CN116064818A - 检测igh基因重排及超突变的引物组、方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测IGH基因重排及超突变的引物组、方法和系统，所述引物组包括序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物。本发明可以实现对IGH基因目标区域的高质量和高效率的扩增，测序读长降低，准确率得以提高，大大缩短IGH基因重排及超突变的检测周期，使医生能够在最早的时间内拿到检测结果，更加及时地辅助病况诊断、制定合理治疗方案，具有广泛的市场前景和巨大的社会价值。

Description

检测IGH基因重排及超突变的引物组、方法和系统
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测IGH基因重排及超突变的引物组、试剂盒、系统和方法。
背景技术
淋巴细胞不同于体内的其他体细胞，在发育过程中，淋巴细胞中的抗原受体基因发生体细胞基因重排。例如，在B细胞发育过程中，编码IGH分子的基因由多个多态基因片段组装而成，这些基因片段经历重排和选择，产生长度和序列均独一无二的VH-DH-JH组合。由于白血病和淋巴瘤起源于个体淋巴细胞的恶性转化，个体的白血病或淋巴细胞通常共享一个或多个细胞特异性或“克隆”抗原受体基因重排。因此，检测IGH克隆重排的测试可用于B细胞肿瘤的研究。
此外，免疫球蛋白重链可变区(IGHV)基因超突变状态为慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)患者提供了重要的预后信息。IGHV体细胞超突变(SHM)的存在被定义为与种系VH基因序列的差异大于或等于2％，而小于2％的差异被认为是没有SHM的证据。克隆的SHM状态与B-CLL具有临床相关性，因为有和没有SHM的患者的中位生存期有明显区别。IGHV区域的超突变强烈预示着良好的预后，而缺乏突变则预示着不良的预后。
最初是使用限制性片段、Southern印迹杂交技术(RF-SBH)鉴定克隆重排。然而，这些技术较为繁琐且需要大量的DNA，并且不适合分析许多不太多样化的单克隆重排。在过去的几十年里，RF-SBH检测已被基于PCR的克隆性检测所取代，并被认为是当前的金标准方法。基于PCR的克隆性分析技术，敏感性较高，结果直观可靠，但检测周期较长，难以区分相似的克隆群体和可能位于单一大小峰下方的多重重排，并且无法识别在后续跟踪分析中所需的克隆特异性DNA序列。但这个限制非常重要，因为一旦确定了独特的克隆特异性DNA序列，该序列就可以用于后续测试，以便继续跟踪独特的克隆细胞群。
近几年，NGS的引入使得对IGH基因重排的更深入分析成为可能，该技术对于IGH基因的克隆重排检测更加敏感和特异，主要是由于二代测序结果提供了独特的核酸序列。因此，用于评估免疫球蛋白受体(IGH)克隆重排的灵敏度有所提高，可以进一步应用于MRD检测、谱分析。目前基于NGS平台的IGH基因重排及超突变商业化试剂盒主要搭配illumina平台的Miseq测序仪，测序读长600bp，仅测序时间就需要4天，以及ilumina下机数据处理较为复杂。整个构库、测序、数据分析处理时间需要约7天，导致检测周期过长，较为影响临床治疗。
因此，有必要提供一种灵敏度高、检测周期短、成本低的检测IGH基因重排及超突变的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种检测IGH基因重排及超突变的引物组、试剂盒、系统和方法。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一个方面，是提供了一种检测IGH基因重排及超突变的引物组，包括：序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、和序列如SEQ IDNO.8所示的反向引物。
本发明的第二个方面，是提供了一种检测IGH基因重排及超突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测IGH基因重排及超突变的引物组。
本发明的第三个方面，是提供了一种检测IGH基因重排及超突变的方法，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，采用上述试剂盒进行IGH基因序列的PCR扩增，对扩增产物进行末端修复后，连接特异性接头，再进行文库扩增，对文库进行上机测序。
本发明的第四个方面，是提供了一种检测IGH基因重排及超突变的系统，包括以下模块：
检测模块，包括IGH基因扩增模块、文库构建模块、IonGeneStudioS5Plus测序模块；所述IGH基因扩增模块包括：序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
分析模块，所述分析模块对所述IonGeneStudioS5Plus测序模块的测序结果进行分析。
在本发明中，根据IGH基因的目标扩增区域设计筛选了特异性引物，并通过优化文库构建方法，结合IonGeneStudioS5Plus测序平台，可以实现对IGH基因目标区域的高质量和高效率的扩增，测序读长降低，准确率得以提高，大大缩短IGH基因重排及超突变的检测周转时间(从DNA提取到报告发放只需3天)，使医生能够在最早的时间内拿到检测结果，更加及时地辅助病况诊断、制定合理治疗方案，具有广泛的市场前景和巨大的社会价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中特异性引物组在IGH基因的设计位置示意图。
图2为本发明实施例2中检测IGH基因重排和超突变的方法流程图。
图3为本发明实施例3中采用不同的引物组进行扩增后的文库片段对比结果。
图4为本发明实施例3中采用不同浓度的引物组进行扩增后的文库片段对比结果。
图5为本发明实施例3中采用不同的试剂进行扩增后的文库片段对比结果。
图6为本发明实施例4中扩增后的文库片段结果。
图7为本发明实施例4中数据处理中的总测序质量报告展示。
图8为本发明实施例4中数据处理的单个样本测序质量报告展示。
图9为本发明实施例4中数据处理中生成的fastq文件。
图10为本发明实施例4中数据处理中的igblast序列比对。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明的一些实施例中，公开了一种检测IGH基因重排及超突变的引物组，包括：序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、和序列如SEQ IDNO.8所示的反向引物。所述引物组是根据IGH基因选定的目标扩增区域而设计的，可以实现对目标区域的高质量和高效率的扩增。
本发明的另一些实施例中，公开了一种检测IGH基因重排及超突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测IGH基因重排及超突变的引物组。
在其中一些实施例中，所述引物组的工作浓度为3uM～5uM。
本发明的另一些实施例中，公开了一种检测IGH基因重排及超突变的方法，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，采用上述试剂盒进行IGH基因序列的PCR扩增，对扩增产物进行末端修复后，连接特异性接头，再进行文库扩增，对文库进行上机测序。现有方法是采用一步扩增或者两步扩增的建库方式构建文库，对应的引物序列包括目的序列+tag序列+接头序列等，引物序列的5’端修饰过长，虽然对扩增特异性影响不大，但引物序列过长会导致其延伸温度过高，不适于TaqDNA聚合酶进行反应，进一步会影响引物与模板的结合效率，导致扩增效率和产物浓度的降低。并且采用扩增建库方式对应的测序读长必须选择600bp，测序读长过长，测序的准确率就会大大降低。本发明采用接头连接的方式进行建库，引物序列只包括目的序列，长度设计在20～25bp之间，可提高扩增产物的产量，扩增效率高。接头和目的片段的连接方向随机，测序方向随机从5’或3’端开始测序，测序长度仅需400bp，数据分析时通过数据拼接即得到整个文库的序列。
本发明的检测方法与目前最常用的基于PCR-毛细管电泳检测技术相比，能够检测出特异性的克隆重排DNA序列，因此灵敏度更高，准确性更好，分辨率更高。与目前现有的基于一步或两步扩增的二代测序方法相比，本方法的引物设计无需添加Tag序列等修饰，可提高目的片段的扩增效率，因此灵敏度更高。此外，本发明的测序时间更短，大大降低碱基测序错误率，可进一步提高灵敏度。
在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系包括：ddH2O 10.15±0.1μL、10×Buffer 2±0.1μL、MgCl2 1.2±0.1μL、dNTP Mix 0.4±0.1μL、引物混合物1±0.1μL、DNAPolymerase 0.25±0.05μL、DNA 5±0.1μL。
在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃60s，35个循环；75℃10min；4℃∞。
在其中一些实施例中，所述文库扩增的反应体系包括：PCR SuperMix HighFidelity 50±2μL、Library Amplification Primer Mix 2.5±0.5μL、Unamplifiedlibrary 12.5±0.5μL。
在其中一些实施例中，所述文库扩增的反应程序包括：95℃5min；95℃15s，58℃15s，70℃60s，7个循环；4℃∞。
在其中一些实施例中，采用Ion GeneStudio S5 Plus平台进行上机测序。测序长度400bp，测序时长仅需4.5小时，搭配Ion chef进行自动化模板制备文库模板，减少手工操作，大大降低实验过程中产生的误差，进一步保证检测结果的可靠性。
本发明的另一些实施例中，公开了一种检测IGH基因重排及超突变的系统，包括以下模块：
检测模块，包括IGH基因扩增模块、文库构建模块、Ion GeneStudio S5 Plus测序模块；所述IGH基因扩增模块包括：包括：序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
分析模块，所述分析模块对所述Ion GeneStudio S5 Plus测序模块的测序结果进行分析。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1检测IGH基因重排和超突变的特异性引物组
本实施例中，参考IMGT数据库中的B细胞免疫球蛋白重链IGH基因(包括5个DNA片段：L区、V区、D区、J区、C区)相关fasta序列，在IGH基因的L区设计了检测IGH基因重排和超突变的正向引物F1～F7，在J区设计了反向引物R1(如图1所示)，采用正向引物F1～F7和反向引物R1，能够扩增完整的V区序列，再结合正向引物中的简并碱基设计，不仅能够检测出IGH基因的单克隆重排结果，还能确定IGH基因的V区超突变频率。引物的具体序列如下：
F1：5'-CTCACCATGGACTGSAYYTGGAG-3'(SEQ ID NO.1)
F2：5'-ATGGACAYACTTTGYTMCACRCTCC-3'(SEQ ID NO.2)
F3：5'-ATGGARTTKGGGCTKWGCTGGGTTT-3'(SEQ ID NO.3)
F4：5'-GGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGC-3'(SEQ ID NO.4)
F5：5'-CTGTGGTTCTTYCTBCTSCTGGTGG-3'(SEQ ID NO.5)
F6：5'-CCTCCTCCTRGCTRTTCTCCAAG-3'(SEQ ID NO.6)
F7：5'-CTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCC-3'(SEQ ID NO.7)
R1：5'-CTTACCTGAGGAGACGGTGACC-3'(SEQ ID NO.8)
实施例2检测IGH基因重排和超突变的方法
请参考图2，为本发明检测IGH基因重排和超突变的方法流程图。利用实施例1的特异性引物组，对IGH基因重排和超突变进行检测。具体包括以下步骤：
(1)、DNA的提取
采用QIAsymphonyDSPDNAMiniKit试剂盒，并搭配全自动核酸提取纯化仪QIAsymphonySP进行核酸提取纯化。样本类型包括全血，骨髓穿刺物等。
(2)、IGH基因的扩增及纯化
a、将AmpliTaqGold
Figure BDA0003983721990000083
DNAPolymerase融化后置于冰板上，根据表1配制IGH基因的扩增反应体系，分装至96孔半裙边PCR板内，按照表2的扩增反应程序进行扩增。
表1PCR扩增反应体系
Figure BDA0003983721990000081
其中，混合引物(4uM)是按实施例1中的各引物等比例混合稀释至4uM，再取1μL。
表2PCR扩增反应程序
Figure BDA0003983721990000082
b、取出AgencourtAMPureXPbeads，平衡至室温，使用前充分震荡；
c、在扩增完成后后的产物中加入36μLAgencourtAMPureXPbeads(1.8*样本体积)，吹打混匀，室温静置5min；
d、置于磁力架2min，溶液澄清后，弃上清；
e、加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s，溶液澄清后吸去上清；重复一次；室温放置5～10min挥发酒精；
f、加入12μLddH2O重悬磁珠，吹打混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后小心转移10μL上清至新的96孔半裙边PCR板内。
g、使用
Figure BDA0003983721990000091
dsDNA HS Assay Kit及
Figure BDA0003983721990000092
3.0Fluorometer测定扩增子的浓度。
(3)、文库构建
文库构建阶段采用赛默飞的4471252Ion plus fragment library kit建库试剂盒试剂和44744517Ion Xpress Barcode Adapters 1-96Kit接头试剂盒试剂。
将步骤(2)的IGH基因扩增产物进行末端修复及纯化，再连接特异性的接头，经过纯化，最后经过文库PCR富集及纯化，构建得到IGH基因组文库。
a、末端修复及纯化
(a)、取步骤(2)扩增纯化后的100ng产物，用Nuclease-free Water补足体积至39.5μL，采用试剂盒4471252Ion plus fragment library kit，配制如表3所示的末端修复反应体系，充分混匀离心，室温放置20min。
表3
组分 体积(μL)
Pooled short amplicons 100ng
Nuclease-free Water 39.5μL-100ng
5X End Repair Buffer 10
End Repair Enzyme 0.5
Total 50
(b)、取出Agencourt AMPure XP beads，平衡至室温，使用前充分震荡；
(c)、在末端修复后的产物中，每个样本加入90μL Agencourt AMPure XP beads(1.8*样本体积)，吹打混匀，室温静置5min；
(d)、置于磁力架2min，溶液澄清后，弃上清；
(e)、加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s，溶液澄清后吸去上清；重复一次；室温放置5～10min挥发酒精；
(f)、加入15μL ddH2O重悬磁珠，吹打混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后小心转移12.5μL上清至新的96孔半裙边PCR板内。
b、连接接头及纯化
(a)、取出试剂盒4471252Ion plus fragment library kit和44744517IonXpress Barcode Adapters 1-96Kit，充分溶解连接缓冲液和特异性接头，按表4所示配制连接接头的反应体系，上下吹打5次，微离心，上PCR仪，按表5反应程序进行接头连接。
表4
组分 体积
DNA 12.5
10X Ligase Buffer 5
Ion P1 Adapter(barcoded libraries) 1
<![CDATA[Ion Xpress<sup>TM</sup> Barcode X]]> 1
dNTP Mix 1
Nuclease-free Water 24.5
DNA Ligase 1
Nick Repair Polymerase 4
Total 50
表5
温度 时间
25℃ 15min
72℃ 5min
4℃ 立即取出
(b)、取出Agencourt AMPure XP beads，平衡至室温，使用前充分震荡；
(c)、在连接后的产物中，每个样本加入70μL Agencourt AMPure XP beads(1.4*样本体积)，吹打混匀，室温静置5min；
(d)、置于磁力架2min，溶液澄清后，弃上清；
(e)、加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s，溶液澄清后吸去上清；重复一次；室温放置5～10min挥发酒精；
(f)、加入15μL ddH2O重悬磁珠，吹打混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后小心转移12.5μL上清至新的96孔半裙边PCR板内。
c、扩增文库及纯化
(a)、按表6所示，配制扩增文库的反应体系，上下吹打5次，微离心，上PCR仪，按表7反应程序进行接头连接。
表6
成分 体积
<![CDATA[Platinum<sup>TM</sup> PCR SuperMix High Fidelity]]> 50μL
Library Amplification Primer Mix 2.5μL
Unamplified library 12.5μL
Total 65μL
表7
Figure BDA0003983721990000111
(b)、取出Agencourt AMPure XP beads，平衡至室温，使用前充分震荡；
(c)、在连接后的产物中，每个样本加入97.5μL Agencourt AMPure XP beads(1.5*样本体积)，吹打混匀，室温静置5min；
(d)、置于磁力架2min，溶液澄清后，弃上清；
(e)、加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s，溶液澄清后吸去上清；重复一次；室温放置5～10min挥发酒精；
(f)、加入13μL ddH2O重悬磁珠，吹打混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后小心转移11μL上清至新的96孔半裙边PCR板内。
(g)、使用
Figure BDA0003983721990000112
dsDNA HS Assay Kit及
Figure BDA0003983721990000113
3.0Fluorometer测定文库的浓度；采用片段分析仪(Bioanalyzer 2100)测定文库的长度。
(h)、测定浓度后，按照等ng进行文库均一化pooling。
(4)、文库模板制备
将文库稀释到50pM，采用IonChef进行自动化模板制备，包括油包水PCR、有效微珠富集、芯片上样，大约需要13小时，全部流程手动操作时间<15min。
(5)、上机测序
采用IonTorrent平台的IonGeneStudioS5Plus进行上机测序，测序读长400bp，测序时间约4.5小时。
(6)、数据处理
测序产生的BCL文件传送到IonTorrent平台专用的计算机服务器Torrent Server上，进行初步数据处理和分析。然后下载fastq文件，利用生物信息学分析方法过滤测序中的低质量数据、去除接头及引物、与IMGT免疫数据库中的对应基因序列进行比对，确定对应的克隆重排序列，然后利用igblast tool(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行序列比对，分析体细胞的超突变状态。在分析样本的体细胞超突变状态时，生物信息学软件将根据克隆扩增子与种系参考基因的错配百分比提供突变率，预测蛋白质是否在框架内或框架外，预测突变或基因重排是否会导致提前成熟的终止密码子以及检测目标区域的VH基因覆盖百分比。
实施例3检测IGH基因重排和超突变的引物的筛选、引物浓度的优化以及检测扩增条件的优化
1、引物的筛选
参考IMGT数据库中的IGH基因相关fasta序列，设计了检测IGH基因重排和超突变的特异性引物组，TM，GC及长度等参数合适，进行引物合成，再进行扩增检测。本发明共设计2组引物(引物组1、引物组2)，具体如表8所示。
表8
Figure BDA0003983721990000131
以商业化试剂盒LymphoTrack
Figure BDA0003983721990000132
IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay-MiSeq
Figure BDA0003983721990000133
中的阳性质控品IGH SHM POS(+)为例进行说明。采用表8的两组引物组进行IGH基因的扩增及文库构建，再采用2100生物分析仪测定文库片段大小以及
Figure BDA0003983721990000134
dsDNA HSAssay Kit测定文库浓度(具体方法如实施例2)。
结果如图3所示，从图3可知，采用引物组1进行检测，扩增的文库片段长度～900bp，为非目的片段文库；采用引物组2能够构建得到～600bp的目的文库片段，为目的片段文库。说明采用引物组2进行检测，扩增特异性更好，可以成功扩增目的序列。
通过测定文库浓度可知，采用引物组2检测的文库浓度为15.23ng/μL，采用引物组1检测的文库浓度为3.28ng/μL。文库浓度的差异说明采用引物组2进行检测，可以实现对IGH基因目标区域的高质量和高效率的扩增，保证PCR产物的产量。
2、引物浓度的优化
在上述步骤1的基础上，探索最适的引物浓度，具体包括以下步骤：
(1)、先将引物组按等比例(即8条引物等比例)混合，然后分别稀释到0.4uM、4uM、40uM，采用上述步骤1的阳性样本和方法进行进行IGH基因的扩增及文库构建；
(2)、构建文库后，再采用2100生物分析仪测定文库片段大小以及
Figure BDA0003983721990000143
dsDNAHSAssayKit测定文库浓度。
图4中的A、B、C为阳性样本IGHSHMPOS(+)使用0.4uM、4uM、40uM引物混合液进行测试后的文库片段大小，表9为阳性样本IGHSHMPOS(+)使用0.4uM、4uM、40uM引物混合液进行测试后的文库浓度。
表9
Figure BDA0003983721990000141
从图4和表9可知，虽然0.4uM能扩增目的片段(～600bp)，但文库浓度过低；4uM、40uM均扩增成功，能检测到目的片段(～600bp)，但是40uM有大量非目的片段检出(大于1000bp)，推测因为引物浓度过高，有非特异性扩增，因此选择4uM为最终引物混合液的工作浓度。
3、检测扩增条件的优化
因检测需求，需要选出性能达标优且扩增时间短的酶。该试验以阳性样本IGHSHMPOS(+)为例进行说明。对同一样本使用不同Taq酶及不同的反应程序进行了测试(试剂A:AmpliTaqGold
Figure BDA0003983721990000144
DNAPolymerase，厂商：赛默飞；试剂B:SKa MultiplexPCRMasterMix，厂商：广州齐凯生物科技有限公司)，引物选用引物组2，工作浓度4uM。具体如表10所示。
表10
Figure BDA0003983721990000142
Figure BDA0003983721990000151
采用表10的反应试剂和反应程序进行IGH基因的扩增及文库构建，测定文库长度及浓度，结果如图5所示。从结果可知，采用A试剂及相应的反应程序进行扩增，能够得到目的片段，文库长度在600bp左右，峰高且尖，说明A试剂扩增效率高。而采用B试剂及相应的反应程序进行检测，峰图结果不理想。通过测定文库浓度可知，采用试剂A检测的文库浓度为14.80ng/μL，采用试剂B检测的文库浓度为3.11ng/μL。文库浓度的差异说明采用试剂A进行扩增，可以实现对IGH基因目标区域的高效率扩增。
实施例4本发明检测方法的方法学验证
采用实施例2的方法，通过8例样本(1例NTC+3例质控品：试剂盒LymphoTrack
Figure BDA0003983721990000153
IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay-MiSeq
Figure BDA0003983721990000154
中的IGH SHM POS(+)、IGH POS(+)、NGS NEG(-)+4例已由LymphoTrack
Figure BDA0003983721990000155
IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay-MiSeq
Figure BDA0003983721990000156
确认结果的临床样本)，对本发明的检测方法的方法学进行了验证。
1、扩增子浓度
采用IGH引物进行扩增后，样本的扩增子浓度如表11所示。
表11
Figure BDA0003983721990000152
Figure BDA0003983721990000161
从表11可知，扩增后纯化的产物浓度较高，初步表明本发明的引物序列及反应体系能够有效扩增得到目的产物IGH基因序列。
2、文库的浓度及长度
扩增纯化后构建文库，对文库进行浓度及长度测定。如表12和图6所示，
表12
实验编号 文库浓度(ng/μL)
IGH-NTC 0
IGH-Test-1 17.6
IGH-Test-2 17.9
IGH-Test-3 19.4
IGH-Test-4 24.8
IGH-Test-5 8.04
IGH-Test-6 10.1
IGH-Test-7 26
从表12和图6结果可知，文库浓度正常，文库长度在600bp左右，符合预期。表明本发明选用的构库方式及对应的试剂盒系统能够满足构建文库要求。
3、下机数据分析
经过上机测序后，通过计算机服务器Torrent Server进行初步分析，分析处理后出具初步的测序质量报告，包括本批次上机测序的总测序质量报告(图7)和单个样本的测序质量报告(图8)。
总测序报告的内容包括ISP loading、Total bases、Total reads、Usablesequence、Final Library、Read length等。如图7所示，该验证批次的ISP loading为92％，对应产生的Total bases为4.59G，Total reads为34632959条。经过一系列的低质量过滤设置，最终的Usable sequence占比为47％，可用于进一步分析的Final Library为16046134条。该批次的Read length在326bp左右。整体来看，下机数据QC正常，片段分布均匀，符合质控要求。
对应的OutputFiles会出具每个样本的测序质量报告，包括每个样本的Bases、Reads、≥Q20Bases、MeanReadLength等，如图8所示。例如验证样本IGH-Test-1的Bases为180388213bp，经过滤后的≥Q20Bases为141444736bp，对应的Reads为557539条，MeanReadLength为323bp。图8结果表明7例验证样本的reads都大于100000条，QC达标，可用于进一步分析。
在初步分析后，选择selectpluginstoruns按钮，通过FileExporter生成fastq文件，如图9所示。下载fastq文件，利用生物信息学分析方法过滤测序中的低质量数据、接头及引物等、与IMGT免疫数据库中的对应基因序列进行比对，确定对应的克隆重排序列。通过比对分析可知，IGH-Test-1的Vgene为IGHV4-59_08。
将确定的单克隆重排序列采用igblast进行序列比对，分析体细胞的超突变状态。如图10所示，验证样本IGH-Test-1的序列比对一致性为89.1％，对应的V区突变频率为10.90％，蛋白质在框架内，无提前成熟的终止密码子。
4、分析结果对比
分析后的对比数据统计如表13所示。
表13
Figure BDA0003983721990000171
Figure BDA0003983721990000181
由结果统计可知，本发明能够正确检测出IGH基因的单克隆重排，并且在同源度上，比对出的Vgene一致。在超突变的检测上，测试结果与已知结果的突变程度基本一致，说明测序400bp也能够检测IGH基因的V区超突变。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测IGH基因重排及超突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括：序列如SEQID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、以及序列如SEQ IDNO.8所示的反向引物。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测IGH基因重排及超突变的试剂盒中的应用。
3.一种检测IGH基因重排及超突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测IGH基因重排及超突变的引物组。
4.根据权利要求3所述的检测IGH基因重排及超突变的试剂盒，其特征在于，所述引物组的工作浓度为3μM～5μM。
5.一种检测IGH基因重排及超突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，采用权利要求3或4所述试剂盒进行IGH基因序列的PCR扩增，对扩增产物进行末端修复后，连接特异性接头，再进行文库扩增，对文库进行上机测序。
6.根据权利要求5所述的检测IGH基因重排及超突变的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：ddH2O 10.15±0.1μL、10×Buffer 2±0.1μL、MgCl21.2±0.1μL、dNTP Mix0.4±0.1μL、引物组混合物1±0.1μL、DNA Polymerase 0.25±0.05μL、DNA 5±0.1μL；和/或所述PCR扩增的反应程序包括：95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃60s，35个循环；75℃10min；4℃∞。
7.根据权利要求5所述的检测IGH基因重排及超突变的方法，其特征在于，所述文库扩增的反应体系包括：PCR SuperMix High Fidelity 50±2μL、Library AmplificationPrimerMix 2.5±0.5μL、Unamplified library 12.5±0.5μL。
8.根据权利要求5所述的检测IGH基因重排及超突变的方法，其特征在于，所述文库扩增的反应程序包括：95℃5min；95℃15s，58℃15s，70℃60s，7个循环；4℃∞。
9.根据权利要求5所述的检测IGH基因重排及超突变的方法，其特征在于，采用IonGeneStudio S5 Plus平台进行上机测序。
10.一种检测IGH基因重排及超突变的系统，其特征在于，包括以下模块：
检测模块，包括IGH基因扩增模块、文库构建模板、Ion GeneStudio S5 Plus测序模板；所述IGH基因扩增模块包括：序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的正向引物、和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
分析模板，所述分析模板对所述Ion GeneStudio S5 Plus测序模块的测序结果进行分析。
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