KR102421942B1 - 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 - Google Patents
마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102421942B1 KR102421942B1 KR1020200136361A KR20200136361A KR102421942B1 KR 102421942 B1 KR102421942 B1 KR 102421942B1 KR 1020200136361 A KR1020200136361 A KR 1020200136361A KR 20200136361 A KR20200136361 A KR 20200136361A KR 102421942 B1 KR102421942 B1 KR 102421942B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microcystis
- seq
- nucleotide sequence
- represented
- detecting
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 유해 남조류 중에서 주로 많이 검출되고 문제가 되는 마이크로시스티스, 독성 마이크로시티스를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로시스티스 (16S rDNA region) 및 독성 마이크로시스티스(mcy B gene region)을 검출하기 위한 특정 프라이머 쌍으로 정량 유전자 분석 기술을 이용하여 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티 검출하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유해 남조류 중에서 주로 많이 검출되고 문제가 되는 마이크로시스티스, 독성 마이크로시티스를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로시스티스 (16S rDNA region) 및 독성 마이크로시스티스(mcy B gene region)을 검출하기 위한 특정 프라이머 쌍으로 정량 유전자 분석 기술을 이용하여 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티 검출하는 방법에 관한 것이다.
최근 지구 온난화와 더불어 남조류 (cyanobacteria)의 확산이 여름과 가을철에 큰 문제가 되고 있다. 특히 우리나라의 경우 2012년 전국의 강과 특히 한강에서도 녹조 현상이 심각하게 발생하여 식수 사용에 위협을 가하기도 했었다. 하지만, 녹조를 일으키는 남조류에 대한 연구는 매우 부족하고 특히 우리나라에서는 아직도 형태적인 분류를 통한 분석이 대부분이다. 기존 조류분석은 현미경을 이용하여 조류 개체수를 계수하는 방법으로, 이는 분석자 간 편차가 크고 동일 분석자가 여러분 분석 할 경우에도 결과에 편차가 크게 나타날 뿐 아니라, 모든 조류 개체들이 독소를 생산하는 것은 아님에도 독소 생산 개체를 육안으로 구분하지 못하므로 독소를 생산할 수 있는 개체들에 대한 선택적인 분석이 불가하므로 분석결과가 확대 해석될 수 있다는 단점이 있다. 최근 발전하여 광범위한 생물학적 분야에 활용되고 있는 차세대 염기서열 분석 장치를 이용하여 시기별, 지역별로 번창하는 남조류의 종과 독소를 생산하는 유해 남조류의 종류를 빠른 시간에 분석한다면 녹조 현상에 대한 대책을 강구하는 여러 방안을 마련할 수 있을 것이다.
남조류는 Microcystis aerugonosa 등의 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.) 균주; A. circinalis, A. flosaquae, A. lemmermanii, A. solitaria 등의 아나배나 속(Anabaena sp.); Aphanizomenon 속 균주, O.agardhii, O. agardhii var. isothrix, O. formosa 등의 오실라토리아 속(Osillatoria sp.) 균주를 포함한다.
마이크로시스틴은 남조류에 속하는 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.), 아나배나 속(Anabaena sp.), 오실라토리아 속(Osillatoria sp.) 등이 생산하는 펩타이드 독소(peptide toxin)로서, 현재 약 50 여종 이상의 구조 유사체들이 밝혀져 있다. 마이크로시스틴은 인간을 포함한 포유동물에게 간독성(hepatotoxic effect)를 유발하여 치사에 이르게 할 수도 있으며, 물고기나 수생식물 등 수중 생태계 전반에 걸쳐 영향을 끼치게 된다.
기존에는 마이크로시스틴을 생산하는 남조류를 탐지할 때 이들로부터 분비된 마이크로시스틴을 직접 탐지하는 방법을 사용하였으나 일반적으로 남조류의 수화현상으로 인해 남조류가 대량으로 번성하기 이전에는 수중에 존재하는 마이크로시스틴의 농도가 매우 낮기 때문에 이러한 문제점들을 예견하고 대처하는데 어려움이 있었다. 마이크로시스틴의 탐지 방법으로는 크게 HPLC 등을 이용한 기기 분석방법과 마이크로시스틴이 프로테인 포스파타아제(protein phosphatase)의 활성을 저해하는 작용을 이용하는 생물학적 분석방법으로 나누어 볼 수 있다. 종래 마이크로시스틴을 생산하는 남조류에만 특이적으로 존재하는 펩타이드를 검출하거나, 특정 종들을 검출하는 방법들을 사용하였다.
댐, 호수에 녹조현상이 발생하게 되면 유해 남조류 4종의 개체수에 따라 조류경보제가 단계별로 발령되고 있으나, 상기 유해 남조류 4 중 간독소인 마이크로스틴 독소를 생성하는 마이크로시스티스를 측정하기 위해서는 고가의 장비 및 전문 인력이 필요하다는 단점이 있고, 수온에 따른 유해 남조류의 검출에 있어서 한계가 있다. 이에 낮은 수온에서도 검출이 가능하며, 신속하고 간편하게 정량할 수 있는 유전자 분석 기술이 필요하다.
본 발명자들은 마이크로시스티스 (16S rDNA region) 및 독성 마이크로시스티스(mcy B gene region)을 검출하기 위한 특정 프라이머 쌍을 개발하였고, 상기 프라이머쌍을 이용하여 정량 유전자 분석을 한 결과 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티 검출할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 프라이머 세트를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 서술한 프라이머 세트를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 마이크로시스티스속 균주를 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
i) 시료내 존재하는 미생물의 게놈 DNA 및 상기 서술한 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
ii) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계; 및
iii) 상기 증폭 산물을 분석하여 시료내에 존재하는 마이크로시스티스속 균주를 탐지하는 단계.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 마이크로시스티스속 균주의 16S rRNA를 증폭할 수 있다.
상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 마이크로시스티스속 균주의 mcyB를 증폭할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서술한 프라이머 세트를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 검출용 조성물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트에 열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 마이크로시스티스속 균주를 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
i) 시료내 존재하는 미생물의 게놈 DNA 및 상기 서술한 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
ii) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계; 및
iii) 상기 증폭 산물을 분석하여 시료내에 존재하는 마이크로시스티스속 균주를 탐지하는 단계.
상기 증폭 산물의 분석은 전기영동법 또는 염기서열 분석법으로 수행하여 시료내 마이크로시스티스속 균주를 탐지할 수 있다.
본 발명의 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트는 기술은 마이크로시스티스 속 및 독성 마이크로시스티스의 유전체 DNA에서 특이적으로 증폭되고, 다른 남조류 등에서는 증폭되지 않아 독성 마이크로시스티스를 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있다. 수온이 낮은 시기에 현미경 개체수 분석과 독소 분석에서는 수치가 검출되지 않았으나, 유전자분석법에서는 이른 시기에 낮은 수치부터 검출되어 시기경과에 따른 검출경향성 분석이 가능하여, 조기경보(early warning) 방법으로 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 Microcystis 16S rRNA gene alignment의 결과이다.
도 2는 본 발명의 Mirocystis 16S rRNA gene alignment의 결과이다.
도 3은 Microcystis 종 특이적 primer의 특이도를 확인한 결과이다.
도 4는 Microcystis specific mcyB primer의 특이도를 확인한 결과이다.
도 5는 Microcystis 종 특이적 primer 또는 Microcystis specific mcyB primer의 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 Mirocystis 16S rRNA gene alignment의 결과이다.
도 3은 Microcystis 종 특이적 primer의 특이도를 확인한 결과이다.
도 4는 Microcystis specific mcyB primer의 특이도를 확인한 결과이다.
도 5는 Microcystis 종 특이적 primer 또는 Microcystis specific mcyB primer의 검출 한계를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)" 는 핵산의 증폭 반응시에 증폭되는 표적 핵산 부위의 5'-말단 서열 및 3'-말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응효소 하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고 뉴클레오타이드를 의미하며, 예컨대 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15 내지 40개 염기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다.
본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "PCR"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “특이적”은 다른 남조류에 결합하지 않고 마이크로시스티스 속 및 독성 마이크로시스티스에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 또는 퀀쳐가 프로브의 말단에 부착될 수 있다.
상기 프로브의 5' 말단에는 리포터(Reporter)로서 Fam이 부착되어 있을 수 있고, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa Fluor), ROX, HEX, 텍사스 레드(texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐(Quencher)로서 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1)이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 BHQ-2, BH3-3, ROX(carboxy-X-rhodamine), 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐 (Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것일 수 있고, 상기 프라이머 세트는 PCR에 사용하기 위한 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 마이크로시스티스속 균주의 16S rRNA를 증폭할 수 있다.
상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 마이크로시스티스속 균주의 mcyB를 증폭할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서술한 프라이머 세트를 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 검출용 조성물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징으로 제작될 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 마이크로시스티스속 균주를 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
i) 시료내 존재하는 미생물의 게놈 DNA 및 상기 서술한 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
ii) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계; 및
iii) 상기 증폭 산물을 분석하여 시료내에 존재하는 마이크로시스티스속 균주를 탐지하는 단계.
상기 단계 1)의 혼합물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있으며, 예를 들면 PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction, IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 사용될 수 있다.
상기 PCR을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공될 수 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공될 수 있다.증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 제조되어 첨가될 수 있다
상기 방법은 상기 단계 2) 후에 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 증폭 산물의 분석은 전기영동법 또는 염기서열 분석법으로 수행하여 시료내 마이크로시스티스속 균주를 탐지할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 마이크로시스티스속 균주 특이적 프라이머 설계 및 제작
본 발명에 따른 프라이머 제조를 위하여 NCBI의 GeneBank로부터 염기 서열이 공개된 Microcystis sp.및 이와 유사한 종의 16S rRNA를 찾아 gene alignment를 통해 Microcystis 종 특이적인 유전자 부위에서 Microcystis sp. 특이적인 프라이머와 프로브를 디자인하였다. primer는 Tm이 55~57℃ 정도로 디자인하였으며, forward primer와 reverse primer간의 Tm차이가 2℃ 이상 차이가 나지 않도록 디자인하였다. 또한 hair pin, dimer 구조가 생기지 않도록 FastPCR 프로그램을 사용하여 프라이머를 검증하였다. Probe는 5’ 말단에 G가 오지 않도록 주의하여 Tm이 60~62℃정도가 되도록 디자인하였다. Gene alignment data에서 Microcystis sp. specific primer와 probe는 도 1과 같다. Primer를 디자인 한 후 증폭부위를 Blast 분석을 통해 Microcystis sp. 이외의 다른 종이 검출 되는지 여부를 확인하였다. 구체적으로 algorithm parameter에서 “max target sequence”를 1000개로 지정하여 최대한 많은 aligned sequence를 검증하여 Microcystis specific 프라이머 여부를 확인하였다. 디자인 서열은 하기 표 1과 같다.
실시예 2. Microcystis sp. 특이적 mcyB gene의 primer 및 probe 디자인
본 발명에 따른 프라이머 제조를 위하여 NCBI의 GeneBank로부터 염기 서열이 공개된 Microcystis sp. mcyB 유전자 염기서열 및 이와 유사한 염기서열을 찾아 gene alignment를 통해 microcystis sp. 특이적인 검출이 가능하도록 프라이머와 프로브를 디자하였다. 프라이머와 프로부의 디자인 방법은 실시예 1의 Microcystis sp. specific primer 및 probe 디자인”과 동일한 방법으로 수행하였다. Gene alignment data에서 Microcystis sp. specific mcyB primer와 probe를 아래 도 2와 같다. Primer를 디자인 한 후 증폭부위를 Blast 분석을 통해 Microcystis sp. 이외의 다른 종이 검출되는지 여부를 확인하였다. 구체적으로 Algorithm parameter에서 “max target sequence”를 1000개로 지정하여 최대한 많은 aligned sequence를 검증하여 Microcystis specific primer 여부를 확인하였다. 디자인 한 primer의 서열은 하기 표 2와 같다.
실시예 3. 샘플 DNA의 genomic DNA 추출 및 증폭
상기 실시예 1 및 2의 방법으로 제작된 프라이머의 특이도를 검증하기 위해 수자원공사에서 아래 표 3의 시료를 분양 받아 ㈜제넷바이오의 PrimePrep Genomic DNA extraction kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. Genomic DNA는 시료를 400 ㎕ 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 추출하였으며, 정량 후 DNA 농도가 1ng/㎕가 되도록 희석하여 사용하였다.
실시예 1의 개시되어 있는 16S rRNA를 target으로 하여 디자인 한 프라이머 또는 실시예 실시예 2의 개시되어 있는 Microcystis 종 특이적 mcyB prime; 및 reaction mixture 조성물(Genomic DNA (1ng/ul) 2ul, primer mix (10 pmole/ul) 2ul, 2X HS Prime qPCR premix 10ul, 증류수 7 ul)을 이용하여 PCR (조건; 50℃, 3 min, 1 cycle; 95 ℃, 10 min 2 min 1 cycle; 95 ℃, 20 sec, 55℃ 또는 57℃, 30 sec, 72℃, 30 sec, 38 cycle; 72 ℃, 5 min, 1 cycle)을 수행하였다. 전기영동을 하여 증폭 산물을 확인하였다. Microcystis sp. 특이적 primer의 특이도 테스트 결과, 도 3과 같이 Microcystis aeruginosa 에서만 target의 증폭이 되는 것이 확인 되었다. 환경 샘플의 경우도 증폭이 확인되어 Microcystis sp.의 DNA가 있는 것으로 추정되었다. 도 4와 같이 Microcystis sp. 특이적으로 증폭이 일어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예4. Microcystis aeruginosa genomic DNA를 이용한 검출 한계 측정
M. aeruginosa의 genomic DNA를 107copy/5ul로 희석한 후, 10배씩 serial dilution하여 10 copies/rxn까지 희석하여 준비하였고, 이를 template로 사용하여 검출한계를 측정하였다. 상기 serial dilution한 DNA 및 reaction mixture 조성물(Template DNA (0.5 ng/ul) 2ul, 4X Oligo mix A-1 5ul, 2X qPCR premix 10ul, 증류수 3ul)을 이용하여 PCR (조건; 50℃, 3 min, 1 cycle; 95 ℃, 10 min 2 min 1 cycle; 95 ℃, 20 sec, 55℃ 또는 57℃, 30 sec, 72℃, 30 sec, 40 cycle; 72 ℃, 5 min, 1 cycle)을 수행하였다. 실험 결과 Microcystis mcyB gene target primer/probe는 100 copies/rxn, Microcystis 16S rRNA gene target primer/probe 역시 100 copies/rxn까지 검출되었다 (도 5).
<110> KOREA WATER RESOURCES CORPPRATION
Mediforum co., Ltd
<120> Primer set for detecting Microcystis, and detection method of
Microcystis sp using the same
<130> 1067387
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Micro-F (131)
<400> 1
cgaacgggaa tcttcggatt c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Micro-R (131)
<400> 2
caggccaatt aggtttcacc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Micro-P
<400> 3
acggggacaa cagttggaaa cgact 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mcyB-F1 (163)
<400> 4
gggcaatcag ttagctcact g 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mcyB-R1 (163)
<400> 5
gcgctcggtr ggataatcc 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mcyB-P1
<400> 6
tggagcgytc cctagagatg gtca 24
Claims (12)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
를 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 마이크로시스티스속 균주의 16S rRNA를 증폭하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 마이크로시스티스속 균주의 mcyB를 증폭하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 프라이머 세트.
- 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 검출용 조성물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 조성물.
- 제 6항의 조성물을 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트.
- 제 8항에 있어서, 상기 검출용 키트에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는, 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주 검출용 키트.
- i) 시료내 존재하는 미생물의 게놈 DNA 및 제 1항의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
ii) 상기 혼합 결과물을 PCR 증폭시키는 단계; 및
iii) 상기 증폭 산물을 분석하여 시료내에 존재하는 마이크로시스티스속 균주 및 독성의 마이크로시스티스속 균주를 탐지하는 단계;
를 포함하는 독성의 마이크로시스티스속 균주를 검출하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 단계 1)의 혼합물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는, 독성의 마이크로시스티스속 균주를 검출하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 증폭 산물의 분석은 전기영동법 또는 염기서열 분석법으로 수행하여 시료내 마이크로시스티스속 균주를 탐지하는, 독성의 마이크로시스티스속 균주를 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200136361A KR102421942B1 (ko) | 2020-10-20 | 2020-10-20 | 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200136361A KR102421942B1 (ko) | 2020-10-20 | 2020-10-20 | 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220052231A KR20220052231A (ko) | 2022-04-27 |
| KR102421942B1 true KR102421942B1 (ko) | 2022-07-19 |
Family
ID=81391136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200136361A KR102421942B1 (ko) | 2020-10-20 | 2020-10-20 | 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102421942B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014532438A (ja) | 2011-11-09 | 2014-12-08 | トゥルン イリオピスト | ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの検出方法および検出用プライマー |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101509071B1 (ko) * | 2013-04-26 | 2015-04-16 | 주식회사 천랩 | 마이크로시스티스속 균주의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 마이크로시스티스속 균주의 탐지방법 |
-
2020
- 2020-10-20 KR KR1020200136361A patent/KR102421942B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014532438A (ja) | 2011-11-09 | 2014-12-08 | トゥルン イリオピスト | ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの検出方法および検出用プライマー |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GENBANK ACCESSION NO. LC557463 (2020.06.23.)* |
| GENBANK ACCESSION NO. MF537433 (2017.09.05.)* |
| Li Li et al., Procedia Environmental Sciences, 10, p.2272-2279, 2011.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220052231A (ko) | 2022-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0395292B1 (en) | Generation of specific probes for target nucleotide sequences | |
| KR101491904B1 (ko) | 마이코플라즈마 오염 유무 확인을 위한 프라이머 세트, ＴａｑＭａｎ 프로브 및 이를 이용한 Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 시험 방법 | |
| KR20090078341A (ko) | Ｄｎａｊ 유전자를 사용한 박테리아의 검출, 및 그의 용도 | |
| KR20110126925A (ko) | 깍지벌레류의 미토콘드리아 ｃｏｉ 유전자 ｄｎａ 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 | |
| Monis et al. | Molecular biology techniques in parasite ecology | |
| Holeva et al. | Real-time PCR detection and quantification of vector trichodorid nematodes and Tobacco rattle virus | |
| Liu et al. | Rapid identification and differentiation of Theileria sergenti and Theileria sinensis using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay | |
| EP1953247A1 (en) | A method for measuring the number of oral streptococci, and a PCR primers-probe set used for the same | |
| KR101934548B1 (ko) | 실시간 pcr을 이용한 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 분석 방법 | |
| CN112210614B (zh) | 检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量lamp引物组及其应用 | |
| CN101636507B (zh) | 用于检测酵母和真菌物种的核酸探针 | |
| KR102421942B1 (ko) | 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 | |
| KR101509071B1 (ko) | 마이크로시스티스속 균주의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 마이크로시스티스속 균주의 탐지방법 | |
| Gomes et al. | Direct detection of Theileria annulata in bovine blood samples using standard and isothermal DNA amplification approaches | |
| KR20190041314A (ko) | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| CN110241231A (zh) | 检测cyp2c19基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用 | |
| KR101492989B1 (ko) | Hrm 분석기술을 이용한 배추작물의 내서성 연관 pcr 프라이머 세트 | |
| KR102496414B1 (ko) | 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트 | |
| CN113957158B (zh) | 一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用 | |
| KR101395645B1 (ko) | 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법 | |
| CN114480328B (zh) | 一种Taq DNA聚合酶突变体 | |
| CN114480327B (zh) | 一种Taq DNA聚合酶突变体 | |
| CN112410445B (zh) | 一种TaqMan探针荧光定量PCR检测巴通体的方法与应用 | |
| KR102237098B1 (ko) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 프로바이오틱 효모 사카로마이세스 유니스포러스의 검출 및 정량 방법 | |
| Subbotin et al. | Methods of biochemical and molecular diagnostics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |