CN110691852A - Alk、ret和ros融合物的多重pcr检测 - Google Patents

Alk、ret和ros融合物的多重pcr检测 Download PDF

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Abstract

本文提供了以非常高的灵敏度和特异性多重检测大量可起作用的基因融合物的方法和组合物。本方法和组合物可以检测ALK、RET和ROS1基因融合物，任选地与其他突变和融合物的组合。

Description

ALK、RET和ROS融合物的多重PCR检测
发明背景
许多癌症与基因融合物相关(Yoshihara等人(2015) Oncogene 34:4845)。最早报道的实例可能是在60年代，BCR-ABL与慢性骨髓性白血病(CML)的关联(Nowell和Hungerford(1960)，J. Natl. Cancer Inst. 25:85)。从那以后，已经报道了许多不同组织中的癌症的数百个基因融合物(Presner和Chinnaiyan(2009)，Curr. Opin Genet. Dev. 19:82)。
另一个实例是酪氨酸受体激酶ALK(间变性淋巴瘤激酶)。EML4-ALK(棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶)融合物与非小细胞肺癌(NSCLC)相关。在这种情况下，ALK的N末端细胞外部分被替换为EML4(KIF5B、HIP1、KLC1、TFG也可以以类似的方式与ALK融合)。所得的融合基因的表达由强EML4启动子驱动，导致ALK的细胞内酪氨酸激酶结构域的更高表达。另外，EML4形成卷曲螺旋，其导致配体非依赖性二聚化和ALK酪氨酸激酶结构域的组成性活化。活化的激酶融合物的额外实例涉及RET (转染期间重排基因)和ROS1。
基因融合物的检测可用于指导治疗。大多数检测方法需要肿瘤组织的活检，这对尤其是后期的许多癌症患者是不可行的。活检组织切片中的检测通常通过荧光原位杂交(FISH)或免疫组织化学(IHC)来进行。所述测试具有高假阳性率和背景，部分是因为在切片过程期间的剪切。因此，要求熟练的细胞学家观察多个组织切片，这需要来自虚弱患者的相当大的活检。类似地，使用RT-PCR的困难是来自肿瘤组织的遗传材料的数量和质量，所述肿瘤组织例如呈福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)形式。参见例如Liu等人(2015)，PLoSOne10: e0117032。
因为检测是时间和资源密集的，所以测试率相对较低。与ALK融合物相关的癌症对ALK抑制剂(例如克唑替尼和色瑞替尼)非常敏感。具有转录期间重排基因(RET)的基因融合物，例如与KIF5B或CCDC6的基因融合物，对于例如用范德他尼的治疗也是敏感的(参见Matsubara等人，(2007)，J. Thorac. Oncol. 7:1872)。基因融合物的低测试率因此代表了治疗机会的大量损失。
发明概述
本文提供了用于检测融合基因、尤其是涉及ALK、RET和ROS1的那些融合基因的多重方法和组合物。
本文提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；(C)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ROS1融合基因；和(D)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。进一步提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(C)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。本文提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(B)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。
在一些实施方案中，所述至少一种ALK融合基因选自：EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20；所述至少一种RET融合基因选自：KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12；且所述至少一种ROS1融合基因选自：CD74外显子6-ROS1外显子34、CD74外显子6-ROS1外显子32、EZR外显子10-ROS1外显子34、TPM3外显子8-ROS1外显子35、SDC4外显子4-ROS1外显子32、SDC4外显子2-ROS1外显子32、SDC4外显子2-ROS1外显子34、SDC4外显子4-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子35和LRIG3外显子16-ROS1外显子35，其呈任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种引物组和探针，其扩增和检测多于2种ALK融合基因、多于2种RET融合基因和/或多于2种ROS1融合基因。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种引物组和探针，其扩增和检测EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、CD74外显子6-ROS1外显子34和EZR外显子10-ROS1外显子34。
在一些实施方案中，所述至少一种ALK融合基因包括：EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20；所述至少一种RET融合基因包括：KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12；且所述至少一种ROS1融合基因包括：CD74外显子6-ROS1外显子34、CD74外显子6-ROS1外显子32、EZR外显子10-ROS1外显子34、TPM3外显子8-ROS1外显子35、SDC4外显子4-ROS1外显子32、SDC4外显子2-ROS1外显子34、SDC4外显子2-ROS1外显子32、SDC4外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子13-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子35和LRIG3外显子16-ROS1外显子35。也就是说，所述测定组合物包括用于扩增和检测所有列出的融合基因的引物组和探针。
在一些实施方案中，对于用于扩增至少一种ALK融合基因的引物组，所述正向引物和反向引物具有分别选自SEQ ID NO:1-50，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，对于用于检测至少一种ALK融合基因的探针，探针序列选自SEQ ID NO:182-186。所述正向和反向引物序列和探针序列可以以任何适当的组合一起使用，以检测呈任何组合的任何1、2、3、4、5、6或7种ALK融合变体。在一些实施方案中，对于用于扩增至少一种RET融合基因的引物组，所述正向引物和反向引物具有分别选自SEQ ID NO:83-145和187，以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，对于用于检测至少一种RET融合基因的探针，所述探针序列选自：189-194。所述正向和反向引物序列和探针序列可以以任何组合一起使用，以检测呈任何组合的任何1、2、3、4、5或6种RET融合变体。在一些实施方案中，对于用于检测至少一种ROS1融合基因的引物组，所述正向引物和反向引物具有分别选自SEQ IDNO:195-212以及SEQ ID NO:213-226的序列。在一些实施方案中，对于用于检测至少一种ROS1融合基因的探针，所述探针序列选自：227-230和51。所述正向和反向引物序列和探针序列可以以任何组合一起使用，以检测呈任何组合的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种ROS1融合变体。
在一些实施方案中，检测内部对照的标记探针上的标记物不同于检测融合基因的标记探针上的标记物。在一些实施方案中，所有标记探针上的标记物彼此不同。在一些实施方案中，单一标记的探针用于检测所有至少一种ALK融合基因。在一些实施方案中，单一标记的探针用于检测所有至少一种RET融合基因。在一些实施方案中，单一标记的探针用于检测所有至少一种ROS1融合基因。在一些实施方案中，所述标记探针连接到至少一种引物组中的引物。在一些实施方案中，所述标记探针与所述引物组分开。
在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种ALK融合基因的情况下，扩增ALK融合基因的所有引物组都包括单一共同引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种ALK融合基因的情况下，所述引物组包括独特的引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种RET融合基因的情况下，扩增RET融合基因的所有引物组都包括单一共同引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种RET融合基因的情况下，所述引物组包括独特的引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种ROS1融合基因的情况下，扩增ROS1融合基因的所有引物组都包括单一共同引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种ROS1融合基因的情况下，所述引物组包括独特的引物。
本文进一步提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(C)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。本文还提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(B)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。在一些实施方案中，在分开的多重测定中扩增和检测至少一种ROS1融合基因。在一些实施方案中，所述至少一种ALK融合基因选自：EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20；且所述至少一种RET融合基因选自：KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12，其呈任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种ROS1融合基因选自：CD74外显子6-ROS1外显子34、CD74外显子6-ROS1外显子32、EZR外显子10-ROS1外显子34、TPM3外显子8-ROS1外显子35、SDC4外显子2-ROS1外显子34、SDC4外显子4-ROS1外显子32、SDC4外显子2-ROS1外显子32、SDC4外显子4-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子35和LRIG3外显子16-ROS1外显子35。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种引物组和探针，其扩增和检测多于2种ALK融合基因和多于2种RET融合基因。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种引物组和探针，其扩增和检测EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12和KIF5B外显子22-RET外显子12。
在一些实施方案中，所述至少一种ALK融合基因包括：EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20；且所述至少一种RET融合基因包括：KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12。
在一些实施方案中，检测内部对照的标记探针上的标记物不同于检测融合基因的标记探针上的标记物。在一些实施方案中，所有标记探针上的标记物彼此不同。在一些实施方案中，单一标记的探针用于检测所有至少一种ALK融合基因。在一些实施方案中，单一标记的探针用于检测所有至少一种RET融合基因。在一些实施方案中，所述标记探针连接到至少一种引物组中的引物。在一些实施方案中，所述标记探针与所述引物组分开。
在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种ALK融合基因的情况下，扩增ALK融合基因的所有引物组都包括单一共同引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种ALK融合基因的情况下，所述引物组包括独特的引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种RET融合基因的情况下，扩增RET融合基因的所有引物组都包括单一共同引物。在一些实施方案中，在扩增和检测多于一种RET融合基因的情况下，所述引物组包括独特的引物。
可以用于本文公开的测定的内部对照的实例包括但不限于SDHA(琥珀酸脱氢酶)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、NONO、PGK(磷酸甘油酸激酶1)、PPIH、HPRT1、β-肌动蛋白、GADPH、ACTB和16S rRNA。
在一些实施方案中，组合物进一步包含DNA聚合酶，例如热稳定DNA聚合酶，例如Taq或Taq衍生物。在一些实施方案中，组合物进一步包含逆转录酶。在一些实施方案中，组合物进一步包含dNTP。在一些实施方案中，组合物进一步包含顺应通过DNA聚合酶和逆转录酶进行聚合作用的缓冲液。
在一些实施方案中，组合物进一步包含来自个体或个体组的生物样品。在一些实施方案中，个体已被诊断患有癌症，例如肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌、肺腺癌)、膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，样品是富集或分离的核酸，例如DNA或RNA。在一些实施方案中，样品是例如从血液(例如，血清、血浆或其他血液级分)、支气管肺泡灌洗或组织活检中分离的RNA。在一些实施方案中，生物样品包括100 nM或更少的包含融合基因的多核苷酸，例如0.01-100 nM、0.01-25 nM、0.01-5 nM、0.02-0.5 nM或0.02-0.1 nM。
进一步提供了治疗个体(例如，被诊断患有癌症的个体)的方法，其包括：使来自所述个体的生物样品与本文所述的任何多重测定组合物(例如，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；(C)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ROS1融合基因；和(D)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照)接触；在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；如果检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因；且如果存在至少一种融合基因，则治疗所述个体。进一步提供了治疗个体(例如，被诊断患有癌症的个体)的方法，其包括：使来自所述个体的生物样品与本文所述的任何多重测定组合物(例如，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(C)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照)接触；在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；如果检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因；且如果存在至少一种融合基因，则治疗所述个体。进一步提供了治疗个体(例如，被诊断患有癌症的个体)的方法，其包括：使来自所述个体的生物样品与本文所述的任何多重测定组合物(例如，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(B)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照)接触；在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；如果检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因；且如果存在至少一种融合基因，则治疗所述个体。
在一些实施方案中，所述治疗使用激酶抑制剂，例如选择性激酶抑制剂，诸如艾乐替尼(alectinib)、克里唑蒂尼、色瑞替尼、劳拉替尼、布加替尼、卡博替尼、阿帕替尼、凡德他尼、普纳替尼、乐伐替尼、DS6051b，或其变体或组合。在一些实施方案中，治疗的过程包括放射疗法或化学疗法(例如，顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛)。在一些实施方案中，所述治疗使用GSK1838705A、TAE-684、CEP-14083、AP26113、NMS-E628、索拉非尼、凡德他尼、莫他沙尼、舒尼替尼和XL-184 (参见，例如，Mologni (2011) Curr. Med. Chem. 18:162)。
在一些实施方案中，在整个治疗中监测所述个体，例如以确定融合基因扩增产物的量是增加还是减少，或者是否检测到不同的融合基因。在一些实施方案中，如果融合基因扩增产物的量改变，或者如果检测到不同的融合基因，则改变治疗。例如，如果最初检测到的融合基因的量减少，但癌症正在进展，则可以将治疗改变为更少靶向的例如放射-疗法或化学疗法。如果个体的病况已改善，则可以减少治疗。
在一些实施方案中，所述生物样品包括DNA或RNA，例如分离或纯化的核酸。在一些实施方案中，所述生物样品是来自血液(例如血浆、血清或其他血液级分)的RNA。在一些实施方案中，使用qRT-PCR实施扩增和检测。
在一些实施方案中，所述个体被诊断患有肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌、肺腺癌)、膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾癌或乳腺癌。
进一步提供了用于确定来自个体(例如，被诊断患有癌症的个体)的样品中至少一种融合基因的存在的方法，其包括：使来自所述个体的生物样品与本文所述的任何多重测定组合物(例如，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；(C)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ROS1融合基因；和(D)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照)接触；在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；如果检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因。进一步提供了用于确定来自个体(例如，被诊断患有癌症的个体)的样品中至少一种融合基因的存在的方法，其包括：使来自所述个体的生物样品与本文所述的任何多重测定组合物(例如，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(C)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照)接触；在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；如果检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因。进一步提供了用于确定来自个体(例如，被诊断患有癌症的个体)的样品中至少一种融合基因的存在的方法，其包括：使来自所述个体的生物样品与本文所述的任何多重测定组合物(例如，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(B)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照)接触；在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；如果检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因。
在一些实施方案中，所述生物样品包括DNA或RNA，例如分离或纯化的核酸。在一些实施方案中，所述生物样品是来自血液(例如血浆、血清或其他血液级分)的RNA。在一些实施方案中，使用qRT-PCR实施扩增和检测。
在一些实施方案中，所述个体被诊断患有肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌、肺腺癌)、膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果检测到至少一种融合基因，则确定治疗的过程。在一些实施方案中，所述治疗使用激酶抑制剂，例如选择性激酶抑制剂，诸如艾乐替尼、克里唑蒂尼、色瑞替尼、劳拉替尼、布加替尼、卡博替尼、阿帕替尼、凡德他尼、普纳替尼、乐伐替尼、DS6051b，或其变体或组合。在一些实施方案中，治疗的过程包括放射疗法或化学疗法(例如，顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛)。在一些实施方案中，所述治疗使用GSK1838705A、TAE-684、CEP-14083、AP26113、NMS-E628、索拉非尼、凡德他尼、莫他沙尼、舒尼替尼和XL-184。
附图简述
图1A显示，指出的ALK融合变体(FAM)在50个拷贝/0.1ng WT RNA是可检测的(n = 3)。图1B显示，指出的RET融合变体(HEX)在50个拷贝/0.1ng WT RNA是可检测的(n = 3)。图1C显示，指出的ROS1融合变体(JA270)在50个拷贝/0.1ng WT RNA是可检测的(n = 3)。图1D显示每种输入RNA的内部对照Ct值。
图2显示如本文所述的多重测定中的ALK和RET融合物的检测限值。该测定能够检测在UHR中稀释的25个拷贝的融合转录物。
图3显示代表性ALK融合变体的线性数据。
图4显示代表性RET融合变体的线性数据。
图5显示代表性ROS1融合变体的线性数据。
图6显示代表性ALK融合变体的LOD数据。
图7显示代表性RET融合变体的LOD数据。
图8显示代表性ROS1融合变体的LOD数据。
发明详述
I. 引言
本发明人已发现了检测遗传区域之间的融合物的新型、定量和多重的方法。本公开的方法仅需要少量患者样品，所述患者样品可以非侵入性采集，例如来自血浆的循环游离RNA(cfRNA)。
由于源于肿瘤的循环核酸的量有限，目前的测试需要活检或大量血浆。目前描述的方法允许进行极端灵敏的(低至约~25个拷贝)单管测定，以检测可预测癌症和对疗法的响应的多种基因融合物。本测定可用于鉴定融合变体，以及在治疗和/或进展期间进行监测和监视。
II. 定义
“基因融合物”是通过先前分离的两个染色体位置的连接形成的杂合染色体序列。融合可以在相同染色体(例如中间缺失或染色体倒位)或不同染色体(例如易位)上的基因之间发生。
“融合基因”是通过先前分离的两个基因的连接形成的杂合基因，导致肿瘤基因组中的结构重排和/或变体。融合基因不一定需要包括来自两个基因的编码序列，而是可以包括来自基因之一的非编码序列，例如启动子或3'非翻译区。包含融合基因的基因命名，如“基因1”、“基因2”、“基因A”、“基因B”等，用于区分构成融合物的基因，并且不一定是指基因在融合物中的位置。术语ALK融合物、RET融合物和ROS1融合物是指分别包括ALK、RET和ROS1作为成员的融合基因。
术语“融合位点”、“融合点”、“断点”和类似术语指基因融合物中的点，在此处发现来自一个基因或遗传位置的核苷酸与来自另一个基因或遗传位置的核苷酸相邻。
术语“靶区域”、“靶部分”、“靶片段”和类似术语指待扩增和/或分析的靶核酸序列的区域。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物，并且包括天然存在的(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)、非天然存在的和经修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如单体数目)限制。核酸可以是单链或双链的，并且一般含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他连接。单体通常称为核苷酸。术语“非天然核苷酸”或“经修饰的核苷酸”指含有经修饰的含氮碱基、糖或磷酸基团的核苷酸，或者在其结构中掺入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸、生物素化、胺化、脱氨基、烷基化、苄基化和荧光团-标记的核苷酸。
术语“引物”指在合适的条件下充当通过核酸聚合酶的多核苷酸链合成的起始点的短核酸(寡核苷酸)。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dNTP和/或rNTP、以及一种或多种任选的辅因子，并且在合适的温度下进行。引物通常包括与靶序列至少基本上互补的至少一个至少靶-杂交区域。这个区域的长度通常为约15至约40个核苷酸。“引物对”指正向引物和反向引物(有时称为5'和3'引物)，其与靶序列的相对链互补，并且设计为扩增靶序列。正向引物和反向引物排列在靶序列上彼此的可扩增距离内，例如约10-5000个核苷酸、约25-500个核苷酸或约60-120个核苷酸。“引物组”指一个或多个引物对，或至少一个正向引物和至少一个反向引物的组合。例如，引物组可以包括3个正向引物和1个反向引物，使得可以潜在地产生3种不同的扩增产物。
对于其为融合位点(或断点)的5' (或3')的序列(或基因的一部分)特异性的引物组或引物对指用于扩增不包括融合位点或断点的序列的引物。
如本文使用的，“探针”意指能够选择性地结合特异性预期的靶生物分子的任何分子，例如被探针结合、捕获或杂交的目的核酸序列。探针通常用非天然存在的部分(例如荧光团、发色团、亲和标签(例如链霉抗生物素蛋白或生物素)和/或猝灭剂)标记。
单词“互补”或“互补性”指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T (对于RNA为A-G-U)与序列T-C-A (对于RNA为U-C-A)互补。互补性可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或可以是完全的，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分互补，则它被视为对于靶序列“特异性的”。取决于条件，与靶序列的互补性程度通常对于较短的核酸如引物高于(例如大于80%、90%、95%或更高)较长的序列。
在两个或更多个核酸或者两个或更多个多肽的背景下，术语“相同的”或“同一性百分比”指两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸(当在比较窗口或指定区域上就最大对应性比较且比对时，例如在指定区域上的约60%同一性，例如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中任一者)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法与默认参数测量的，或通过手动比对和目视检查测量的。参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST处的NCBI网站。这些序列然后被说成是“基本上相同的”。通常在最佳比对序列上测定同一性百分比，使得定义适于具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些序列。在本领域中通常使用的算法考虑缺口等。通常，同一性存在于包含长度至少约8-25个氨基酸或核苷酸的序列的区域上，或者长度50-100个氨基酸的区域或核苷酸的区域上，或者参考序列的整个长度上。
术语“等位基因”指基因的序列变体。一个或多个遗传差异可构成等位基因。
术语“试剂盒”指任何制造品(例如包装或容器)，其包括至少一种试剂例如核酸探针或探针库等，其用于特异性扩增、捕获、加标签/转换或检测RNA或DNA，如本文所述。
术语“扩增条件”指允许引物的杂交和模板依赖性延伸的核酸扩增反应(例如PCR扩增)中的条件。术语“扩增子”或“扩增产物”指核酸分子，其含有靶核酸序列的全部或片段，并且通过任何合适的扩增方法作为体外扩增产物形成。给定扩增子的边界通常由用于扩增的正向和反向引物的互补部分的位置定义。合适的PCR条件描述在PCR Strategies(Innis 等人，1995, Academic Press, San Diego, CA) 第14章；PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis等人，Academic Press, NY, 1990)中。
术语“热稳定核酸聚合酶”或“热稳定聚合酶”指这样的聚合酶，当与例如来自大肠杆菌(E. coli)的聚合酶相比较时，所述聚合酶在升高的温度下是相对稳定的。热稳定聚合酶适合于在聚合酶链式反应(“PCR”)典型的温度循环条件下使用。示例性热稳定聚合酶包括来自下述的那些：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、栖热菌属物种(Thermus sp.) Z05(参见例如美国专利号5,674,738)和栖热菌属物种Z05聚合酶的突变体、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌属物种sps17、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、热温泉家族(Hot Spring family) B /克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、及其修饰形式。
术语“样品”或“生物样品”指含有或推测含有来自个体的核酸的任何组合物。该术语包括细胞、组织或血液的纯化或分离的组分，例如DNA、RNA、蛋白质、无细胞部分或细胞裂解产物。在一些实施方案中，对从血液分离的血浆样品进行分析；术语“在患者的血液中检测到”和“在患者的血浆中检测到”可互换使用，以意指从患者获得血液，并由其衍生的血浆用于分析。样品也可以指其他类型的生物样品，例如皮肤、血浆、血清、全血和血液组分(例如，血小板、血沉棕黄层)、唾液、尿、眼泪、精液、阴道液、组织活检及其他流体和组织，包括石蜡包埋组织。样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物(包括细胞系)的组成成分和组分。
“对照”样品或值是指充当用于与测试样品或测试条件比较的参考(通常为已知的参考)的样品。例如，测试样品可以从测试条件(例如怀疑患有癌症的个体)获取，并且与来自已知条件(例如无癌个体(阴性对照)或已知患有癌症和/或特定基因异常的个体(阳性对照))的样品进行比较。在本公开的背景下，阴性对照的实例可以是来自已知健康(非癌症、非突变的)个体的生物样品，并且阳性对照的实例可以是来自已知具有特定基因融合物的患者或细胞系的生物样品。对照也可以表示从多个测试或结果收集的平均值或范围。对照也可以对于反应条件进行制备。例如，关于核酸存在的阳性对照可以包括检测已知存在于样品中的序列的引物或探针，而阴性对照将不含核酸。本领域技术人员将认识到对照可以设计用于评价任何数目的参数。例如，对照可以设计为基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施比较治疗益处(例如益处和/或副作用的比较)。对照可以设计用于体外应用。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于测定数据的显著性也是有价值的。例如，如果关于给定参数的值在对照中是广泛变化的，则测试样品中的变化不被视为显著的。
“内部对照”(IC)是指预期存在于样品中的核酸，诸如在样品间以相当标准的水平表达或存在的持家基因。内部对照可用于将样品中核酸的量和质量与其他样品中核酸的量和质量标准化，并确保扩增和检测反应发挥功能。内部对照的实例包括SDH (琥珀酸脱氢酶)、LDHA (乳酸脱氢酶A)、NONO、PGK (磷酸甘油酸激酶1)、PPIH、HPRT1、β-肌动蛋白、GADPH、ACTB和16S rRNA。
术语“诊断”指受试者患有病症例如癌症或某些类型的癌症(例如起因于基因融合物)的相对概率。类似地，术语“预后”指某一未来结果可能在受试者中发生的相对概率。例如，在本公开的背景下，诊断可以指癌症的分类或个体将响应特定疗法的可能性。该术语不预期是绝对的，如医学诊断领域中的任何技术人员应了解的。
术语“对疗法的响应”、“对治疗的响应”、“改善”和类似术语指症状严重性的任何降低。在治疗癌症的情况下，治疗可以指例如减少肿瘤大小、癌细胞数目、生长速率、转移活性、减少非癌细胞的细胞死亡、减少恶心及其他化学疗法或放射疗法副作用等。术语“治疗”和“预防”不预期是绝对术语。治疗和预防可以指发作中的任何延迟、症状改善、患者存活中的改善、存活时间或存活率中的增加等。治疗和预防可以是完全的(不可检测水平的癌细胞)或部分的，使得在患者中发现的癌细胞比没有治疗的情况下出现的少。治疗效应可以与未接受治疗的个体或个体库(例如具有相同基因融合物的个体)进行比较，或者与在治疗前或在治疗期间的不同时间的相同患者进行比较。在一些方面，例如与施用前的个体或未经历治疗的对照个体相比较，疾病的严重性降低至少10%。在一些方面，疾病的严重性降低至少25%、50%、75%、80%或90%，或在一些情况下，使用标准诊断技术不再可检测。
关于患者，术语“治疗”和“施用”包括向患者推荐、提供或开具具体治疗，并且不限于直接地、物理地治疗患者。
术语“阈值循环”或“Ct”是相对浓度的度量，并且通常用于实时PCR (也称为qPCR)中。Ct指扩增曲线与阈值线的交点。阈值线通常设置在可以检测到高于背景的信号时，或者当扩增反应进入指数期时的点处。Ct可以受靶的浓度和扩增条件的影响，例如条件对可检测标记物和扩增效率的作用。更高的Ct对应于达到阈值的更长时间，无论它是由于低靶浓度还是无效扩增。
术语“个体”、“受试者”、“患者”和类似术语可互换使用并指人，除非另有说明。其他哺乳动物可以被视为受试者，例如非人灵长类动物、以及兔、大鼠、小鼠、狗、猫和其他哺乳动物物种。该术语不一定指示受试者已被诊断患有特定疾病，但通常指处于医疗监督下的个体。患者可以寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等。患者可以包括未接受治疗、目前接受治疗、已进行手术的个体以及已中断治疗的个体。
术语“标记物”、“标签”、“可检测部分”和类似术语指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(例如32P、3H)、电子致密试剂或基于亲和性的部分，例如用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“链霉抗生物素蛋白标签”。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。参见例如Pfaffl, Methods: The ongoing evolution of qPCR，第50卷(2010)；van Pelt-Verkuil等人，Principles and Technical Aspects of PCRAmplification, Springer(2010)；Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULARBIOLOGY, Elsevier(第4版2007)；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING, A LABORATORYMANUAL, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个/一种”预期意指“一个或多个/一种或多种”。当在步骤或元件描述之前时，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，预期意指进一步的步骤或元件的添加是任选的并且不被排除。
III. 融合基因
许多癌症相关的融合基因是已知的，并且出现在各种各样的癌症中。实例包括肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌、肺腺癌)、膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾癌和乳腺癌。癌症相关的融合基因通常发生在其中融合物的一个成员是涉及促生长信号传导途径的激酶，而另一个成员有助于升高或组成性表达或信号传导的情况下。ALK、RET和ROS1的融合物就是这种情况。ALK的常见融合配偶体是EML4和KIF5B。RET的常见融合配偶体是KIF5B、CCDC6和NCOA4。已知几种基因与ROS1融合，包括CD74、EZR、TPM3、SDC4、SLC34A2和LRIG3 (参见，例如，Yoshihara等人. (2015) Oncogene 34:4845)。
本组合物和方法着重于设计多重测定以检测ALK、RET和ROS1融合物。对于癌症患者，侵入性活检或过度血液采集经常是不可行的。本组合物和方法允许用来自患者的相对小的样品检测几种可起作用的基因融合物，所述样品可以是非侵入性血浆样品。
这些高度多重测定的设计可以不同。例如，在检测多种ALK融合物的情况下，可以使用与ALK基因中在融合点附近的序列杂交的通用引物和探针，以及对各种融合配偶体特异性的引物。因此，例如，如果检测5种不同的ALK融合物，则所述测定可以包括15种寡核苷酸(10种引物和5种探针)或7种寡核苷酸(1种共同引物、1种共同探针和5种特异性引物)。
在一些实施方案中，所述多重测定在单一扩增和检测反应中检测2、3、4、5、6或7种ALK融合物和2、3、4、5或6种RET融合物。在一些实施方案中，所述多重测定同一反应中进一步检测2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种ROS1融合物。在一些实施方案中，在分开的扩增和检测反应中检测ROS1融合物。在一些实施方案中，所述扩增和检测反应进一步包括内部对照(例如，持家基因)。
ALK，RET和ROS1融合物的存在表明癌症患者将对选择性激酶抑制剂响应。这些包括艾乐替尼、克里唑蒂尼、色瑞替尼、劳拉替尼、布加替尼、卡博替尼、阿帕替尼、凡德他尼、普纳替尼、乐伐替尼、DS6051b，及其变体或组合。可以在整个治疗中监测患者的融合物状态，以确定是否可以改变治疗方法，例如改变为不同的激酶抑制剂或更标准的化学疗法或放射疗法。
IV. 样品的制备
用于测试基因融合物的样品可以从任何来源获得，但有利地以非侵入性方式例如从血液或血液级分(例如，血浆、血清、血小板等)中获得。用于本文方法的样品也可以取自尿、支气管肺泡灌洗或组织活检。用于从生物样品中分离核酸的方法是已知的，例如如Sambrook中所述，并且几种试剂盒是商购可得的(例如来自Roche的High Pure RNA Isolation Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit和MagNA Pure LC Total Nucleic Acid IsolationKit)。
在一些实施方案中，制备DNA，并且用作本文公开的扩增和检测方法的模板。在一些实施方案中，制备RNA。当RNA用作通过PCR扩增的模板时，需要逆转录步骤以制备cDNA。DNA聚合酶例如Taq或另一种热稳定聚合酶然后可以用于实施扩增。
在一些实施方案中，样品是从血浆中分离的RNA。取决于患者的状况，可以获得约1-10 mL的血浆用于测试(通常为约2 mL)。用于分离循环游离RNA的试剂盒是商购可得的，例如来自Norgen Biotek Corp或Qiagen。
如实施例中所示，目前公开的样品制备和用定制的靶标特异性寡核苷酸进行扩增/检测的方法是异常敏感的，并且可用于检测野生型RNA背景中1:4000稀释的样品中的少至约50个(并且在一些情况下约20个)拷贝的基因融合突变。这允许在其中靶序列非常罕见的样品(例如，循环无细胞RNA (cfRNA))中检测融合变体。血浆中的RNA和DNA的不同背景不会减损检测的特异性，甚至在低拷贝数的情况下。
V. 扩增和检测
核酸扩增可以使用任何引物依赖性方法进行。在一些实施方案中，扩增是定量的，使得给定扩增靶的相对丰度或实际丰度可以通过扩增产物的量来测定。
基于DNA的方法可以用于本文公开的扩增和检测方法，例如PCR。在一些实施方案中，使用实时或定量PCR (RTPCR或qPCR)。qPCR允许在PCR过程的每个循环期间生成的产物的可靠检测和测量。此类技术是本领域众所周知的，并且试剂盒和试剂是商购可得的，例如来自Roche Molecular Systems、Life Technologies、Bio-Rad等。参见例如Pfaffl(2010)，Methods: The ongoing evolution of qPCR第50卷。在一些实施方案中，扩增和检测在用猝灭剂和荧光团标记的双重标记的探针(例如TaqMan、CPT，LNA或MGB探针)的存在下进行(参见例如Gasparic等人(2010)，Anal. Bioanal. Chem. 396:2023)。
在一些实施方案中，进行初步逆转录步骤(也称为RT-PCR，不与实时PCR混淆)。参见例如Hierro等人(2006)，72:7148。如本文使用的，术语“qRT-PCR”指逆转录，随后为定量PCR。两种反应均可以在单个管中进行而不中断，例如以添加试剂。
还可以使用基于RNA的扩增方法，例如转录介导的扩增(TMA)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。参见例如Fakruddin等人(2013)，J Pharm Bioallied Sci. 5:245；vanDeursen等人(1999)，Nucl. Acids Res. 27:e15；Kamisango等人(1999)，J Clin. Microbiol. 37:310。
本测定中使用的一些寡核苷酸(引物和探针)包括烷基碱基修饰以增强选择性扩增，尤其是在多重形式中。
探针或者引物对中的一个或两个引物可以用直接或间接发射或生成可检测信号的任何物质或组分进行标记。在一些实施方案中，标记物是荧光团(染料)，其中许多在文献中报道并且是本领域技术人员已知的，并且其中许多是商购可得的。荧光团在例如Cardullo等人(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790；Hochstrasser等人(1992)，Biophysical Chemistry 45: 133；Selvin(1995)，Methods in Enzymology 246:300；Steinberg, Ann. Rev. Biochem., 40: 83- 114(1971)；和Wang等人，Anal. Chem.67: 1197-1203(1995)中描述。
下述是可以用作标记物的荧光团的实例：4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸根合茋-2,2'-二磺酸；吖啶；异硫氰酸吖啶；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸盐 N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄；香豆素；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)/7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆满151)；花青染料；四氯四溴荧光素(cyanosine) 4',6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5''-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸根合二氢茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸根合茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红；曙红异硫氰酸酯；赤藓红B；赤藓红异硫氰酸酯；乙锭；5-羧基荧光素(FAM)；5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)；2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)；荧光素；异硫氰酸荧光素；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；藻红蛋白(包括但不限于B和R型)；邻苯二甲醛；芘；芘丁酸酯；琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；量子点；活性红4(Cibacron亮红3B-A)；6-羧基-X-罗丹明(ROX)；6-羧基罗丹明(R6G)；丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明；罗丹明B；罗丹明123；罗丹明X异硫氰酸酯；磺酰罗丹明B；磺酰罗丹明101；磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸；和镧系元素螯合衍生物。
所列出的荧光团(染料)中的任一者都可以用于本文所述的测定中，以如本文所述的标记核酸。荧光团可以通过常规共价键合，使用在荧光团和/核酸上的适当官能团进行连接。
如上文注意到的，双重标记的探针可以用于检测。双重标记的探针可以包含荧光团，例如上文列出的荧光团中的任一者，和猝灭剂。合适的猝灭剂包括但不限于DDQ-I、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和BHQ-3。对于具有在500和550 nm之间的发射最大值的荧光团(例如FAM、TET和HEX)，可以选择具有在450和500 nm之间的吸收最大值的猝灭剂(例如dabcyl或BHQ-1)。对于具有高于550 nm的发射最大值的荧光团(例如罗丹明和Cy染料)，可以选择具有高于550 nm的吸收最大值的猝灭剂(例如BHQ-2)。关于选择染料-猝灭剂对中的考虑，参见例如Johansson(2003)，Meth. Mol. Biol. 335:17。
检测装置是本领域已知的，并且可以对于所选标记物而适当选择。适合于定量PCR的检测装置包括cobas®和Light Cycler®系统(Roche)、PRISM 7000和7300实时PCR系统(Applied Biosystems)等。
VI. 试剂盒
在一些实施方案中，用于实施本文公开的方法的试剂和材料包括在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒包括用于获得、贮存和/或制备样品的组分。这些组分包括例如无菌针和注射器、EDTA内衬管、缓冲液(例如用于使核酸结合至基质和从基质洗脱)、RNA酶抑制剂和/或DNA酶等。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增ALK融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:1-50，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测ALK融合变体的探针，其具有选自SEQ ID NO:182-186的序列。所述正向和反向引物序列和探针序列可以以任何适当的组合一起使用，以检测呈任何组合的任何1、2、3、4、5、6或7种ALK融合变体。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增RET融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:83-145和187，以及SEQ IDNO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测RET融合变体的探针，其具有选自:189-194的序列。所述正向和反向引物序列和探针序列可以以任何组合一起使用，以检测呈任何组合的任何1、2、3、4、5或6种RET融合变体。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增ROS1融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:195-212以及SEQ ID NO:213-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测ROS1融合变体的探针，其具有选自:227-230和51的序列。所述正向和反向引物序列和探针序列可以以任何组合一起使用，以检测呈任何组合的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种ROS1融合变体。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增EML外显子13-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:1-10，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增EML外显子20-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:11-20，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增EML外显子6-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:21-30，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。所述试剂盒包括用于扩增EML外显子2-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:31-35，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增EML外显子18-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:36-40，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增KIF外显子24-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:41-45，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增KIF外显子17-ALK外显子20融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:46-50，以及SEQ ID NO:52-61和181的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测ALK融合物的探针，其具有选自SEQ ID NO:182-186的序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增KIF外显子15-RET外显子12融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:83-97以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增KIF外显子16-RET外显子12融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:98-107以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增KIF外显子22-RET外显子12融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:108-117以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增KIF外显子23-RET外显子12融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:118-127和187，以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增CCDC外显子1-RET外显子12融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:128-135和118，以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增NCO外显子6-RET外显子12融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:136-145以及SEQ ID NO:161-180的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测RET融合物的探针，其具有选自SEQ ID NO:189-194的序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增CD74外显子6-ROS1外显子34融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:195-197以及SEQ ID NO:222-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增CD74外显子6-ROS1外显子32融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:195-197以及SEQ ID NO:213-215的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增EZR外显子10-ROS1外显子34融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:208以及SEQ ID NO:222-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增TPM3外显子8-ROS1外显子35融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:211-212以及SEQ ID NO:216-221的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SDC4外显子4-ROS1外显子34融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:200-202以及SEQ ID NO:222-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SDC4外显子2-ROS1外显子32融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:198-199以及SEQ ID NO:213-215的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SDC4外显子2-ROS1外显子34融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:198-199以及SEQ ID NO:222-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SDC4外显子4-ROS1外显子32融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:200-202以及SEQ ID NO:213-215的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SLC34A2外显子13-ROS1外显子34融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:203-205以及SEQ ID NO:222-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SLC34A2外显子13-ROS1外显子32融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:203-205以及SEQ ID NO:213-215的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SLC34A2外显子4-ROS1外显子32融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:206-207以及SEQ ID NO:213-215的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增SLC34A2外显子4-ROS1外显子34融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:206-207以及SEQ ID NO:222-226的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增LRIG3外显子16-ROS1外显子35融合变体的正向引物和反向引物，其具有分别选自SEQ ID NO:209-210以及SEQ ID NO:216-221的序列。
在一些实施方案中，引物组各自包装在分开的管中，例如以待由使用者决定的比率加入。在一些实施方案中，将一个或多个或全部引物组以预定比率包装在单个管中。
所述试剂盒还可以包括酶，例如逆转录酶和/或DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶是能够在热循环条件下扩增的热稳定DNA聚合酶，例如Taq或Taq衍生物。在一些实施方案中，试剂盒包括dNTP。在一些实施方案中，试剂盒包括有助于通过所选择的聚合酶的聚合/扩增的缓冲液。
在一些实施方案中，试剂盒包括对照，例如在待检测的基因融合物处是野生型(即，无基因融合物)的多核苷酸，或包括待检测的基因融合物的多核苷酸。
试剂盒还可以包括消耗品，例如样品管或小瓶；反应容器(例如管、多孔板、微流体芯片或室等)，以及使用或参考网站的说明书。
VII. 实施例
A. 实施例1：用于检测ALK、RET和ROS1融合组的多重测定
在本实施例中，我们测试多重、定量RT-PCR方法来检测ALK、RET和ROS1融合物(ALK/RET/ROS1组)。在单管(或容器、孔、室、隔间)测定中使用四组不同的引物和探针，以减少获得可测量的、可靠的结果所需的样品量。这四组对应于(i) ALK (用一种或多种用第一标记物标记的探针检测)，(ii) RET (用一种或多种用第二标记物标记的探针检测)，(iii)ROS1 (用一种或多种用第三标记物标记的探针检测)，和(iv)内部对照(用以第四标记物标记的探针检测)。所述标记物可以选自本文公开的那些，并且在一些实施方案中，可彼此区分。在本实施例中，ALK融合物用FAM标记的探针检测，RET融合物用HEX标记的探针检测，ROS1融合物用JA270标记的探针检测，且内部对照用Cy5.5标记的探针检测。
高度多重测定的覆盖范围显示于表1中，其中在括号中指示融合变体编号。
表1
Figure 876629DEST_PATH_IMAGE001
所述“多重”可以包括各种基因融合物检测组合，并且在一些实施方案中，测定和检测更少的融合物。用于检测ALK和RET融合物的测定形式的一个实施例显示于表2中。ROS1中的融合物可以分开检测或在平行测定中检测，例如，如表3中所示。
表2
Figure 793769DEST_PATH_IMAGE002
表3
Figure 573507DEST_PATH_IMAGE003
可以选择表4-6中显示的寡核苷酸用于测定中。第一组正向和反向引物跨越EML4-ALK和KIF5B-ALK融合物扩增。所述引物用基因名称(例如，用于EML4的EML)，外显子(例如，用于外显子13的13)和名称(例如用于正向1的F1)指定。符号<t_bb_dA>、<t_bb_dC>、<t_bb_dT>、<t_bb_dG>分别指对叔丁基苄基修饰的A、C、T和G。正向和反向引物可以单对使用或以任何组合使用以扩增不同的融合产物，如本领域技术人员将理解的。在本实施例中，使反应中的寡核苷酸的数量最小化，如表1-3中所示。所有反应中的反向引物都充当用于逆转录酶反应的引物。
表4：用于扩增和检测ALK融合物的寡核苷酸
Figure 781765DEST_PATH_IMAGE004
Figure 658454DEST_PATH_IMAGE005
表5：用于扩增和检测RET融合物的寡核苷酸
Figure 560999DEST_PATH_IMAGE007
Figure 759900DEST_PATH_IMAGE008
Figure 484459DEST_PATH_IMAGE010
表6：用于扩增和检测ROS1融合物的寡核苷酸
Figure 238788DEST_PATH_IMAGE011
Figure 312235DEST_PATH_IMAGE013
我们已经使用来自Horizon Discovery的EML4-ALK阳性细胞系NCI-H2228和EML4-ALK融合变体1细胞系、CCDC6-RET细胞系LC2AD以及来自NSCLC福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)和血浆样本的RNA测试该方法。
在血浆的情况下，我们使用具有MagNA Pure裂解缓冲液和Esperase酶的RocheHigh Pure FFPET RNA提取试剂盒提取cfRNA。因为cfRNA的产量太低而无法精确测量，所以我们将固定体积(总体积的1/24)的提取的血浆cfRNA输入qRT-PCR。
反应条件如下。对于每个反应，将25 uL输入RNA添加至包含正向和反向引物、标记探针、缓冲液、dUTP、dTTP、dATP、dGTP、UNG和Z05酶的RT-PCR反应混合物中，至50 uL的最终体积。反应以多重运行，其各自具有对每种融合变体特异性的引物和探针，如表1中所示。
使用下一代测序测定法证实结果，所述下一代测序测定法检测qRT-PCR测定中涵盖的融合变体。
最大Ct (阈值循环)被设置为38，这意味着必须在38的Ct内检测到高于背景的信号。数据显示于图1A、1B、1C和1D中。已知每个反应的输入RNA具有所示的融合变体。每个反应重复三次。
图1A显示每种ALK融合变体在50个拷贝是可检测到的。图1B显示每种RET融合变体在50个拷贝是可检测到的。图1C显示每种ROS1融合变体在50个拷贝是可检测到的。图1D显示，反应效率和输入量是相等的，如内部对照Ct所示。
B. 实施例2：滴定的转录物中的ALK和RET融合物的灵敏度
我们测试多重qRT-PCR对于实施例1、表1中显示的ALK和RET融合变体的检测限值。我们通过将ALK或RET融合物阳性转录物以250、100、50或25个拷贝滴定至0.1 ng通用人RNA(UHR)中来测试多重测定。扩增和检测反应重复3次。
如图2中所示，测试的所有ALK和RET融合变体在低至25个拷贝都可检测到。
C. 实施例3：线性研究和另外的检测限值(LOD)研究
实施另外的研究以确定ALK、RET和ROS1融合物的检测线性，如图3-5中所显示和描述。
灵敏度或检测限值(LOD)研究显示和描述于图6-8中。每种测定的LOD显示于表7和8中。所有7种ALK、6种RET和13种ROS1融合变体在低至少于10个拷贝都可检测到。主要的融合变体用*标记。
表7
融合物 命中率 95%概率的LOD
E13:A20* 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
E20:A20* 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
E6:A20* 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
E2:A20 11/12，在6.25个拷贝 6.45个拷贝
K17:A20 12/12，在6.25个拷贝(11/12，在12.5个拷贝) 4.78个拷贝
K24:A20 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
E18:A20 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
K15:R12* 11/12，在6.25个拷贝 6.45个拷贝
K16:R12* 11/12，在6.25个拷贝 6.45个拷贝
K22:R12 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
K23:R12 11/12，在6.25个拷贝 6.45个拷贝
C1:R12* 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
N6:R12 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
表8
融合变体 命中率 95%概率的LOD
C6:R32 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
C6:R34* 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
SD2:R32 11/12，在6.25和12.5个拷贝 11.07个拷贝
SD4:R34 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
SL13:R32 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
SL13:R34 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
SL4:R32 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
SL4:R34 11/12，在6.25个拷贝 6.45个拷贝
E10:R34* 11/12，在6.25个拷贝 6.45个拷贝
L16:R35 11/12，在12.5个拷贝；12/12，在6.25个拷贝 4.78个拷贝
T8:R35 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝
SD2:R34 12/12，所有测试水平 <6.25个拷贝

Claims (31)

1.多重测定组合物，其包含：
A. 至少一种引物组和探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；
B. 至少一种引物组和探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；
C. 至少一种引物组和探针，其特异性扩增和检测至少一种ROS1融合基因；和
D. 引物组和探针，其特异性扩增和检测内部对照。
2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种ALK融合基因选自：EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20。
3.权利要求1或2的组合物，其中A包括至少一种引物组和探针，其扩增和检测多于2种ALK融合基因。
4.前述权利要求中任一项的组合物，其中A包括至少一种引物组和探针，其扩增和检测EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20。
5.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种RET融合基因选自：KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其中B包括至少一种引物组和探针，其扩增和检测多于2种RET融合基因。
7.前述权利要求中任一项的组合物，其中B包括至少一种引物组和探针，其扩增和检测KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12。
8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种ROS1融合基因选自：CD74外显子6-ROS1外显子34、CD74外显子6-ROS1外显子32、EZR外显子10-ROS1外显子34、TPM3外显子8-ROS1外显子35、SDC4外显子4-ROS1外显子34、SDC4外显子2-ROS1外显子34、SDC4外显子2-ROS1外显子32、SDC4外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子13-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子32v2、SLC34A2外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子35和LRIG3外显子16-ROS1外显子35。
9.前述权利要求中任一项的组合物，其中C包括至少一种引物组和探针，其扩增和检测多于2种ROS1融合基因。
10.前述权利要求中任一项的组合物，其中C包括至少一种引物组和探针，其扩增和检测CD74外显子6-ROS1外显子34、CD74外显子6-ROS1外显子32、EZR外显子10-ROS1外显子34、TPM3外显子8-ROS1外显子35、SDC4外显子4-ROS1外显子34、SDC4外显子2-ROS1外显子32v2、SDC4外显子2-ROS1外显子32、SLC34A2外显子13-ROS1外显子34、SLC34A2外显子13-ROS1外显子32v2、SLC34A2外显子4-ROS1外显子32、SLC34A2外显子4-ROS1外显子35和LRIG3外显子16-ROS1外显子35。
11.前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包含热稳定的DNA聚合酶。
12.前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包含逆转录酶。
13.前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包含来自个体的生物样品。
14.权利要求13的组合物，其中所述生物样品包含来自血浆的RNA。
15.多重测定组合物，其包含：
A. 至少一种引物组和探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；
B. 至少一种引物组和探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和
C. 引物组和探针，其特异性扩增和检测内部对照。
16.权利要求15的组合物，其中所述至少一种ALK融合基因选自：EML4外显子13-ALK外显子20、EML4外显子20-ALK外显子20、EML4外显子6a/b-ALK外显子20、EML4外显子2-ALK外显子20、EML4外显子18-ALK外显子20、KIF5B外显子17-ALK外显子20和KIF5B外显子24-ALK外显子20。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述至少一种RET融合基因选自：KIF5B外显子15-RET外显子12、KIF5B外显子16-RET外显子12、KIF5B外显子22-RET外显子12、KIF5B外显子23-RET外显子12、CCDC6外显子1-RET外显子12和NCOA4外显子6-RET外显子12。
18.权利要求15-17中任一项的组合物，其进一步包含热稳定的DNA聚合酶。
19.权利要求15-18中任一项的组合物，其进一步包含逆转录酶。
20.权利要求15-19中任一项的组合物，其进一步包含来自个体的生物样品。
21.权利要求20的组合物，其中所述生物样品包含来自血浆的RNA。
22.鉴定具有癌症的个体的方法，其包括：
A. 使来自所述个体的生物样品与权利要求1-12和15-19中任一项的组合物接触；
B. 在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；
C. 如果在步骤B中检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因；
D. 由此，如果存在至少一种融合基因，则至少一种融合基因在所述个体的样品中的存在表明所述个体对激酶抑制剂疗法的敏感性。
23.确定患有癌症的个体对激酶抑制剂疗法的响应的可能性的方法，其包括：
A. 使来自所述个体的生物样品与权利要求1-12和15-19中任一项的组合物接触；
B. 在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；
C. 如果在步骤B中检测到融合基因，则确定存在至少一种融合基因；和
D. 确定所述个体可能对激酶抑制剂疗法响应。
24.权利要求22或23的方法，其中所述生物样品包括DNA或RNA。
25.权利要求22或23的方法，其中所述生物样品是来自个体的血浆的RNA。
26.权利要求22或23的方法，其中使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)实施所述扩增和检测。
27.权利要求22-26中任一项的方法，其中所述激酶抑制剂疗法选自艾乐替尼、克里唑蒂尼、色瑞替尼、劳拉替尼、布加替尼、卡博替尼、阿帕替尼、凡德他尼、普纳替尼、乐伐替尼、DS6051b，或其变体。
28.用于确定来自患有癌症的个体的生物样品中至少一种融合基因的存在的方法，其包括：
A. 使来自所述个体的生物样品与权利要求1-12和15-19中任一项的组合物接触；
B. 在允许在所述生物样品中存在至少一种融合基因的情况下形成和检测扩增产物的条件下实施扩增和检测；
C. 如果在步骤B中检测到融合基因，则确定至少一种融合基因的存在。
29.权利要求28的方法，其中所述生物样品包括DNA或RNA。
30.权利要求28的方法，其中所述生物样品是来自个体的血浆的RNA。
31.权利要求28的方法，其中使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)实施所述扩增和检测。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018277210B2 (en) 2017-05-31 2024-03-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multiplex PCR detection of ALK, RET, and ROS fusions
CN109837275B (zh) * 2019-01-08 2022-09-06 大连医科大学附属第二医院 一种融合基因阳性对照标准品的制备方法
CN111718994A (zh) * 2019-03-22 2020-09-29 广州金域医学检验中心有限公司 肿瘤融合基因靶向检测探针、试剂盒及应用
CN110964830A (zh) * 2019-12-31 2020-04-07 中山大学达安基因股份有限公司 多重检测ros1基因突变的试剂盒及方法
CN117144016A (zh) * 2023-10-27 2023-12-01 神州医疗科技股份有限公司 一种用于外周血循环肿瘤rna中检测ret融合基因的引物探针、试剂盒及检测系统

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466721A (zh) * 2007-04-13 2009-06-24 细胞信号技术公司 在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶
CN104818320A (zh) * 2014-12-03 2015-08-05 厦门艾德生物医药科技有限公司 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒
CN105102635A (zh) * 2013-03-15 2015-11-25 生命技术公司 肺癌的分类和可行性指数

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5455170A (en) 1986-08-22 1995-10-03 Hoffmann-La Roche Inc. Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05
CA2371818C (en) * 1999-02-18 2009-01-06 The Regents Of The University Of California Salicylamide-lanthanide complexes for use as luminescent markers
JP2004516806A (ja) * 2000-04-05 2004-06-10 モレキュラー ステージング，インコーポレイテッド プライマー伸長法を用いた対立遺伝子識別のためのプロセス
US7385043B1 (en) 2003-04-30 2008-06-10 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Homogeneous multiplex screening assays and kits
DK2447359T3 (en) * 2006-04-14 2016-02-08 Cell Signaling Technology Inc Genetic defects and mutated ALK kinase in human solid tumors
EP2470897A4 (en) * 2009-08-28 2013-05-29 Asuragen Inc MICRO-RNA BIOMARKERS OF PULMONARY DISEASE
US9109259B2 (en) * 2010-06-22 2015-08-18 Japanese Foundation For Cancer Research Detection method for novel ROS1 fusions
EP2599878A4 (en) * 2010-07-26 2014-02-12 Astellas Pharma Inc NEW METHOD FOR DETECTING FUSED BODIES RET
US20130059762A1 (en) * 2011-04-28 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US20130237442A1 (en) * 2012-03-07 2013-09-12 University Of Miami Methods and Compositions for Diagnosis of Non-Viable Early Pregnancy
EP2971104A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Abbott Molecular Inc. Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits
US10072298B2 (en) * 2013-04-17 2018-09-11 Life Technologies Corporation Gene fusions and gene variants associated with cancer
US9914973B2 (en) 2014-03-25 2018-03-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Detection of gene fusions by intragenic differential expression (IDE) using average cycle thresholds
CN106414768B (zh) 2014-03-27 2020-05-29 生命技术公司 与癌症相关的基因融合体和基因变异体
EP3906921A1 (en) 2014-04-25 2021-11-10 Exelixis, Inc. Method of treating lung adenocarcinoma
CN107532209A (zh) 2015-04-17 2018-01-02 豪夫迈·罗氏有限公司 检测基因融合的多重pcr
AU2018277210B2 (en) 2017-05-31 2024-03-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multiplex PCR detection of ALK, RET, and ROS fusions

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466721A (zh) * 2007-04-13 2009-06-24 细胞信号技术公司 在人实体瘤中的基因缺损和突变体alk激酶
CN105102635A (zh) * 2013-03-15 2015-11-25 生命技术公司 肺癌的分类和可行性指数
CN104818320A (zh) * 2014-12-03 2015-08-05 厦门艾德生物医药科技有限公司 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARUJA E LIRA等: "A single-tube multiplexed assay for detecting ALK, ROS1, and RET fusions in lung cancer" *

Also Published As

Publication number Publication date
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