ES2534665T3 - Detección simultánea de estado mutacional y número de copia génica - Google Patents

Detección simultánea de estado mutacional y número de copia génica Download PDF

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Abstract

Método para evaluar el estado de RFCE de una muestra de tejido, que comprende: procesar dicha muestra de tejido con reactivos para producir señales distinguibles correspondientes a la presencia o ausencia de una mutación L858R de RFCE, de una mutación de RFCE por deleción del exón 19 y de la amplificación del gen RFCE, y visualizar simultáneamente dichas señales distinguibles.

Description

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(50% de bases G-C) presentará una Tm calculada de aproximadamente 41ºC, dependiendo, entre otros factores, de la concentración de la sonda y su diana, el contenido de sales de la reacción y el orden exacto de los nucleótidos. Como cuestión práctica, las partes de sonda diana más largas habitualmente se seleccionan para mejorar la especificidad de la hibridación. Por ejemplo, pueden utilizarse partes de sonda diana de entre 20 y 25 nucleótidos de longitud, ya que es altamente probable que sean específicas en el caso de que se utilicen en reacciones realizadas a temperaturas que son próximas a sus Tm (a aproximadamente 5ºC o menos de la Tm).
En realizaciones preferentes, la sonda de ácidos nucleicos está diseñada bajo dichas consideraciones, de manera que la parte de sonda diana se hibride con un ácido nucleico diana bajo condiciones adecuadas definidas por el usuario.
El ácido nucleico puede seleccionarse manualmente, o con ayuda de un algoritmo implementado por ordenador que optimice la selección de cebadores basándose en parámetros deseados, tales como la temperatura, la longitud, el contenido de GC, etc. Se encuentran disponibles numerosos algoritmos o programas implementados por ordenador para la utilización en internet o en un ordenador personal. Por ejemplo, para generar múltiples regiones de unión a partir de una secuencia diana de ácidos nucleicos (por ejemplo una secuencia diana genómica de ácidos nucleicos), se utilizan regiones de secuencia sin secuencias repetitivas de ácidos nucleicos (u otras secuencias no deseables, por ejemplo productora de fondo), por ejemplo manualmente o mediante la utilización de un algoritmo informático. Dentro de una secuencia diana de ácidos nucleicos (por ejemplo una secuencia genómica diana de ácidos nucleicos) que comprende entre varias kilobases y varios centenares de kilobases, típicamente se identifican numerosas regiones de unión que se encuentran sustancial o completamente libres de secuencias repetitivas de ácidos nucleicos (u otras secuencias no deseables, por ejemplo productoras de fondo).
Las sondas de ácidos nucleicos pueden sintetizarse mediante cualquier método conocido. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes de las sondas de ácidos nucleicos se clonan en un vector de expresión plasmídico. La sonda de ácidos nucleicos preferentemente se transcribe a partir del vector con una ARN polimerasa, proporcionando una molécula de ARN codificante de la sonda de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la sonda de ácidos nucleicos se sintetiza químicamente, por ejemplo utilizando análogos de fosforamidita. En algunas realizaciones, las sondas de ADN se sintetizan mediante propagación, purificación y digestión de restricción del ADN plasmídico, proporcionando una molécula de ADN codificante de la sonda de ácidos nucleicos diana. El ADN de doble cadena puede desnaturalizarse posteriormente en cadenas sencillas para la utilización en protocolos de hibridación. En algunas realizaciones, las sondas diana de ácidos nucleicos se sintetizan mediante PCR asimétrica. En algunas realizaciones, un cebador podría ser, por ejemplo, un análogo de ácido nucleico (por ejemplo ANB). Este procedimiento genera una sonda con la parte específica diana que contiene nucleótidos bloqueados, estando constituida la parte diana de detección por dNTP estándares. En algunas realizaciones, el cebador que contiene ANB contiene una biotina para facilitar la purificación de la cadena deseada.
En alguna realización, las sondas de ácidos nucleicos comprenden una o más fracciones detectables. En algunas realizaciones, las fracciones detectables son directamente detectables, mientras que en otras realizaciones, las fracciones detectables son indirectamente detectables. En algunas realizaciones, las fracciones detectables son fracciones generadoras de señales que producen una señal detectable. En algunas realizaciones, la fracción detectable se conjuga con nucleótidos o análogos de nucleótidos utilizados en la síntesis de la sonda de detección. Por ejemplo, se utilizan fosforamiditas nucleósidos que se conjugan con una fracción detectable deseada, para sintetizar una sonda de detección mediante síntesis química, tal como es conocido de la técnica.
En algunas realizaciones, la fracción detectable se detecta indirectamente. En algunas realizaciones, la fracción detectable es un primer elemento de un sistema generador de señales. En estas realizaciones, se incorporan en la sonda de detección nucleótidos conjugados con un primer elemento de una pareja de unión, preferentemente mediante la utilización de fosforamiditas nucleósidos conjugadas con el primer elemento de la pareja de unión. A continuación, la muestra se pone en contacto con un agente de unión específica que comprende el segundo elemento de la pareja de unión (es decir, una fracción de unión específica). En algunas realizaciones, el segundo elemento de la pareja de unión se conjuga con una fracción generadora de señales y se utiliza para detectar la sonda de detección mediante la unión al primer elemento de la pareja de unión. En otras realizaciones, la muestra se pone en contacto con un tercer elemento de unión que se une al segundo elemento de unión. En estas realizaciones, el tercer elemento de unión se conjuga con una fracción generadora de señales. Entre los ejemplos de sistemas de moléculas de unión adecuados se incluyen, aunque sin limitación, avidina, biotina, haptenos, anticuerpos antihapteno y anticuerpos anti-anticuerpo, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la parte de fracción detectable de la sonda de detección comprende uno o más nucleótidos haptenilados. Estos nucleótidos haptenilados se detectan mediante la utilización de un anticuerpo antihapteno y un anticuerpo anti-(anticuerpo antihapteno) que se conjuga con una fracción generadora de señales.
Sistemas generadores de señales
Tal como se ha indicado anteriormente, los sistemas y métodos de la presente invención utilizan una diversidad de reactivos, por ejemplo moléculas de unión a antígeno y sondas de ácidos nucleicos que se marcan con fracciones detectables para la detección directa (es decir, se marcan con fracciones generadoras de señales) o para la
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detección directa (es decir, se marcan con una fracción detectable) que es un primer elemento de una pareja de unión o sistema generadora de señales. La presente invención no se encuentra limitada a ningún marcaje o señal particular. En efecto, puede utilizarse una diversidad de señales y sistemas generadores de señales en los sistemas y métodos descritos, incluyendo, aunque sin limitación, señales colorimétricas, señales fluorescentes, señales luminiscentes y similares. En algunas realizaciones preferentes, se utilizan señales colorimétricas. En algunas realizaciones preferentes, los anticuerpos primarios y las sondas de ácidos nucleicos se detectan mediante detección indirecta mediante la utilización de anticuerpos primarios haptenilados y sondas de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones preferentes adicionales, las señales son compatibles entre sí de manera que pueden visualizarse simultáneamente en una muestra de un paciente múltiples señales (por ejemplo señales para las dos mutaciones de RFCE y la amplificación de RFCE).
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas realizaciones, la presente exposición proporciona sistemas generadores de señales que utilizan anticuerpos primarios haptenilados y sondas de ácidos nucleicos. Entre dichos haptenos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pirazoles, particularmente nitropirazoles, compuestos nitrofenilo, benzofurazanos, triterpenos, ureas y tioureas, particularmente fenilureas y todavía más particularmente feniltioureas, rotenona y derivados de rotenona, también denominados en la presente memoria rotenoides, oxazol y tiazolas, particularmente oxazol y tiazol-sulfonamidas, coumarina y derivados de coumarina, ciclolignanos, ejemplificados por podofilotoxina y derivados de podofilotoxina, y combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos específicos de haptenos se incluyen, aunque sin limitación, 2,4-dinitrofenilo (DNP), biotina, derivados de fluoresceína (FITC, TAMRA, rojo Texas, etc.), digoxigenina (DIG), 5-nitro-3-pirazolcarbamida (nitropirazol, NP), 4,5-dimetoxi-2nitrocinamida (nitrocinamida, NCA), 2-(3,4-dimetoxifenil)-quinolín-4-carbamida (fenilquinolona, DPQ), 2,1,3benzoxadiazol-5-carbamida (benzofurazano, BF), 3-hidroxi-2-quinoxalincarbamida (hidroxiquinoxalina, HQ), 4(dimetilamino)azobencén-4'-sulfonamida (DABSYL), rotenona-isoxazolina (Rot), (E)-2-(2-(2-oxo-2,3-dihidro-1Hbenzo[b][1,4]diazepín-4-il)fenozi)actamida (benzodiazepina, BD), ácido 7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromén-3carboxílico (coumarina 343, CDO), 2-acetamido-4-metil-5-tiazolsulfonamida (tiazolsulfonamida, TS) y pmetoxifenilpirazopodofilamida (podo). Estos haptenos y su utilización en sondas se describen en mayor detalle en las solicitudes copropietarias publicadas de patente US nº 2008/0305497, nº 2008/0268462 y nº 2008/0057513.
En realizaciones en las que el anticuerpo primario o sonda de ácidos nucleicos comprende haptenos, el segundo elemento del sistema generador de señales preferentemente es una molécula que se une al hapteno, tal como una molécula de unión a antígeno. Entre las moléculas de unión a antígeno adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos, inmunoglobulinas o moléculas de tipo inmunoglobulina (incluyendo, a título de ejemplo y sin limitación, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH y fragmentos Fab, tales como los conocidos de la técnica, fragmentos de anticuerpo recombinantes (tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos F(ab')2, proteínas Fv de cadena sencilla ("scFv"), proteínas Fv estabilizadas por disulfuro ("dsFv"), diacuerpos y triacuerpos (tales como son conocidos de la técnica) y anticuerpos de camélidos (ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.015.695, nº 6.005.079-5.874.541, nº 5.840.526, nº 5.800.988 y nº 5.759.808). En algunas realizaciones, se une una fracción detectable que genera una señal detectable, covalentemente o de otra manera, a la molécula de unión a antígeno. Entre los ejemplos de elementos de la segunda pareja de unión adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos anti-DNP, antibiotina, anti-FITC, anti-DIG, anti-NP, anti-NCA, anti-DPQ, anti-BF, anti-HQ, anti-DABSYL, anti-Rot, anti-BD, anti-CDO, anti-TS y anti-Podo, que se conjugan con una fracción detectable que genera una señal detectable. En realizaciones adicionales, un segundo elemento del sistema de molécula de unión es un anticuerpo primario antihapteno que no comprende una fracción detectable. En estas realizaciones, el tercer elemento del sistema de molécula de unión es un anticuerpo secundario anti-anticuerpo (tal como un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón) que comprende una fracción detectable que genera una señal que se utiliza para generar una señal detectable.
Los sistemas generadores de señales de la presente exposición comprenden una fracción generadora de señales. En realizaciones preferentes, la fracción generadora de señales puede detectarse mediante cualquier mecanismo conocido o todavía no descubierto, incluyendo la absorción, la emisión y/o la dispersión de un fotón (incluyendo la radiofrecuencia, la frecuencia de microondas, la frecuencia de infrarrojos, la frecuencia visible y los fotones de frecuencia ultravioleta). Entre las fracciones generadoras de señales se incluyen las moléculas y materiales de color, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como mediante la conversión de una sustancia incolora en una sustancia de color, o viceversa, o mediante la producción de un precipitado o el incremento de la turbidez de la muestra) y moléculas o materiales paramagnéticos y magnéticos.
En algunas realizaciones preferentes, la fracción generadora de señales es un enzima. Entre los enzimas adecuados se incluyen, aunque sin limitación, luciferasas (por ejemplo la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana, patente US nº 4.737.456), la luciferina, las 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (PRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisoxima, sacárido oxidasas (por ejemplo glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos han sido descritas en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en: Methods en Enzym. (editores J. Langone y H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166, 1981). En el caso de que el marcaje detectable incluya un
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al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6899-6903). En algunas realizaciones, la amplificación del gen RFCE corresponde a la sobreexpresión de RFCE (Bhargava et al., Modern Pathology 18:1027-1033, 2005).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona la detección del número de copia génica de RFCE mediante la utilización de técnicas de hibridación in situ (por ejemplo la hibridación in situ con plata o cromogénica). En algunas realizaciones, se aplican técnicas de hibridación in situ estándar. Las técnicas de hibridación in situ estándares se describen en la técnica (por ejemplo Gall y Pardue, Methods in Enzymology 21:470-480, 1981); Henderson, International Review of Cytology 76:1-46, 1982; Angerer et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Setlow y Hollaender, editores, vol. 7, páginas 43 a 65 (Plenum Press, New York, 1985).
En algunas realizaciones, la hibridación in situ comprende las etapas principales siguientes: (1) fijación del tejido o estructura biológica que debe examinarse, (2) tratamiento de prehibridación de la muestra biológica para incrementar la accesibilidad del ADN diana y para reducir la unión no específica, (3) sonda de hibridación del ácido nucleico en la muestra biológica, (4) lavados posteriores a la hibridación para eliminar sonda no unida en híbridos específicos, y (5) detección de las sondas hibridadas. Estas etapas, los reactivos utilizados y sus condiciones de utilización varían en diferentes realizaciones de la presente invención.
En algunas realizaciones, la presente exposición proporciona sondas oligonucleótidas configuradas para hibridarse con regiones del gen RFCE. En algunas realizaciones, las sondas de RFCE se configuran para unirse a regiones del gen RFCE bajo condiciones de baja astringencia. En algunas realizaciones, las sondas de RFCE se configuran para unirse a las regiones del gen RFCE bajo condiciones de astringencia moderada, pero no bajo condiciones de baja astringencia. En algunas realizaciones, las sondas de RFCE se configuran para unirse a las regiones del gen RFCE sólo bajo condiciones de alta astringencia.
En algunas realizaciones, la hibridación in situ comprende la hibridación in situ cromogénica (CISH), la hibridación in situ con plata (SISH) o la hibridación fluorescente in situ (FISH). En algunas realizaciones, se lleva a cabo la CISH para la región del gen RFCE. Por ejemplo, se incuban secciones de tejido a 55ºC durante la noche. Se desparafinan las secciones en xileno y gradación de etanoles. Se lleva a cabo el pretratamiento térmico en el tampón de pretratamiento (Zymed Laboratories Inc.) a una temperatura de entre 98ºC y 100ºC durante 15 minutos. Se digiere el tejido con pepsina durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras la aplicación de la sonda de RFCE, se cubren los portaobjetos con cubreobjetos y los bordes se sellan con cemento de caucho. Los portaobjetos se calientan a 95ºC durante 5 minutos seguido de la incubación durante la noche a 37ºC utilizando una cámara humidificada. Se lleva a cabo un lavado posterior a la hibridación y seguido de la inmunodetección utilizando un kit de detección de polímero CISH (por ejemplo de Zymed Laboratories Inc.). Se realiza un recuento de las señales de CISH utilizando un microscopio óptico con un objetivo de x40. En algunas realizaciones, se interpreta un tumor como positivo para la amplificación génica en el caso de que el número medio de copias génicas sea de 45 por núcleo. El experto en la materia podrá ajustar los parámetros para optimizar la hibridación in situ.
La hibridación in situ cromogénica (CISH) es una técnica que permite llevar a cabo métodos de hibridación in situ y la detección con un microscopio de campo brillante, en lugar de un microscopio de fluorescencia según se requiera para FISH. Aunque FISH requiere un microscopio de fluorescencia dotado de un objetivo de inmersión en aceite de 60X o 100X de alta calidad y filtros de fluorescencia multi-paso de banda (no utilizados en la mayoría de los laboratorios de rutina diagnóstica), CISH permite la detección con microscopios ópticos (de campo brillante) estándares (que generalmente son utilizados en los laboratorios diagnósticos). CISH generalmente no palidece, permitiendo archivar las muestras de tejidos y revisarlas posteriormente. El detalle histológico se aprecia mejor con la detección de campo brillante, lo que resulta posible con la detección de CISH. Pueden escanearse rápidamente grandes regiones de sección de tejido tras la contratinción de CISH ya que el detalle morfológico es fácilmente visible utilizando objetivos de baja magnificación (por ejemplo 10X y 20X), mientras que la detección de FISH generalmente requiere una magnificación sustancialmente más alta (reduciendo de esta manera el campo de visión).
Los métodos de hibridación in situ cromogénicos/colorimétricos generales se describen en el documento nº WO00/26415 de Fletcher et al., y en la publicación de patente US nº 2003/0017491. Los reactivos particulares y las etapas para llevar a cabo CISH en muestras de tejidos fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE), así como muestras celulares/muestras de cromosomas en metafase se describen en el documento nº WO00/26415 y en la publicación de patente US nº 2003/0017491, y en la sección presentada posteriormente. Resulta importante que la descripción detallada posteriormente proporciona métodos, procedimientos y reactivos ejemplares y no debe interpretarse como limitativa de la presente invención.
4. Diagnósticos y kits
En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención se aplican en tejidos, células, tejido de biopsia, muestras de tejido (por ejemplo cilindros, secciones, etc.), etc., de sujetos que se sospecha que presentan cáncer, han sido diagnosticados de cáncer y/o que sufren de cáncer. En algunas realizaciones, se realizan secciones de biopsias de tejidos y se detectan las proteínas utilizando, por ejemplo, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica e hibridación in situ (por ejemplo CISH, FISH, etc.).
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de catálogo 950-102) en BenchMark XT. A continuación, los portaobjetos se sometieron a pretratamiento térmico utilizando acondicionador celular 1 (nº de catálogo 950-124) previamente a la incubación de anticuerpos. Se dispensó anticuerpo E746-A750del sobre los portaobjetos y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Tras lavar los portaobjetos con tampón de reacción, se aplicó anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con FA y se incubaron 5 durante 16 minutos a 37ºC. Se llevó a cabo el revelado de color con naftol y azul Fast. A continuación, los portaobjetos se calentaron para inactivar los reactivos para la primera detección IHQ. Se dispensó anticuerpo específico para mutante L858R sobre los portaobjetos y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Tras lavar los portaobjetos con tampón de reacción, se aplicó anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con FA sobre los portaobjetos y se incubaron durante 16 minutos a 37ºC. Se llevó a cabo el revelado del color con naftol y rojo Fast. A 10 continuación, se procesaron los portaobjetos para pretratamiento térmico con tampón de reacción y se digirieron con proteasa 3 de ISH (nº de catálogo 780-4149). Se aplicó sonda de RFCE a las secciones de tejidos y se hibridaron durante 5 horas tras la etapa de codesnaturalización de sonda y diana. Se llevaron a cabo etapas de lavado de astringencia con SSC (nº de catálogo 950-110) y se incubaron secciones de tejidos con anticuerpo monoclonal de conejo anti-DNP (nº de catálogo 780-4335). A continuación, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anticonejo
15 conjugado con peroxidasa de rábano picante y se llevó a cabo el revelado del color con el kit de SISH ultraView (nº de catálogo 780-002). Las secciones de tejido se contratiñeron con hematoxilina-II (nº de catálogo 790-2208) y reactivo azulante (nº de catálogo 760-2037).
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