CN109837275B - 一种融合基因阳性对照标准品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种融合基因阳性对照标准品及其制备方法，其通过非融合基因阳性样品扩增融合伴侣基因，并以不对称PCR结合自身退火PCR方法将融合伴侣基因核酸片段连接，获得相应融合基因，巢式PCR和琼脂糖凝胶电泳纯化回收，浓度测定后制备成相应融合基因阳性对照标准品。本发明解决了融合基因核酸序列阳性对照标准品难以获得和人工合成造价高的问题。在临床融合基因检测辅助诊断、治疗和判断预后方面有应用前景。另外，人工合成的融合基因严格控制两侧伴侣基因浓度为1:1，可以作为基因拷贝数分析等定量分析的内对照。本发明制备融合基因阳性对照品具有制作简单、灵活、造价低廉等优点，在临床检测和相关质检等方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合基因标准品及其制备方法。
背景技术
融合基因是由染色体易位、倒位或内部缺失等造成不相邻两个基因的断裂并异常拼接而成。融合基因不仅在淋巴造血系统恶性肿瘤发生和演进中发挥重要作用，越来越多实体肿瘤如：间质结缔组织肿瘤、前列腺癌、肺癌中也发现了融合基因。临床上一些特定融合基因已经被用于诊断、鉴别诊断、指导用药和判断预后的重要指标。因此，肿瘤细胞融合基因检测的临床需求越来越大。目前国内临床融合基因检测的主要方法有免疫组织化学方法，荧光原位杂交(FISH)法，测序法和实时定量反转录PCR(real-time qPCR)法。前三种方法不仅价格昂贵，检测周期长，而且受限于是否有商品化抗体，探针及相应试剂盒等，好多融合基因类型无法筛查。基于实时定量反转录PCR方法衍生的一些融合基因检测方法(如基于高分辨熔解曲线分析的融合基因检测方法、基于探针的实时定量PCR方法、数字PCR等)都具有灵敏度高，检测灵活的特点，有广阔应用前景。无论具体哪种基于实时定量反转录PCR衍生的方法用以检测融合基因，需要融合基因阳性对照标准品。融合基因阳性对照标准品是判断方法准确率、灵敏度、特异度以及不同仪器、不同样品间均一性所必须的。现有所谓融合基因标准品只是市场出售试剂盒中依据自己的检测范围和检测方法配置的检测阳性标准品，这些标准品并非真正的多种类型融合基因的实际序列。而只有融合基因真实碱基序列的核酸片段的阳性标准品才能适合作为多种检测方法的融合基因阳性对照标准品。不同厂家融合基因诊断检测试剂，不同型号荧光定量PCR仪都有各自最佳适用条件和范围，不同类型融合基因表达量的不同对检测试剂灵敏度差异，这些均需要应用通用融合基因标准品对诊断试剂灵敏性、准确性分析，不同厂家试剂平行分析，不同使用仪器的校准分析等。另外在临床医疗过程中，常有一些特殊融合基因需要检测以辅助诊断，配合后期治疗。如果有能够适合多种检测方法、多种类型融合基因阳性对照标准品(即多种融合基因真实碱基序列的核酸片段)，融合基因检测将更加灵活的配合临床需求，为广大患者造福。因此，多种类型融合基因真实碱基序列的核酸片段的融合基因阳性对照标准品的制备有重要临床实际意义和需求。
一般来说，多种融合基因真实碱基序列的核酸片段可以从经测序验证已知融合基因阳性样品提取的核酸获得，也可以人工合成融合基因核酸序列。前者需大量检测后筛选融合基因阳性样品，明确融合基因类型，必然受限于已有样品融合基因类型、样品数量及质量，而后者序列合成需要较高的成本。因此需要一种能够制备融合基因阳性标准品的简单、经济的方法。
另外，一些基因拷贝数变异与临床用药、预后等关系越来越密切，但传统拷贝数变异的检测方法繁琐，难以有效在临床开展使用。实时定量荧光PCR方法能够简单、快速的用于拷贝数检测，但稳定参考基因的选择是困扰该方法应用的主要问题。待测基因与参考基因扩增效率可能存在差异，精确稀释标准品难以获得，不同检测仪器、试剂都会影响定量准确性，从而干扰拷贝数检测。人工合成拷贝数相同的目的基因和参考基因融合基因作为内部对照，用于拷贝数分析能使实时定量荧光PCR方法检测拷贝数变异可行性、准确性大大提高。目前常用将参考基因和待测基因按等比例克隆到质粒中制作内部对照，但这种方法存在成本较高，制作周期长，更换参考基因不灵活等缺点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种融合基因阳性对照标准品的制备方法。本发明设计一种将不同基因接合的PCR扩增方法，可以根据欲制备融合基因序列分别扩增融合伴侣基因，并将其接合，扩增、纯化，从而制备成含有目标基因序列的融合基因标准品。本方法的优点是依据目标基因任意组合，控制核酸序列长度，操作灵活，制备速度快，成本低廉。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种融合基因阳性对照标准品的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取融合伴侣基因有表达样本中的总RNA，通过反转录合成cDNA；
(2)以步骤(1)合成的cDNA为模板，以基因特异引物和基因接合引物为引物，通过不对称PCR分别扩增出融合基因的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因；
(3)将上述步骤(2)中分别扩增得到的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的PCR扩增产物混合，进行自身退火PCR反应，完成上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的接合；
(4)以步骤(3)获得的PCR产物为模板，通过巢式PCR完成融合基因的扩增；
(5)对于步骤(4)得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并回收目的片段。
在上述技术方案中，在所述的步骤(2)中，用于扩增上游融合伴侣基因的基因特异引物和基因接合引物的摩尔浓度比为5-20：1，优选为5-10：1，用于扩增下游融合伴侣基因的基因特异引物和基因接合引物的摩尔浓度比为5-20：1，优选为1-5：10。
在上述技术方案中，在所述的步骤(5)中，经琼脂糖凝胶电泳分离回收得到的目的核苷酸基因片段，依据核苷酸序列计算分子量，测定核苷酸浓度，并换算为摩尔浓度，保存备用。也可以将得到的核苷酸序列构建到质粒中保存备用。
本发明的上述融合基因阳性对照标准品的制备方法中，用于提取总RNA的样本为融合伴侣基因有表达的样本，其意义在于：多种类型融合基因阳性样品难以获得，基于现有技术不能扩增出相应融合基因类型的目的片段，融合基因检测的阳性对照缺乏，根据本发明能够应用无融合基因阳性，但有融合伴侣基因表达的样本，分别扩增伴侣基因，制作出各种类型融合基因阳性对照标准品。
本发明的第二方面，提供一种融合基因阳性对照标准品，该标准品采用上述的融合基因阳性对照标准品的制备方法制备得到，其中，在上述制备方法中的步骤(2)中，所述的基因特异引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1-22，所述的基因接合引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO:23-96；所述的融合基因为EML4(2)-ALK(20)、EML4(3)-ALK(20)、EML4(10)-ALK(20)、EML4(14)-ALK(20)、EML4(15)-ALK(20)、EML4(17)-ALK(20)、EML4(18)-ALK(20)、EML4(20)-ALK(20)、STRN(3)-ALK(20)、TFG(4)-ALK(20)、KLC1(9)-ALK(20)、KLC1(10)-ALK(20)、HIP1(21)-ALK(20)、HIP1(28)-ALK(20)、HIP1(30)-ALK(20)、KIF5B(15)-ALK(20)、KIF5B(17)-ALK(20)、KIF5B(24)-ALK(20)、CD74(6)-ROS1(32)、CD74(6)-ROS1(34)、EZR(10)-ROS1(34)、TPM3(8)-ROS1(35)、LRIG3(16)-ROS1(35)、SLC34A2(4)-ROS1(32)、SLC34A2(13)-ROS1(32)、GOPC(4)-ROS1(36)、SDC4(2)-ROS1(32)、SDC4(2)-ROS1(34)、SDC4(4)-ROS1(32)、CCDC6(11)-RET(12)、KIF5B(15)-RET(12)、KIF5B(16)-RET(12)、KIF5B(22)-RET(12)、KIF5B(23)-RET(12)、KIF5B(15)-RET(11)、KIF5B(24)-RET(11)、CFTR(7)-EGFR(20)。这些融合基因标准品可用于临床上肺癌融合基因的检测。具体地，可用于临床融合基因诊断试剂敏感性，准确率检测，不同厂家试剂平行分析，应用于不同仪器时的校正分析等。
本发明的第三方面，提供一种针对定量检测的融合基因阳性对照标准品，该标准品采用上述的融合基因阳性对照标准品的制备方法制备得到，其中，所述的融合基因为CFTR(7)-EGFR(20)。其中，所述的CFTR(7)-EGFR(20)融合基因阳性对照标准品中EGFR基因片段和参照基因CFTR片段分子数比例为1：1。即，每个标准品基因片段分子，都含有1个分子EGFR基因片段和1个分子参照基因CFTR片段，故无论标准品浓度是多少，EGFR基因片段和参照基因CFTR片段分子数比例为1：1不变。本发明方法得到的CFTR(7)-EGFR(20)融合基因阳性对照标准品可作为EGFR基因拷贝数分析的内部对照品来使用。具体地，可应用于在定量检测EGFR拷贝数试剂盒质检、平行比较、仪器使用比较、cut-off值确定、基因拷贝数分析中。
本发明的有益效果：
1、本发明可以任意方便获取的样品为模板，应用自身退火聚合酶链式反应方法连接任意二个或多个基因，人工合成相应融合基因的核酸片段，以此可以低成本、灵活、快速的制备含有多种融合基因真实碱基序列核酸片段的融合基因阳性对照标准品。
2、本发明融合基因标准品制备方法简单、节省成本，应用常规PCR仪，合成普通PCR引物，市场常见PCR反应聚合酶即可；
3、本发明使用灵活，可以依据临床需求制备任意组合，可控核酸片段长度的融合基因标准品；
4、本发明制备的融合基因标准品容易定量和保存，定量可应用核酸浓度测定方法如分光光度法，保存可依据需求选择存储液或干粉；
5、本发明采用的自身退火PCR方法继续延伸还可应用于2种以上基因的连接，用以制备拷贝数检测的标准品。
附图说明
图1为融合基因标准品制备方法原理示意图。
图2为一种ALK融合基因测序结果图。
图3为一种ROS1融合基因测序结果图。
图4为一种RET融合基因测序结果图。
图5为ALK融合基因标准品检测结果，图5A为扩增曲线，黑色线为ALK融合基因阴性的A549 cDNA样品，不同灰度线是ALK融合基因标准品与ALK融合基因阴性的A549 cDNA混合扩增曲线；图5B为熔解曲线分析结果，ALK融合基因阴性样品只有一个单一低温熔解曲线峰，而ALK标准品在高温区显示熔解曲线峰，不同融合类型，其熔解曲线峰形状各不相同。
图6为融合基因CFTR(7)-EGFR(20)标准品10倍倍比稀释后，CFTR基因扩增曲线和定量标准曲线，图6A为扩增曲线，黑色为EGFR基因扩增曲线，灰色为CFTR基因扩增曲线；图6B为定量分析的扩增曲线。
图7为融合基因CFTR(7)-EGFR(20)标准品10倍倍比稀释后，EGFR基因扩增曲线和定量标准曲线，图7A为EGFR基因扩增标准曲线；图7B为CFTR基因扩增标准曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
本发明一种融合基因阳性对照标准品的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取融合伴侣基因有表达样本中的总RNA，通过反转录合成cDNA；
(2)以步骤(1)合成的cDNA为模板，以基因特异引物和基因接合引物为引物，通过不对称PCR分别扩增出融合基因的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因；其中，用于扩增上游融合伴侣基因的基因特异引物和基因接合引物的摩尔浓度比为5-20：1，用于扩增下游融合伴侣基因的基因特异引物和基因接合引物的摩尔浓度比为5-20：1；
(3)将上述步骤(2)中分别扩增得到的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的PCR扩增产物混合，进行自身退火PCR反应，完成上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的接合；
(4)以步骤(3)获得的PCR产物为模板，通过巢式PCR完成融合基因的扩增；
(5)对于步骤(4)得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并回收目的片段。
根据上述方法，本发明提供ALK、ROS1、RET、EGFR融合基因类型标准品，其中用于如上述步骤(2)所述的不对称PCR的基因特异引物和基因接合引物的核苷酸序列如表1所示，其中，基因特异引物，其核苷酸序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22，基因接合引物，其核苷酸序列选自SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:96。
表1.核苷酸序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:96
表1中，SEQ ID NO.1～17、SEQ ID NO.21所示的基因特异引物和SEQ ID NO.23～59所示的基因接合引物用于融合基因的上游融合伴侣基因的扩增，SEQ ID NO.18～20、SEQID NO.22所示的基因特异引物和SEQ ID NO.60～96所示的基因接合引物用于融合基因的下游融合伴侣基因扩增。
在表1的基础上，所述融合基因，以及用于分别扩增出融合基因的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的所述基因特异引物的SEQ ID NO和所述基因接合引物的SEQ IDNO如表2所示。在表2中基因特异引物和基因接合引物的SEQ ID NO以及其对应的序列与表1相同。
表2.融合基因，以及用于分别扩增出融合基因的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的基因特异引物的SEQ ID NO和所述基因接合引物的SEQ ID NO
本发明提供通过上述制备方法制备得到的肺癌中常见的融合基因标准品，包括EML4(2)-ALK(20)、EML4(3)-ALK(20)、EML4(10)-ALK(20)、EML4(14)-ALK(20)、EML4(15)-ALK(20)、EML4(17)-ALK(20)、EML4(18)-ALK(20)、EML4(20)-ALK(20)、STRN(3)-ALK(20)、TFG(4)-ALK(20)、KLC1(9)-ALK(20)、KLC1(10)-ALK(20)、HIP1(21)-ALK(20)、HIP1(28)-ALK(20)、HIP1(30)-ALK(20)、KIF5B(15)-ALK(20)、KIF5B(17)-ALK(20)、KIF5B(24)-ALK(20)、CD74(6)-ROS1(32)、CD74(6)-ROS1(34)、EZR(10)-ROS1(34)、TPM3(8)-ROS1(35)、LRIG3(16)-ROS1(35)、SLC34A2(4)-ROS1(32)、SLC34A2(13)-ROS1(32)、GOPC(4)-ROS1(36)、SDC4(2)-ROS1(32)、SDC4(2)-ROS1(34)、SDC4(4)-ROS1(32)、CCDC6(11)-RET(12)、KIF5B(15)-RET(12)、KIF5B(16)-RET(12)、KIF5B(22)-RET(12)、KIF5B(23)-RET(12)、KIF5B(15)-RET(11)、KIF5B(24)-RET(11)、CFTR(7)-EGFR(20)；其中，在上述步骤(2)中所用的基因特异引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1-22，所用的基因接合引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO:23-96，具体如表2。
本发明还提供通过上述制备方法制备得到的针对定量检测的融合基因阳性对照标准品，其为CFTR(7)-EGFR(20)融合基因。
对本发明所述融合基因的表示方式说明如下：所述融合基因均以融合基因上游伴侣基因-融合基因下游伴侣基因的形式表示，括号中的数字代表融合基因接合处的外显子。如融合基因EML4(2)-ALK(20)为融合基因上游伴侣基因EML4第2外显子与下游伴侣基因ALK第20外显子接合。如下表述中，所述的上游伴侣基因以及下游伴侣基因的概念均与以上所述相同。
上述不对称PCR，自身退火PCR和巢式PCR反应所用试剂均为常规PCR反应试剂，无需添加荧光染料，在普通PCR仪上即可完成。
实施例1非小细胞肺癌ALK，ROS1和RET融合基因阳性对照标准品的制备
1.依据数据库(COSMIC v85)，筛选肺癌中报道的ALK，ROS1和RET融合基因类型和基因信息，所述融合基因包括：EML4(2)-ALK(20)，EML4(3)-ALK(20)、EML4(10)-ALK(20)、EML4(14)-ALK(20)、EML4(15)-ALK(20)、EML4(17)-ALK(20)、EML4(18)-ALK(20)、EML4(20)-ALK(20)、STRN(3)-ALK(20)、TFG(4)-ALK(20)、KLC1(9)-ALK(20)、KLC1(10)-ALK(20)、HIP1(21)-ALK(20)、HIP1(28)-ALK(20)、HIP1(30)-ALK(20)、KIF5B(15)-ALK(20)、KIF5B(17)-ALK(20)、KIF5B(24)-ALK(20)、CD74(6)-ROS1(32)、CD74(6)-ROS1(34)、EZR(10)-ROS1(34)、TPM3(8)-ROS1(35)、LRIG3(16)-ROS1(35)、SLC34A2(4)-ROS1(32)、SLC34A2(13)-ROS1(32)、GOPC(4)-ROS1(36)、SDC4(2)-ROS1(32)、SDC4(2)-ROS1(34)、SDC4(4)-ROS1(32)、CCDC6(11)-RET(12)、KIF5B(15)-RET(12)、KIF5B(16)-RET(12)、KIF5B(22)-RET(12)、KIF5B(23)-RET(12)、KIF5B(15)-RET(11)、KIF5B(24)-RET(11)。
因融合基因EML4(6a/b)-ALK(20)和EML4(13)-ALK(20)分别在肺癌细胞系H2228和H3122中阳性表达，故这两类型融合基因不包括在本实施例中。
2.选用经检测已知融合伴侣基因高表达的细胞系A549，H3122，H1975，HCT116，提取总RNA(应用罗氏公司High Pure RNA Isolation Kit试剂盒，按说明书操作步骤完成)。
3.cDNA合成：以上述2中得到的总RNA为模板，应用宝生物公司PrimeScriptTM II1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，按说明书操作步骤合成得到cDNA，应用PCR用水稀释至200ng/μL备用。
4.应用表1所述引物序列，通过不对称PCR反应，分别扩增融合基因伴侣基因片段，反应体系如下(应用宝生物PrimeSTAR热启动DNA聚合酶及其缓冲液)：
上述不对称PCR反应体系中，引物1和引物2分别为相应基因片段的基因特异引物，序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:20中一种和基因接合引物，序列SEQ ID NO:23～SEQ IDNO:94中一种。PCR反应条件如下：30个循环，98℃，20秒，55℃，15秒，72℃，30秒或80秒。
5.自身退火PCR反应体系(应用宝生物PrimeSTAR热启动DNA聚合酶及其缓冲液)：
自身退火PCR反应条件如下：2个循环，98℃，20秒，70℃，30秒或80秒。
6.上述5中得到的PCR产物稀释1000倍做模板，巢式PCR扩增目的融合基因片段。巢式PCR引物序列如表2。
表3.巢式PCR引物序列
巢式PCR反应体系如下(应用宝生物Ex Taq热启动DNA聚合酶及其缓冲液)：
上述巢式PCR反应体系中，引物1和引物2分别为相应融合基因的上游引物和下游引物，如表2。PCR反应条件为45个循环，98℃，30秒，56℃，20秒，72℃，40秒或90秒。
7.对于上述步骤6中得到的巢式PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳分离，切胶纯化回收相应的融合基因片段，得融合基因标准品。
8.对于上述步骤7中切胶分离得到的各融合基因标准品应用Sanger法测序，验证融合基因接合位点与期望相符。测序结果表明本发明得到的各融合基因标准品的基因序列与预期得到的融合类型一致，说明本发明方法可以获得相应融合类型的融合基因阳性标准品。图2-4分别为三大类ALK、ROS1、RET融合基因的测序结果例图，展示融合基因接合处的基因序列。图2为融合基因EML4(3)-ALK(20)的测序结果，图3为融合基因TPM3(8)-ROS1(35)的测序结果，图4为融合基因KIF5B(15)-RET(12)的测序结果。
9.通过分子量校正，应用核酸定量分析仪(Nanodrop 2000)对各融合基因阳性标准品浓度测定，各融合基因标准品的分子量以及浓度见下表3。
表3.各融合基因标准品的分子量以及浓度
10.各融合基因标准品拷贝数浓度换算，见下表4，保存备用。
表4.各融合基因标准品拷贝数浓度换算表
11、ALK融合基因标准品的应用。将ALK融合基因标准品按108-109倍稀释(约1017copies/μL)，混入ALK融合基因阴性A549细胞cDNA(20ng/μL)中，在RotorGene Q荧光定量PCR上完成ALK融合基因的检测，检测结果见图5。图5中，A为扩增曲线，黑色线为ALK融合基因阴性的A549 cDNA样品，不同灰度线是ALK融合基因标准品与ALK融合基因阴性的A549cDNA混合扩增曲线；B为熔解曲线分析结果，ALK融合基因阴性样品只有一个单一低温熔解曲线峰，而ALK标准品在高温区显示熔解曲线峰，不同融合类型，其熔解曲线峰形状各不相同。
实施例2EGFR拷贝数分析内部对照标准品CFTR(7)-EGFR(20)融合基因的制备和应用
1.根据文献选取与EGFR基因在同一染色体，不同染色体臂上的CFTR基因相对保守区段序列作为EGFR基因拷贝数分析的参考基因。应用实施例1合成的HCT116细胞cDNA作为模板，分别不对称PCR扩增CFTR和EGFR基因片段，所用基因特异引物分别为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，所用基因接合引物分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:96，扩增方法，体系，条件同实施例1。
2.自身退火PCR反应体系及反应条件同实施例1。
3.上述步骤2中得到的自身退火PCR产物稀释1000倍做模板，巢式PCR扩增目的融合基因片段，引物序列为：CTGTACAGCGTCTGGCACAT(SEQ ID NO:118)和GATGGGACAGGCACTGATTT(SEQ ID NO:119)，其他反应体系和反应条件同实施例1。
4.对于上述步骤3得到的巢式PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳分离，切胶纯化回收相应的融合基因片段，得CFTR(7)-EGFR(20)标准品。
5.Sanger法基因测序，证实融合基因标准品融合序列信息。
6.分子量校正，核酸定量分析仪(Nanodrop 2000)测定浓度，各融合基因标准品浓度见下表5。
表5.融合基因CFTR(7)-EGFR(20)的分子量以及浓度
7.CFTR(7)-EGFR(20)融合基因标准品在定量检测中的应用。将ALK标准品按104倍稀释后作为第一个浓度，连续5次10倍倍比稀释作为模板，以实时定量PCR方法分别扩增EGFR基因和CFTR基因，引物分别为：GCTCCCAGTACCTGCTCAA和TTATCTCCCCTCCCCG TATC；TTGATTGATTGATTGATTGATTGA和CTGATCTTCCCAGCT CTCTGA。PCR反应试剂应用宝生物Ex Taq热启动DNA聚合酶及其缓冲液，荧光染料应用
PLUS(BioFire Diagnostics)，反应条件为40个循环，98℃，15秒，55℃，15秒，72℃，15秒。在RotorGene Q荧光定量PCR仪上进行反应，并应用仪器自带软件进行定量分析，并绘制标准曲线。结果见图6和图7。图6中，图6A为扩增曲线，黑色为EGFR基因扩增曲线，灰色为CFTR基因扩增曲线；图6B为定量分析的扩增曲线；图7中，图7A为EGFR基因扩增标准曲线；图7B为CFTR基因扩增标准曲线。图6和图7的结果表明EGFR和CFTR具有相同拷贝数。因此，在检测未知样品EGFR拷贝数时，以CFTR为参考基因，通过以CFTR(7)-EGFR(20)融合基因标准品作为内参照，可以应用ΔΔCt法在未知样品和内参照检分别比较EGFR和CFTR的浓度，因为内参照EGFR和CFTR浓度比是1：1，直接换算相对于参考基因的EGFR拷贝数，从而避免因基因扩增效率，样本质量，仪器差异造成的拷贝数检测偏差。
Claims (5)
1.一种融合基因阳性对照标准品的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取融合伴侣基因有表达样本中的总RNA，通过反转录合成cDNA；
(2)以步骤(1)合成的cDNA为模板，以基因特异引物和基因接合引物为引物，通过不对称PCR分别扩增出融合基因的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因；
(3)将上述步骤(2)中分别扩增得到的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的PCR扩增产物混合，进行自身退火PCR反应，完成上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的接合；
(4)以步骤(3)获得的PCR产物为模板，通过巢式PCR完成融合基因的扩增；
(5)对于步骤(4)得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并回收目的片段；
在步骤(2)中，所述融合基因，以及用于分别扩增出融合基因的上游融合伴侣基因和下游融合伴侣基因的所述基因特异引物的SEQ ID NO和所述基因接合引物的SEQ ID NO为如下：
在步骤(4)中，所述巢式PCR中所用的上游引物和下游引物的SEQ ID NO以及针对的融合基因为如下：
在步骤(3)中，所述自身退火PCR反应的条件如下：2个循环，98℃，20秒，70℃，30秒或80秒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，用于扩增上游融合伴侣基因的基因特异引物和基因接合引物的摩尔浓度比为5-20：1，用于扩增下游融合伴侣基因的基因特异引物和基因接合引物的摩尔浓度比为5-20：1。
3.一种融合基因阳性对照标准品，其特征在于，采用如权利要求1所述的制备方法制备得到。
4.一种针对定量检测的融合基因阳性对照标准品，其特征在于，采用如权利要求1所述的制备方法制备得到所述的融合基因阳性对照标准品，所述的融合基因为CFTR(7)-EGFR(20)。
5.根据权利要求4所述的针对定量检测的融合基因阳性对照标准品，其特征在于，所述的CFTR(7)-EGFR(20)融合基因阳性对照标准品中EGFR基因片段和参照基因CFTR片段分子数比例为1：1。
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