JP2022513696A - カンジダ・アウリス(candida auris)の検出のための組成物および方法 - Google Patents
カンジダ・アウリス(candida auris)の検出のための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本開示は、例えばCA 5.8s/ITS2 rRNA遺伝子核酸配列の一部を増幅することによってCAを検出する方法を提供する。該遺伝子の核酸配列は公的に入手可能である(例えば、GenBankアクセッション番号AB375772)。具体的には、特定のCA核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが本開示の実施形態によって提供される。
米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号および同第4,965,188号には、従来のPCR技術が開示されている。PCRは、典型的には、選択された核酸鋳型(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態では有用なプライマーは、記載される標的CA遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド(例えば、配列番号1~7)を含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる1つの方法は、加熱によるものである。
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、同第5,565,322号、同大5,849,489号、同第6,162,603号)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および/または定量することができる、2つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分(例えば、米国特許第7,741,467号を参照)を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
本開示は、生物学的または非生物学的試料中のCAの存在または非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、試料汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。上記方法は、1つ以上のプライマー対を使用して試料からの標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも1つのサイクリング工程を実施すること、およびFRET検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。上記方法を、CAの存在を検出するためにプライマーおよびプローブを使用して行うことができ、標的CA遺伝子の検出は、試料中のCAの存在を示す。
本開示の実施形態は、CAを検出するための製造品、組成物またはキットを更に提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的CA遺伝子を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含むことができる。組成物は、標的CA遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを含むことができる。特定の実施形態では、組成物はまた、標的CA遺伝子を検出するためのプローブを含むことができる。CAを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。更に、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびDNA標準のような、DNA固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅して標的核酸分子にハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
CAの標的選択は、公開配列データベースの包括的検索、ならびに最近傍のカンジダ・ヘムロニイおよびサッカロミセス・セレビシエを同定する可能性のあるCA標的の文献検索の結果であった。公開配列データベースからの複数の標的を設計段階の標的選択プロセスで分析したが、すべてがC.ヘムロニイおよびS.セレビシエとの交差反応性を示した。公開データベース内の配列は、マルチコピー標的からの「バルク」配列データによって複雑化される。選択されたオリゴヌクレオチドのBLAST分析は、唯一の有意な交差反応性がカンジダ・ヘムロニイによるものであることを示した。
略式の配列表
配列番号1:CAUR001フォワードプライマー TGAGCGTGATGTCTTCTCAC
配列番号2:CAUR003フォワードプライマー GAGCGTGATGTCTTCTCACC
配列番号3:CAUR005フォワードプライマー ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAA
配列番号4:CAUR007フォワードプライマー AACTAACCCAACGTTAAGTTCAAC
配列番号5:CAUR002リバースプライマー CCTGATTTGAGGCGACAACAA
配列番号6:CAUR004リバースプライマー CGTCTGCAAGTCATACTACGTA
配列番号7:CAUR006リバースプライマー CGATGATTCACGTCTGCAAGTC
配列番号8:CAUR008リバースプライマー CAACGCCACCGCGAA
配列番号9:CAUR101HQ6プローブ CTTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA
配列番号10:CAUR103HQ6プローブ TTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA
配列番号11:CAUR105HQ10プローブ ACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATG
配列番号12:CAUR107HQ8プローブ CTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA
Claims (15)
- 試料中のカンジダ・アウリス(CA:Candida auris)を検出する方法であって、
-CA 5.8s/ITS2 rRNA核酸が前記試料中に存在する場合、CA 5.8s/ITS2 rRNA遺伝子プライマーのセットと前記試料とを接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること、
-1種以上の検出可能なCA 5.8s/ITS2 rRNA遺伝子プローブと前記増幅産物とを接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること、および
-前記増幅産物の存在または非存在を検出することであって、前記増幅産物の存在が前記試料中のCAの存在を示し、前記増幅産物の非存在が前記試料中のCAの非存在を示す、検出すること、を含み、
前記CA 5.8s/ITS2 rRNA遺伝子プライマーのセットが、配列番号1~3からなる群から選択される第1の核酸配列またはその相補体を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号5~6および8からなる群から選択される第2の核酸配列またはその相補体を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーとを含み、
前記1種以上の検出可能なCA 5.8s/ITS2 rRNA遺伝子オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号9~11からなる群から選択される第3の核酸配列またはその相補体を含む、方法。 - 前記ハイブリダイズ工程が、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識された検出可能なCA 5.8s/ITS2 rRNA遺伝子オリゴヌクレオチドプローブと前記増幅産物とを接触させることを含み、検出工程が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の存在または非存在を検出することを含み、蛍光の前記存在または非存在が、前記試料中のCAの存在または非存在を示す、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅工程が、5’~3’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター部分が、前記プローブ上で互いに8~20ヌクレオチド以内にある、請求項2または3に記載の方法。
- 前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号2の核酸配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号5の核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号10の核酸配列を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 第1、第2および第3のオリゴヌクレオチドが40個以下のヌクレオチドを有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 第1、第2および第3のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、少なくとも1種の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- カンジダ・アウリス(CA)の核酸を検出するためのキットであって、
-配列番号1~3からなる群から選択される第1の核酸配列またはその相補体を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
-配列番号5~6および8からなる群から選択される第2の核酸配列またはその相補体を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに
-配列番号9~11からなる群から選択される第3の核酸配列またはその相補体を含む蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、前記第1および前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、を含む、キット。 - 第3の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む、請求項9に記載のキット。
- 前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項10に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液の少なくとも1つを更に含む、請求項9~11のいずれか一項に記載のキット。
- 第1、第2および第3のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、少なくとも1種の修飾ヌクレオチドを含む、請求項9~12のいずれか一項に記載のキット。
- 第1、第2および第3のオリゴヌクレオチドが40個以下のヌクレオチドを有する、請求項9~13のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号2の核酸配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号5の核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号10の核酸配列を含む、請求項9~14のいずれか一項に記載のキット。
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