CN109154023B - 用于检测阴道毛滴虫的组合物和方法 - Google Patents
用于检测阴道毛滴虫的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
描述了用于快速检测生物样品或非生物样品中阴道毛滴虫(TV)的存在或不存在的方法。所述方法可以包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外,提供了设计用于检测TV的靶向靶TV基因的引物、探针,以及试剂盒。
Description
发明领域
本公开内容涉及分子诊断学领域,并且更具体地涉及阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的检测。
发明背景
阴道毛滴虫(TV)是一种引起滴虫病的有鞭毛的原生动物寄生虫,滴虫病是美国最普遍的非病毒的性传播感染,在全国影响约370万人。黑人和非西班牙裔白人女性之间的患病率不同,分别有13%和1.8%受影响。已经报道阴道毛滴虫感染影响> 11%的年龄≥ 40岁的女性,并且已经报道患病率在STD诊所中测试的有症状的女性中高达26%,而在无症状女性中为6.5%。还已知阴道毛滴虫在与女性发生性关系的男性(MSW)中引起尿道炎。大多数感染都没有被注意到,70%的男性和85%的女性只经历轻微的症状,并且如果不治疗可能持续数月或数年。感染的无症状传播确实发生并且仍然是一个问题。女性中的感染包括阴道炎、宫颈炎和尿道炎。有症状的女性通常主诉阴道分泌物、外阴阴道疼痛和/或刺激。排尿困难也是常见的。并发症可能包括早产、低出生体重的后代、胎膜早破,以及流产后或子宫切除术后感染。已经报道了盆腔炎性疾病(PID)、输卵管性不孕和宫颈癌与先前滴虫病发作的关联。男性中的症状可能包括尿道炎、附睾炎或前列腺炎。
阴道毛滴虫感染与孕妇中HIV感染、早产和其它不良妊娠结局的风险增加到2到3倍相关。在具有HIV感染的女性中,阴道毛滴虫感染与盆腔炎性疾病(PID)的风险增加相关。由于与无症状滴虫病和HIV感染相关的不良事件,推荐对具有HIV感染的无症状女性进行阴道毛滴虫的常规筛查。阴道毛滴虫的诊断测试应该在寻求阴道分泌物处理的女性中进行。对于在高患病率环境(例如STD诊所和监狱)中接受处理的人以及对于处于感染高风险的无症状的人(例如具有多个性伴侣、非法使用毒品或有STD史的人),可考虑进行筛查。
在可获得分子方法之前,培养被认为是用于诊断阴道毛滴虫感染的金标准方法,但与分子方法相比时,已经估计培养的灵敏度在38%至82%的范围。对于女性中的培养,阴道分泌物相对于尿是优选的,因为尿培养已被显示不太灵敏。在男性中,培养标本需要尿道拭子、尿沉渣和/或精液。用于接种单一培养物的来自男性的多个标本的培养可以改进灵敏度。由于方便和相对低成本,生殖器分泌物的湿制备物的显微镜检查可能是用于阴道毛滴虫诊断的最常用方法,但与培养相比仅35%至80%灵敏。此外,湿涂片方法的灵敏度高度依赖于显微镜技术人员的经验以及标本运输到实验室的时间,其中在收集后1小时内灵敏度下降高达20%。因此,本领域需要一种以灵敏的方式特异性检测TV的快速且可靠的方法。
发明概述
本公开内容中的某些实施方案涉及用于快速检测生物样品或非生物样品中TV的存在或不存在的方法,例如通过在单个试管中的实时聚合酶链反应多路检测TV。实施方案包括检测TV的方法,其包括进行至少一个循环步骤,所述循环步骤可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外,实施方案包括设计用于在单个管中检测TV的引物、探针和试剂盒。检测方法被设计用于靶向阴道毛滴虫基因组中的特定基因,所述方法具有区分最接近的相邻物种Trichomonas tenax和人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)的潜力。
提供了用于检测样品中的TV的方法,其包括进行扩增步骤,所述步骤包括使样品与被设计用于靶向特定TV基因的一组引物接触,以便如果样品中存在TV则产生扩增产物;进行杂交步骤,所述步骤包括使扩增产物与一种或多种针对靶TV基因的可检测探针接触;并且检测扩增产物的存在或不存在,其中扩增产物的存在表明样品中存在TV,并且其中扩增产物的不存在表明样品中不存在TV;其中靶TV基因选自5.8s核糖体RNA(5.8s)基因、18s(或16s样)核糖体RNA(18s)基因、DNA错配修复同源物、减数分裂后分离增加-1(PMS1)基因、MutL同源物1a(Mlh1a)基因和冠蛋白(CRN)基因。图1显示了5.8s基因、转录间序列2(ITS2)和相邻基因在TV基因组中的位置。
在一个方面,提供了检测样品中的阴道毛滴虫(TV)的方法,所述方法包括进行扩增步骤,所述步骤包括使样品与一组靶TV基因引物接触,以便如果样品中存在靶TV基因核酸则产生扩增产物;进行杂交步骤,所述步骤包括使扩增产物与一种或多种可检测的靶TV基因探针接触;并且检测扩增产物的存在或不存在,其中扩增产物的存在表明样品中存在TV,并且其中扩增产物的不存在表明样品中不存在TV;其中该组靶TV基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 1-9、19-28、45-48、55-64和80-89的第一寡核苷酸序列或其互补物或由选自SEQ ID NOs: 1-9、19-28、45-48、55-64和80-89的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 10-13、29-38、49-52、65-74和90-99的第二寡核苷酸序列或其互补物或由选自SEQ ID NOs: 10-13、29-38、49-52、65-74和90-99的第二寡核苷酸序列或其互补物组成;并且其中所述一种或多种可检测的靶TV基因探针包含选自SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105的第三寡核苷酸序列或其互补物或由选自SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105的第三寡核苷酸序列或其互补物组成。
在一个实施方案中,用于5.8s基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 10、11、12和13的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 10、11、12和13的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于5.8s基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 14、15、16、17和18的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 14、15、16、17和18的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于5.8s基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ IDNOs: 3、6、7和9的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 3、6、7和9的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NO: 12的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NO: 12的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于5.8s基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 16、17和18的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 16、17和18的核酸序列或其互补物组成。
在另一个实施方案中,用于18s基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 19、20、21、22、23、24、25、26、27和28的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 19、20、21、22、23、24、25、26、27和28的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 29、30、31、32、33、34、35、36、37和38的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 29、30、31、32、33、34、35、36、37和38的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于18s基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 39、40、41、42、43和44的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs:39、40、41、42、43和44的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于18s基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 21和22的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 21和22的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 31和32的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 31和32的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于18s基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NO: 40的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NO: 40的核酸序列或其互补物组成。
在另一个实施方案中,用于PMS1基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 45、46、47和48的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 45、46、47和48的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 49、50、51和52的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ IDNOs: 49、50、51和52的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于PMS1基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 53和54的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 53和54的核酸序列或其互补物组成。
在另一个实施方案中,用于Mlh1a基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 55、56、57、58、59、60、61、62、63和64的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 55、56、57、58、59、60、61、62、63和64的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 65、66、67、68、69、70、71、72、73和74的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 65、66、67、68、69、70、71、72、73和74的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于Mlh1a基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 75、76、77、78和79的核酸序列或其互补物,或由SEQ IDNOs: 75、76、77、78和79的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于Mlh1a基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 57、58、63和64的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 57、58、63和64的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 67、68、73和74的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 67、68、73和74的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于Mlh1a基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 76和79的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 76和79的核酸序列或其互补物组成。
在另一个实施方案中,用于CRN基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 80、81、82、83、84、85、86、87、88和89的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 80、81、82、83、84、85、86、87、88和89的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 90、91、92、93、94、95、96、97、98和99的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 90、91、92、93、94、95、96、97、98和99的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于CRN基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 100、101、102、103、104和105的核酸序列或其互补物,或由SEQ IDNOs: 100、101、102、103、104和105的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于CRN基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:80、81、82和83的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 80、81、82和83的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 90、91、92和93的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 90、91、92和93的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于CRN基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 100和101的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 100和101的核酸序列或其互补物组成。
在一些实施方案中,杂交步骤包括使扩增产物与可检测的靶TV基因探针接触,所述探针使用供体荧光部分和对应的受体部分标记;并且检测步骤包括检测探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在,其中荧光的存在或不存在表明样品中TV的存在或不存在。在一些实施方案中,扩增和杂交步骤是重复的。在本文中,重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物,将需要更多的扩增和杂交步骤以扩增足够用于检测的靶序列。在一些实施方案中,扩增和杂交步骤重复至少约20次,但是可以重复多达至少25、30、40、50、60或甚至100次。此外,检测扩增产物的存在或不存在可以在每次扩增和杂交步骤期间或之后、每隔一次扩增和杂交步骤期间或之后、特定的扩增和杂交步骤期间或之后、或在特定的扩增和杂交步骤期间或之后进行,在所述步骤中期望足够的用于检测的扩增产物(如果存在)。在一些实施方案中,扩增步骤采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中,供体荧光部分和对应的受体部分在探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。在一些实施方案中,受体部分是猝灭剂。
在一些实施方案中,寡核苷酸包含选自SEQ ID NO: 1-105的核苷酸的序列或其互补物,或由选自SEQ ID NO: 1-105的核苷酸的序列或其互补物组成,其具有100个或更少核苷酸、50个或更少的核苷酸、40个或更少的核苷酸或30个或更少的核苷酸。在一些实施方案中,第一和第二靶TV基因引物和可检测靶TV基因探针具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸,30个或更少的核苷酸等)。在另一个实施方案中,本公开内容提供了寡核苷酸,其包括与SEQ ID NO:1-105之一具有至少70%序列同一性(例如,至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸或其互补物,所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。一般地,在这些实施方案中这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等等。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸,例如,以便相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地,寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中,寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简单地“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或者,当核酸不编码氨基酸序列时,是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到改变、添加或缺失编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5%,更通常小于4%、2%或1%)的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”,其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸由化学上相似的氨基酸的取代。在一些实施方案中,第一和第二靶TV基因引物和可检测的靶TV基因探针中的至少一种包含至少一个修饰的核苷酸。
在一些实施方案中,扩增(扩增步骤)可以采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。因此,供体荧光部分和受体部分,例如猝灭剂,沿着探针的长度可以彼此相距不超过5至20个核苷酸(例如,8或10个)。在另一个方面,可检测探针包含允许二级结构形成的核酸序列。这样的二级结构形成通常导致第一荧光部分和第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法,探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
本公开内容提供了检测来自个体的生物样品中TV的存在或不存在的方法。这样的方法一般包括进行至少一个循环步骤,所述循环步骤包括扩增步骤和染料结合步骤。通常,扩增步骤包括使样品与多对设计用于靶向特定TV基因的引物接触,以产生一个或多个靶TV基因扩增产物(如果样品中存在靶TV基因核酸分子),并且染料结合步骤包括使靶TV基因扩增产物与双链DNA结合染料接触。这样的方法还包括检测存在或不存在双链DNA结合染料向扩增产物内的结合,其中结合的存在表明样品中存在TV,并且其中所述结合的不存在表明样品中不存在TV。代表性的双链DNA结合染料是溴化乙锭。另外,这样的方法还可以包括确定靶TV基因扩增产物和双链DNA结合染料之间的解链温度,其中所述解链温度证实TV的存在或不存在。靶TV基因可以包括但不限于5.8s基因、18s基因、PMS1基因、Mlh1a和CRN基因。
在另一个方面中,提供了用于检测TV的一种或多种核酸的试剂盒。该试剂盒可以包括对于靶TV基因的扩增具有特异性的一组或多组引物;以及对于靶TV基因扩增产物的检测具有特异性的一种或多种可检测探针。靶TV基因可以包括但不限于5.8s基因、18s基因、PMS1基因、Mlh1a和CRN基因。具体地,上文结合根据本发明的方法公开的寡核苷酸引物和探针适合包括在根据本发明的试剂盒中。在本文中,提供了用于检测阴道毛滴虫(TV)的核酸的试剂盒,其包含第一引物;第二引物;和荧光可检测标记的探针,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 1-9、19-28、45-48、55-64和80-89的第一寡核苷酸序列或其互补物;所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 10-13、29-38、49-52、65-74和90-99的第二寡核苷酸序列或其互补物;所述荧光可检测标记的探针包含选自SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105的第三寡核苷酸序列或其互补物,所述可检测标记的探针设定为与由第一引物和第二引物产生的扩增子杂交。在一个方面,试剂盒可以包括已经用供体和对应的受体部分,例如另一种荧光部分或暗猝灭剂标记的探针,或者可以包括用于标记探针的荧光团部分(fluorophoric moieties)。试剂盒还可以包括核苷三磷酸、核酸聚合酶和对于核酸聚合酶功能所必需的缓冲液中的至少一种。试剂盒还可以包括用于使用引物、探针和荧光团部分来检测样品中TV的存在或不存在的包装插页和说明书。在一些实施方案中,第三可检测标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和对应的受体部分。在一些实施方案中,受体部分是猝灭剂。在一些实施方案中,第一、第二和第三寡核苷酸中的至少一种包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中,第一、第二和第三寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。
在另一个方面,提供了组合物,其包含如上文公开的用于扩增靶TV基因的一组寡核苷酸引物。在一些实施方案中,该组靶TV基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 1-9、19-28、45-48、55-64和80-89的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 1-9、19-28、45-48、55-64和80-89的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 10-13、29-38、49-52、65-74和90-99的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 10-13、29-38、49-52、65-74和90-99的第二寡核苷酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,组合物进一步包含一种或多种可检测的靶TV基因探针,所述探针包含选自SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105的第三寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105的第三寡核苷酸序列或其互补物组成。
在另一个方面,检测来自个体的生物样品中的TV的方法与检测来自相同生物样品的生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG)的方法一起进行,这是由于感染TV和/或MG的个体的无症状性质。本文中,除上文提供的用于扩增和检测TV的步骤之外,用于检测样品中的MG和/或TV的方法进一步包括进行扩增步骤,所述步骤包括使样品与被设计用于靶向特定MG基因的一组引物接触,以便如果样品中存在MG则产生扩增产物;进行杂交步骤,所述步骤包括使扩增产物与一种或多种针对靶MG基因的可检测探针接触;并且检测扩增产物的存在或不存在,其中扩增产物的存在表明样品中存在MG,并且其中扩增产物的不存在表明样品中不存在MG;其中靶MG基因选自选自23s 核糖体RNA (23s)基因、MgPa黏附操纵子内mgpB基因(mgpB)的保守区A,和mgpB部分重复序列(MgPar)的可变EF区。在一个实施方案中,检测生物样品中的TV和MG的方法在相同的反应混合物中作为多路测定进行。在一个实施方案中,该组靶MG基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:106-112、134-140和152-161的第一寡核苷酸序列或其互补物,所述第二引物包含选自SEQID NOs: 113-122、141-146和162-171的第二寡核苷酸序列或其互补物;并且其中所述一种或多种可检测的靶MG基因探针包含选自SEQ ID NOs: 123-133, 147-151和172-194的第三寡核苷酸序列或其互补物。
在一个实施方案中,用于23s基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 106、107、108、109、110、111和112的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 106、107、108、109、110、111和112的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 113、114、115、116、117、118、119、120、121和122的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 113、114、115、116、117、118、119、120、121和122的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于23s基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132和133的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132和133的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于23s基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 108 和109的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 108 和109的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 113和114的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 113和114的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于23s基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NO: 129的核酸序列或其互补物,或由SEQ IDNO: 129的核酸序列或其互补物组成。
在另一个实施方案中,用于mgpB基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 134、135、136、137、138、139和140的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 134、135、136、137、138、139和140的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 141、142、143、144、145和146的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 141、142、143、144、145和146的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于mgpB基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQID NOs: 147、148、149、150和151的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 147、148、149、150和151的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于mgpB基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 139和140的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 139和140的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 145 和146的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 145 和146的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于mgpB基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 150和151的核酸序列或其互补物,或由SEQID NOs: 150和151的核酸序列或其互补物组成。
在另一个实施方案中,用于MgPar基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 152、153、154、155、156、157、158、159、160和161的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 152、153、154、155、156、157、158、159、160和161的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:162、163、164、165、166、167、168、169、170和171的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 162、163、164、165、166、167、168、169、170和171的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于MgPar基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193和194的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193和194的核酸序列或其互补物组成。在某些实施方案中,用于MgPar基因靶的扩增的引物组包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 153 和161的第一寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 153 和161的第一寡核苷酸序列或其互补物组成,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 169、170和171的第二寡核苷酸序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs:169、170和171的第二寡核苷酸序列或其互补物组成,并且用于MgPar基因扩增产物的检测的可检测探针包含SEQ ID NOs: 185和194的核酸序列或其互补物,或由SEQ ID NOs: 185和194的核酸序列或其互补物组成。在一些实施方案中,杂交步骤进一步包括使扩增产物与可检测的靶MG基因探针接触,所述探针使用供体荧光部分和对应的受体部分标记;并且检测步骤包括检测探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在,其中荧光的存在或不存在表明样品中MG的存在或不存在。在一些实施方案中,扩增和杂交步骤是重复的。在本文中,重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物,将需要更多的扩增和杂交步骤以扩增足够用于检测的靶序列。在一些实施方案中,扩增和杂交步骤重复至少约20次,但是可以重复多达至少25、30、40、50、60或甚至100次。此外,检测扩增产物的存在或不存在可以在每次扩增和杂交步骤期间或之后、每隔一次扩增和杂交步骤期间或之后、特定的扩增和杂交步骤期间或之后、或在特定的扩增和杂交步骤期间或之后进行,在所述步骤中期望足够的用于检测的扩增产物(如果存在)。在一些实施方案中,扩增步骤采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中,供体荧光部分和对应的受体部分在探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。在一些实施方案中,受体部分是猝灭剂。在一些实施方案中,寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs: 106-194的核苷酸的序列或其互补物,或由选自SEQ ID NOs: 106-194的核苷酸的序列或其互补物组成,其具有100个或更少核苷酸、50个或更少的核苷酸、40个或更少的核苷酸或30个或更少的核苷酸。在一些实施方案中,第一和第二靶MG基因引物和可检测靶MG基因探针具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸,30个或更少的核苷酸等)。在另一个实施方案中,本公开内容提供了寡核苷酸,其包括与SEQ ID NOs: 106-194之一具有至少70%序列同一性(例如,至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸或其互补物,所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。一般地,在这些实施方案中这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等等。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸,例如,以便相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地,寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中,寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简单地“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或者,当核酸不编码氨基酸序列时,是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到改变、添加或缺失编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5%,更通常小于4%、2%或1%)的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”,其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸由化学上相似的氨基酸的取代。在一些实施方案中,第一和第二靶MG基因引物和可检测的靶MG基因探针中的至少一种包含至少一个修饰的核苷酸。
在另一个方面,提供了设计用于在单个管中组合检测TV和MG的试剂盒。在本文中,试剂盒可以包括上文提供的对于靶TV基因的扩增具有特异性的一组或多组引物;和对于靶TV基因扩增产物的检测具有特异性的一种或多种可检测探针,所述引物和探针与对于靶MG基因的扩增具有特异性的一组或多组引物;和对于靶MG基因扩增产物的检测具有特异性的一种或多种可检测探针组合。在一个实施方案中,试剂盒包含第一引物;第二引物;和荧光可检测标记的探针,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 1-9、19-28、45-48、55-64和80-89的第一寡核苷酸序列或其互补物;所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 10-13、29-38、49-52、65-74和90-99的第二寡核苷酸序列或其互补物;所述荧光可检测标记的探针包含选自SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105的第三寡核苷酸序列或其互补物,所述可检测标记的探针设定为与由第一引物和第二引物产生的扩增子杂交,并且所述试剂盒进一步包含设计用于靶向特定MG基因以产生所述MG基因的扩增产物的一组引物和一种或多种能够与MG扩增产物杂交的可检测探针。本文中,所述特定MG基因选自23s 核糖体RNA(23s)基因、MgPa黏附操纵子内mgpB基因(mgpB)的保守区A,和mgpB部分重复序列(MgPar)的可变EF区。更具体地,用于扩增和检测特定MG基因的引物和探针可以是上文所述的MG引物和探针。在一些实施方案中,该组靶MG基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 106-112、134-140和152-161的第一寡核苷酸序列或其互补物,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 113-122、141-146和162-171的第二寡核苷酸序列或其互补物;并且其中所述一种或多种可检测的靶MG基因探针包含选自SEQ ID NOs: 123-133、147-151和172-194的第三寡核苷酸序列或其互补物。在一些实施方案中,试剂盒包括已经用供体和对应的受体部分,例如另一种荧光部分或暗猝灭剂标记的探针,或者可以包括用于标记探针的荧光团部分。在本文中,用于检测TV和用于检测MG的探针的标记可以是相同的。在该实施方案中,试剂盒可用于检测TV或MG中的任一种,而不区分存在哪种靶核酸。在另一个实施方案中,用于检测TV的探针的标记与用于检测MG的标记不同,使得能够特异性检测任一种靶核酸并区分存在哪种靶核酸(TV和MG均不存在、只有TV或MG之一,或TV和MG两者)。试剂盒可以进一步包括上文对TV试剂盒概述的任何组分。
除非另行定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在下文中描述了合适的方法和材料,但与本文所述那些类似或等同的方法和材料也可用于实践或测试本主题。另外,所述材料、方法和实施例仅为说明性,且非旨在限制。在以下的附图和说明书中描述了本发明的一个或多个实施方案的详细内容。本发明的其它特征、目标和优点从附图和详细描述以及权利要求书将是显而易见的。
附图简述
图1显示了5.8s核糖体RNA基因、转录间序列2(ITS2)和相邻核糖体基因在阴道毛滴虫基因组中的位置。
图2显示了在不同浓度的基因组阴道毛滴虫DNA模板存在下(以每个PCR反应1000[黑色]、100[浅灰色]和10[灰色]基因组当量浓度存在),实时PCR实验的PCR生长曲线。
图3和4显示了在与内部对照标准(GIC 10PFU/PCR)和10 ge/PCR的生殖支原体DNA模板(MG 10ge/PCR)的共同扩增中,具有以每个PCR反应100 (1e2 FdT)、10 (1e1 FdT)、5(5ge FdT) 和1 (1ge FdT)基因组当量浓度存在的基因组阴道毛滴虫DNA模板浓度的实时PCR实验的PCR生长曲线。
发明详述
通过核酸扩增来诊断TV感染提供了用于快速且准确地检测原生动物感染的方法。本文描述了用于检测样品中的TV的实时测定。提供了用于检测TV的引物和探针,以及含有这样的引物和探针的制品或试剂盒。与其它方法相比,用于检测TV的实时PCR的增加的灵敏度,以及实时PCR的改进的特征,包括样品容量和扩增产物的实时检测,使得这种技术用于临床实验室中的TV感染的常规诊断的实施成为可行。
本公开内容包括与TV基因组的特定基因座杂交的寡核苷酸引物和荧光标记的水解探针,以便使用TaqMan®扩增和检测技术特异性鉴定TV。对TV的靶选择需要公共序列数据库的全面检索,以及对于具有区分最接近的相邻物种Trichomonas tenax和人五毛滴虫的潜力的TV靶的文献检索。在靶选择过程中分析来自公共序列数据库的多个靶,但许多显示与T. tenax和人五毛滴虫的交叉反应性。此外,公共数据库中的序列由来自多拷贝靶的“大批”序列数据复杂化。
作为分析的结果,可能的靶TV基因包括5.8s核糖体RNA基因(GenBank登录号U86613)、18s核糖体RNA基因(GenBank登录号NW001533462)、DNA错配修复同源物,减数分裂后分离增加-1 (PMS1)基因(GenBank登录号NW001581675)、MutL同源物1a (Mlh1a)基因(GenBank登录号XM001320341)和冠蛋白(CRN)基因(GenBank登录号XM001581132)。在某些方面,靶TV基因是5.8s核糖体RNA基因,因为该基因以每个基因组超过200个拷贝存在,因此将有益于测定的灵敏度。此外,5.8s核糖体RNA基因存在于甲硝唑抗性和甲硝唑敏感性TV中,因此允许两种TV类型的组合检测。
所公开的方法可以包括进行至少一个循环步骤,所述步骤包括使用一对或多对引物扩增来自样品的核酸分子基因靶的一个或多个部分。如本文使用的“引物”是指寡核苷酸引物,其与TV中的靶基因特异性退火,并且在适当条件下从其起始DNA合成,产生各自的扩增产物。所讨论的引物中的每一种与各自的靶核酸分子内或相邻的靶退火,使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于靶的核酸序列。如果样品中存在一种或多种靶TV基因核酸,则产生一种或多种扩增产物,因此一种或多种靶TV基因扩增产物的存在表明样品中TV的存在。扩增产物应含有与用于靶TV基因的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文使用的“探针”是指与编码靶TV基因的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤,其中使样品与一种或多种可检测的探针接触,用于检测样品中TV的存在或不存在。
如本文使用的术语“扩增”是指合成与模板核酸分子的一条链或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性、在低于引物的解链温度的温度将引物退火至模板核酸,以及从引物酶促延伸以生成扩增产物。扩增通常要求存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如,Platinum® Taq)以及用于聚合酶的最优活性的合适的缓冲液和/或辅因子(例如,MgCl2和/或KCl)。
如本文使用的术语“引物”是本领域技术人员已知的并且是指寡聚化合物,主要指寡核苷酸但也指修饰的寡核苷酸,其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成,即,例如寡核苷酸的3'端提供游离的3'-OH基团,可以通过模板依赖性DNA聚合酶将另外的“核苷酸”连接到其上建立3'至5'磷酸二酯键,由此使用脱氧核苷三磷酸,并且由此释放焦磷酸。因此,可能除了对于所预期的功能之外,“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间不存在根本的区别。
术语“杂交”是指一个或多个探针退火至扩增产物。杂交条件通常包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。
术语“5'至3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性,其通常与核酸链的合成有关,由此将核苷酸从核酸链的5'端移除。
术语“耐热聚合酶”是指热稳定的聚合酶,即,该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成,并且当经受升高的温度持续引起双链模板核酸变性所必需的时间时,不会不可逆地变性。一般地,合成起始于每个引物的3'端并以5'至3'的方向沿着模板链进行。已经从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T. thermophilus)、水生栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T. rubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)中分离出了耐热聚合酶。尽管如此,不耐热的聚合酶也可被用于PCR测定,前提是补充该酶。
术语“其互补物”是指与给定的核酸不仅长度相同并且还完全互补的核酸。
当谈到核酸而使用时,术语“延伸”或“延长”是指额外的核苷酸(或其它类似分子)被掺入到核酸中的情况。例如,核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂,如聚合酶延伸,所述聚合酶通常在核酸的3'末端添加核苷酸。
在两个或更多个核酸序列的语境中,术语“相同的”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列在针对最大对应程度进行比较和比对(例如,使用技术人员可获得的序列比较算法之一或通过目测进行测量)时,是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法为BLAST程序,其描述在,例如,Altschul et al. (1990) “Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) “Identification of protein coding regions bydatabase similarity search” Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996)“Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschulet al. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of proteindatabase search programs” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 以及Zhang et al.(1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive orautomated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656。
在寡核苷酸的语境中,“修饰的核苷酸”是指一种改变,其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸所替换,这为寡核苷酸提供了所需的特性。本文中所述的寡核苷酸中可被取代的示例性的修饰的核苷酸包括,例如,C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄嘌呤核苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基核糖-U、2'-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。寡核苷酸中可被取代的许多其它修饰的核苷酸在本文中提到,或以其它方式为本领域中已知。在某些实施方案中,相对于对应的未修饰的寡核苷酸的解链温度,修饰的核苷酸取代改变了寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明,在一些实施方案中,某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如,最小化引物二聚体形成等),增加预期靶扩增子的产量,和/或等。这些类型的核苷酸修饰的实例描述在,例如美国专利号6,001,611中。
TV的检测
本公开内容提供了通过扩增例如靶TV基因核酸序列的一部分来检测TV的方法。5.8s基因、18s基因、PMS1基因、Mlh1a 基因和CRN基因的核酸序列是公众可获得的(例如,GenBank)。具体地,在本公开内容中通过实施方案提供了用于扩增和检测特定TV核酸分子靶的引物和探针。
为了检测TV,提供了用于扩增靶TV基因的引物和探针。除了本文例示的那些以外的核酸也可以用于检测样品中的TV。例如,通过本领域技术人员使用常规方法可以评估功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能性变体可以包含例如本文公开的靶TV基因核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体地,寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NO: 1-105的序列的核酸、其基本上相同的变体,其中所述变体与SEQ ID NO: 1-105之一具有至少例如80%、90%或95%序列同一性,或SEQ ID NO: 1-105以及所述变体的互补物。
表I:5.8s正向引物
表II: 5.8s反向引物
表III: 5.8s探针
表IV: 18s正向引物
表V: 18s反向引物
表VI:18s探针
表VII:PMS1正向引物
表VIII: PMS1反向引物
表IX:PMS1探针
表X: Mlh1a正向引物
表XI: Mlh1a反向引物
表XII:Mlh1a探针
表XIII: CRN正向引物
表XIV: CRN反向引物
表XV:CRN探针
在一个实施方案中,使用了上文描述的引物和探针组,从而提供在疑似含有TV的生物样品中的TV的检测。所述引物和探针组可包含5.8s基因、18s基因、PMS1基因、Mlh1a基因和CRN基因的核酸序列的特异性引物和探针,或由所述引物和探针组成,所述引物和探针包含SEQ ID NOs: 1-105的核酸序列或由SEQ ID NOs: 1-105的核酸序列组成。在另一个实施方案中,用于靶TV基因的引物和探针包含SEQ ID NOs: 1-105的引物和探针中任一者的功能活性变体,或由所述变体组成。
SEQ ID NOs: 1-105的引物和/或探针中任一者的功能活性变体可通过使用所公开方法中的引物和/或探针鉴定。SEQ ID NOs: 1-105中任一者的引物和/或探针的功能活性变体属于这样的引物和/或探针:相比于SEQ ID NOs: 1-105的各自的序列,其在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高的特异性和灵敏度。
变体可例如通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代,如在SEQ ID NOs: 1-105的各自的序列的5'端和/或3'端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代而不同于SEQ ID NOs:1-105的序列。如上文详述的,引物(和/或探针)可以是化学修饰的,即,引物和/或探针可包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后,探针(或引物)即为修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过某种修饰而不同于天然“核苷酸”,但仍然由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖(pentofuranosyl sugar)或戊呋喃糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或其组合组成。例如,可以将“标记”连接到“核苷酸”的碱基部分,从而得到“修饰的核苷酸”。同样还可以用,例如,7-脱氮嘌呤替换“核苷酸”中的天然碱基,从而得到“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)以如上文对于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)所概括的方式,通过某种修饰而不同于天然核苷。
可以使用例如计算机程序如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc.,Cascade, Colo.)设计包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物的寡核苷酸,其扩增编码靶TV基因,例如5.8s基因的核酸分子。在设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以促进检测(例如,通过电泳)、引物对的成员的相似的解链温度、以及每个引物的长度(即,引物需要足够长,以便序列特异性地退火并启动合成,但又不过长使得在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常,寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如,长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸)。在一些实施方案中,寡核苷酸引物的长度为40个或更少核苷酸。
除一组引物之外,所述方法可以使用一种或多种探针,以便检测TV的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA),其通过设计或选择而含有特定的核苷酸序列,所述核苷酸序列允许所述核酸在明确的预定严格性下与“靶核酸”特异性地(即,优先地)杂交,在本发明的情况下与靶TV基因核酸特异性地(即,优先地)杂交。“探针”可以被称为“检测探针”,意指它检测靶核酸。
在一些实施方案中,描述的靶TV基因探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中,靶TV基因探针可以用供体荧光部分(例如,荧光染料)和对应的受体荧光部分(例如,猝灭剂)来标记。在一个实施方案中,探针包含荧光部分和核酸序列或由荧光部分和核酸序列组成,所述核酸序列包含SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105或由SEQ ID NOs: 14-18、39-44、53-54、75-79和100-105组成。
设计待用作探针的寡核苷酸可以通过与引物设计类似的方式进行。实施方案可使用单个探针或一对探针以用于检测扩增产物。取决于实施方案,所用探针可包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。如引物一样,探针通常具有相似的解链温度,并且每个探针的长度必须足以使序列特异性杂交发生,但又不过长使得在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15-40(例如,16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
构建体可以包括各自含有靶TV基因引物和探针核酸分子之一的载体。例如,构建体可以用作对照模板核酸分子。适合使用的载体是商购可得的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法生产。靶TV基因核酸分子可以例如通过化学合成、从TV直接克隆或通过PCR扩增获得。
除靶TV基因核酸分子(例如,含有SEQ ID NOs: 1-105中的一个或多个序列的核酸分子)之外,适用于所述方法的构建体通常还包括编码选择标记(例如抗生素抗性基因)的序列(其用于选择期望的构建体和/或转化体)以及复制起点。载体系统的选择通常取决于几个因素,包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、可选择性、诱导性和回收的容易性。
含有靶TV基因核酸分子的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文使用的,术语宿主细胞意欲包括原核生物和真核生物,例如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌(E. coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母例如酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞例如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、昆虫细胞和植物细胞例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)。可以使用本领域普通技术人员通常已知的技术中的任一种将构建体引入宿主细胞内。例如,磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是用于将核酸引入宿主细胞内的常见方法。另外,裸DNA可以直接递送至细胞(参见例如,美国专利号5,580,859和5,589,466)。
MG的检测
本公开内容提供了通过扩增例如靶MG基因核酸序列的一部分来额外检测MG的方法。23s核糖体RNA基因、mgpB基因和MgPar部分重复序列的核酸序列是公众可获得的(例如,GenBank)。具体地,提供了用于扩增和检测特定MG核酸分子靶的引物和探针。为了检测MG,提供了用于扩增靶MG基因的引物和探针。除了本文例示的那些以外的核酸也可以用于检测样品中的MG。例如,通过本领域技术人员使用常规方法可以评估功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能性变体可以包含例如本文公开的靶MG基因核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体地,寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NOs: 106-194的序列的核酸、其基本上相同的变体,其中所述变体与SEQ ID NOs: 106-194之一具有至少例如80%、90%或95%序列同一性,或SEQ ID NOs: 106-194以及所述变体的互补物。
表I: 23s正向引物
表II:23s反向引物
表III:23s探针
表IV: mgpB 正向引物
表V: mgpB 反向引物
表VI:mgpB探针
表VII: MgPar 正向引物
表VIII: MgPar 反向引物
表IX:MgPar探针
在一个实施方案中,使用了上文描述的引物和探针组,从而提供在疑似含有MG的生物样品中的MG的额外检测。所述引物和探针组可包含23s基因、mgpB基因和MgPar部分重复序列的核酸序列的特异性引物和探针,或由所述引物和探针组成,所述引物和探针包含SEQ ID NOs: 106-194的核酸序列或由SEQ ID NOs: 106-194的核酸序列组成。在另一个实施方案中,用于靶MG基因的引物和探针包含SEQ ID NOs: 106-194的引物和探针中任一者的功能活性变体,或由所述变体组成。
SEQ ID NOs: 106-194的引物和/或探针中任一者的功能活性变体可通过使用所公开方法中的引物和/或探针鉴定。SEQ ID NOs: 106-194中任一者的引物和/或探针的功能活性变体属于这样的引物和/或探针:相比于SEQ ID NOs: 106-194的各自的序列,其在描述的方法或试剂盒中提供相似或更高的特异性和灵敏度。
变体可例如通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代,如在SEQ ID NOs: 106-194的各自的序列的5'端和/或3'端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代而不同于SEQ IDNOs: 106-194的序列。如上文详述的,引物(和/或探针)可以是化学修饰的,即,引物和/或探针可包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后,探针(或引物)即为修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过某种修饰而不同于天然“核苷酸”,但仍然由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖或戊呋喃糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或其组合组成。例如,可以将“标记”连接到“核苷酸”的碱基部分,从而得到“修饰的核苷酸”。同样也可以用,例如,7-脱氮嘌呤替换“核苷酸”中的天然碱基,从而得到“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)以如上文对于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)所概括的方式,通过某种修饰而不同于天然核苷。
可以使用例如计算机程序如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc.,Cascade, Colo.)设计包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物的寡核苷酸,其扩增编码靶MG基因,例如23s基因的核酸分子。在设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以促进检测(例如,通过电泳)、引物对的成员的相似的解链温度、以及每个引物的长度(即,引物需要足够长,以便序列特异性地退火并启动合成,但又不过长使得在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常,寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如,长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸)。
除一组引物之外,所述方法可以使用一种或多种探针,以便检测MG的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA),其通过设计或选择而含有特定的核苷酸序列,所述核苷酸序列允许所述核酸在明确的预定严格性下与“靶核酸”特异性地(即,优先地)杂交,在本发明的情况下与靶MG基因核酸特异性地(即,优先地)杂交。“探针”可以被称为“检测探针”,意指它检测靶核酸。
在一些实施方案中,描述的靶MG基因探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中,靶MG基因探针可以用供体荧光部分(例如,荧光染料)和对应的受体荧光部分(例如,猝灭剂)来标记。在一个实施方案中,探针包含荧光部分和核酸序列或由荧光部分和核酸序列组成,所述核酸序列包含SEQ ID NOs: 123-133、147-151和172-194或由SEQID NOs: 123-133、147-151和172-194组成。
设计待用作探针的寡核苷酸可以通过与引物设计类似的方式进行。实施方案可使用单个探针或一对探针以用于检测扩增产物。取决于实施方案,所用探针可包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。如引物一样,探针通常具有相似的解链温度,并且每个探针的长度必须足以使序列特异性杂交发生,但又不过长使得在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15-40(例如,16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。在一些实施方案中,寡核苷酸引物的长度为40个或更少核苷酸。
聚合酶链反应(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用两种寡核苷酸引物,其结合所选的核酸模板(例如,DNA或RNA)。可用于一些实施方案中的引物包括能够充当描述的靶TV基因核酸序列内的核酸合成起始点的寡核苷酸(例如SEQ ID NOs: 1-13、19-38、45-52、55-74和80-99)。引物可通过常规方法从限制酶切消化纯化,或它可以经合成产生。对于扩增中的最大效率,引物优选地为单链的,但引物也可以是双链的。双链引物首先经过变性,即,处理以使链分离。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的,那么有必要在其可被用作PCR中的模板之前,将两条链分离。链的分离可以通过任何合适的变性方法(包括物理、化学或酶促方式)而实现。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如,大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。使模板核酸变性所必要的加热条件将取决于,例如,缓冲液盐浓度以及要变性的核酸的长度和核苷酸组成,但通常在约90℃至约105℃的范围内进行一段时间,而时间取决于反应的特征,如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如,1分钟至2分30秒,或1.5分钟)。
如果通过加热使双链模板核酸变性,则允许反应混合物冷却至促进每个引物退火至描述的靶TV基因核酸分子上的其靶序列的温度。退火温度通常为约35℃至约65℃ (例如,约40℃至约60℃;约45℃至约50℃)。退火时间可以为约10秒至约1分钟(例如,约20秒至约50秒;约30秒至约40秒)。然后,调节反应混合物至促进或优化聚合酶活性的温度,即,足以发生从退火的引物的延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。该温度应当足以从每个退火至核酸模板的引物合成延伸产物,但不应当过高而使延伸产物从其互补模板变性(例如,用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内(例如,约50℃至约70℃;约60℃)。延伸时间可以为约10秒至约5分钟(例如,约30秒至约4分钟;约1分钟至约3分钟;约1分30秒至约2分钟)。
PCR测定可采用核酸如RNA或DNA (cDNA)。模板核酸不需要经过纯化;它可以是复杂混合物的一小部分,如包含在人细胞中的核酸。核酸分子可以通过常规技术从生物样品中提取,所述常规技术如在Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing 等人(编), 1993, American Society for Microbiology,Washington D.C.)中描述的那些。核酸可得自多种来源,如质粒,或天然来源,包括细菌、酵母、野生动物病毒、细胞器或高等生物如植物或动物。
在诱导引物延伸的反应条件下,将寡核苷酸引物与PCR试剂组合。例如,链延伸反应一般包含50 mM KCl、10 mM Tris-HCl (pH 8.3)、15 mM MgCl2、0.001% (w/v)明胶、0.5-1.0 µg原变性的 (protodenatured)模板DNA、50皮摩尔的每种寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10% DMSO)。反应通常含有各150至320 µM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP或其一种或多种类似物。
新合成的链形成双链分子,其可被用于反应的后续步骤中。链分离、退火和延伸的步骤可根据需要的频次重复,以产生所需数量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应的限制因素是存在于反应中的引物、耐热酶和核苷三磷酸的量。优选地,将循环步骤(即,变性、退火和延伸)重复至少一次。对于在检测中使用,循环步骤的次数将取决于,例如,样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物,则将需要更多的循环步骤以扩增足以用于检测的靶序列。通常,循环步骤重复至少约20次,但也可能重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移(FRET)
FRET技术(参见,例如,美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)是基于这样的概念:当供体荧光部分和对应的受体荧光部分被置于彼此一定距离之内时,两个荧光部分之间发生能量转移,其可以被目测或以其它方式检测和/或定量。当供体经具有适当波长的光辐射激发时,供体通常向受体转移能量。受体通常将转移来的能量以具有不同波长的光辐射的形式重新发射出去。在某些系统中,非荧光能量可以通过生物分子在供体部分和受体部分之间转移,所述生物分子包括基本上非荧光的供体部分(参见例如,美国专利号7,741,467)。
在一个实例中,寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和对应的猝灭剂,所述猝灭剂可以是或不是荧光的,并且其将转移来的能量以光以外的形式耗散掉。当探针完整时,能量转移通常发生在供体和受体部分之间,这样使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间,结合至扩增产物的探针通过例如,Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性被切割,这样使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针描述在,例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂为DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHoleQuenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa Black™,(Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、BlackBerry™ Quencher 650(BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。
在另一个实例中,两个寡核苷酸探针(其各自含有荧光部分)可以在由所述寡核苷酸探针与靶核酸序列的互补性决定的特定位置杂交至扩增产物。当所述寡核苷酸探针在适当的位置杂交至扩增产物核酸时,生成FRET信号。杂交温度可以在约35℃至约65℃的范围,持续约10秒至约1分钟。
可以使用,例如,光子计数反射荧光显微镜系统(包括用于在特定范围监测荧光发射的合适的分色镜和滤光器)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行荧光分析。可使用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧灯、光纤光源或为在所需范围内的激发经适当过滤的其它高强度光源来进行激发以引发能量转移或允许直接检测荧光团。
如本文中在谈到供体和对应的受体部分时使用的“对应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应当比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少100 nm。因此,它们之间可以产生有效的非辐射能量转移。
一般根据以下选择荧光供体和对应的受体部分(a) 高效率Forster能量转移;(b)大的最终Stokes位移(>100 nm);(c) 发射位移尽可能远地进入可见光谱的红色部分(>600nm);以及(d) 发射位移至比通过供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射更高的波长。例如,可选择具有以下的供体荧光部分:在激光谱线附近的其最大激发(例如,氦-镉442nm或氩488 nm)、高消光系数、高量子产量以及其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可选择具有以下的对应的受体荧光部分:高消光系数、高量子产量、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠,以及可见光谱的红色部分中的发射(>600 nm)。
可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性的供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸根合芪-2,2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯以及4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸根合芪-2,2'-二磺酸衍生物。取决于所用的供体荧光部分,代表性的受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明X异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯,或镧系元素离子(例如,铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光部分可得自,例如,Molecular Probes (Junction City, Oreg.)或Sigma Chemical Co. (St.Louis, Mo.)。
可通过连接臂将供体和受体荧光部分连接于合适的探针寡核苷酸。每个连接臂的长度是重要的,因为连接臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。连接臂的长度可以是从核苷酸碱基到荧光部分的距离(以埃(Å)计)。一般来讲,连接臂为约10 Å至约25 Å。连接臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开了用于将连接臂连接于特定核苷酸碱基,以及还用于将荧光部分连接于连接臂的方法。
可将受体荧光部分(如LC Red 640)与含有氨基接头(例如,C6-氨基亚磷酰胺,可得自ABI (Foster City, Calif.)或Glen Research (Sterling, VA.))的寡核苷酸组合以产生,例如,LC Red 640标记的寡核苷酸。用于将供体荧光部分(如荧光素)偶联至寡核苷酸的常用接头包括硫脲接头(衍生自FITC的,例如,来自Glen Research或ChemGene(Ashland, Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(衍生自荧光素-NHS-酯的,如来自BioGenex(San Ramon, Calif.)的CX-荧光素-CPG)或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3'-氨基-CPGs。
TV的检测以及TV和/或MG的检测
本公开内容提供了用于检测生物样品或非生物样品中TV的存在或不存在的方法和用于检测生物样品或非生物样品中TV和/或MG的存在或不存在的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。所述方法包括进行至少一个循环步骤,所述步骤包括使用一对或多对引物扩增来自样品的靶核酸分子的一部分,和FRET检测步骤。优选在热循环仪中进行多个循环步骤。可以使用引物和探针进行所述方法,以检测TV的存在,并且检测到靶TV基因表明样品中TV的存在。在其它实施方案中,可以使用引物和探针进行所述方法,以检测TV和/或MG的存在,并且检测到靶TV和/或MG基因表明样品中TV和/或MG的存在。
如本文中所述,可使用利用FRET技术的标记的杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用TaqMan®技术以检测扩增产物的存在或不存在,并由此检测TV的存在或不存在。TaqMan®技术利用一种用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记的单链杂交探针,所述猝灭剂可以是或不是荧光的。当第一荧光部分由合适波长的光激发时,所吸收的能量根据FRET原理被转移至第二荧光部分或暗猝灭剂。第二部分通常为猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间,标记的杂交探针结合至靶DNA (即,扩增产物)并在后续的延伸阶段通过例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性被降解。因此,荧光部分和猝灭剂部分在空间上变得彼此分离。作为结果,当猝灭剂不存在时激发第一荧光部分时,则可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说,ABI PRISM® 7700 序列检测系统(Applied Biosystems)使用TaqMan®技术,并且适于进行本文中所述的用于检测样品中TV的存在或不存在以及检测检测样品中TV和/或MG的存在或不存在的方法。
与FRET结合的分子信标也可以用于使用实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用由第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是猝灭剂,并且荧光标记通常位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为探针内的二级结构形成的结果,当探针在溶液中时,两个荧光部分处于空间接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交后,探针的二级结构被破坏并且荧光部分变得彼此分离,使得在用合适波长的光激发后,第一荧光部分的发射可以被检测到。
FRET技术的另一种常见形式利用两种杂交探针。每种探针可以用不同的荧光部分标记,并且一般被设计为在靶DNA分子(例如扩增产物)中彼此紧密接近地杂交。供体荧光部分例如荧光素由LightCycler® 仪器的光源在470 nm处激发。在FRET期间,荧光素将其能量转移至受体荧光部分,例如LightCycler®-Red 640(LC Red 640)或LightCycler®-Red 705(LC Red 705)。受体荧光部分然后发射更长波长的光,其由LightCycler®仪器的光学检测系统检测。有效的FRET可以仅在荧光部分处于直接局部接近时,以及在供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时发生。发射的信号的强度可以与原始靶DNA分子的数目(例如,TV基因组的数目)相关联。如果发生靶核酸的扩增并且产生扩增产物,则杂交步骤导致基于探针对的成员之间的FRET的可检测信号。
一般地,FRET的存在表明样品中TV的存在,并且FRET的不存在表明样品中TV的不存在。然而,不充分的标本采集、运输延迟、不适当的运输条件或某些采集拭子(海藻酸钙或铝柄(shaft))的使用均是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文公开的方法,在例如45个循环步骤之内检测到FRET表明TV感染。在其它实施方案中,在例如45个循环步骤之内检测到FRET表明TV和/或MG感染。
可以用于实施所述方法的代表性生物样品包括但不限于呼吸道标本、粪便标本、血液标本、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血液培养物、皮肤和软组织感染。生物样品的采集和贮存方法是本领域技术人员已知的。可以处理生物样品(例如,通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒),以释放TV核酸,或者在一些情况下,可以使生物样品与PCR反应组分和适当的寡核苷酸直接接触。相应地,可以处理生物样品(例如,通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒),以释放TV和/或MG核酸,或者在一些情况下,可以使生物样品与PCR反应组分和适当的寡核苷酸直接接触。
解链曲线分析是可以包括在循环概况(profile)中的另外步骤。解链曲线分析基于以下事实:DNA在称为解链温度(Tm)的特征性温度下解链,所述解链温度被定义为以下温度:在该温度一半DNA双链体已分离成单链。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此,富含G和C核苷酸的DNA分子的Tm高于具有丰富的A和T核苷酸的那些。通过检测丢失信号时的温度,可以确定探针的解链温度。类似地,通过检测生成信号时的温度,可以确定探针的退火温度。来自扩增产物的探针的解链温度可以证实样品中TV的存在或不存在。相应地,来自扩增产物的探针的解链温度可以证实样品中TV和/或MG的存在或不存在。
在热循环仪的每次运行中,对照样品也可以被循环。使用例如,对照引物和对照探针,阳性对照样品可以扩增靶核酸对照模板(不同于所描述的靶基因的扩增产物)。阳性对照样品还可以扩增,例如,含有靶核酸分子的质粒构建体。可以使用与用于检测预期靶相同的引物和探针,对这种质粒对照进行内部扩增(例如,在样品内)或在分开的样品中与患者样品并排运行。这种对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。热循环仪的每次运行还可以包括阴性对照,其例如缺乏靶模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保了系统和试剂将不会产生假阳性信号。因此,对照反应可容易地确定,例如,引物序列特异性地退火和启动延伸的能力以及探针序列特异性地杂交和发生FRET的能力。
在一个实施方案中,所述方法包括避免污染的步骤。例如,在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了使用尿嘧啶-DNA糖苷酶的酶促方法以减少或消除热循环仪的一次运行与下一次之间的污染。
可以使用与FRET技术结合的常规PCR方法来实施所述方法。在一个实施方案中,使用了LightCycler®仪器。下列专利申请描述了如LightCycler®技术中所用到的实时PCR:WO97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
LightCycler®可以使用PC工作站进行操作并且可以利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管顺序地置于光学元件上时获取来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后,对于所有样品可持续更新相对于循环次数的荧光定量展示。生成的数据可以被保存用于进一步分析。
作为FRET的替代方案,可以使用双链DNA结合染料,例如荧光DNA结合染料(例如,SYBR® Green或SYBR® Gold(Molecular Probes))检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时,这种荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。也可以使用双链DNA结合染料,例如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时,通常进行解链曲线分析用于确认扩增产物的存在。
应当理解,本公开内容的实施方案不受一种或多种商购可得仪器的构造的限制。
制品/试剂盒
本公开内容的实施方案进一步提供了检测TV的制品、组合物或试剂盒。制品可以包括用于检测靶TV基因的引物和探针,连同合适的包装材料。组合物可以包含用于扩增靶TV基因的引物。在某些实施方案中,组合物还可以包含用于检测靶TV基因的探针。用于检测TV的代表性引物和探针能够与靶核酸分子杂交。另外,试剂盒还可以包括DNA固定、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料,例如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法,并且提供了扩增靶核酸分子且与靶核酸分子杂交的引物和探针的代表性实例。
制品还可以包括用于标记探针的一个或多个荧光部分,或替代地,可以标记随试剂盒提供的探针。例如,制品可以包括用于标记探针的供体荧光部分和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。
制品还可以含有包装插页或包装标签,在其上具有关于使用引物和探针来检测样品中的TV的说明。制品和组合物可以另外包括用于进行本文公开的方法的试剂(例如,缓冲液、聚合酶、辅因子或防止污染的试剂)。这些试剂对于本文所述的商购可得仪器之一可以是专用的。
将在以下实施例中进一步描述本公开内容的实施方案,所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
提供下述实施例、表格和附图以帮助理解主题,其实际范围在所附权利要求中阐述。应理解,可以在程序中做出修改,而不背离本发明的精神。
实施例1
TV的靶选择是公共序列数据库的全面检索以及对于具有区分最接近的相邻物种Trichomonas tenax和人五毛滴虫的潜力的TV靶的文献检索。在设计阶段的靶选择过程中分析来自公共序列数据库的多个靶,但所有都显示与T. tenax和人五毛滴虫的交叉反应性。公共数据库中的序列由来自多拷贝靶的“大批”序列数据复杂化。选择的寡核苷酸的BLAST分析表明唯一的显著交叉反应性将是与Trichomonas tenax。
使用cobas® 4800系统或cobas® 6800/8800系统平台(Roche MolecularSystems, Inc., Pleasanton, CA)进行TV的实时PCR检测。扩增试剂的终浓度如下所示:
表XVI PCR扩增试剂
下表显示用于PCR扩增反应的典型热概况(thermoprofile)。
表XVII PCR 热概况
Pre-PCR程序包括初始变性和在55℃、60℃和65℃温育,用于RNA模板的逆转录。在三个温度下温育组合了这样的有利效果:在较低温度下也转录了轻微错配的靶序列(诸如生物的遗传变体),而在较高温度下抑制了RNA二级结构的形成,因此导致了更有效的转录。将PCR循环分为两次测量,其中两次测量均采用一步设置(one-step setup)(组合了退火和延伸)。在55℃下的前5次循环通过预扩增轻微错配的靶序列而允许增加的包容性,而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度而提供了增加的特异性。图2描绘了典型的扩增实验,其中以不同浓度的基因组TV模板DNA显示了PCR生长曲线。
使用上文所述的条件进行靶TV基因,即5.8s rRNA、18s rRNA、PMS1、Mlh1a和CRN的扩增和检测。使用针对以10基因组当量/PCR (5.8s rRNA)或1000基因组当量/PCR(18srRNA、PMS1、Mlh1a、CRN)的浓度存在的基因组TV DNA的几种选择的寡核苷酸引物和探针的实验的结果在下文显示为扩增反应的Ct值(阈值循环)。
表XVIII 靶TV基因的扩增和检测
实施例2
按照实施例1中的描述进行TV 5.8s rRNA基因的扩增和检测(使用具有SEQ IDNO:3和12的引物和具有SEQ ID NO:18的标记的探针),不同之处是生殖支原体(MG)的基因组模板DNA与能够扩增和检测MG的引物和探针一起包括在PCR测定中。本文中使用了与mgpB基因(mgpB)的保守区A杂交的、具有SEQ ID NOs: 139、145和150的引物和探针,以及与mgpB基因(MgPar)的可变区EF杂交的、具有SEQ ID NOs: 153、169和194的引物和探针。
测试了每个PCR反应100、10、5和1基因组当量(ge/PCR)的TV检测限(LOD),所述测试是在与内部对照标准品(GIC)和10 ge/PCR的MG的共扩增中进行的。结果显示在图3(TV)和4(MG和GIC)。检测了所有水平的TV而没有脱落,并且确定TV LOD为<1 ge/PCR。此外,也可以检测10 ge/PCR的MG而没有脱落。
Claims (14)
1.用于检测阴道毛滴虫(TV)的核酸的试剂盒,其包含:
- 第一引物,其包含选自SEQ ID NOs: 1-4的第一寡核苷酸序列;
- 第二引物,其包含选自SEQ ID NOs: 10-13的第二寡核苷酸序列;和
- 荧光可检测标记的探针,其包含选自SEQ ID NOs: 14-18的第三寡核苷酸序列或其互补物,所述可检测标记的探针设定为与由第一引物和第二引物产生的扩增子杂交;或
- 第一引物,其包含选自SEQ ID NOs: 5-9的第一寡核苷酸序列;
- 第二引物,其包含选自SEQ ID NOs: 12-13的第二寡核苷酸序列;和
- 荧光可检测标记的探针,其包含选自SEQ ID NOs: 16-18的第三寡核苷酸序列或其互补物,所述可检测标记的探针设定为与由第一引物和第二引物产生的扩增子杂交。
2.权利要求1的试剂盒,其中荧光可检测标记的探针包含供体荧光部分和对应的受体部分。
3.权利要求2的试剂盒,其中受体部分是猝灭剂。
4.权利要求1至3的任一项的试剂盒,进一步包含核苷三磷酸、核酸聚合酶和对于核酸聚合酶功能所必需的缓冲液中的至少一种。
5.权利要求1至3的任一项的试剂盒,其中第一、第二和第三寡核苷酸中的至少一种包含至少一个修饰的核苷酸。
6.权利要求1至3的任一项的试剂盒,进一步适于检测生殖支原体(MG)的核酸,并且进一步包含设计用于靶向特定MG基因以产生所述MG基因的扩增产物的一组引物,和一种或多种能够与MG扩增产物杂交的可检测探针。
7.一组靶TV基因引物和一种或多种可检测的靶TV基因探针在制备用于进行检测样品中的阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,TV)的方法的试剂盒中的用途,所述方法包括:
- 进行扩增步骤,所述步骤包括使样品与一组靶TV基因引物接触,以便如果样品中存在靶TV基因核酸则产生扩增产物;
- 进行杂交步骤,所述步骤包括使扩增产物与一种或多种可检测的靶TV基因探针接触;并且
- 检测扩增产物的存在或不存在,其中扩增产物的存在表明样品中存在TV,并且其中扩增产物的不存在表明样品中不存在TV;
其中该组靶TV基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ IDNOs: 1-4的第一寡核苷酸序列,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 10-13的第二寡核苷酸序列;并且
其中所述一种或多种可检测的靶TV基因探针包含选自SEQ ID NOs: 14-18的第三寡核苷酸序列或其互补物;或
其中该组靶TV基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ IDNOs: 5-9的第一寡核苷酸序列,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 12-13的第二寡核苷酸序列;并且
其中所述一种或多种可检测的靶TV基因探针包含选自SEQ ID NOs: 16-18的第三寡核苷酸序列或其互补物。
8.权利要求7的用途,其中:
- 杂交步骤包括使扩增产物与可检测的靶TV基因探针接触,所述探针使用供体荧光部分和对应的受体部分标记;并且
- 检测步骤包括检测探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在,其中荧光的存在或不存在表明样品中TV的存在或不存在。
9.权利要求7至8的任一项的用途,其中所述扩增步骤采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。
10.权利要求7至8的任一项的用途,其中供体荧光部分和对应的受体部分在探针上彼此相距8-20个核苷酸。
11.权利要求7至8的任一项的用途,其中受体部分是猝灭剂。
12.权利要求7至8的任一项的用途,进一步适于检测所述样品中的生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG),并且进一步包括:
- 进行扩增步骤,所述步骤包括使样品与被设计用于靶向特定MG基因的一组引物接触,以便如果样品中存在MG则产生扩增产物;
- 进行杂交步骤,所述步骤包括使扩增产物与一种或多种针对靶MG基因的可检测探针接触;并且
- 检测扩增的MG产物的存在或不存在,
其中扩增的MG产物的存在表明样品中存在MG,并且其中扩增的MG产物的不存在表明样品中不存在MG;
其中靶MG基因选自23s 核糖体RNA (23s)基因、MgPa黏附操纵子内mgpB基因(mgpB)的保守区A,和mgpB部分重复序列(MgPar)的可变EF区。
13.权利要求12的用途,其中检测样品中的TV和MG在相同的反应混合物中作为多路测定进行。
14.权利要求12的用途,其中该组靶MG 23s核糖体RNA基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 106-112的第一寡核苷酸序列,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 113-122的第二寡核苷酸序列;并且其中所述一种或多种可检测的靶MG23s核糖体RNA基因探针包含选自SEQ ID NOs: 123-133的第三寡核苷酸序列或其互补物;或
其中该组靶MG mgpB基因引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQID NOs: 134-140的第一寡核苷酸序列,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs: 141-146的第二寡核苷酸序列;并且其中所述一种或多种可检测的靶MG mgpB基因探针包含选自SEQ IDNOs: 147-151的第三寡核苷酸序列或其互补物;或
其中该组靶MG MgPar部分重复序列引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自SEQ ID NOs: 152-161的第一寡核苷酸序列,所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:162-171的第二寡核苷酸序列;并且其中所述一种或多种可检测的靶MG MgPar部分重复序列探针包含选自SEQ ID NOs: 172-194的第三寡核苷酸序列或其互补物。
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