CN104395468A - 检测hla-a*24:02的方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供高精度且简便地、并且能在减少污染风险的同时特异性地检测HLA-A*24:02等位基因的方法为课题。作为其解决手段，本发明提供了含有下述PCR引物的引物组、包含所述引物组的试剂盒以及利用所述试剂盒的方法，所述PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端开始到至少第16位的DNA序列。

Description

检测HLA-A*24:02的方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检测HLA-A*24:02的方法及检测试剂盒。
背景技术
近年来，新的肿瘤特异性抗原相继被鉴定出来，与之相伴，正逐渐进行对新的免疫疗法的开发。其中，癌免疫疗法中，在生物体内诱导出肿瘤抗原特异性的CD8阳性T细胞的疫苗疗法是主流。与利用疫苗疗法的癌免疫疗法相关的多种临床应用已在进行。通过对作为肿瘤特异性抗原的一部分的10个左右的氨基酸残基结合至HLA分子而形成的肽·HLA复合体的识别，诱导出肿瘤特异性的CD8阳性T细胞。利用其开发了将结合至HLA的肽作为抗原的肽疫苗疗法。
现在，日本国内正在进行利用结合至(日本人多数具有的)HLA-A*24:02的肽的肽疫苗疗法的开发。通过施用这种肽预期能获得效果的仅限于保持有HLA-A*24:02等位基因(allele)的患者。因此，需要在施用前预先确认对象患者保持有HLA-A*24:02。
对HLA检验而言，DNA分型(DNA typing)是现在最通常的检验方法，作为代表性技术，已知PCR-SBT(基于测序的分型)、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)及PCR-SSP(序列特异性引物)等。
作为肽疫苗施用前检测HLA-A*24的方法，报道了基于PCR-SSR的方法(非专利文献1)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nakatsugawa M等人，Comparison of speedyPCR-ssp method and serological typing of HLA-A24 for Japanesecancer patients.,Journal of Immunoassay and Immunochemistry，2011年4月，32(2)，pp.93-102
发明内容
以往的方法中，PCR-SBT存在下述问题：必须要用测序仪来解读HLA基因的DNA序列，操作繁杂，并且为了分析需要专门的软件。另外，以往的PCR-SSP中，存在为了提高正确性必须增加引物组数量的问题。此外，以往的PCR-SSP中，必须通过电泳来确认PCR产物，因此有污染风险。污染风险(尤其在基因检验的领域中)将大大损害可靠性。
利用PCR-SBT时，因为存在上述问题，所以并不简便，虽然其可特异性地仅检测HLA-A*24:02等位基因。然而以往的PCR-SSO和PCR-SSP不能特异性地仅检测HLA-A*24:02等位基因。
因此，本发明的课题为提供较之以往的方法而言更简便、并且能在减轻污染风险的同时、特异性地检测HLA-A*24:02等位基因的方法。
本申请的发明人着眼于A*24:02:01:01和A*24:20各自的碱基序列中仅在以下位置有所不同：HLA第211位的碱基在A*24:02:01:01中为C，而在A*24:20中则为A。本申请的发明人发现，通过以该第211位的碱基作为靶标碱基，将在该靶标碱基处形成错配的正向PCR引物、与规定的反向PCR引物和序列特异性结合探针组合并进行实时PCR，能够特异性地检测HLA-A*24:02等位基因。
本发明是基于上述新发现、通过进一步努力研究而完成的。本发明包括下述实施方式。
项1：
引物组，其含有：
(A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端到至少第16位的DNA序列。
项2：
引物组，其含有：
项1中记载的引物(A1)，及
(A2)反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3’末端到至少第20位的DNA序列。
项3：
实时PCR用试剂盒，其含有：
根据项1或2所述的引物组，及
(B)下述寡核苷酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核苷酸包含序列号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、443、447和449位的碱基中的任一碱基的15～25个碱基的连续的DNA序列。
项4：
一种方法，用于判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A:24:02的人，所述方法包括下述工序：
工序(1)，以人DNA检测样品为模板，使用根据项3所述的试剂盒进行实时PCR；及
工序(2)，将在工序(1)中检测到信号的人DNA检测样品确定为来源于具有HLA-A:24:02的人的检测样品。
项5：
HLA-A:24:02限制性肽疫苗施用对象群的筛选方法，所述方法包括下述工序：
工序(1)，以人DNA检测样品作为模板，使用根据项3所述的试剂盒进行实时PCR；及
工序(2)，将作为在工序(1)中检测到信号的人DNA检测样品的采集来源的人选择为施用HLA-A:24:02限制性肽疫苗的对象。
通过本发明，能够提供高精度且简便地、进而能在减少污染的风险的同时、特异性地检测HLA-A*24:02等位基因的方法。
附图简述
图1为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图2为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:20/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图3为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*02:01/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图4为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*11:01/11:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图5为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*23:01/29:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图6为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对TE缓冲液(阴性对照)进行实时PCR得到的结果的图。
图7为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图8为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、以及TE缓冲液(阴性对照)进行实时PCR得到的结果的图。
图9为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图10为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:20/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图11为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*02:01/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图12为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*11:01/11:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图13为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*23:01/29:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图14为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(A)和A*24:02检测用探针(i)对TE缓冲液(阴性对照)进行实时PCR得到的结果的图。
图15为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图16为表示使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、以及TE缓冲液(阴性对照)进行实时PCR得到的结果的图。
图17为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图18为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)对HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、以及TE缓冲液(阴性对照)进行实时PCR得到的结果的图。
图19为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图20为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图21为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对HLA-A*02:01/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图22为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对HLA-A*11:01/11:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图23为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对HLA-A*23:01/29:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
图24为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对TE缓冲液(阴性对照)进行实时PCR得到的结果的图。
图25为代替示意图的照片，其表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、引物组(B)和A*24:02检测用探针(i)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)对HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、以及TE缓冲液(阴性对照)分别进行实时PCR之后、将各PCR产物供给至琼脂糖电泳得到的结果。
图26为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(i)或(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(i)或(ii)对HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、以及TE缓冲液(阴性对照)分别进行实时PCR得到的结果的图。
图27为表示使用TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix、包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，在使引物和探针的浓度分别变化的同时，对HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、以及TE缓冲液(阴性对照)分别进行实时PCR得到的结果的图。
图28为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
图29为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
图30为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
图31为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
图32为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
图33为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针(ii)、以及IPC用引物组及IPC用探针(ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
具体实施方式
1.引物组
1.1正向引物(A1)
本发明的引物组为含有下述(A1)的引物组：
(A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端到至少第16位的DNA序列。
序列号1相当于HLA的DNA序列的第190～211位的部分序列。
正向PCR引物(A1)为包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端到优选第16、17、18、19、20或21位、更优选到第19位的DNA序列的寡核苷酸。
正向PCR引物(A1)中，位于3’末端的碱基、即与HLA的DNA序列的第211位碱基相应的碱基为C。A*24:02:01:01和A*24:20的HLA碱基序列仅在以下位置有所不同：分别地，HLA的第211位的碱基在A*24:02:01:01中为C，而在A*24:20中则为A。因此，若正向PCR引物(A1)与A*24:02:01:01及A*24:20的HLA碱基序列分别杂交，则仅与A*24:20的HLA碱基序列在第211位的位置处产生一个碱基的错配。但是，一般而言，仅一个碱基的错配不损害作为PCR引物的作用是已知的。因此，为了达到通过错配阻碍PCR的目的，通常，在从错配位点朝向5’碱基侧1或2个碱基处还另行设置错配。并且，正向PCR引物(A1)与A*24:20的HLA碱基序列之间产生的错配是所谓的C-T错误配对，其一般被认为难以阻碍PCR延伸反应。因此，使用正向PCR引物(A1)时，即使使用A*24:20的HLA碱基序列作为试样，认为基本不会因为上述错配而导致不发生PCR延伸反应。但是，本申请的发明人发现，与预想相反，使用正向PCR引物(A1)时，使用A*24:20的HLA碱基序列作为试样的情况下，因为错配而将导致不发生延伸反应。由此，若使用正向PCR引物(A1)，则进而通过与规定的反向引物组合，能够将A*24:02:01:01和A*24:20区分开。
进而，本申请的发明人发现，若使用正向PCR引物(A1)，则进而通过与规定的反向引物组合，不仅限于A*24:02:01:01，而是能够将A*24:02全部均与A*24:20区分开。
1.2反向引物(A2)
本发明的引物组还可进一步含有：
(A2)反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3’末端到至少第20位的DNA序列。
序列号2相当于HLA的DNA序列的第882～910位的部分序列的互补序列。
反向PCR引物(A2)为包含序列号2表示的DNA序列中从3’末端到优选至少第21位、更优选到第23位的DNA序列的寡核苷酸。
反向PCR引物(A2)中，位于从3’末端到第2位碱基的2个碱基、即与HLA的DNA序列的第909位和第910位碱基互补的碱基为T和G。A*23:01:01、以及A*24:04及A*24:20的HLA碱基序列在以下位置有所不同：分别地，HLA第909位和第910位的碱基在A*24:02:01:01、A*24:04及A*24:20中为C和A，而在A*23:01:01中为T和T。因此，若反向PCR引物(A2)与A*23:01:01、A*24:02:01:01、以及A*24:04及A*24:20的HLA碱基序列分别杂交，则仅与A*23:01:01的HLA碱基序列在第909位和第910位的位置处产生两个碱基的错配。该错配将阻碍PCR延伸反应。因此，若使用反向PCR引物(A2)，则在用A*23:01:01的HLA碱基序列作为试样的情况下，因为两个碱基的错配将导致不发生PCR延伸反应。因此，若使用反向PCR引物(A2)，则进而通过与规定的正向引物组合，能将A*23:01:01与A*24:02:01:01、A*24:04及A*24:20区分开。
进而，本申请的发明人等发现，若使用反向PCR引物(A2)，则进而通过与规定的正向引物组合，不仅限于将A*23:01:01与A*24:02:01:01区分开，而是能将A*23:01:01与A*24:02全部、A*24:04及A*24:20区分开。
2.实时PCR用试剂盒
本发明的实时PCR用试剂盒含有：
上述“1.”中记载的引物组，及
(B)下述寡核苷酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核苷酸包含序列号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、443、447和449位的碱基中的任一碱基的15～25个碱基的连续的DNA序列。
上述“1.”中记载的引物组优选含有：
(A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端到第16、17、18、19、20或21位的DNA序列；及
(A2)反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3’末端到至少第21位的DNA序列。
上述“1.”中记载的引物组更优选含有：
(A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端到第19位的DNA序列；及
(A2)反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3’末端到第23位的DNA序列。
2.1序列特异性结合探针(B)
本发明中使用的序列特异性结合探针(B)为下述寡核苷酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核苷酸包含序列号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、443、447和449位的碱基中的任一碱基的15～25个碱基的连续的DNA序列。
序列号3表示的DNA序列相当于HLA-A*24:02:01:01的第1～1,000位的部分序列。A*24:02及A*24:04的DNA序列在第429～449位的DNA序列中含有的7个碱基处有所不同。具体而言，DNA序列在下述位置有所不同：A*24:02第429、437、440、442、443、447及449位的碱基分别依次为A、C、T、G、C、T及C，而A*24:04则分别依次为C、G、C、C、T、G及G。
具体而言，例如，可以使用包含序列号3表示的DNA序列的第427～451位、第429～449位或第433～451位的DNA序列的寡核苷酸经标记而形成的序列特异性结合探针。
通过将序列特异性结合探针(B)与上述引物组一起使用，能够通过实时PCR检测第211位的碱基为C、第909及910位的碱基分别为C及A、并且第429、437、440、442、443、447及449位中任一碱基均与序列号3的碱基序列一致的HLA(例如A*24:02:01:01的HLA)的DNA。
进而，本申请的发明人发现，通过将序列特异性结合探针(B)与上述引物组一起使用，能够通过实时PCR特异性地仅检测A*24:02全部(不仅限于A*24:02:01:01)的HLA的DNA。
关于上述检测精度，详细而言，以日本人为对象时，为能够不将现在报道的A*24:20及A*24:04判定为阳性的精度。即使是对包含未报道为存在于日本人中的等位基因的群进行检测，上述检测精度也仍为能够特异性检测A*24:02的精度。具体而言，上述检测精度为能够不将抗原型与A*24不同的等位基因、以及A*24:08、A*24:13、A*24:19、A*24:24、A*24:29、A*24:44、A*24:89、A*24:94、A*24:89、A*24:109及A*24:129中的任一判定为阳性的精度。
通过将序列特异性结合探针(B)与上述引物组一起使用并进行实时PCR，能够进行Plus/Minus检验(Plus/Minus Assay)。此外，通过该方法可以以单一反应体系进行检测，因为同时进行内部标准(内部阳性对照)反应，能够排除PCR阻碍导致的假阴性的可能性。
序列特异性结合探针(B)具有用于通过实时PCR进行检测的标记。标记例如为荧光标记。与实时PCR中的不同检测方式相应地，对标记的方式进行选择。
作为实时PCR中的检测方式，没有特定限制，例如可举出以下所示的这些。
例如，可以举出利用以DNA聚合酶的5’外切核酸酶活性进行水解导致发出荧光来进行检测的方式(该方式中使用的探针被称为“水解探针”)。作为水解探针的代表性例子，可举出市售的TaqMan(注册商标)探针。
此外，可以举出下述方式，其中，使用经分别不同的荧光染料标记的探针，在单链靶标DNA中两条探针相互邻接并杂交而发出荧光，而在双链靶标DNA中探针则均不杂交、不发荧光，利用这点进行检测(该方式中使用的探针被称为“杂交探针”)。
进而，可以举出通过进行熔融曲线分析来进行检测的方式。所谓熔融曲线分析，表示以实时方式追踪核酸的退火和热变性。探针与靶标的杂交体的Tm在存在错配时将显著降低。熔融曲线分析中，利用这点来检测是否存在错配。
熔融曲线分析也可以在PCR之后进行。
为进行该方式，除了前文所述的杂交探针之外，还可使用经一种物质标记的探针。
熔融曲线分析中，通过对序列特异性结合探针与靶标DNA的杂交体的熔融进行监测，即使只有一个碱基的错配，也可以识别出来。
在使用杂交探针的情况下，熔融曲线分析详细而言为下述这样的分析。寡核苷酸中的一者与靶标DNA的不产生错配的部分杂交。该探针能够作为锚探针(anchor probe)发挥作用。另一者的寡核苷酸(检测用探针)则结合至可产生错配的部分。产生错配的情况下，该检测用探针的Tm将比锚探针的Tm低约5℃。DNA扩增完成后，立刻使用合适的装置实施熔融曲线分析，识别不同的基因型。该分析期间，在使温度缓慢上升(例如，每1秒0.1～0.2℃)的同时，继续进行荧光测定。通过该操作，能够监测结合至靶标DNA的探针的熔融动态。伴随温度上升，从较短的突变探针开始发生熔融。通过熔融，两种荧光染料之间的距离分开，因此荧光信号减少。探针与靶标的杂交体的Tm不仅取决于探针的长度或GC含量，还取决于杂交体的同源性程度。因此，探针更完全结合，则熔融Tm更高；而对于结合至包含欠缺稳定性的错配的DNA上的探针来说，Tm将变低。
作为实时PCR中的检测方式，还可举出使用分子信标(MolecularBeacon)、Eclipse Probes(结构化探针，structured Probe)、HyProbe(邻近杂交探针，adjacent hybridization Probes)及Q Probe等的方式，以及使用包含RNA和DNA的嵌合探针的循环探针(cycling probe)法及使用Invader(注册商标)探针的Invader Plus(注册商标)法等。
2.2其它组分
本发明的PCR用试剂盒还可含有其它构成要素(组分)。
作为其它构成要素，没有特别限定，可举出PCR用试剂盒中通常含有的那些构成要素。
作为PCR用试剂盒中通常含有的那些构成要素，没有特别限定，例如可举出dNTP(脱氧核苷酸三磷酸)、耐热性DNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液及说明书等。
dNTP中，也可代替dTTP而含有dUTP。dNTP中含有dUTP代替dTTP的情况下，通过利用UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)(其为分解包含尿嘧啶的DNA的酶)，能够防止此前进行的PCR扩增产物的遗留(carryover)导致的假阳性。即，即使万一此前进行的PCR扩增产物混入了反应体系，因为PCR扩增产物中掺有dUTP，因此通过作为分解包含尿嘧啶的DNA的酶的UNG发挥作用，由此能够防止这样的遗留导致的假阳性。因此，本发明的PCR用试剂盒还可含有UNG。
2.2.1耐热性DNA聚合酶
作为耐热性DNA聚合酶，没有特别限定，可从市售品中针对探针的种类进行适当的选择。需要说明的是，因为本发明目的在于以与模板DNA杂交了的正向PCR引物(A1)的3’末端处是否形成错配为指标进行判定，因此优选不具有3’→5’外切核酸酶活性的耐热性DNA聚合酶。
作为序列特异性结合探针(B)，使用水解探针的情况下，优选为具有5’→3’外切核酸酶活性的耐热性DNA聚合酶。作为具有5’→3’外切核酸酶活性的耐热性DNA聚合酶，没有特别限定，作为优选，可举出例如Taq DNA聚合酶及Tth DNA聚合酶。作为Taq DNA聚合酶，除通常的为Taq DNA聚合酶外，还可使用化学修饰型的AmpliTaq Gold(注册商标)DNA聚合酶、HotStarTaq(注册商标)DNA聚合酶及FastStart Taq DNA聚合酶、以及作为使用了适体(aptamer)的热启动酶的AptaTaq DNA聚合酶、或利用了抗Taq抗体的Hot Start PCR系统(TaKaRa Taq TM Hot Start Version等)等。
使用分子信标探针(Molecular Beacon Probe)或Hyprobe的方式、以及采用循环探针法及Invader Plus法等的情况下，使用欠缺保真(Proof-reading)活性、并且5’→3’外切核酸酶活性及3’→5’外切核酸酶活性均无的酶。
作为这样的酶，没有特别限定，可举出例如TaqΔexo DNA聚合酶、KOD(exo-)DNA聚合酶、Exo-Pfu DNA聚合酶及Vent(exo-)DNA聚合酶等。
2.2.2 Mg 2+
作为Mg2+，没有特别限定，例如可作为MgCl2及MgSO4含有在PCR用试剂盒中。虽然没有特别限定，但通常需要为1.5～2.5mM的Mg2+。
2.2.3缓冲液
缓冲液通常相应于使用的酶的种类来选择。作为缓冲液，没有特别限定，可以使用市售的PCR用缓冲液、或与市售的PCR用试剂盒中含有的缓冲液相同的缓冲液。这些市售品中，经常不标明缓冲液组成。下面举出使用Taq聚合酶的情况下的标准缓冲液的组成。
50 mM KCl
10mM Tris-HCl(pH 8.4～9.0，25℃)
1.5mM MgCl2
0.01％明胶或0.01％Triton X-100
本发明的PCR用试剂盒中也可含有较之缓冲液使用时而言为10倍左右高的浓度的物质。这种情况下，使用时将缓冲液稀释后使用。
3.判定方法
本发明的用于判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A:24:02的人的方法为包括下述工序的判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A:24:02的人的方法，所述工序为：
工序(1)，以人DNA检测样品为模板，使用上述“2.”中记载的试剂盒进行实时PCR；及
工序(2)，将在工序(1)中检测到信号的人DNA检测样品确定为来源于具有HLA-A:24:02的人的检测样品。
作为人DNA检测样品，含有人基因组DNA即可，没有特别限定，例如可举出血液、口腔粘膜、毛发、指甲及血迹(将血液滴至滤纸上而得的)等。
作为人DNA检测样品，可优选使用血液检测样品。作为血液检测样品，可以直接使用通过采血制备而得的检测样品，也可使用对通过采血得到的物质施加规定的处理而得的检测样品。作为规定的处理，没有特别限定，可举出例如加热及冷冻等。
对实时PCR，可使用通常使用的市售的装置。作为市售的装置，没有特别限定，可举出例如ABI 7500 Fast及ABI 7500 Fast Dx(LifeTechnologies)等。
关于实时PCR的条件，可在通常的条件下进行。
关于引物及探针各自的浓度及反应容量，在使用例如市售的预混溶液(例如，Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及缓冲液的混合液)的情况下，可根据该预混溶液推荐的那样来确定。作为市售的预混溶液，没有特别限定，可举出例如TaqMan(注册商标)Gene ExpressionMaster Mix(Life Technologies)、QuantiTect(注册商标)MultiplexPCR试剂盒(QIAGEN)等。根据针对TaqMan(注册商标)GeneExpression Master Mix的推荐，可使用引物900nM、探针250nM、反应体系20μL。此外，根据针对QuantiTect(注册商标)MultiplexPCR试剂盒的推荐，可使用引物400nM、探针200nM、反应体系25μL。
相应于退火温度和延伸温度，选择Tm值合适的引物。
PCR条件可合适地设定。虽然没有特别限定，但可举出例如下述条件。
(1)50℃，2分钟
(2)95℃，10～15分钟
(3)95℃，15秒
(4)68℃，1分钟
(5)以(3)和(4)作为1个循环，重复进行剩下的39个循环(使得全部合计为40个循环)。但是，利用抗体型或适体的热启动的情况下，因为不需要用于活化的时间，所以上述(2)也可以为0～15分钟。
通过本发明，对具有日本人这样的等位基因频率的群体，能够简便且高精度地进行对HLA-A:24:02的检测。
此外，例如，在东南亚，存在作为A*24亚型之一的A*24:07等位基因被报道为高频率的国家。在日本A*24:07等位基因的频率低。A*24:02与A*24:07序列上的不同仅在于第412位的一个碱基。通过注目于该一个碱基的不同，能够设计能特异性检测A*24:07的引物。作为这样的引物，没有特别限定，可举出例如包含序列号4表示的DNA序列的正向引物等。将Tm值设定为68℃左右时，通过使用该正向引物进行PCR，能够将观察到DNA扩增的检测样品判定为A*24:07等位基因阴性。因此，针对以高频率具有A*24:07等位基因的群体，以本发明的判定方法为基础，通过进一步另行使用能特异性检测A*24:07的引物，可简便且高精度地进行对HLA-A:24:02的检测。此外，针对等位基因频率与日本人不同的其他群体，通过以本发明为基础施加类似的改良，能够简便且高精度地进行对HLA-A:24:02的检测。
4.筛选方法
本发明的HLA-A:24:02限制性肽疫苗施用对象群的筛选方法为包括下述工序的方法：
工序(1)，以人DNA检测样品作为模板，使用上述“2.”中记载的试剂盒进行实时PCR；及
工序(2)，将作为在工序(1)中检测到信号的人DNA检测样品的采集来源的人选择为施用HLA-A:24:02限制性肽疫苗的对象。
现在，日本国内正在进行利用结合至日本人多数具有的HLA-A*24:02的肽(HLA-A:24:02限制性肽疫苗)的肽疫苗疗法的开发。作为这样的HLA-A:24:02限制性肽疫苗，可举出例如OTS102、OCV-101、OCV-105、WT4869、S288310、S488410及OTSGC-A24等。
通过施用HLA-A:24:02限制性肽疫苗预期能获得治疗效果的仅限于保持有HLA-A*24:02等位基因的患者。因此，若能够在施用前预先确认对象患者保持有HLA-A*24:02，则能够筛选施用HLA-A:24:02限制性肽疫苗的对象。
关于人DNA检测样品、实时PCR的诸项条件以及对象群，与上述“3.判定方法”中给出的说明相同。
实施例
以下参照实施例更详细地说明本发明，但本发明不仅限于这些实施例。
1.材料和方法
1-1.引物及探针的设计
关于引物的设计，报道过基于A*24:02:01:01的序列、通过将第909～910位设定为反向引物的3’末端，能够不检测出A*23:01:01而检测出A*24:02:01:01(Bunce M,O'Neill CM等人，Phototyping:comprehensive DNA typing for HLA-A,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5&DQB1 by PCR with 144 Primer mixes utilizingsequence-specific Primers(PCR-SSP).,Tissue Antigens，1995年11月，46(5)，pp.355-67)。
与A*24:02:01:01互补的正向引物，相对其它等位基因而言，序列上仅在3’末端有一个碱基不同。具体而言，正向引物的3’末端碱基为C，而例如A*24:20的互补链为T，这种情况下产生C-T错误配对，其使得延伸反应最容易进行(Kwok S等人，Effects ofPrimer-template mismatches on the polymerase chain reaction:humanimmunodeficiency virus type 1 model studies.,Nucleic Acids Res.，1990年2月，18(4)，pp.999-1005；Huang MM等人，Extension of basemispairs by Taq DNA polymerase:implications for single nucleotidediscrimination in PCR.,Nucleic Acids Res.，1992年9月，20(17)，pp.4567-73)。为了解决该问题，存在在引物的各碱基中利用LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)的方法(Latorra D等人，Enhancedallele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3'lockednucleic acid(LNA)Primers.,Hum Mutat.，2003年7月，22(1)，pp.79-85)和利用等位基因特异性竞争性遏制剂(allele specificcompetitive blocker)的方法(Orou A等人，Allele-specific competitiveblocker PCR:a one-step method with applicability to pool screening.,Hum Mutat.，1995年，6(2)，pp.163-9)等。
A*24:02:01:01检测引物、探针的序列如下文所示。关于引物，设计了从上述的3’末端到5’末端侧16～26mer的引物。
作为本发明的实施例，使用了最常用的TaqMan(注册商标)探针。
关于探针，设计了例如A*24:02:01:01的第429～449位的序列(21mer)和第433～451位的序列(19mer)。关于荧光染料，使用了FAM。关于淬灭剂，使用了TAMRA和作为黑洞淬灭剂的ATTO540Q。关于Taqman探针的设计，只要序列上有一个碱基不同，就可以利用包含LNA或MGB的探针检测到(Ugozzoli LA等人，Real-time genotyping with oligonucleotide Probes containing lockednucleic acids.,Anal Biochem.，2004年1月，324(1)，pp.143-52；de KokJB等人，Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms usingnovel minor groove binding DNA oligonucleotides(MGB Probes).,Hum Mutat.，2002年5月，19(5)，pp.554-9)，因此以A*24:02:01:01的从第429位到449位中的何处序列不同位点为靶标均可。
此外，为了防止检测样品的分注错误、通过PCR阻碍导致的假阴性，设计了RNaseP基因的引物、探针序列作为内部阳性对照。
引物、探针是从Sigma Genosys或日本基因研究所(Nihon GeneResearch Laboratories,Inc.)购入的。
＜A*24:02:01:01检测引物、探针＞
正向引物(5’-3’)
26mer GCCACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号5)
25mer CCACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号6)
24mer CACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号7)
23mer ACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号8)
22mer CTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号9)
21mer TCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号10)
20mer CCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号11)
19mer CTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号12)
18mer TCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号13)
17merCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号14)
16mer GTCCCCAGGCTCCCAC(序列号15)
15mer TCCCCAGGCTCCCAC(序列号16)
反向引物(5’-3’)
29mer ACGCACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号17)
28mer CGCACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号18)
27mer GCACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号19)
26mer CACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号20)
25mer ACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号21)
24mer CGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号22)
23mer GTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号23)
22mer TGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号24)
21mer GCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号25)
20mer CCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号26)
19mer CCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号27)
18mer CTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号28)
17mer TCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号29)
16mer CCAGGTAGGCTCTCTG(序列号30)
探针(5’-3’)
(i)(FAM-)AGAACCTGCGGATCGCGCTCC(-TAMRA)(序列号31)
(ii)(FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q)(序列号32)
＜内部阳性对照检测引物、探针＞
正向引物(5’-3’)
TGCAGATTTGGACCTGCGAG(序列号33)
反向引物(5’-3’)
TGAGCGGCTGTCTCCACAAG(序列号34)
探针(5’-3’)
(i)(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-TAMRA)(序列号35)
(ii)(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q)(序列号35)
1-2.PCR基础混合液(master mix)
作为DNA扩增酶，使用了TaqΔexo DNA聚合酶。
使用了作为通常的实时PCR基础混合液试剂的TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix(Life Technologies)、QuantiTectMultiplex PCR试剂盒(QIAGEN)。使用QuantiTect Multiplex PCR试剂盒(QIAGEN)时，向25μl的反应中添加0.25个单位的热不稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA Glycosylase(heat-labile))(Roche)。
1-3.源于人的基因组DNA
通过美国CTL公司购入HLA分型PBMC，使用QIAamp DNABlood Mini Kit(QIAGEN)对基因组DNA进行了纯化，此外，从Human Science财团(Japan Health Sciences Foundation)购入源于人细胞的细胞基因组DNA，关于它们，使用AlleleSEQR HLA-A(AbbottLaboratories)、Assign软件(Conexio Genomics)、UniTray(注册商标)(Life Technologies)、Micro SSP Allele Specific HLA Class IDNA Typing Tray(One Lambda Inc)进行了HLA-A的分型。
添加2μL的100ng/μL、1ng/μL的基因组DNA，进行了实时PCR反应。
1-4.实时PCR
实时PCR使用ABI 7500 Fast、ABI 7500 Fast Dx(LifeTechnologies)进行。
条件如下所示。
TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix
50℃处理2分钟、95℃处理10分钟之后，进行了40个95℃15秒、68℃1分钟的循环。
QuantiTect Probe PCR+UNG试剂盒、QuantiTect Multiplex PCR试剂盒
50℃处理2分钟、95℃处理15分钟之后，进行了40个95℃15秒、68℃1分钟的循环。
2.结果
2-1.对引物的研究(Tm值)
选择了一般进行PCR时能被考虑的最长的26mer的引物组(A)，以及使用最接近碱基对参数(Nearest Neighbor Parametes(杉本直己、“最近接塩基対パラメータを用いた核酸の安定性予測とその機能との関係(使用了最接近碱基对参数进行的核酸稳定性预测与其功能之间的关系)”，《生物物理》(吉冈书店)，vol.33，pp.61-67)选择了Tm值为68℃左右的引物组(B)并对引物的长度进行了优化。将Tm值设定为68℃左右是因为退火、延伸温度设定为在68℃进行，例如若退火、延伸温度为60℃，则选择Tm值为60℃左右的引物。关于探针，选用了包含在A*24:04和A*24:02:01:01等位基因中观察到不同的第429位至第449位的全部序列的探针。引物和探针的浓度、反应容量按照各基础混合液(Master Mix)所推荐的浓度来进行。关于基础混合液，使用了TaqMan(注册商标)Gene ExpressionMaster Mix、QuantiTect Multiplex PCR试剂盒。关于TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix，以引物900nM、探针250nM、反应体系为20μL进行，关于QuantiTect Multiplex PCR试剂盒，以引物400nM、探针200nM、反应体系为25μL进行。关于实时PCR装置，使用了ABI7500 Fast。基因组DNA的等位基因为(i)A*24:02/A*02:06、(ii)A*24:20/A*02:06、(iii)A*02:01/A*02:06、(iv)A*11:01/A*11:01及(v)A*23:01/A*29:01。
(A)
正向引物(5’-3’)
26mer GCCACTCCTCGTCCCCAGGCTCCCAC(序列号5)
反向引物(5’-3’)
26mer CACGTGCCCTCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号17)
(B)
正向引物(5’-3’)
16mer TCCCCAGGCTCCCAC(序列号16)
反向引物(5’-3’)
16mer TCCAGGTAGGCTCTCTG(序列号29)
A*24:02检测用探针(i)((A)、(B)共通)
(FAM-)AGAACCTGCGGATCGCGCTCC(-TAMRA)(序列号31)
两种基础混合液的情况下，使用长度为26mer的引物组(A)时，针对A*24:02以外的等位基因均检测到了信号，特别是针对包括A*24:20的(ii)A*24:20/A*02:06，观察到了显著的信号扩增。但是，使用将Tm值优化为68℃左右的(B)引物组时，没有观察到A*24:02阴性基因组的扩增。显示了TaqMan(注册商标)Gene ExpressionMaster Mix(图1～8)、QuantiTect Multiplex PCR试剂盒(图9～16)的结果。
2-2.对引物的研究(IPC-内部阳性对照)
向(B)的引物组反应液中添加下述内部阳性对照(IPC-InternalPositive Control)用的引物、探针，进行了测定。通过添加内部阳性对照，能够防止因为某种因素而阻碍了PCR反应或加样错误导致的假阴性。IPC的信号被检测到、而HLA-A*24:02检测信号没有被检测到的话，则能够断定为阴性。基础混合液使用了TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix、QuantiTect Multiplex PCR试剂盒。IPC的引物从RNaseP基因的区域选择，为了尽量不对HLA-A*24:02检测系统造成影响，将扩增区域设定为较短(69bp)，并且引物浓度也以低浓度(0.1μM)添加。IPC的探针浓度按照各基础混合液的推荐浓度(TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix–250nM，QuantiTect Multiplex PCR试剂盒–200nM)进行。HLA-A*24:02检测引物、探针浓度按照各基础混合液的推荐浓度进行。关于TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix，以引物900 nM、探针250nM、反应体系为20μL进行，关于QuantiTect Multiplex PCR试剂盒，以引物400nM、探针200nM、反应体系为25μL进行。关于实时PCR装置，使用了ABI7500 Fast。
示出了TaqMan(注册商标)Gene Expression Master Mix的结果(图17～24)。
关于HLA-A*24:02的结果，获得了与未加IPC引物、探针时相同的结果，在全部的基因组中均检测出了IPC的信号。此外，琼脂糖凝胶电泳的结果中，在A*24:02/02:06和A*11:01/11:01基因组中发现了作为HLA-A*24:02检测目标条带(800bp附近)的条带(图25)。关于A*11:01等位基因，虽然设定于探针中的序列存在不同，但引物区域与A*24:02的序列为基本相同的序列，确认到了扩增。关于通过实时PCR没有检测到信号，确认了这是因为探针序列中存在不同。在添加了基因组DNA的全部情况下均确认到IPC的条带，这反映了实时PCR的结果。QuantiTect Multiplex PCR试剂盒的情况中存在相同的结果。
＜内部阳性对照检测引物、探针＞
正向引物(5’-3’)
TGCAGATTTGGACCTGCGAG(序列号33)
反向引物(5’-3’)
TGAGCGGCTGTCTCCACAAG(序列号34)
IPC用探针(i)(5’-3’)
(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-TAMRA)(序列号35)
2-3.对引物的优化
通过制作的引物的组合进行实时PCR，进行了对引物的优化。使用了作为基础混合液试剂的TaqMan(注册商标)Gene ExpressionMaster Mix(Life Technologies)。关于引物、探针浓度，以引物浓度为900nM、探针浓度为250nM、反应体系为20μL进行。关于基因组DNA，为(i)A*24:02/A*02:06为100ng/μL、1ng/μL，(ii)A*24:20/A*02:06、(iii)A*02:01/A*02:06、(iv)A*11:01/A*11:01、(v)A*23:01/A*29:01则用TE缓冲液调整为100ng/μL，向反应体系中添加2μL。测定仪器使用了ABI 7500 Fast。结果示于表1。
关于结果的判定，以3～15对基线(Baseline)进行分析，对于(i)100ng/μL、1ng/μL的结果而言信号为0.05以上时，并且(ii)～(v)的信号为0.05以下时，记为○。(i)的A*24:02阳性基因组为0.05以下，或(ii)～(v)的阴性等位基因中观察到信号上升至0.05以上的情况，则记为×。
表1
2-4.对探针的优化
上述研究中使用的A*24:02检测用探针(i)(FAM-)AGAACCTGCGGATCGCGCTCC(-TAMRA)(序列号31)在从5’末端起算的第2位上存在G(鸟嘌呤)碱基。G碱基具有荧光消光作用，因为优选在5’末端尽量不存在G碱基。此外，TAMRA淬灭剂自身具有荧光，因此导致在整个谱中产生背景。关于A*24:02检测用探针的序列，可以以A*24:04和A*24:02:01:01等位基因中存在不同的第429位～第449位的序列错配为靶标，例如，设计了第433～451位的序列(19mer)，其靶向第437～449位的序列。此外，将TAMRA淬灭剂改变为作为黑洞淬灭剂的ATTO540Q淬灭剂。将获得的探针用作为A*24:02检测用探针(ii)。
A*24:02检测用探针(ii)
(FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q)(序列号32)
此外，关于IPC用的探针，也从TAMRA淬灭剂(IPC用探针(i))改变为ATTO540Q淬灭剂(IPC用探针(ii))。
IPC用探针
(i)(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-TAMRA)(序列号35)
(ii)(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q)(序列号35)
分别使用上述的TAMRA淬灭剂探针(IPC用探针(i))及ATTO540Q淬灭剂探针(IPC用探针(ii))，进行了实时PCR。使用了作为基础混合液试剂的TaqMan(注册商标)Gene ExpressionMaster Mix(Life Technologies)。
关于引物，从上表选择了正向引物-19mer(序列号12)、反向引物-23mer(序列号23)。关于引物、探针浓度，以引物浓度为900nM、探针浓度为250nM、反应体系为20μL进行。关于基因组DNA，为(i)A*24:02/A*02:06为100ng/μL、1ng/μL，(ii)A*24:20/A*02:06、(iii)A*02:01/A*02:06、(iv)A*11:01/A*11:01、(v)A*23:01/A*29:01则用TE缓冲液调整为100ng/μL，向反应体系中添加2μL。测定仪器使用了ABI 7500 Fast。结果示于图26。
在经改良的FAM-ATTO540Q中观察到了信号的更大上升。关于IPC，获得了同等的结果。
2-5.对引物、探针浓度的优化
进行了对引物、探针浓度的优化。过量的引物通常导致无关DNA的扩增，有使最终PCR产物变得不均匀的危险，过量的探针是背景上升的原因。使用下述引物、探针，进行了关于浓度的研究。使用了作为基础混合液试剂的TaqMan(注册商标)Gene Expression MasterMix(Life Technologies)，以反应体系为20μL进行。关于基因组DNA，为(i)A*24:02/A*02:06为100ng/μL、1ng/μL，(ii)A*24:20/A*02:06、(iii)A*02:01/A*02:06、(iv)A*11:01/A*11:01、(v)A*23:01/A*29:01则用TE缓冲液调整为100ng/μL，向反应体系中添加2μL。测定仪器使用了ABI 7500 Fast。
结果示于图27。使A*24:02检测引物的浓度成为100nM、300nM、900nM，进行了实时PCR。任一组合中均仅观察到A*24:02阳性基因组中信号的上升。100nM时信号值明显较低，但300nM、900nM时为同等程度。接着，将引物浓度固定为300nM，使探针浓度成为100、200、400nM，结果，随着FAMProbe、HEXProbe共同地浓度上升，信号也上升。任一组合中均仅观察到A*24:02阳性基因组中信号的上升。上述结果显示本系统不依赖于引物或引物浓度。
＜A*24:02检测用＞
正向引物-19mer(100、300、900nM)
反向引物-23mer(100、300、900nM)
A*24:02检测用探针(ii)(FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q)(100、200、400nM)(序列号32)
＜IPC用＞
正向引物-TGCAGATTTGGACCTGCGAG(100nM固定)(序列号33)
反向引物-TGAGCGGCTGTCTCCACAAG(100nM固定)(序列号34)
IPC用探针(ii)(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q)(100、200、400nM)(序列号35)
2-6.对来源于日本人的细胞株基因组的测定
使用了从Human Science财团购入的来源于日本人的细胞株(PSC细胞株)基因组的100份样品，进行了HLA-A分型。分型首先使用AlleleSEQR HLA-A(Abbott Laboratories)、Assign软件(Conexio Genomics)来进行，关于可能为A*24:02的情况，使用UniTray(注册商标)(Life Technologies)、Micro SSPTM Allele SpecificHLA Class I DNA Typing Tray(One Lambda Inc)进行进一步分型，确认了为A*24:02。100份样品中，A*24:02阳性为68份样品，阴性为32份样品。
使用利用了序列特异性引物、探针的HLA-A*24:02检测系统，对100份样品的基因组进行了测定(图28～33)。引物、探针按照下文所述的条件来进行。基因组浓度调整为100ng/μL、1ng/μL，添加2μL。反应体积为20μL，测定仪器使用了ABI 7500 Fast Dx。将基线设定为3～15来进行分析，40个循环时的信号为0.05以上的情况被确定为阳性。
结果示于表2。阳性基因组的68份样品中均得到了0.05以上的信号，而阴性基因组的32份样品中没有观察到信号的上升。IPC的信号则在100份样品中均显示出了0.05以上的信号。
＜A*24:02＞
正向引物-19mer(300nM)
反向引物-23mer(300nM)
(ii)(FAM-)CCTGCGGATCGCGCTCCGC(-ATTO540Q)(200nM)(序列号32)
＜IPC＞
正向引物-TGCAGATTTGGACCTGCGAG(100nM)(序列号33)
反向引物-TGAGCGGCTGTCTCCACAAG(100nM)(序列号34)
(ii)(HEX-)TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG(-ATTO540Q)(200nM)(序列号35)
表2
                                   阳性一致率100％
                                   阴性一致率100％
                                   全体一致率100％
3.讨论
对引物、探针进行了优化，构建了简便、精度高的A*24:02检测体系。特别地，A*24:20等位基因与A*24:02在序列上仅一个碱基不同，此外，为了将正向引物设计为使得A*24:20不为阳性的引物，而必须要设计为使得C(引物)-T(模板)错配不延伸。本发明中，将引物的长度设计为最短，使得错配率上升，因此不会发生错误的C-T错配延伸。本研究中，通过使用了22mer～16mer的正向引物，从而能够解决这些问题，以单一反应体系完成了测定体系。
参照日本人的等位基因频率进行设计，以100份样品测定了来源于日本人的基因组DNA，结果能够以灵敏度、特异度100％的精度进行测定。
此外，还可在日本以外应用本测定系统。虽然在日本，在A*24亚型中A*24:20等位基因被高频率地报道，但在东南亚也有A*24:07等位基因(作为A*24亚型之一)被高频率地报道的国家。A*24:02与A*24:07的序列仅在第412位的一个碱基处不同(A*24:02(C)-A*24:07(G))，将正向引物的3’末端设定为序列不同位点、并将Tm值设定为68℃左右的话，与(GACAGGGAAAGTGAAGGCCCAC)(序列号4)相同地，能够获得将A*24:07判断为阴性的体系。通过以这种方式增加反应体系，使得精度的上升也成为可能。
序列表自由文本
[序列号1]正向·引物
[序列号2]反向·引物
[序列号3]智人(Homo Sapiens)
[序列号4]正向·引物
[序列号5]正向·引物
[序列号6]正向·引物
[序列号7]正向·引物
[序列号8]正向·引物
[序列号9]正向·引物
[序列号10]正向·引物
[序列号11]正向·引物
[序列号12]正向·引物
[序列号13]正向·引物
[序列号14]正向·引物
[序列号15]正向·引物
[序列号16]正向·引物
[序列号17]反向·引物
[序列号18]反向·引物
[序列号19]反向·引物
[序列号20]反向·引物
[序列号21]反向·引物
[序列号22]反向·引物
[序列号23]反向·引物
[序列号24]反向·引物
[序列号25]反向·引物
[序列号26]反向·引物
[序列号27]反向·引物
[序列号28]反向·引物
[序列号29]反向·引物
[序列号30]反向·引物
[序列号31]探针
[序列号32]探针
[序列号33]正向·引物
[序列号34]反向·引物
[序列号35]探针

Claims (5)

1.引物组，其含有：
(A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端到至少第16位的DNA序列。
2.引物组，其含有：
权利要求1中记载的正向PCR引物(A1)，及
(A2)反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3’末端到至少第20位的DNA序列。
3.实时PCR用试剂盒，其含有：
根据权利要求1或2所述的引物组，及
(B)下述寡核苷酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核苷酸包含序列号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、443、447和449位的碱基中的任一碱基的15～25个碱基的连续的DNA序列。
4.一种方法，用于判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A:24:02的人，所述方法包括下述工序：
工序(1)，以人DNA检测样品为模板，使用根据权利要求3所述的试剂盒进行实时PCR；及
工序(2)，将在工序(1)中检测到信号的人DNA检测样品确定为来源于具有HLA-A:24:02的人的检测样品。
5.HLA-A:24:02限制性肽疫苗施用对象群的筛选方法，所述方法包括下述工序：
工序(1)，以人DNA检测样品作为模板，使用根据权利要求3所述的试剂盒进行实时PCR；及
工序(2)，将作为在工序(1)中检测到信号的人DNA检测样品的采集来源的人选择为施用HLA-A:24:02限制性肽疫苗的对象。
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