CN104089936B - 基于生物传感器对荧光标记的mcf肿瘤标志物检测的方法 - Google Patents

Abstract

本文发明了一种基于生物探针和DNA循环放大相结合构建新型的生物化学传感器，来检测肿瘤标志物的方法。磁珠表面进行发卡DNA和前体1的连接修饰，加入端粒酶打来发卡结构，进而与修饰有前体2的金纳米粒子结合，而纳米粒子上又标记有大量荧光分子，通过循环放大增强其荧光信号。最终，通过荧光信号对肿瘤细胞中端粒酶进行定量分析，在医学中及早的检测出肿瘤细胞。

Description

基于生物传感器对荧光标记的MCF肿瘤标志物检测的方法

技术领域

生物传感器通常是指由一种生物敏感部件和转化器紧密结合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。它是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控方法，也是对物质在分子水平上进行快速和微量分析的方法。

背景技术

生物传感器主要的组成部件有感受器和换能器，其主要的工作原理是待测物质经扩散作用进入固定生物膜敏感层，经分子识别而发生生物学作用，产生的信息如光、热、音等被相应的信号转换器变为可定量和处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的量或浓度。

生物传感器的分类方法很多中，其中，根据生物物质分类，可分为：酶传感器、微生物传感器、细胞器传感器、组织传感器、免疫传感器、基因传感器等。

基因传感器也称为核酸传感器，是依据生物体内核苷酸顺序相对稳定，核苷酸碱基顺序互补的原理而设计出核酸探针传感器。基因传感器一般有10-30个核苷酸的单链核酸分子，能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸分子。

端粒是染色体末端的一种特殊结构，它是由许多简单短重复序列和端粒结合蛋白组成。在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。端粒是细胞必需的遗传组分，因为它能够保护和补偿染色体末端遗传信息的丢失，保护它不会被核酸酶识别而免遭降解。端粒酶是合成端粒DNA的特殊逆转录酶，具有RNA依赖性和DNA多聚酶性质的核糖体蛋白复合体，能以自身RNA为模版，在hTERT(端粒逆转录酶)的逆转录催化下，将端粒重复序列合成并添加到染色体末端，不断合成端粒酶DNA序列，保持染色体端粒的完整性。

端粒酶与90％以上的人类恶性肿瘤之间的紧密联系，使该酶成为目前已知的最为广泛的肿瘤分子标志物。端粒酶活性评价对早期癌症的发现，判断肿瘤的侵袭性、病理分级、分期和肿瘤治疗后监测病人的残存或微小病灶以及复发是有用的指标。因此，端粒酶活性测定对临床可提供许多有价值的信息。端粒酶抑制剂为肿瘤的治疗提供了新的领域，但选择对瘤细胞高选择性的靶，对正常细胞没有损害的端粒酶抑制剂仍比较困难且很重要。另外端粒酶的调控机制和合成端粒酶的分子机制尚不十分清楚，能否从端粒酶蛋白及其基因水平阻断端粒酶活性等仍有许多问题需要研究和探讨。如何进一步提高灵敏度、增强安全性、减少操作的烦琐程度以及降低实验成本，是各种检测方法最终的追求目标。

发明内容

本发明结合了前人工作的基础上提出利用分子信标和纳米金粒子构建了新型的生物化学传感器，采用磁性微球和发卡环链循环置换，纳米金粒子技术实现了信号的两次放大，并且将此传感器应用在了端粒酶等肿瘤标志物和宫颈癌(Hela)细胞的检测中，通过对荧光光谱的应用，进而为测定肿瘤细胞及宫颈癌细胞中端粒酶的浓度提供了一种方便可靠而又快捷的方法，这也使得应用此方法提高肿瘤细胞及宫颈癌细胞的检测限成为了可能。

本发明所提供的方法包括以下步骤：

(a)还原性金纳米粒子的合成：组装蒸馏装置，向其加入50mL的0.01％氯金酸，调节转子转数，加热至沸。快速加入一定量柠檬酸钠，再煮沸20min。溶液由无色逐渐变为酒红色，自然冷却至室温。倒入广口瓶中，置于冰箱中(4℃)保存，备用。

所述的方法，其所述的还原剂为柠檬酸三钠。

(b)银包金纳米探针的合成：将粒径为10nm的金胶离心后加入PBS缓冲溶液、Primer 2DNA和荧光DNA，避光24h。再离心，加入1％PVP、0.1M L-SA、1mMAgNO₃溶液，避光37℃温育震荡5h。所述的方法，其所述的用PVP和L-SA来保护金胶，防止其聚沉。

所述的方法，其所述的反应温度为37℃，时间为5h。

(c)磁珠载体的修饰：向活化好的磁珠加入发卡DNA，避光温育24h。磁分离，PBS洗涤，加入Primer 1DNA，温育2h。

所述的方法，其所述的所用的磁珠需避光进行，反应24h。

所述的方法，其所述的加入Primer 1DNA后反应时间为2h。

(d)磁珠与酶结合：向步骤(c)中加入不同浓度的端粒酶和dNTPs，温育2h。

所述的方法，其所述的加入端粒酶的反应时间为2h。

(e)探针与磁珠的结合：将步骤(d)和步骤(b)混合均匀，温育2h。加DNA聚合酶，震荡温育24h。

所述的方法，其所述的探针与磁珠结合的反应时间为2h。

所述的方法，其所述的加入DNA聚合酶后的反应时间为24h。

所述的方法，其所述的利用特定序列的DNA单链循环放大使得信号呈指数增长。

(f)荧光检测：分子荧光仪测其荧光值。

所述的方法，其所述的利用化学方法来检测肿瘤物质。

附图说明

附图1为发明设计过程原理图。

附图2为端粒酶浓度曲线(从下往上依次为10IU,20IU,30IU,40IU,50IU,60IU)。

附图3为端粒酶反应时间曲线。

附图4为温度最佳曲线。

附图5为pH最佳曲线。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

基于生物传感器对荧光标记的MCF肿瘤标志物检测的方法(见图1)

一、生物探针的制备

(1)金纳米粒子的制备

纳米金粒子的合成是通过柠檬酸三钠还原四氯金酸制备而成。具体制备方法如下：

1％柠檬酸钠：称取0.0306g柠檬酸钠溶于3mL水中。

0.01％氯金酸：取1％氯金酸500μL，置于50mL的容量瓶中，摇匀，待用。

将蒸馏装置(250mL的三口烧瓶，球型冷凝管，进水管和出水管)组装好，向其加入50mL的0.01％氯金酸，调节转子转速，加热至沸。快速加入一定量柠檬酸钠，再煮沸20min。此时，烧瓶中溶液由无色逐渐变为酒红色，自然冷却至室温。倒入广口瓶中，置于冰箱中保存(4℃)，备用。

(2)银包金纳米探针的合成

取500μL金胶溶液，在10000r/min的离心机上离心30min，用PBS(10mM的磷酸盐，0.03M NaCl，pH 7.4)缓冲溶液定容至50μL，加入25μLPrimer 2DNA和50μL荧光DNA，避光反应24h。再同上离心，用PBS(10mM的磷酸盐，0.03M NaCl，pH 7.4)缓冲溶液定容至50μL，向其中加入1％PVP 19.8μL，0.1M的L-SA29.7μL，1mMAgNO₃溶液12μL，避光处理，恒温震荡孵育5h。即可制得银包金纳米探针。

二、磁珠载体的修饰

(1)活化磁珠

用咪唑盐酸(0.1M，pH 6.8)溶液洗涤三次，并加入50μL的咪唑盐酸；再加入40μLEDC溶液活化磁珠2h。

(2)磁珠载体的修饰

向活化好的磁珠中加入一定量的发卡DNA，37℃恒温孵育24h。使用磁力架将磁性微球与未连接在磁性微球上的DNA进行分离，并用50μL PBS(10mM的磷酸盐，0.1M NaCl，pH7.4)缓冲溶液洗涤三次，定容至原来的体积，加入一定量的Primer 1DNA，恒温孵育2h；再加入2.5μL不同浓度的端粒酶及dNTPs 1μL，恒温孵育2h。

三、探针与金胶结合

向磁性微球溶液中加入由10nm的金纳米粒子、Primer 2DNA、荧光DNA及AgNO₃溶液制成的银包金探针，再次恒温孵育2h；加入Klenow DNA聚合酶10μL(聚合酶：buffer＝1：9)，恒温孵育24h。

四、荧光检测

将磁珠进行洗涤三次，测其荧光值。

Claims (4)

1.基于生物传感器对荧光标记的MCF肿瘤标志物检测的方法，步骤包括：

(a)还原性金纳米粒子的合成：组装蒸馏装置，向其加入50mL的0.01％氯金酸，调节转子转数，加热至沸；快速加入一定量1％柠檬酸钠，再煮沸20min；溶液由无色逐渐变为酒红色，自然冷却至室温；倒入广口瓶中，置于冰箱中4℃保存，备用；

(b)银包金纳米探针的合成：将粒径为10nm的金胶离心后用PBS缓冲溶液定容至50μL，加入Primer 2 DNA 25μL和荧光DNA 50μL，避光24h；再离心，加入1％PVP 19.8μL、0.1M L-SA 29.7μL、1mMAgNO₃溶液12μL，避光37℃温育震荡5h；

(c)磁珠载体的修饰：向活化好的磁珠加入发卡DNA，避光温育24h；磁分离，PBS洗涤，加入Primer 1 DNA，温育2h；

(d)磁珠与酶结合：向步骤(c)中加入不同浓度的端粒酶2.5μL和dNTPs 1μL，温育2h；

(e)探针与磁珠的结合：将步骤(d)和步骤(b)混合均匀，温育2h；加DNA聚合酶10μL，震荡温育24h；

(f)荧光检测：分子荧光仪测其荧光值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中用PVP和L-SA来保护金胶，防止其聚沉。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用特定序列的DNA单链循环放大使得信号呈指数增长。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用化学方法来检测肿瘤物质。