnology,17:804-807(1999)(AMPLIFLUORTM,发夹引物)。示例性的探针可替代性地包括连接至荧光团和荧光猝灭剂的寡核苷酸,其中荧光团和猝灭剂靠近直至寡核苷酸特异性结合至扩增产物,例如,Gelfand等,美国专利号5,210,015(TAQMANTM,PCR探针);Nazarenko等,Nucleic AcidsResearch,25:2516-2521(1997)(“蝎型探针”);和Tyagi等,Nature Biotechnology,16:49-53(1998)(“分子信标”)。这类探针可用于测量反应完成时反应产物的总量或测量扩增反应期间扩增产物的生成。
术语“标记物”、“可检测标记物”、“可检测部分”和类似术语指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如,可用的标签包括荧光染料(荧光团)、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如,ELISA中常用)、生物素、地高辛、32P和其它同位素、半抗原、以及可被检测的蛋白质(例如通过将放射性标签整合至肽中或或用于检测与肽特异性反应的抗体)。该术语包括单一标记试剂的组合,例如,提供独特可检测特征(例如,特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可以采用本领域已知的用于将标记物偶联到需要的试剂的任何方法,例如,使用如下文献中所述的方法:Hermanson,《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)1996,圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)。
核酸或其部分与另一核酸“杂交”的某些条件使得生理缓冲液(例如,pH 6-9,25-150mM盐酸盐)中限定温度下的非特异性杂交最少。在一些情况中,核酸或其部分与一组靶核酸之间共有的保守序列杂交。在一些情况中,如果包括与超过一个核苷酸伴侣互补的“通用”核苷酸在内有至少约6、8、10、12、14、16或18个连续的互补核苷酸,引物或其部分能杂交至引物结合位点。或者,如果在至少约12、14、16或18个连续的互补核苷酸中有不到1或2个互补错配,引物或其部分能杂交至引物结合位点。在一些实施方式中,发生特异性杂交的限定温度是室温。在一些实施方式中,发生特异性杂交的限定温度高于室温。在一些实施方式中,发生特异性杂交的限定温度至少约37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。在一些实施方式中,发生特异性杂交的限定温度是或约37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。
“模板”指包含待扩增,侧接一对引物杂交位点,或与引物杂交位点相邻的多核苷酸序列。因此,“靶模板”或“靶多核苷酸序列”包含毗邻至少一个引物杂交位点的靶多核苷酸序列。在一些情况中,“靶模板”包含侧接有“正向”引物和“反向”引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。
“靶基因组区”是指被靶向用于通过位点特异性基因组编辑试剂的基因组编辑的生物体的基因组区。可通过杂交并扩增一个或多个扩增引物来扩增靶基因组区。靶基因组区可含有一个或多个亚区,其含有特异性靶向的切割或缺刻位点。
“位点特异性基因组编辑试剂”是指可用于位点特异性基因组编辑的组分或组分的组。一般而言,这种试剂含有靶向模块和核酸酶或缺刻酶模块。示例性的靶向模块含有核酸,例如,引导RNA,如用于CRISPR/Cas-型系统中的那些。或者,靶向模块可以是,或衍生自转录因子结构域,或TAL效应DNA结合结构域。例如,锌指结构域可用作靶向部分。示例性的核酸酶或缺刻酶模块包括,但不限于IIS型限制性内切核酸酶(例如,FokI),Cas核酸酶(例如,Cas9)或其衍生物。在一些情况中,位点特异性基因组编辑试剂使用引导RNA、“死”Cas核酸酶、和IIS型限制性内切核酸酶的组合。其它变体则是本领域已知的。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于,提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于,肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如,硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基,如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰,包括但不限于用荧光团(例如,量子点)或其他部分加帽。
“聚合酶”是指能进行模板引导的多核苷酸(例如,DNA和/或RNA)合成的酶。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的,包括但不限于分离或衍生自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶或其修饰版本。市售可得的聚合酶的其他示例包括但不限于:克列诺片段(新英格兰生物实验室公司、Taq DNA聚合酶(凯杰公司(QIAGEN))、9°NTM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Deep VentTM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Manta DNA聚合酶(酶学公司)、Bst DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、和phi29 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)。
聚合酶包括DNA-依赖聚合酶和RNA-依赖聚合酶,如逆转录酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族,虽然大多数落入A、B和C家族。其它类型DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。相似地,RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III,和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性和RNA依赖性的。
本文所用术语“划分”或“划分的”指将样品分为多个部分或多个“划分产物(partition)”。划分产物通常是实体意义上的,例如,一个划分产物中的样品不与或基本不与邻近划分产物中的样品混合。划分产物可以是固体或流体。在一些实施方式中,划分产物是固体划分产物,例如微通道。在一些实施方式中,划分产物是流体划分产物,例如液滴。在一些实施方式中,流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中,流体划分产物(如液滴)是水性液滴,其被不互溶的运载体流体(如油)包围。
附图的简要说明图1描绘了在数字扩增(例如,数字PCR(dPCR))测定中同时检测同源依赖修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)突变的示例性示意图。正向和反向扩增引物位于基因组编辑试剂靶向的基因组区。通过聚合酶链反应或其他扩增方法产生扩增子(例如,长度约100-400bp或更长)。参考探针杂交并检测所有扩增子等位基因(WT,NHEJ,HDR)。HDR探针检测HDR编辑位点。不可延伸的HDR暗探针阻遏与野生型的交叉反应。HDR暗探针并不总是必需的。NHEJ脱落探针与野生型切割位点杂交。在切割位点处的NHEJ突变导致NHEJ脱落探针的杂交丢失。在一些情况下,NHEJ脱落探针可以与与HDR探针的靶位点重叠的区杂交,从而阻断与野生型模板的潜在的HDR交叉反应性。NHEJ脱落探针的位置可以通过切割策略而变化;它可能位于编辑位点附近,而不是与HDR位点重叠。
图2显示了用于数字放大测定的探针的具体位置如何可以基于所使用的具体切割策略而变化。NHEJ脱落探针可以设计成与DNA切割位点杂交。例如,在CRISPR-Cas9中,在引导RNA(gRNA)靶向的PAM位点(NGG)上游3bp(SEQ ID NO:3)进行一次双链切割。NHEJ脱落探针可以设计成靶向这个切割位点,从而询问(interrogate)这个切割位点。HDR事件可靶向多达50-100bp之外。因此,HDR探针可以基于所使用的引导和供体序列靶向以在与NHEJ脱落探针一定距离处进行杂交。对于Cas9-缺刻酶,通过使用配对gRNA在每个gRNA靶位点(SEQID NO:1-2)处引起单链断裂产生两个NHEJ位点。在这种情况下,dPCR测定可以包含两个NHEJ脱落探针。这种策略可以推广到其他非CRISPR切割或缺刻策略,如利用Tale效应物核酸酶或缺刻酶(TALEN)和锌指核酸酶或缺刻酶(ZFN)的策略。
图3说明了NHEJ和HDR定量测定策略的几种变化形式。测定设计的选择可以基于所使用的基因组编辑试剂的类型,其确定预期的HDR和NHEJ修饰的类型和位置。还可以使用HDR暗探针(未显示)来增加HDR探针的严谨性。基因组编辑试剂切割位点由X描绘,其也对应于随后的NHEJ诱导的突变的位置。该图说明了各种CRISPR-Cas9基因组编辑策略的测定设计,但该方法可应用于TALEN和ZFN。
图4显示了当使用几种不同的基因组编辑试剂(例如,CRISPR/Cas,CRISPR/Cas9-缺刻酶,dCas9-FokI等)时,可以用于检测NHEJ和HDR突变的“全突变测定”。在该实施例中,使用一个引物对,一个参考探针,一个HDR探针和一个HDR-暗探针(未显示),以及总共三个NHEJ脱落探针,每个探针定位在给定的预测切割位点(由X描绘),由三种不同的基因组编辑试剂所决定。来自可检测标记的NHEJ脱落探针中任一个的信号的减少表示由基因组编辑试剂产生的三个可能切割位点中的任一个处的NHEJ事件。由于多个NHEJ事件或一个延伸事件导致来自多个NHEJ脱落探头的信号损失将导致信号损失的幅度增加。
图5示出了其中使用长探针(例如,大于50bp)的实施方式。NHEJ脱落探针(其与NHEJ序列杂交)可以沿扩增子扩增区检测NHEJ突变。在某些情况下,NHEJ脱落探针可靶向与HDR探针的杂交位点重叠的位点,并用于增加HDR探针的严谨性。或者,可以使用HDR暗探针(未显示)。
图6显示了用三个不同基因组编辑试剂(CRISPR-Cas9,Cas9-缺刻酶和dCas9-FokI)定量基因组位点RBM20R636S(SEQ ID NO:12-13)处的NHEJ(SEQ ID NO:9,15和16)和HDR(SEQ ID NO:10)突变的示例性测定设计。
图7显示了用CRISPR-Cas9基因组编辑试剂的图6所示的模拟测定得到的数据。使用仅野生型基因组DNA作为输入产生结果。
图8显示了用CRISPR-Cas9基因组编辑试剂的图6所示的模拟测定得到的数据。通过用5%的模拟HDR和5%的模拟NHEJ模板以每个液滴0.5个拷贝的浓度掺杂野生型模板的样品来产生结果。可以分析数据以确定样品中编辑的基因组的浓度。这样的数据可用于确定基因组编辑试剂或方案的HDR、NHEJ、或HDR和NHEJ基因组编辑效率。
图9A-B显示了用于靶向导入点突变的GRN基因座的方案(SEQ ID NO:20-21)。设计用于Cas9切口酶的一对引导RNA(gRNA),用于定位GRN基因座(SEQ ID NO:17-18)两个近端位置的Cas9缺刻酶,以在靶基因座的相反链上产生一对近端单链缺口。编码所需突变的供体寡核苷酸(SEQ ID NO:19)可以作为损伤的同源定向修复(HDR)期间的模板。图9B描绘了由图9A所示的基因组编辑试剂编辑的分离的iPS细胞克隆的两个序列(SEQ ID NO:22-24)的比对。该克隆在一个等位基因中具有C>T HDR突变(SEQ ID NO:23)和另一等位基因中的24-bp缺失(SEQ ID NO:24)。这些结果表明,HDR和NHEJ修复的组合可以在单个细胞中发生,提供复合杂合突变体细胞。
图10A-B显示用于靶向用于引入和检测HDR突变(SEQ ID NO:30-31)的RBM20基因座(SEQ ID NO:25-26和28-29)的方案。图10A中描绘了编辑试剂,供体寡核苷酸(SEQ IDNO:27)和基于TaqMan的PCR测定检测方案。示例性的Cas9、Cas9-缺刻酶和TALEN基因组编辑试剂在图10B中进一步描绘。
图11A-C描绘了用于检测HDR突变的ddPCR测定。图11A描述了ddPCR测定的基础。图11B描述了含有野生型和HDR等位基因的靶基因组区的1∶1混合物的所得ddPCR数据的二维图。图11C描绘了在野生型背景中的HDR等位基因的稀释系列的ddPCR数据。
图12描述了ddPCR测定同时检测HDR和NHEJ突变的方案。
图13A-D描绘了图12中所示测定的验证数据。没有(图13A)和有(图13B)HDR和NHEJ等位基因的5%gBlock DNA的WT HEK293细胞的基因组DNA通过图4所示的Cas9探针混合物分析(参考,HDR,NHEJ和暗探针)中。图13C显示了具有不同比例的野生型和突变型靶基因组区的测定的定量性能。图13D显示了用Cas9基因组编辑试剂处理的HEK293细胞的数据,如图10A所示。在该测定中观察到HDR+和NHEJ+群体。
图14描绘了各种基因组编辑策略的HDR和NHEJ突变产生活性的比较。用RBM20TALEN、Cas9或Cas9缺刻酶与RBM20R636S单链DNA寡核苷酸供体一起转染HEK293细胞或人iPS细胞以引入如图10A所示的C>A突变。
发明详述
I.引言
针对位点特异性基因组编辑的试剂变得越来越先进。通常,这样的试剂靶向基因组区,并在目标区内的DNA中诱导双链切割或两条单链缺刻。切割或缺刻的修复可以通过两个替代途径进行。在非同源末端连接(NHEJ)中,DNA链的切割或缺刻末端直接连接而不需要同源模板核酸。NHEJ可导致在修复部位处的一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代或其组合。在同源定向修复中,DNA链的切割或缺刻末端通过来自同源模板核酸的聚合来修复。因此,原始序列被替换为模板的序列。同源模板核酸可以通过基因组中的其他位置的同源序列(姐妹染色单体,同源染色体,或相同或不同染色体上的重复区域)提供。或者,可以引入外源模板核酸以获得特异性HDR突变。
虽然目前的基因组编辑试剂可以是非常具体的,但引入脱靶突变可能是一个问题。这样的脱靶突变可能难以鉴定,因为它们可以在整个基因组中发生。可以使用几种方法来降低脱靶突变的频率。例如,可以使用低浓度或活性的基因组编辑试剂来降低突变的总体频率。通过减少靶内(on-target)和脱靶(off-target)突变频率,单个细胞将同时含有靶内和脱靶突变的机会减少。然而,这使得更难以在未编辑的细胞的背景群体中识别所需编辑的单元。
或者,可以利用需要多个靶识别事件的基因组编辑试剂。例如,可以设计基因组编辑试剂,其包括一对缺刻酶,其中每个缺刻酶被引导至靶基因组区内的近端位置处并切割DNA。来自该对的单个缺刻酶的脱靶活性绝大多数可能导致在脱靶位点处的单个缺口,其由高保真基因切除修复途径快速修复。这种缺刻酶可以容易地通过各种方法产生。例如,细胞可以与Cas9缺刻酶突变体(例如D10A或H840A变体)接触,并且一对引导RNA指向靶基因组区内的近端位点。参见Shen等,Nat Methods.2014年4月;11(4):399-402。
作为另一个示例,可以使用含有专性异二聚体核酸酶的基因组编辑试剂来减少脱靶突变。这样的基因组编辑试剂可以被设计成仅当通过对每个单体组分的位点特异性募集到相邻的目标半位点时,在目标基因组区域上形成专性异二聚体核酸酶时才产生双链断裂。示例性专性异二聚体核酸酶包括但不限于在美国专利申请号13/812,857中公开的那些。靶向功能可以由核酸酶缺陷型Cas9(dCas9)和适当的引导RNA,一对TALEN或任何其他核酸序列特异性靶向方法提供。
尽管在开发位点特异性基因组编辑试剂方面有这些和其他最近的进展,但定量样品中实现的基因组编辑的量可能是有用的。在某些情况下,这种定量可用于优化基因组编辑条件,或通过同胞选择(sib-selection)技术来富集编辑的细胞群。例如,与HDR突变相比,可以优化基因组编辑条件以减少或增加NHEJ突变的类型或量。作为另一个例子,可以优化基因组编辑条件以提高编辑的效率,从而允许使用低浓度或活性的基因组编辑试剂,而不会不必要地减少实现的编辑量。
Miyaoka等,Nat Methods.2014年3月;11(3):291-3描述了通过数字PCR定量HDR突变并应用同胞选择来富集基因组编辑的细胞的方法。该方法依赖于使用序列特异性探针来检测在DNA损伤的同源定向修复期间由模板核酸引入的预定突变。然而,用于直接检测NHEJ突变的探针不能如此设计,因为不能预测突变的类型(例如,插入或缺失)和程度(例如,碱基对的数量)。在某些情况下,根据所使用的基因组编辑试剂,也无法预测NHEJ突变的精确位置。
本文描述的是用于定量NHEJ突变的方法。本文还描述了同时定量NHEJ和HDR突变的方法。
II.方法本文公开的是通过数字扩增在样品中检测或定量同源定向修复(HDR)基因组编辑产物,非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物或其组合的方法。通常,样品是细胞样品,从细胞样品提取的基因组样品,或其片段。该方法可用于确定样品获得的基因组编辑程度,用于鉴定基因组编辑的最佳条件,或指导用于基因组编辑产物的细胞群的富集(例如,通过同胞选择)。
在适合靶基因组区的基因组编辑的条件下,可以将细胞或从细胞提取的基因组与位点特异性基因组编辑试剂接触。在一些情况下,将细胞或基因组与HDR模板核酸接触以将预先确定的HDR突变引入基因组。在与位点特异性基因组编辑试剂接触后,可以使用本文所述的一种或多种方法测定所完成的基因组编辑程度。基因组编辑试剂可以含有一种或多种核酸酶或缺刻酶,或其组合。
A.检测NHEJ
在一些实施方式中,所述方法包括检测或定量样品中的NHEJ基因组编辑产物。可以使用参考探针和NHEJ脱落探针检测或定量NHEJ基因组编辑产物。用于检测或定量样品中NHEJ基因组编辑产物的方法可包括从与基因组编辑试剂接触的细胞或基因组提供核酸样品,以及形成含有参考探针和NHEJ脱落探针的反应混合物。样品可以含有NHEJ突变、HDR突变或其组合。
反应混合物可以划分成多个具有平均体积的混合物划分产物,该混合物划分产物包含:i)目标基因组区;ii)DNA依赖性DNA聚合酶;iii)正向和反向寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反向引物与靶基因组区的相反链杂交和侧接靶基因组区,并且其中所述引物被设置为在所述聚合酶存在下扩增所述靶基因组区;和iv)与靶基因组区杂交的可检测标记的寡核苷酸参考探针,不论等位基因(即与野生型,HDR和NHEJ编辑的靶基因组区杂交)。
混合物划分产物还可以包含一种或多种NHEJ脱落探针。通常,NHEJ脱落探针被设计为与含有由位点特异性基因组编辑试剂靶向的切割或缺刻位点的靶基因组区的亚区域杂交。一种或多种NHEJ脱落探针的设计可以随样品接触到的基因组编辑试剂的类型而变化。
例如,如果基因组编辑试剂是Cas9核酸酶和引导RNA,切割位点通常是前间区序列相邻基序(PAM)上游的3-5个碱基对。尽管可以使用一些其它PAM序列,例如NGA或NAG,PAM通常由序列NGG组成。因此,切割位点可以是,例如,[5′-20nt靶-NGG-3′]或[5′-CCN-20nt靶-3′],因为它同样有效地靶向DNA的编码或非编码链。当靶位点为5′-20nt靶-NGG时,预测的切割位点在NGG PAM的5′末端上游约3-5个碱基对。在这种情况下,NHEJ脱落探针可以设计成与含有该预测切割位点的亚区杂交。
作为另一个实例,基因组编辑试剂可以是靶向靶基因组区相反链上的PAM序列相邻位点的一对引导RNA,每个引导RNA与核酸酶缺陷或死亡的Cas9核酸酶(dCas9)复合,其与IIS型限制性核酸酶(例如,FokI)的专性异源二聚体的单体融合。在这种情况下,切割位点通常为靶向基因组区的相反链上的相邻PAM序列之间的12至21个碱基对。因此,NHEJ脱落探针可被设计为与包含相邻PAM序列之间的12至21个碱基对的预测切割位点的亚区杂交。可以使用类似的规则设计用于其他基因组编辑试剂的NHEJ脱落探针。
在某些情况下,预测切割位点的位置范围可以大于12-21个碱基对。在这种情况下,可以使用多个NHEJ脱落探针来覆盖更大面积的潜在NHEJ突变。或者,可以增加NHEJ脱落探针的长度;然而,在一些情况下,增加脱落探针的长度可降低检测单核苷酸基因组编辑的能力。在一些情况下,基因组编辑试剂被设计成产生多个切口或缺刻。在这种情况下,可以设计多个NHEJ脱落探针以与多个切口或缺刻杂交。例如,基因组编辑试剂可以是一对缺刻酶,其靶向一缺刻在近端位置处的靶基因组区(例如,一对切口位点分开小于1kb,小于500bp,小于250bp,小于200bp,小于150bp,或小于100bp)和靶基因组区的相反链上。在该实施例中,可以设计一对NHEJ脱落探针以检测每个缺刻位点处的NHEJ突变。
NHEJ脱落探针的长度可以为10至35个核苷酸。在一些情况下,NHEJ脱落探针的长度为12至30个核苷酸,或18至30个核苷酸。在一些情况下,NHEJ脱落探针的长度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。通常,探针被设计为与野生型靶序列特异性杂交,但是当在测定的扩增和/或检测条件下靶序列中存在突变时,不能杂交。杂交的这种特异性可以通过改变探针长度、GC含量或扩增和/或检测条件(例如温度,盐含量等)来实现。
在某些情况下,NHEJ脱落探针对(即检测)HDR突变和NHEJ突变均敏感。例如,基因组编辑试剂可以包括外源HDR模板核酸。模板核酸可以用作模板来修复包含由基因组编辑试剂引入的双链断裂或配对缺刻或在其内部的区。因此,将引入相对于野生型基因组存在于HDR模板核酸中的任何突变。当HDR位点靠近或在靶切割位点时,NHEJ脱落探针可以与潜在的NHEJ编辑位点和潜在的HDR编辑位点杂交。在这种情况下,NHEJ脱落探针可以通过不与含有这种突变的靶基因组区杂交来检测HDR突变和NHEJ突变。
此外,可以通过在反应混合物中使用HDR探针来区分NHEJ突变和HDR突变。例如,如本文所述的HDR探针或如Miyaoka等,2014所述的HDR探针。因此,如果NHEJ脱落探针检测到突变(HDR或NHEJ),并且HDR探针不存在,则突变可以分类为NHEJ。相反,如果NHEJ探针检测到突变并且HDR探针也检测到突变,那么突变可被归类为HDR。类似地,在包含多个靶基因组区的划分产物中,每一个具有可能的NHEJ和/或HDR突变,NHEJ或HDR突变的存在或不存在可以通过来自不同探针的信号的相对强度来确定。因此,例如,如果划分产物包含具有NHEJ突变的一个靶基因组区和具有HDR突变的一个靶基因组区,则参考探针信号将指示多个靶基因组区,HDR探针信号将指示一个HDR突变的靶基因组区,并且NHEJ脱落探针信号将指示多个靶基因组区域含有突变。
可以通过,例如,使混合物划分产物经PCR扩增条件来扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区。条件可以包括两步或三步热循环方案。在一些情况下,使用三步热循环方案来确保靶基因组区的完全扩增。例如,在某些情况下,如果靶基因组区(包括预测的切割位点位置的HDR突变位点(如果适用)和参考探针杂交位点)大于约200bp,或大于约400bp,则可以选择三步扩增方案。
可以通过检测参考探针或NHEJ脱落和参考探针不检测任何靶基因组区扩增子的混合划分产物的数目来确定空混合物划分产物的量。这个空的混合物划分产物的数量可以称为N阴性。可以通过检测其中参考探针检测靶基因组区扩增子,但NHEJ脱落探针不检测任何野生型靶基因组区扩增子的混合划分产物的数量来确定在HDR模板核酸未被用于诱导HDR突变的样品中仅含有NHEJ编辑的靶基因组区扩增子的混合划分产物的量(NNHEJ)。仅含有NHEJ编辑的靶基因组区扩增子的混合划分产物的数目可以添加到空混合物划分产物的数目中,以获得称为N总的值。然后可以通过计算多个混合划分产物的平均体积的倒数乘以N阴性除以N总的负自然对数来确定样品中NHEJ编辑的基因组的浓度。
类似地,在可能存在HDR突变的反应混合物中,可以组合使用HDR和NHEJ脱落探针以确定仅含有NHEJ编辑的靶基因组区扩增子(NNHEJ)的混合物划分产物的量。例如,可通过检测其中参考探针检测到靶基因组区扩增子、NHEJ脱落探针不检测到任何野生型靶基因组区扩增子,并且HDR探针不检测到HDR等位基因的混合物划分产物的数目来确定在使用HDR模板核酸来诱导HDR突变的样品中仅含有NHEJ编辑的靶基因组区扩增子(NNHEJ)的混合划分产物的量。
通过从NHEJ反应混合物中基因组的总浓度中减去NHEJ编辑的基因组的浓度,可以容易地从样品中NHEJ编辑的基因组的浓度得到样品中野生型基因组的浓度。或者,野生型基因组的浓度可以通过将以下值加在一起直接得到:a)空混合物划分产物(N空);b)仅含有NHEJ编辑的靶基因组扩增子的混合物划分产物(NNHEJ);和c)含有至少一些可检测的野生型靶基因组扩增子(NNHEJ+wT和NWT)的混合划分产物,以获得N总。N阴性的值可以通过将仅有NHEJ编辑的靶基因组扩增子(NNHEJ)的空混合划分产物的数量(N空)和混合物划分产物的数量相加在一起而获得。然后可以通过计算多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以N阴性除以N总的负自然对数来确定样品中野生型基因组的浓度。
B.检测不同反应混合物中的NHEJ和HDR
在一些实施方式中,所述方法包括在一个反应混合物中检测或定量HDR基因组编辑产物,并在不同的反应混合物中检测或定量NHEJ基因组编辑产物。例如,可以将样品分成两种不同的反应混合物,并在不同的反应混合物(即,HDR反应混合物和NHEJ反应混合物)中定量HDR和NHEJ。可以使用如上所述的参考探针和NHEJ脱落探针来检测或定量NHEJ基因组编辑产物。可以使用参考探针、HDR探针、和可选的HDR暗探针来检测或定量HDR基因组编辑产物。
NHEJ和HDR反应混合物可以分开划分以形成具有平均体积的多个混合物划分产物,混合物划分产物包含:i)靶基因组区;ii)DNA依赖性DNA聚合酶;iii)正向和反向寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反向引物与靶基因组区的相反链杂交和侧接靶基因组区,并且其中所述引物被设置为在所述聚合酶存在下扩增所述靶基因组区;和iv)与目标基因组区杂交的可检测标记的寡核苷酸参考探针,不论等位基因(即与野生型,HDR和NHEJ编辑的靶基因组区域杂交)。
通过划分HDR反应混合物产生的混合物划分产物还可包含一种或多种HDR探针。通常,HDR探针设计为与含有HDR突变的靶基因组区的亚区杂交,但不与不含HDR突变的亚区杂交。在某些情况下,HDR探针也可以检测NHEJ突变。例如,HDR探针可以与与位点特异性基因组编辑试剂的预测切割位点重叠的区杂交,从而检测在修复的切割位点处存在或不存在NHEJ诱导的错误。一种或多种HDR探针的设计可以随着HDR模板核酸上存在的突变的数目和特征而变化。
HDR探针的长度可以为10至35个核苷酸,或更长。在某些情况下,HDR探针的长度为12至30个核苷酸,或18至30个核苷酸。在某些情况下,HDR探针长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。通常,探针被设计为与HDR编辑的靶基因组序列特异性杂交,而不是在测定的扩增和/或检测条件下与野生型靶序列杂交。杂交的这种特异性可以通过改变探针长度、GC含量或扩增和/或检测条件(例如温度,盐含量等)来实现。
HDR探针可以包含与参考探针相同的可检测标记物。在这种情况下,当检测到HDR突变的靶基因组区时,来自HDR探针和参考探针的信号可以相加。然后可以将包含HDR突变靶基因组区和非HDR突变靶基因组区(例如,野生型)的混合物划分产物检测为位于含仅野生型和仅HDR靶基因组的混合物划分产物之间的分开的、但可能重叠的簇。
HDR混合物划分产物可包含HDR暗探针。HDR暗探针可以通过将HDR探针与野生型靶基因组区的结合提供的错误信号减少来提高测定的严谨性。HDR暗探针通常设计为与HDR探针竞争结合野生型靶基因组区,而不是HDR突变靶基因组区。在某些情况下,HDR暗探针和HDR探针是相同的序列,除了由HDR突变改变的核苷酸以外。通常,HDR暗探针被设计为包含不可延伸的3′端。示例性的不可延伸的3′末端包括但不限于3′末端磷酸酯。替代的不可延伸的3′末端包括但不限于在例如国际专利申请公开号WO 2013/026027中公开的那些。
可以通过,例如,使混合物划分产物经过PCR扩增条件来扩增多个HDR混合物划分产物中的靶基因组区。条件可以包括两步或三步热循环方案。在一些情况下,使用三步热循环方案来确保靶基因组区的完全扩增。例如,在某些情况下,如果包括预测切割位点位置,HDR突变位点和参考探针杂交位点的靶基因组区大于约200bp或400bp,则可以选择三步扩增方案。
NHEJ和野生型定量可以通过如上所述分析NHEJ混合物划分产物来进行。HDR编辑的基因组的浓度可以通过将以下数字加在一起得到:a)空混合划分产物(N空);b)仅含有NHEJ编辑的靶基因组扩增子(NNHEJ)的混合物划分产物;和c)含有至少一些可检测的野生型靶基因组扩增子的混合物划分产物(NNHEJ+wT和NWT),以获得N阴性。可以通过添加含有至少一些可检测的HDR编辑的靶基因组扩增子(NHDR,NHDR+wT,NHDR+NHEJ和NHDR+NHEJ+wT)的混合物划分产物和N阴性来获得N总的值。然后可以通过计算多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以N阴性除以N总的负自然对数来确定样品中野生型基因组的浓度。
C.同时检测NHEJ和HDR
在一些实施方式中,所述方法包括同时检测或定量样品中的HDR和NHEJ基因组编辑产物。可以使用本文所述的参考探针,如本文所述的一种或多种NHEJ脱落探针,如本文所述的HDR探针和任选的如本文所述的HDR暗探针来检测或定量HDR和NHEJ基因组编辑产物。用于检测或定量样品中的HDR和NHEJ基因组编辑产物的方法可包括提供来自与基因组编辑试剂接触的细胞或基因组的核酸样品,以及形成含有参考探针、一种或多种NHEJ脱落探针、HDR探针和可选的HDR暗探针的反应混合物。在一些情况下,通过形成含有参考探针、一种或多种NHEJ脱落探针、HDR探针和任选的HDR暗探针的单一反应混合物来进行对NHEJ和HDR的同时检测。在一些情况下,使用单一反应混合物可以降低用户错误的可能性或提高测定的精确度或准确性。
反应混合物可以划分成多个具有平均体积的混合物划分产物,该混合物划分产物包含:i)目标基因组区;ii)DNA依赖性DNA聚合酶;iii)正向和反向寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反向引物与靶基因组区的相反链杂交和侧接靶基因组区,并且其中所述引物被设置为在所述聚合酶存在下扩增所述靶基因组区;和iv)与靶基因组区杂交的可检测标记的寡核苷酸参考探针,不论等位基因(即与野生型,HDR和NHEJ编辑的靶基因组区杂交)。
混合物划分产物还可包含一种或多种NHEJ脱落探针、HDR探针和可选的HDR暗探针。在一些情况下,一种或多种NHEJ脱落探针之一与靶基因组区的与HDR探针的杂交位点重叠的亚区杂交。在这种情况下,NHEJ探针可以替代HDR暗探针,使其使用不必要。
在一些情况下,在单孔中形成混合物划分产物。在某些情况下,单孔的使用可以降低用户错误的可能性或提高测定的精度或准确性。例如,可以在单孔中形成多个液滴混合物划分产物。孔中的混合物划分产物可包含:i)靶基因组区;ii)DNA依赖性DNA聚合酶;iii)正向和反向寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反向引物与靶基因组区域的相反链杂交和侧接靶基因组区,并且其中所述引物被设置为在所述聚合酶存在下扩增所述靶基因组区;和iv)与靶基因组区杂交的可检测标记的寡核苷酸参考探针,不论等位基因(即与野生型、HDR和NHEJ编辑的靶基因组区杂交)。孔中的混合物划分产物可进一步包含一种或多种NHEJ脱落探针、HDR探针和任选的HDR暗探针。
多个混合物划分产物中的靶基因组区可以通过,例如,使混合物划分产物经PCR扩增条件来扩增。条件可以包括两步或三步热循环方案。在一些情况下,使用三步热循环方案来确保靶基因组区的完全扩增。例如,在某些情况下,如果靶基因组区(包括预测的切割位点位置,HDR突变位点和参考探针杂交位点)大于约200bp或大于约400bp,则可选择三步扩增方案。
NHEJ和野生型定量可以通过如上所述分析混合物划分产物来进行。HDR编辑的基因组的浓度可以通过将以下数字加在一起得到:a)空混合划分产物(N空);b)仅含有NHEJ编辑的靶基因组扩增子(NNHEJ)的混合物划分产物;和c)含有至少一些可检测的野生型靶基因组扩增子的混合物划分产物(NNHEJ+wT和NWT),以获得N阴性。可以通过添加含有至少一些可检测的HDR编辑的靶基因组扩增子(NHDR,NHDR+wT,NHDR+NHEJ和NHDR+NHEJ+wT)的混合物划分产物和N阴性来获得N总的值。然后可以通过计算多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以N阴性除以N总的负自然对数来确定样品中野生型基因组的浓度。
图1中描绘了用于同时检测HDR和NHEJ的示例性示意图。如该图所示,正向和反向扩增引物侧接基因组编辑试剂靶向的基因组区域。通过DNA依赖性DNA聚合酶(例如,PCR)在扩增引物的多轮杂交和扩增过程中产生扩增子。扩增子的长度可以为约100-400bp,或更长。通常,选择扩增子的长度以确保有足够的空间,使得所有探针(例如参考,NHEJ和HDR)可以结合其扩增子中的靶序列。在一些情况下,期望使扩增子的大小最小化以降低扩增时间,从而提高测定速度。在一些情况下,扩增子的大小可以通过扩增引物所包含的靶切割点或缺刻位点的上游和下游侧翼区的大小来确定。如图1所示,侧翼区可以是大约200bp。或者,侧翼区可以是大约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250或更长。在某些情况下,上游和下游侧翼区域的大小相同。在某些情况下,上游和下游侧翼区域的大小不同。
如图1所示,参考探针杂交并检测所有扩增子等位基因。HDR探针检测HDR编辑位点。可选的不可延伸的HDR暗探针阻止与野生型的交叉反应。NHEJ脱落探针与野生型切割位点杂交。在切割位点处的NHEJ(或HDR)突变导致NHEJ脱落探针的杂交丢失。在某些情况下,NHEJ脱落探针可以与与HDR探针的靶位点重叠的区杂交,从而阻断与野生型模板的潜在的HDR交叉反应,代替HDR暗探针的功能。NHEJ脱落探针的位置可以通过切割策略而变化;它可能位于编辑位点附近,而不是与HDR位点重叠。
图2中描绘了用于同时检测HDR和NHEJ的替代示例性示意图。如该图所示,用于数字扩增测定的探针的具体位置可以基于所使用的特定切割策略而变化。NHEJ脱落探针可以设计成与DNA切割位点杂交。例如,在CRISPR-Cas9中,在引导RNA(gRNA)gRNA靶向的PAM位点(NGG)上游3bp处进行一次双链切割。NHEJ脱落探针可以设计成靶向这个切割位点,从而询问这个切割位点。HDR事件可靶向多达50-100bp之外。因此,HDR探针可以基于所使用的引导和供体序列靶向以在与NHEJ脱落探针一定距离处进行杂交。
对于Cas9-缺刻酶,通过使用配对的gRNA和将单链切割(缺刻)引入靶DNA的突变体Cas9产生两个NHEJ位点。通过靶向两个附近(例如,在小于约1kb,小于约500bp,小于约250bp,小于约200bp,小于约150bp,或小于约100bp,75bp,50bp,25bp,15bp或10bp)序列与一对gRNA,引入一对近端单链缺刻。在这种情况下,dPCR测定可以包含两个NHEJ脱落探针。这种策略可以推广到其他非CRISPR切割或缺刻策略,如利用Tale效应物核酸酶或缺刻酶(TALEN)和锌指核酸酶或缺刻酶(ZFN)的策略。
用于同时检测HDR和NHEJ的几个替代示例性示意图示于图3。测定设计的选择可以基于所使用的基因组编辑试剂的类型,其确定预期的HDR和NHEJ修饰的类型和位置。还可以使用HDR暗探针(未显示)来增加HDR探针的严谨性。基因组编辑试剂切割位点由X描绘,其也对应于随后的NHEJ诱导的突变的位置。该图说明了各种CRISPR-Cas9基因组编辑策略的测定设计,但该方法可应用于TALEN和ZFN。
图4显示了当使用几种不同的基因组编辑试剂(例如,CRISPR/Cas,CRISPR/Cas9-缺刻酶,dCas9-FokI等)时,可以用于检测NHEJ和HDR突变的“全突变测定”。在该实施例中,使用一个引物对,一个参考探针,一个HDR探针和一个HDR-暗探针(未显示),以及总共三个NHEJ脱落探针,每个探针定位在给定的预测切割位点(以X表示),由三种不同的基因组编辑试剂所决定。来自可检测标记的NHEJ脱落探针中任一个的信号的减少表示由基因组编辑试剂产生的三个可能切割位点中的任一个处的NHEJ事件。由于多个NHEJ事件或一个延伸事件导致来自多个NHEJ脱落探头的信号损失将导致信号损失的幅度增加。
图5示出了其中使用长探针(例如,大于50bp)的实施方式。NHEJ脱落探针(其与NHEJ序列杂交)可以沿扩增子扩增区检测NHEJ突变。在某些情况下,NHEJ脱落探针可靶向与HDR探针的杂交位点重叠的位点,并用于增加HDR探针的严谨性。或者,可以使用HDR暗探针(未显示)。
D.优化基因组编辑
本文描述的一种或多种方法可用于鉴定细胞的基因组编辑的优化条件。例如,可以在第一组条件下在多个细胞上进行位点特异性基因组编辑以提供第一细胞样品;以及第二组条件以提供第二个细胞样品。在某些情况下,根据第三、第四、第五、第六等条件进行编辑。可以从细胞中提取基因组DNA,并且上述方法用于定量不同细胞样品中NHEJ编辑的靶基因组区域和/或HDR编辑的靶基因组区域的数目,以确定不同条件的基因组编辑效率。可以比较不同条件的基因组编辑效率,以确定提供更高基因组编辑效率的一组条件。可以选择较高的效率作为基因组编辑的优化条件。在某些情况下,HDR编辑的更高效率被确定为基因组编辑的优化条件。在某些情况下,NHEJ编辑的较高效率被确定为基因组编辑的优化条件。在某些情况下,NHEJ与HDR编辑效率的较高比例被认为是基因组编辑的优化条件。在某些情况下,HDR与NHEJ编辑效率的较高比例被认为是基因组编辑的优化条件。
在某些情况下,不同的条件包括不同浓度的基因组编辑试剂。在某些情况下,不同的条件包括不同类型的基因组编辑试剂。例如,可将锌指核酸酶与CRISPR/Cas试剂进行比较,例如所有其它变量保持恒定。在一些情况下,不同的条件包括靶向不同靶基因组区的相同或不同类型的基因组编辑试剂。因此,例如,可以将靶向闭合染色质区的基因组编辑效率与针对开放染色质区的基因组编辑效率进行比较。
E.划分
样品可以划分成多个混合物划分产物。划分的使用可以有利于降低背景放大,减少放大偏差,增加通量,提供绝对或相对定量检测,或其组合。划分还可以允许不同靶标的多重检测(或靶标中的不同突变)。划分产物可包括多种类型的划分产物中的任一种,包括固体划分产物(如孔或管)或流体划分产物(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中,这些划分产物是液滴。在一些实施方式中,这些划分产物是微通道。划分样品的方法和组合物描述于,例如,公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US2011/0092376,其全部内容各自通过引用纳入本文。
在一些情况中,划分样品并将检测试剂(例如,探针、酶等)整合至划分的样品中。在其他情况下,将样品与检测试剂(例如,探针,酶等)接触,然后划分样品。在一些实施方式中,各试剂(如探针、引物、缓冲剂、酶、底物、核苷酸、盐等)在划分前混合在一起,随后划分样品。在一些情况下,样品在将试剂混合在一起之后立即划分,使得基本上全部或大多数的反应(例如,DNA扩增,DNA切割等)在划分后发生。在其它情况中,在反应进行缓慢或完全不进行的温度下混合试剂,然后划分样品,并且调节反应温度以使反应进行。例如,可在冰上、5℃、或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35℃或更高温度下合并试剂。一般而言,本领域技术人员会知晓如何选择一种或多种反应受到抑制的温度。在一些示例中,采用温度和时间的组合以避免划分之前的明显反应。
此外,试剂和样品可以使用一种或多种热启动酶,例如热启动DNA-依赖性DNA聚合酶混合。因此,可混合样品和缓冲剂、盐、核苷酸、探针、标记物、酶等中的一种或多种并随后进行划分。随后,由热启动酶催化的反应可通过加热混合物分区以激活一种或多种热启动酶来起始。
此外,可以将样品和试剂(例如缓冲液,盐,核苷酸,探针,标记物,酶等中的一种或多种)混合在一起,而没有引发预期反应(例如,DNA扩增)所需的一种或多种试剂。混合物然后可被划分到一组第一划分产物混合物中,然后可通过融合这组第一划分产物混合物和提供必要试剂的一组第二划分产物混合物来提供一种或多种必要试剂。替代地,可向第一划分产物混合粉中加入必要试剂,而不形成第二划分产物混合物。例如,必要试剂可分散到第一划分产物混合物油包水液滴的组中。作为另一个示例,缺失的试剂可加入含有所述第一划分产物混合物组的一组微通道中。
在一些实施方式中,将样品划分成多个液滴。在一些实施方式中,液滴包含乳液组合物,即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中,液滴是水性液滴,其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中,液滴是油性液滴,其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中,本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中,由样品生成的液滴中少于0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝,一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。
在一些实施方式中,通过使油相流过含有要检测的识别标记(identificationsignature)的水样品而形成液滴。在一些实施方式中,包含要检测的识别标记的含水样品还包括缓冲溶液和用于检测识别标记的两个或更多个探针。
该油相可包含氟化基础油,其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中,该基础油包括以下一种或多种:HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中,该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中,该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中,Krytox-AS的浓度是约1.8%。在一些实施方式中,Krytox-AS的浓度是约1.62%。KrytoxFSH的吗啉代衍生物的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中,Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8%。在一些实施方式中,Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62%。
在一些实施方式中,该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方式中,1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.25%、1.50%、1.75%、2.0%、2.25%、2.5%、2.75%或3.0%(w/w)的浓度添加。在一些实施方式中,1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.18%(w/w)的浓度添加。
在一些实施方式中,该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴,其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊;这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如,这类转化可发生在大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间,流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。在加热之前可以或可以不除去过量的连续相油。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
转化后,这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中,这些微胶囊可用于储存或运输划分产物混合物。例如,可以在一个位置收集样品,划分成含有酶,缓冲液,探针和/或引物的液滴,任选地可以进行一个或多个扩增反应,然后可以加热划分产物以进行微囊化,并且可将微胶囊存储或运输用于进一步分析。
这些微胶囊划分产物可含有一种或多种探针(如本文所述经标记探针)并可抗聚结,特别是在高温下。因此,这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的划分产物数)下孵育。在一些实施方式中,可每毫升孵育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000个划分产物。在一些实施方式中,样品-探针孵育发生在单个孔中,例如微量滴定板的孔,此时各划分产物之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。
在一些实施方式中,将样品划分成至少500个划分产物、至少1000个划分产物、至少2000个划分产物、至少3000个划分产物、至少4000个划分产物、至少5000个划分产物、至少6000个划分产物、至少7000个划分产物、至少8000个划分产物、至少10000个划分产物、至少15000个划分产物、至少20000个划分产物、至少30000个划分产物、至少40000个划分产物、至少50000个划分产物、至少60000个划分产物、至少70000个划分产物、至少80000个划分产物、至少90000个划分产物、至少100000个划分产物、至少200000个划分产物、至少300000个划分产物、至少400000个划分产物、至少500000个划分产物、至少600000个划分产物、至少700000个划分产物、至少800000个划分产物、至少900000个划分产物、至少1000000个划分产物、至少2000000个划分产物、至少3000000个划分产物、至少4000000个划分产物、至少5000000个划分产物、至少10000000个划分产物、至少20000000个划分产物、至少30000000个划分产物、至少40000000个划分产物、至少50000000个划分产物、至少60000000个划分产物、至少70000000个划分产物、至少80000000个划分产物、至少90000000个划分产物、至少100000000个划分产物、至少150000000个划分产物或至少200000000个划分产物。
在一些实施方式中,将样品分成足够数量的分区,使得至少大部分分区具有不超过1-5个靶基因组区域(例如,不超过约0.5、1、2、3、4个或5个靶基因组区域)。在一些实施方式中,平均每个分区中存在约0.5、1、2、3、4或5个靶基因组区。在一些实施方式中,各分区中存在平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个靶基因组区。在一些实施方式中,至少一个划分产物不包含靶基因组区(划分产物为“空”)。在一些实施方式中,至少约1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%或10%的划分产物不包含靶基因组区。通常,划分产物可以含有过量的酶、探针和引物,使得每个混合物划分产物可能成功扩增存在于划分产物中的任何靶基因组区。
在一些实施方式中,生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如,在一些实施方式中,这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中,生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中,生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米,或小于约25微米。在一些实施方式中,生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中,生成的液滴在体积上基本均匀。例如,液滴体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中,液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25%。在一些实施方式中,生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
F.监测基因组编辑的细胞
基因编辑的未来可能需要监测已在基因组编辑的细胞群中完成的基因编辑。可以对输入患者(人或动物)的基因组编辑的治疗细胞群进行监测。可以对在体外培养、传代和/或选择的基因组编辑的细胞群进行监测,以评估指定治疗的功效。细胞可以是多能的(例如,诱导多能的),多潜能的或单能的干细胞,例如造血干细胞。或者,细胞可以是来自干细胞的体细胞或终末分化细胞(例如,终末分化的诱导多能干细胞)。
监测可用于检测或推断基因组编辑的存在或不存在。在一些情况下,监测是定量的,相对定量的,或提供绝对的定量。可以使用基于划分的测定来进行监测,例如利用数字扩增的测定。可以使用液滴数字测定(如ddPCR测定)进行监测。用于突变检测的液滴数字测定包括,例如U.S.2014/0309128中描述的那些。在某些情况下,通过在对位点特异性基因组编辑试剂切割或缺刻对位点的同源定向修复期间检测插入的HDR模板检测来进行监测。在一些情况下,通过在与基因组编辑试剂或基因组编辑试剂和HDR模板寡核苷酸接触的细胞群的样品中同时定量HDR和NHEJ突变进行监测。在某些情况下,通过大规模平行测序(例如,靶向或全基因组大规模平行测序)进行监测。
可以使用组织,血液,全血(或其成分),血浆,血清,尿液,唾液,粪便物质或可从人或动物中提取的任何其它流体或物质进行测试。测试可以包括监测特定组织类型以确定基因组编辑的细胞输注是否已经成功,来自含有基因组编辑的组织的细胞的百分比,样品中基因组编辑的存在或不存在,在样品中基因组编辑(或含有基因组编辑的细胞)的相对或绝对丰度的变化或变化速率。
在一些情况下,阈值(例如,基于百分比的阈值)可能与治疗结果相关。例如,超过或低于阈值的样品中基因组编辑的细胞的百分比可以指示或预测治疗成功或指导治疗决定。在某些情况下,可以获得或计算,诸如,样品中基因组编辑的细胞数与治疗结果之间的线性或对数相关性的非阈值方法,例如指示或预测治疗成功,监测治疗进展,或指导治疗决定。可以进行用基因组编辑的细胞成功或不成功治疗的风险因数的确定。可以使用统计技术(即确定让步比)来确定风险因数。在某些情况下,样品中基因组编辑的细胞的存在或不存在可以与治疗结果或与特定组织类型相关的各种疾病状态的诊断或检测与指导治疗决定的意图相关。
本文还描述了向样品中编辑的基因组的细胞或编辑的基因组的存在,不存在或数量的向医生或医疗中心提供报告或其他信息的方法。该信息可以用于指导治疗决定,例如,可以使用该信息来指导是否需要给予更多编辑的细胞,或者是否需要不同的编辑。信息或报告可以基于测试结果,达到阈值或相关的风险因数。
在一些实施方式中,可编译或填入数据库,其可收集和/或存储许多患者基因组编辑测试或治疗结果的信息(例如,治疗结果)。在一些情况下,信息可以与治疗决定相关,例如给予额外的或替代的基因组编辑的细胞或本领域已知的其它治疗(例如,化学疗法,例如抗癌抗体或抗体药物偶联物治疗)。
在一些实施方式中,可以获得(例如,通过使用CRISPR/Cas,TALENS,锌指核酸酶或其他方法)或提供基因组编辑的细胞群,可将群给于患者,然后样品可以从患者获得并分析以推断患者中基因组编辑的细胞的数量。在一些情况下,将患者中基因组编辑的细胞的数目与给予患者的基因组编辑的细胞的数目进行比较。在一些情况下,将患者中基因组编辑的细胞的数目与从先前获得的样品推断的患者中先前确定的基因组编辑的细胞的数量进行比较。在一些情况下,将患者中基因组编辑的细胞的数目与从随后获得的样品推断的患者中随后确定的基因组编辑的细胞的数量进行比较。患者中基因组编辑的细胞数量的增加或显着增加,或患者中基因组编辑的细胞数目没有减少或显着减少可以指示治疗成功或成功治疗的可能性。患者中基因组编辑的细胞数量减少或显着减少或者没有增加或显着增加可以指示治疗失败或治疗失败的可能性。或者,这种减少或没有增加可以指示额外的基因组编辑的细胞的给予或治疗(例如,药物)方案的改变。在某些情况下,增加或减少的速率表示治疗成功或失败,或表明需要给予额外的基因组编辑的细胞。在一些情况下,本文所述的前述方法之一还可以包括向有需要的对象给予额外的或替代的基因组编辑的细胞,向有需要的对象给予细胞,所述对象包含与之前给予的基因组编辑的细胞不同的基因组编辑,或对有需要的对象给予治疗方案的变化(例如,药物或剂量的变化)。
在一些实施方式中,可以获得(例如,通过使用CRISPR/Cas,TALENS,锌指核酸酶或其他方法)或提供基因组编辑的细胞群,可以定量群以确定群中基因组编辑的细胞数量,或者可从数据库或其他信息库确定数量。然后可以在体外选择群体,并且可以通过在选择之后量化群体中编号的基因组的数目来确定选择的效果。该选择可以包括体外培养,体外细胞培养传代,或者将细胞与药物或化学治疗剂体外接触。
如果细胞被给予需要的对象,则选择后基因组编辑的细胞数量的增加或显着增加,或选择后基因组编辑的细胞数目没有减少或显着减少可以指示治疗成功或成功治疗的可能性。如果将细胞给予有需要的对象,则患者中基因组编辑的细胞数量的减少或显着减少或没有增加或显着增加可表明治疗失败或治疗失败的可能性。或者,如果将细胞给予有需要的对象,则这样的减少或没有增加可以指示额外的基因组编辑的细胞的给予或治疗方案的变化(例如,药物或剂量的变化)。在一些情况下,如果细胞被给予有需要的对象,增加或减少的速率表示治疗成功或失败,表明需要给予额外的基因组编辑的细胞,或指示治疗方案的变化(例如,药物或剂量的变化)。在一些情况下,本文所述的前述方法之一可以进一步包括向有需要的对象给予基因组编辑的细胞,向有需要的对象给予细胞,所述对象包含与体外选择的细胞不同的基因组编辑,或向有需要的对象给予的治疗方案的变化(例如,药物或剂量的变化)。
II.反应混合物本文描述的是含有以下的反应混合物:i)靶基因组区;ii)DNA依赖性DNA聚合酶;iii)正向和反向寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反向引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区,并且其中所述引物被设置为在所述聚合酶存在下扩增所述靶基因组区;iv)与靶基因组区杂交的可检测标记的寡核苷酸参考探针,不论等位基因(即与野生型,HDR和NHEJ编辑的靶基因组区杂交);v)一种或多种NHEJ脱落探针;vi)HDR探针;和可选地,vii)HDR暗探针。在一些情况下,一种或多种NHEJ脱落探针之一与靶基因组区的与HDR探针的杂交位点重叠的亚区杂交。在这种情况下,NHEJ探针可以替代并使HDR暗探针的应用变得不必要。
在一些情况下,反应混合物是体积为约0.001nL,约0.005nL,约0.01nL,约0.02nL,约0.03nL,约0.04nL,约0.05nL,约0.06nL,约0.07nL,约0.09nL,约0.1nL,约0.2nL,约0.3nL,约0.4nL,约0.5nL,约0.6nL,约0.7nL,约0.8nL,约0.9nL,约1,约1.5nL,约2nL,约2.5nL,约3nL,约3.5nL,约4nL,约4.5nL,约5nL,约5.5nL,约6nL,约6.5nL,约7nL,约7.5nL,约8nL,约8.5nL,约9nL,约9.5nL,约10nL,约11nL,约12nL,约13nL,约14nL,约15nL,约16nL,约17nL,约18nL,约19nL,约20nL,约25nL,约30nL,约35nL,约40nL,约45nL,或约50nL的划分产物中的反应混合物。
在一些情况下,反应混合物处于直径为约0.001微米,约0.005微米,约0.01微米,约0.05微米,约0.1微米,约0.5微米,约1微米,约5微米,约10微米约20微米,约30微米,约40微米,约50微米,约60微米,约70微米,约80微米,约90微米,约100微米,约150微米,约200微米,约300微米约400微米,约500微米,约600微米,约700微米,约800微米,约900微米或约1000微米的划分产物中。在一些情况下,反应混合物处于直径小于约1000微米,小于约900微米,小于约800微米,小于约700微米,小于约600微米,小于约500微米,小于约400微米,小于约300微米,小于约200微米,小于约100微米,小于约50微米,或小于约25微米的划分产物中。
本文还描述了这样的反应混合物的组。该组可以包含至少500个反应混合物,至少1000个反应混合物,至少2000个反应混合物,至少3000个反应混合物,至少4000个反应混合物,至少5000个反应混合物,至少6000个反应混合物,至少7000个反应至少8000个反应混合物,至少10,000个反应混合物,至少15,000个反应混合物,至少20,000个反应混合物,至少30,000个反应混合物,至少40,000个反应混合物,至少50,000个反应混合物,至少60,000个反应混合物,至少70,000个反应混合物,至少80,000个反应混合物,至少90,000个反应混合物,至少100,000个反应混合物,至少200,000个反应混合物,至少300,000个反应混合物,至少400,000个反应混合物,至少500,000个反应混合物,至少600,000个反应混合物,至少700,000个反应混合物,至少800,000个反应混合物,至少900,000个反应混合物,至少1个至少2,000,000个反应混合物,至少3,000,000个反应混合物,至少4,000,000个反应混合物,至少5,000,000个反应混合物,至少10,000,000个反应混合物,至少20,000,000个反应混合物,至少30,000,000个反应混合物,至少40,000,000至少50,000,000个反应混合物,至少60,000,000个反应混合物,至少70,000,000个反应混合物,至少80,000,000个反应混合物,至少90,000,000个反应混合物,至少100,000,000个反应混合物,至少150,000,000个反应混合物,或至少200,000,000个反应混合物。
在一些情况下,在该组反应混合物的每个反应混合物中平均存在约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、或5个靶基因组区。在一些实施方式中,该组反应混合物中的至少一种反应混合物不含靶基因组区。在一些实施方式中,该组反应混合物的至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或10%的反应混合物不含靶基因组区。
通过引用将本文引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。
实施例仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解,可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。
实施例1:使用数字PCR同时定量基因组编辑的细胞中的HDR和NHEJ事件
材料和方法
引物:正向(F)和反向(R)引物设计用于在靶向的编辑位点(HDR)周围产生约200-400bp的扩增子。编辑位点应该大致位于该扩增子的中间(目标编辑位点的约100-200bp的5′和3′序列)。如果需要,也可以使用设计用于产生更短或更长的扩增子的扩增引物。
探针:
○参考探针:荧光标记的参考探针(例如,FAM)在反向扩增引物的上游和附近杂交,或在正向扩增引物的下游和附近杂交。该参考探针可用于检测和计数所有包含混合物划分产物的扩增子,无论等位基因(WT、NHEJ、或HDR)。对于最大信号,参考探针应与其相邻的扩增引物在相同链上。然而,参考探针可以被设计为与扩增子的任一链杂交。
○HDR探针:第二个荧光标记的探针被设计为与和HDR编辑位点重叠的基因组区杂交。可以用相同的荧光标记或不同的荧光标记标记HDR和参考探针。
○HDR暗探针:还设计了第二个“暗”寡核苷酸探针,其中包含不可延伸的3′末端且无荧光团标记,除了HDR编辑的位置之外,其顺序与HDR探针几乎相同。在暗探针中,这个位置与野生型(未编辑)序列互补。该探针的目的是使HDR探针与野生型DNA的交叉反应性最小化。这改善了2D图中WT和HDR簇组之间的分离。在某些测定设计中,可能完全不需要HDR暗探针。在一些情况下,与HDR探针直接竞争结合野生型序列的NHEJ脱落探针可补偿HDR暗探针的缺失。
○NHEJ脱落探针:NHEJ脱落探针指示,探针信号丢失时的突变(NHEJ)事件,未获得。这是一个负信号。该探针被设计为在靶向DNA的由特异性切割系统(例如,CRISPR-Cas9切割PAM NGG位点上游5′的3-5个碱基)切割的位点处与野生型序列杂交。当野生型序列被突变,例如,通过NHEJ引起的插入缺失标记(indel),探针“脱落”并且不能结合;因此,荧光幅度的损失(例如,HEX,如果NHEJ脱落探针用HEX标记)表示为NHEJ事件(仅保留FAM参考信号以标记该等位基因)。在具有超过一个切割位点的基因组编辑策略(例如Cas9-缺刻酶)的情况下,可能需要超过一个NHEJ脱落探针以测定所有潜在的NHEJ突变位点。或者,可以使用较长的NHEJ脱落探针以杂交至(从而询问)多个潜在的NHEJ位点。
用于用三种不同基因组编辑试剂(CRISPR-Cas9,Cas9-缺刻酶和dCas9-FokI)定量基因组位点RBM20R636S(SEQ ID NO:12-13)处的NHEJ(SEQ ID NO:9,15和16)和HDR(SEQ IDNO:10)突变的示例性探针和引物组合物在图6中显示。
测定组成:以最终的1x浓度形成反应混合物,其含有以下物质:
○正向和反相扩增引物:各自处于900nM(SEQ ID NO:8和14)
○参考探针:250nM(SEQ ID NO:11)
○HDR探针:250nM
○HDR暗探针:500nM
○NHEJ脱落探针:各250nM
数字PCR反应设定:
●使用本领域已知的标准方案建立数字PCR测定。例如,将100ng基因组DNA样品(约30,000个人类基因组对应物)与超滤(ddPCR Supermix for Probes(无dUTP)),测定缓冲液,2U不切割野生型或HDR编辑的扩增子的限制性内切核酸酶(例如,六切割器(或更长)如HindIII-HF)和水组合。组分被充分混合(例如,通过涡旋)。执行划分(例如,产生液滴)并且划分产物经热循环。
●热循环方案:为了适应长扩增子,可以使用3步热循环方案。在某些情况下,2步方案是足够的。延长2分钟的3步方案应充分覆盖高达1kB的扩增子。根据以下示例性方案产生扩增子:
○95℃,10分钟
○94℃,30秒
○退火温度(由温度梯度确定),例如,59℃,1分钟
○72℃,2分钟
○至步骤2,39x
○98℃,10分钟
○12℃,保持
●检测划分产物中荧光标记的探针的杂交
●使用液滴数字PCR(ddPCR)的方法,当每孔加载0.6至1.6份/液滴的基因组DNA(cpd)时,将读取最大数量的NHEJ突变体拷贝。这代表每孔约40ng-100ng的人基因组DNA。1cpd加载(66ng)在数学上是最佳的,但是实践中(real-world)的因素,如样品完整性和测定性能也将影响1cpd加载时的性能。例如,在较高负载下,可以减少来自包含野生型靶基因组区和HDR编辑的靶基因组区的液滴的信号之间的分离。通常,100ng基因组DNA/孔是通过ddPCR提供稳定和准确定量的量,但使用适当的对照(如gblock)运行样品稀释系列可以鉴定给定测定的最佳载量。
分析:首先确定簇组。例如,可以通过套索阈值在Quantasoft中鉴定簇组。当利用两个通道检测,并且HDR和参考探针用相同的荧光标记(例如,FAM)标记时,包含HDR编辑的靶基因组区的划分产物中的荧光信号是来自HDR和参考探针的信号。
●为了正确地套索(lasso)给定的簇,可以使用阳性对照孔来识别正确的簇位置和幅度。一个实例的阳性对照孔含有与样品相同加载方案的野生型(WT)DNA,加上给定百分比(例如5%突变体拷贝)的gblock合成模板对照。另一个示例性阳性对照是仅包含WT DNA的孔(图7)。因此,可以使用对照孔簇位置来在样品孔中分配簇。
●使用描述的分析策略,簇类将出现并且可以以这种方式进行套索阈值化:
●Ch1+Ch2+液滴:WT+WT/NHEJ液滴
●Ch1+Ch2-:NHEJ
●Ch1++Ch2+:HDR+HDR/WT液滴
●Ch1-Ch2-:阴性
●注意,在该示例中,给定的簇可以包含超过一个的液滴组(如椭圆形覆盖物所示,大约(参见图8))。当计算给定物种的浓度判定(如NHEJ等位基因)时,分析方法考虑了这一事实。这使得即使在较高的加载方案下也能进行准确的定量。
●可以确定每孔的HDR、NHEJ和野生型等位基因的浓度判定(拷贝/μL),包括95%置信区间。从这些数字可以很容易地得出NHEJ百分比和HDR百分比以及每个样品每孔的HDR:NHEJ比例。
定量:
ddPCR定量的标准公式是:
其中:
N阴性=不含感兴趣物质的液滴的数量
N总=液滴的总数
对于本文所述的测定,一些液滴群不容易分离(例如,野生型(WT)和NHEJ+WT群)。为了这种情况下定量,使用适当的液滴亚组来计算N阴性和N总。
定义:
●N空=标为“空”的簇中的液滴数(黑色)
●NNHEJ=标为“NHEJ”的簇中的液滴数(蓝色)●NWT+=标为“WT”和“NHEJ+WT”的簇中的液滴总数(绿色)
●NHDR+=标为“HDR”和“HDR+WT”的簇中的液滴总数(橙色)加上簇“HDR+NHEJ”和“HDR+NHEJ+WT”中的液滴数(数据中清楚看到的液滴太少)
●N=观察液滴的总数
对于NHEJ定量:
●N总=N空+NNHEJ
●N阴性=N空
对于HDR定量:
●N总=N空+NNHEJ+NWT++NHDR+
●N阴性=N空+NNHEJ+NWT+
对于WT定量:
●N总=N空+NNHEJ+NWT+
●N阴性=N空+NNHEJ
实施例2:使用ddPCR同时定量由序列特异性核酸酶诱导的HDR和NHEJ事件
绪论
序列特异性核酸酶如TALEN和CRISPR/Cas9系统激活了靶位点处的非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)的DNA修复途径。尽管容易出错,但NHEJ可用于破坏基因功能。对于许多应用,HDR比NHEJ更需要,因为HDR利用同源供体DNA来产生精确的基因修复。由于NHEJ和HDR涉及到不同的修复酶,所以可以想到可通过高HDR和低NHEJ实现条件。然而,改变NHEJ和HDR之间平衡的方法是难以捉摸的,因为我们缺乏一个快速敏感的测定来定量内源性基因座处的NHEJ和HDR。为了克服这一障碍,本文描述了基于液滴数字PCR(ddPCR)和野生型(WT)、NHEJ和HDR等位基因特异性的荧光寡核苷酸探针同时检测NHEJ和HDR的方法。该方法可以测试用于基因组编辑的多种条件,包括不同类型的序列特异性核酸酶和供体DNA,以便将NHEJ和HDR之间的平衡倾向于期望的修复途径。
材料和方法
QX100液滴数字PCR系统(伯乐公司(Bio-Rad))用于ddPCR。使用Voytas实验室的Golden Gate装配系统(Cermak等,Nucleic Acids Res.39,e82,2011)和MR015主链载体(斯坦福大学的M.Porteus和M.Rahdar赠送)构建TALEN。使用Zhang实验室的pX335(缺刻酶)和pX330(核酸酶)(Ran等,Cell 154,1380-1389,2013)构建引导RNA(gRNA)。探针和引物来自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)。
单细胞中的HDR和NHEJ
图9显示了靶向GRN基因座用于人诱导多能干细胞(iPS)中点突变的策略。设计了一对Cas9缺刻酶的gRNA以在GRN基因座中引入C>T点突变(图9A)。野生型C(SEQ ID NO:17-18)和突变体T(SEQ ID NO:20-21)残基用矩形突出显示。缺刻位点由三角形表示。将分离的iPS细胞克隆的序列与WT序列(SEQ ID NO:22-24)比对(图9B)。该克隆具有C>T点突变(SEQID NO:23)和24-bp缺失(SEQ ID NO:24)。这些结果表明,HDR和NHEJ可能发生在单细胞中,最终形成复合杂合突变体细胞。
靶向和检测HDR的设计
图10A-B显示了靶向和检测细胞中同源定向修复(HDR)突变的策略。图10A描绘了在RBM20基因座处用于诱变的TALEN,CRISPR/Cas9和TaqMan PCR系统的设计。设计了一对TALEN和一对gRNA(SEQ ID NO:25-26)。与野生型序列(SEQ ID NO:28-29)相比具有C>A突变的60-nt供体寡核苷酸(SEQ ID NO:27)被设计为用作HDR修复的模板,由此将C>A突变引入细胞(SEQ ID NO:30-31)。还描绘了等位基因特异性TaqMan PCR测定,其被设计用于检测由HDR诱导的特异性编辑但不检测NHEJ。在该测定中,使用与野生型序列互补的羧基荧光素标记的探针来检测野生型序列,并且使用与供体寡核苷酸编码的HDR突变序列互补的VIC标记探针来分别检测野生型和HDR突变。如图10B所示,在本研究中比较了以下不同的核酸酶平台:CRISPR/Cas9,CRISPR/Cas9缺刻酶和TALEN,以比较它们诱导HDR和NHEJ的活性。
仅检测HDR的ddPCR测定
图11A-C显示了仅用于检测HDR的ddPCR测定的基础。将反应划分成超过10,000纳升油包水滴。每个液滴包含所有PCR试剂和少数或没有模板DNA的拷贝。根据存在的模板,热循环放大每个液滴中的FAM、VIC或两个信号。最后,信号在单个液滴中测量,允许检测罕见的模板。浓度以拷贝/μl报告。图11B描绘了WT和HDR等位基因的1∶1混合物的ddPCR的二维图。使用阴性(黑色),FAM+(WT等位基因),VIC+(HDR等位基因)和FAM和VIC双+(WT和HDR等位基因)液滴的数量来计算等位基因的浓度。图11C描述了HDR等位基因和WT等位基因的稀释系列的ddPCR数据。将具有WT-或HDR等位基因的质粒以不同的比例混合。ddPCR可用于大致检测WT等位基因群体中0.1%或更少的HDR等位基因。
检测HDR和NHEJ的ddPCR测定
图12显示了用于同时检测HDR和NHEJ的ddPCR测定的设计。显示了用于检测Cas9诱变的测定法作为实施例。在该实施例中,测定利用FAM-偶联的参考探针(参考探针),其检测远离诱变位点的扩增子中的保守序列,具有点突变等位基因序列的FAM偶联的HDR探针,其检测HDR事件,位于切割位点处具有保守序列的HEX偶联的NHEJ探针,其检测NHEJ事件(或NHEJ探针结合区中的HDR事件),当其不能结合时,以及在HDR位点处具有保守序列但缺乏荧光团的Dark不可延伸的竞争物探针。诱变以诱导图10A-B所示的RBM20点突变后,如果没有留下修饰,WT等位基因将保持完整,给出FAM+和HEX+,因为参考探针和NHEJ探针结合WT等位基因。暗探针与HDR探针竞争,防止HDR探针与WT等位基因结合。如果发生HDR引入C>A转换,则HDR探针将结合所创建的突变体等位基因而不是暗探针,因此HDR等位基因将具有更高的幅度FAM++和HEX+,因为HDR等位基因具有两个FAM探针的结合位点。如果发生NHEJ突变,则NHEJ探针将失去其结合位点,参考探针将保持结合,使得NHEJ等位基因将被检测为FAM+和HEX-。因此,三种不同类型的等位基因在ddPCR中可以检测为不同群。Cas9缺刻酶和TALEN的测定显示在图12的方框部分中。由于使用了一对Cas9缺刻酶,Cas9缺刻酶测定使用两种NHEJ探针。
用于同时检测HDR和NHEJ突变的测定的验证
图13A-D描绘了用于从具有合成DNA(gBlock)的基于Cas9的基因组编辑试剂检测HDR和NHEJ诱导的突变的ddPCR测定的验证数据。没有(图13A)和有(图13B)HDR和NHEJ等位基因的5%gBlock DNA的WT HEK293细胞的基因组DNA通过图12所示的Cas9探针混合物分析(参考,HDR,NHEJ和暗探针)中。WT基因组DNA样品中所有等位基因均为FAM+和HEX+,但当添加gBlock DNA时,检测到HDR(棕色)和NHEJ(蓝色)等位基因。使用合成的DNA测量HDR和NHEJ测定的定量性能显示,检测NHEJ突变的定量限为约0.1%,检测HDR突变低于0.04%(图13C)。用Cas9处理HEK293细胞以诱导HDR,如图10A所示,并分析其基因组DNA。观察到HDR+和NHEJ+群(图13D)。
不同核酸酶的比较
用RBM20TALEN,Cas9或Cas9缺刻酶与RBM20R636S单链寡DNA供体一起转染HEK293细胞或人iPS细胞以引入C>A突变,如图10A-B所示。通过使用图12和13A-D中描述的探针和引物组分析从这些细胞分离的基因组DNA以检测HDR和NHEJ突变。标准化至WT等位基因的HDR和NHEJ等位基因的拷贝数显示在图14左图中。图14,右图仅显示了HDR突变的数据。在HEK293细胞和iPS细胞中,所有的核酸酶比HDR都诱导多得多的NHEJ。
结论
本文描述的是高度灵敏,定量和快速的方法来同时检测HDR和NHEJ事件。通过使用该方法,显示了序列特异性核酸酶比HDR更诱导多得多的NHEJ。这种方法可以允许轻松搜索改进的基因组编辑条件。例如,该测定可用于鉴定增加HDR突变的产生同时最小化NHEJ突变的产生的条件。
序列表
<110> J·大卫格莱斯顿学会(J. David Gladstone Institutes)
生物辐射实验室股份有限公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)
J·伯曼(Berman, Jennifer)
S·库珀(Cooper, Samantha)
G·卡琳-纽曼(Karlin-Neumann, George)
Miyaoka, Yuichiro
B·康克林(Conklin, Bruce)
J·施诺夫(Shinoff, Josh)
<120> 检测基因组编辑
<130> 0968442
<150> US 62/101,828
<151> 2015-01-09
<150> US 62/201,446
<151> 2015-08-05
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核苷酸序列-DNA靶标
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aatggggagg acatcgatgt cacctccaat gactagggtg ggcaaccac 49
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<212> DNA
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<223> 合成核苷酸序列- DNA靶标(反向互补)
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gtggttgccc accctagtca ttggaggtga catcgatgtc ctccccatt 49
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列- sgRNA
<400> 3
gtcacctcca atgactaggg guuuuagagc uagaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu u 101
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列-供体寡
<400> 4
acagatatgg cccagaaagg ccgcggtcta gtagtccggt gagccggtca ctctccccga 60
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成gRNA寡核苷酸序列
<400> 5
ccttggctcc ctcacagata tggggtctcg tagtccggtg agccgg 46
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成gRNA寡核苷酸序列
<400> 6
ggtctcgtag tccggtgagc cgg 23
<210> 7
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成gRNA寡核苷酸序列
<400> 7
taaatcctgc tccttggctc cctcacagat atggcccaga aaggccgcgg tctcgtagtc 60
cggtgagccg gtcactctcc ccgaggt 87
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物寡核苷酸
<400> 8
gtcctctgca cggaag 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸探针HEX (NHEJ)
<400> 9
tgctccttgg ctccct 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸探针FAM (HDR)
<400> 10
ccgcggtcta gtagtcc 17
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸探针FAM (ref)
<400> 11
acccctgggc acatga 16
<210> 12
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸靶序列
<400> 12
gtcctctgca cggaagccag ataaatcctg ctccttggct ccctcacaga tatggcccag 60
aaaggccgcg gtctcgtagt ccggtgagcc ggtcactctc cccgaggttg gacccctggg 120
cacatgatcg caaacaccac cc 142
<210> 13
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸靶序列(反向互补)
<400> 13
gggtggtgtt tgcgatcatg tgcccagggg tccaacctcg gggagagtga ccggctcacc 60
ggactacgag accgcggcct ttctgggcca tatctgtgag ggagccaagg agcaggattt 120
atctggcttc cgtgcagagg ac 142
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物寡核苷酸
<400> 14
gggtggtgtt tgcga 15
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸探针HEX (NHEJ)
<400> 15
agagtgaccg gctcac 16
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸探针HEX (NHEJ)
<400> 16
cggcctttct gggcc 15
<210> 17
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸GRN WT等位基因
<400> 17
ccagcactgc tgcccggctg gctacacctg caacgtgaag gctcgatcct gcgagaagga 60
agtggtctct gccca 75
<210> 18
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸GRN WT等位基因(反向互补)
<400> 18
tgggcagaga ccacttcctt ctcgcaggat cgagccttca cgttgcaggt gtagccagcc 60
gggcagcagt gctgg 75
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成GRN突变体寡核苷酸供体
<400> 19
cggctggcta cacctgcaac gtgaaggctt gatcctgcga gaaggaagtg gtctctgccc 60
<210> 20
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸GRN突变体等位基因
<400> 20
ccagcactgc tgcccggctg gctacacctg caacgtgaag gcttgatcct gcgagaagga 60
agtggtctct gccca 75
<210> 21
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸GRN突变体等位基因(反向互补)
<400> 21
tgggcagaga ccacttcctt ctcgcaggat caagccttca cgttgcaggt gtagccagcc 60
gggcagcagt gctgg 75
<210> 22
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸 - WT
<400> 22
gctgcccggc tggctacacc tgcaacgtga aggctcgatc ctgcgagaag gaagtggtct 60
ctgccc 66
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸 - 等位基因A
<400> 23
gctgcccggc tggctacacc tgcaacgtga aggcttgatc ctgcgagaag gaagtggtct 60
ctgccc 66
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸 - 等位基因B
<400> 24
gctgcccggc tggctacacc tgcaaggaag tggtctctgc cc 42
<210> 25
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成gRNA核苷酸序列
<400> 25
ggaggtgtga agattctaaa tcctgctcct tggctccctc acagatatgg ctcagaaagg 60
ccggggtctc gtagtccggt gagccggtca ctctccccga ggtcccacac tcccagcttc 120
acctcctgca gc 132
<210> 26
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成gRNA核苷酸序列(反向互补)
<400> 26
gctgcaggag gtgaagctgg gagtgtggga cctcggggag agtgaccggc tcaccggact 60
acgagacccc ggcctttctg agccatatct gtgagggagc caaggagcag gatttagaat 120
cttcacacct cc 132
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成供体寡核苷酸序列
<400> 27
acagatatgg cccagaaagg ccgcggtcta gtagtccggt gagccggtca ctctccccga 60
<210> 28
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RMB20 WT等位基因核苷酸序列
<400> 28
ggaggtgtga agattctaaa tcctgctcct tggcggcctc acagatatgg cccagaaagg 60
ccgcggtctc gtagtccggt gagccggtca ctctccccga ggtcccacac tccgagcttc 120
acctcctgca gc 132
<210> 29
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RMB20 WT等位基因核苷酸序列(反向互补)
<400> 29
gctgcaggag gtgaagctcg gagtgtggga cctcggggag agtgaccggc tcaccggact 60
acgagaccgc ggcctttctg ggccatatct gtgaggccgc caaggagcag gatttagaat 120
cttcacacct cc 132
<210> 30
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RMB20突变体等位基因核苷酸序列
<400> 30
ggaggtgtga agattctaaa tcctgctcct tggcggcctc acagatatgg cccagaaagg 60
ccgcggtcta gtagtccggt gagccggtca ctctccccga ggtcccacac tccgagcttc 120
acctcctgca gc 132
<210> 31
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成RMB20突变体等位基因核苷酸序列(反向互补)
<400> 31
gctgcaggag gtgaagctcg gagtgtggga cctcggggag agtgaccggc tcaccggact 60
actagaccgc ggcctttctg ggccatatct gtgaggccgc caaggagcag gatttagaat 120
cttcacacct cc 132
Claims (50)
1.一种对细胞样品中同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)基因组编辑产物同时定量的方法,其中所述细胞样品包含已经与设置成切割或切开靶基因组区中的DNA的位点特异性基因组编辑试剂和HDR模板核酸接触的细胞,所述方法包括:
a)形成多个具有平均体积的混合物划分产物,其中混合物划分产物包含:
i)靶基因组区;
ii)DNA-依赖性DNA聚合酶;
iii)正向和反相寡核苷酸扩增引物,其中所述正向和反应引物与靶基因组区的相反链杂交并侧接靶基因组区,并且其中引物设置成在聚合酶存在下扩增靶基因组区;
iv)可检测标记的寡核苷酸参考探针,其中参考探针杂交至野生型靶基因组区、含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的同源定向修复引入的HDR突变的靶基因组区,和含有通过对来自位点特异性基因组编辑试剂的DNA破坏的NHEJ修复引入的NHEJ突变的靶基因组区;
v)可检测标记的寡核苷酸HDR探针,其中HDR探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交;和vi)可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针,其中所述NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区杂交,并且其中所述NHEJ脱落探针不与含有NHEJ突变的靶基因组区杂交;
b)扩增多个混合物划分产物中的靶基因组区;并且
c)通过检测多个混合物划分产物中标记的探针与靶基因组区的杂交来确定野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量,和含有NHEJ突变的靶基因组区的量。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述参考和HDR探针包含相同的可检测标记物。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述HDR探针不与野生型靶基因组区杂交。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述NHEJ脱落探针不与含有HDR突变的靶基因组区杂交。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述NHEJ脱落探针与含有HDR突变的靶基因组区杂交。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述DNA依赖性DNA聚合酶包含5’至3’外切核酸酶活性,和c)包括检测多个混合物划分产物中由对杂交的标记的探针的5’至3’外切核酸酶消化导致的荧光增加。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多个混合物划分产物还包含HDR暗寡核苷酸探针,其中该HDR暗探针包含不可由DNA聚合酶延伸的3’末端,并且其中所述HDR暗探针与所述HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述NHEJ脱落探针与所述HDR探针竞争杂交野生型靶基因组区。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述位点特异性基因组编辑试剂是CRISPR-Cas9试剂、TALEN、或锌指核酸酶。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述位点特异性基因组编辑试剂包括2种位点特异性基因组缺刻酶,其中各缺刻酶设置成在其他缺刻酶的不到约1kb以内切开细胞基因组中的靶DNA。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括,在形成多个混合物划分产物之前,提供细胞样品并提取靶基因组区。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述提供包括使多个细胞与位点特异性基因组编辑试剂接触。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,向患者给予与位点特异性基因组编辑试剂接触的多个细胞,并且所述提供包括提供来自已经向其给予细胞的患者的细胞样品。
14.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述提供还包括使所述多个细胞与HDR模板核酸接触,其中所述HDR模板核酸包含靶基因组区的部分的突变并且设置成在对靶基因组区的同源定向修复期间发挥模板作用,从而将HDR突变引入靶基因组区。
15.如权利要求14所述的方法,其特征在于,所述HDR模板核酸包括DNA。
16.如权利要求14所述的方法,其特征在于,所述HDR模板核酸是单链DNA寡核苷酸。
17.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多个混合物划分产物包含多个结构上不同的可检测标记的寡核苷酸NHEJ脱落探针,其中所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针与野生型靶基因组区的不同亚区杂交。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交。
19.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且不与HDR突变的亚区杂交。
20.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述多个结构上不同的NHEJ脱落探针不与NHEJ突变的亚区杂交并且与含有HDR突变的靶基因组区杂交。
21.如权利要求1所述的方法,其特征在于,c)包括通过对以下进行检测并计数来确定样品中具有NHEJ突变的靶基因组区的浓度:
i)不含靶基因组区的混合物划分产物的总数;和
ii)以下部分的总数:
-其中仅检测到含NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;和
-不含靶基因组区的混合物划分产物,
其中浓度计算为多个混合物划分部分的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。
22.如权利要求1所述的方法,其特征在于,c)包括通过对以下进行检测和计数来确定样品中具有HDR突变的靶基因组区的浓度:
i)以下的总数:
-不含靶基因组区的混合物划分产物;
-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;
-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物;和
-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;和
ii)以下的总数:
-i);和
-其中检测到HDR突变的混合物划分产物,其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。
23.如权利要求1所述的方法,其特征在于,c)包括通过对以下进行检测和计数来确定样品中野生型靶基因组区的浓度:
i)以下的总数:
-不含靶基因组区的混合物划分产物;和
-其中仅检测到含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;和
ii)以下的总数:
-i);
-其中仅检测到野生型靶基因组区的混合物划分产物;和
-其中仅检测到野生型靶基因组区和含有NHEJ突变的靶基因组区的混合物划分产物;
并且其中浓度计算为多个混合物划分产物的平均体积的倒数乘以i)除以ii)的比率的负自然对数。
24.一种鉴定细胞的基因组编辑的优化条件的方法,所述方法包括:
a)在第一组条件下对多个细胞进行位点特异性基因组编辑以提供第一细胞样品;
b)在第二组条件下对多个细胞进行位点特异性基因组编辑以提供第二细胞样品;
c)进行如权利要求1-10或17-23中任一项所述的方法中的任一种以对第一和第二细胞样品中NHEJ编辑的靶基因组区和HDR编辑的靶基因组区的数量进行定量以确定第一和第二组条件的基因组编辑效率;
d)比较第一和第二组条件的基因组编辑效率以鉴定提供较高基因组编辑效率的一组条件;和
e)选择提供较高基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。
25.如权利要求24所述的方法,其特征在于,
a)包括使第一细胞样品与第一浓度的基因组编辑试剂接触;和
b)包括使第二细胞样品与第二浓度的基因组编辑试剂接触。
26.如权利要求24所述的方法,其特征在于,
a)包括使第一细胞样品与第一基因组编辑试剂接触;和
b)包括使第二细胞样品与第二结构不同的基因组编辑试剂接触。
27.如权利要求24所述的方法,其特征在于,
c)包括确定第一组条件的HDR基因组编辑效率并确定第二组条件的HDR基因组编辑效率;
d)包括比较第一和第二组条件的HDR基因组编辑效率以鉴定提供较高HDR基因组编辑效率的一组条件;和
e)包括选择提供较高HDR基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。
28.如权利要求27所述的方法,其特征在于,
c)包括确定第一组条件的NHEJ基因组编辑效率并确定第二组条件的NHEJ基因组编辑效率;
d)包括比较第一和第二组条件的NHEJ基因组编辑效率以鉴定提供较低NHEJ基因组编辑效率的一组条件;和
e)包括选择提供较高HDR基因组编辑效率和较低NHEJ基因组编辑效率的一组条件作为基因组编辑的优化条件。
29.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其特征在于,细胞样品来自已经向其给予基因组编辑的细胞的患者,并且所述方法还包括从野生型靶基因组区的量、含有HDR突变的靶基因组区的量、和/或含有NHEJ突变的靶基因组区的量估计患者中基因组编辑的细胞的数量。
30.一种监测患者中细胞群的方法,其中所述细胞包括编辑的基因组的克隆群,所述方法包括:
提供来自已经向其给予包含编辑的基因组的克隆群的细胞的个体的样品作为治疗的部分;
分析所述样品以确定所述样品中编辑的基因组或其片段的数量;并且
从所述样品中编辑的基因组或其片段的数量估计所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量。
31.如权利要求30所述的方法,其特征在于,分析所述样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括使用如权利要求1-22中任一项所述的方法定量同源定向修复(HDR)和非同源末端连接基因组编辑产物。
32.如权利要求30所述的方法,其特征在于,分析所述样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括对含有通过基因组编辑诱导的多态性的基因组的数量进行定量。
33.如权利要求32所述的方法,其特征在于,所述定量包括液滴数字核酸扩增。
34.如权利要求30所述的方法,其特征在于,分析所述样品以确定编辑的基因组或其片段的数量包括大规模平行测序。
35.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述方法包括基于所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的估计数量确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。
36.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述方法还包括比较患者中编辑的基因组的克隆群的细胞的估计数量与已经给予患者的基因组编辑的细胞的数量。
37.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量和已经给予患者的细胞的数量之间的差表示治疗是否成功或是否将要成功。
38.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品的患者中的包含编辑的基因组的克隆群的细胞数量的变化确定治疗成功或失败的风险因数。
39.如权利要求38所述的方法,其特征在于,所述风险因数是让步比。
40.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述方法包括基于从给予细胞到从患者获得样品的患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。
41.如权利要求40所述的方法,其特征在于,从给予细胞到从患者获得样品,患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的减少表明需要向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。
42.如权利要求36所述的方法,其特征在于,所述方法包括,基于从给予细胞到从患者获得样品的患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含替代编辑的基因组的第二克隆群的细胞。
43.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
分析第二样品以估计所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的第二数量,其中第二样品是在较晚的时间点从所述患者获取的样品;并且
比较来自第一与第二样品的患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量变化。
44.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述细胞的数量变化指示治疗是否成功或是否将会成功。
45.如权利要求43所述的方法,其特征在于,从所述第一到第二样品,在患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量减少表明治疗不成功或将不成功。
46.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述方法包括从所述第一到第二样品,基于患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定治疗成功或失败的风险因数。
47.如权利要求46所述的方法,其特征在于,所述风险因数是让步比。
48.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述方法包括从所述第一到第二样品,基于所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。
49.如权利要求48所述的方法,其特征在于,从第一到第二样品,患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的减少表明需要向所述患者给予包含编辑的基因组的克隆群的额外的细胞。
50.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述方法包括从所述第一到第二样品,基于所述患者中包含编辑的基因组的克隆群的细胞的数量的变化确定是否向所述患者给予包含替代编辑的基因组的第二克隆群的细胞。
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