CN105087560B - 一种基于高通量测序构建猪bcr重链文库的多重pcr引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物和方法。所述的多重PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ？ID？NO:1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQ？ID？NO:2～SEQ？ID？NO:6所示的核苷酸序列组成的下游引物组。本发明提供的多重PCR引物组能高效构建猪的B淋巴细胞受体高通量测序文库，可获得丰富的猪BCR重排信息。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物和方法。
背景技术
B细胞受体(BCR)由两条重链和两条轻链，共由四条肽链组成，重链由IGH基因编码，轻链分别由IGL(Lamda链)和IGK(Kappa)链编码，同时由于重链更具有复杂的内部组成而能更好的反应BCR的组成状况。IGH基因的胚系基因又多个开放阅读框依次排列而成，可划分为IGHV，IGHJ，GHD片段，在B淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的IGH分子，为BCR的多样性提供了分子遗传基础。在的连接处，由于非模板核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了BCR分子的多样性程度。B细胞活化过程中，由于体细胞超突变(即亲和力成熟)及重组类型转换的作用，BCR的多样性进一步增加。而IGH基因的互补决定区3(CDR3)刚好覆盖IGHV-Junction-IGHD-Junction-IGHJ区域，包括了IGH基因几乎全部的多样性信息，因此对于B淋巴细胞IGH基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反映BCR免疫组库的组成及应答状况。
传统的方法比如SSCP技术、GeneScan技术、荧光定量溶解曲线技术等，常存在覆盖率范围窄的缺点，不能满足数量繁多、种类多样的的检测。得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被用于干T细胞和B细胞受体的免疫组库测序。
目前，还未有报道提供一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物和方法。
发明内容
鉴于此，本发明第一方面提供了一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物和方法。
第一方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
本发明提供的带标签序列的引物可以给待测样品中的每个RNA分子或DNA分子都加上了一个标签序列，所述标签序列由ATCG四种基本碱基随机组合，且所述标签序列互不相同，例如，标签序列的碱基个数是八个时(本发明实施例中表示为8N标签序列)，可以获得109个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是七个时，可以获得108个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是六个时，可以获得107个不同的标签序列组合，所述标签序列的碱基个数是八个，或者七个，或者六个。
本发明提供的BCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的BCR序列，有利于BCR序列的多态性程度分析及BCR序列的长度多态性分布分析。
第二方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，包括如下步骤：
取待测样品；
采用多重PCR反应，扩增BCR，其中，多重PCR反应采用的引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成的下游引物组；
将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，获得检测结果。
优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。
当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通实验室采用的体系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组)，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组)。
优选地，所述待测RNA样品为(优选采用RNA试剂盒)提取猪外周血单个核细胞的获得的总RNA。
优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示核苷酸序列组成的下游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的上游引物，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
优选地，所述多重PCR反应的程序为：
上述程序具体为：98℃预变性1min，98℃变性20S,65℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次，最后72℃后延伸5min。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物在检测猪BCR多样性中的应用。
本发明提供的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物及方法的有益效果为：本发明提供的多重PCR引物组能高效构建猪的B淋巴细胞受体高通量测序文库，可获得丰富的BCR重排信息。
附图说明
图1为本发明实施例提供的多重PCR所得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2～图5为本发明实施例所得序列的VDJ重组分析结果。
具体实施方式
材料及试剂说明：
猪：来源于温氏集团，饲养按行业标准。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
具体地，本发明引物如下(下划线部分为测序公司接头序列)：
实施例1
本发明实施例1提供了一种B淋巴细胞受体(BCR)DNA样品的制备方法，包括如下步骤：
(1)收集的新鲜外周血样本各10毫升(ml)，按LymphoPrep试剂盒(Axis-shield,Cat.No.AS1114544UK)说明书操作，获得相对较纯的PBMC；
(2)采用采用QIAgenRNeasyMiniKit试剂盒提取步骤(1)所得细胞的基RNA，并用Qubit2.0系列测定RNA的浓度及纯度，然后保存RNA。
实施例2
本发明实施例2提供了一种采用猪BCR重链文库的多重PCR引物构建猪BCR重链高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)将实施例1所得总RNA反转录成cDNA，方法如下：
(1.1)冰上配置如下体系：
| 试剂 | 体积(ul) |
| RNA | 10 |
| SEq2-SEq6(10mM) | 2 |
| Total | 12 |
该体系中的SEq2-SEq6为在SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示序列上游加上测序接头后混合而成的引物组(具体为：接上illumina测序公司的下游引物接头序列后等摩尔混合，所述illumina测序公司的下游引物接头序列如SEQIDNO:8所示(具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书)，总RNA为实施例1所制备的总RNA，配置含有RNA的反应体系时所采用的水皆为无RNA酶的去离子水；
然后将该体系置于65℃下5min，再置于冰上；
(1.2)冰上配置如下体系：
| 试剂 | 体积(ul) |
| 5xReaction buffer | 4 |
| dNTP | 2 |
| RNase inhibitor | 1 |
| Reverse Transcription | 1 |
| 配置体系1的产物 | 12 |
| Total | 20 |
随后将该体系置于42℃下60min，然后72℃下5min，最后4℃保存所得cDNA；磁珠纯化以获得的第一链cDNA为模板
(2)合成cDNA第二链，方法如下：
以步骤(1)所得cDNA为模板(为混合物，其中含有cDNA，还有步骤(1)反应后剩余的下游引物组)，取序列为SEQIDNO:1所示的上游引物，再采用QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒，配置下述多重PCR体系：
| 试剂 | 体积(ul) |
| 2xQIAGEN Multiplex PCR Master | 25 |
| 5x Q-solution | 5 |
| Seq1(10Um) | 2 |
| cDNA | 18-20 |
| Total | 50 |
该体系中的Seq1为SEQIDNO:1所示序列的上游加上测序接头后的引物，具体为在SEQIDNO:1所示序列的5’端接上illumina测序公司的上游引物接头序列后等摩尔混合，所述illumina测序公司的上游引物接头序列如SEQIDNO:7所示(具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书)，再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：
PCR结束后，用1.5倍BACKMANCOULTERAgencourtAMPUTEXP磁珠与PCR产物在1.5mlEP管中混合均匀，静置2min，移至磁力架中放置3min，移去上清液，用200ul的80％无水乙醇进行洗脱，洗脱2次，接着在56℃下孵育2-3min直到磁珠龟裂取出，加入25ul的ddH2O溶解放置磁力架5min至澄清，上清液为纯化后的产物。
(3)二代测序文库构建
(3.1)PCR反应在DNA两端加上illumina测序用的接头
参照illumina高通量测序文库构建步骤，对磁珠纯化的产物进行2次PCR，PCR反应的试剂盒是BIOLabs的Q5酶，配置体系如下：
将所配置的体系按下述程序进行PCR反应：
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶，在120V电压下电泳1.1h，在紫外下切下452-509bp目的片段，进行切胶回收，溶胶的试剂盒为OMEGAbio-tekGelExtractionKit并纯化至30μL。
在溶胶回收的产物中，进行PCR反应，配置体系如下：
| 试剂 | 体积(ul) |
| Q5DNA polymerase | 0.5 |
| 5x Q5buffer | 5 |
| dNTP(10mM) | 1 |
| QP1 | 0.5 |
| QP2 | 0.5 |
| DNA | 17.5 |
| Total | 25 |
将配置的体系按下述程序进行PCR反应：
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶，在120V电压下电泳1.1h，然后通过凝胶成像检测目的条带，结果如图1，在紫外下切下452-509bp目的片段(目的片段参见泳道1和3；另外，泳道2是预实验发明人提取的RNA样品的扩增结果，由于存放时间较长，RNA样品降解，PCR效果不佳；M是DNAMarker)，进行切胶回收，溶胶的试剂盒为OMEGAbio-tckGelExtractionKIT并纯化至30μL，即为建库样本，Nanodrop2000测试DNA浓度，并送公司进行高通量测序(采用Illuminahiseq2000测序)。
使用Qubit2.0系列对不同建库样本浓度定量，然后按相同量混合。然后以稀释后的文库为模板，在Flowcell表面所固定的接头上进行桥式PCR扩增与变性，使用Illunima测序系统提供试剂，操作步骤按试剂盒进行，然后进行IllunimaMiSeq3*100pair-end测序，测序结果即为猪B淋巴细胞受体重链文库。然后将测序结果进行生物信息学统计分析，结果如图2、图3、图4、图5所示。
根据分析结果可知，V、D、J基因片段的丰度非常不一致，有些片段丰度显著高于其他片段，结果如图2、图3、图4所示；其中，图2为BCRV基因使用频率分布，图3为BCRD基因使用频率分布，图4为BCRJ基因使用频率分布。横坐标为不同的V，D，J基因家族，不同的V基因家族，纵坐标为每类V基因家族的序列占总序列数的百分比，可以看出：丰度最高的V基因片段为IGHv1-6，同样，D基因中，IGHD1占所有D基因最高。此外，我们发现，在J基因当中IGHJ5是100％。
图5显示BCRCDR3序列，呈正态分布，横坐标表示长度，纵坐标表示CDR3序列。
上述结果表明，利用本发明的方法构建猪BCR重链文库能够覆盖IGH基因的多样性信息。
Claims (9)
1.一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
2.如权利要求1所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
3.一种基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品；
采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物；其中，所述的多重PCR反应采用的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成的下游引物组；
将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，获得检测结果。
4.如权利要求3所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
5.如权利要求3所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，其特征在于，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。
6.如权利要求5所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，其特征在于，所述待测RNA样品为提取猪外周血单个核细胞获得的总RNA。
7.如权利要求3所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，其特征在于，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：以RNA样品为模板，以SEQIDNO:2～SEQIDNO:6所示核苷酸序列组成的下游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的上游引物，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
8.如权利要求3所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR方法，其特征在于，所述多重PCR反应的程序为：
9.如权利要求1所述的基于高通量测序构建猪BCR重链文库的多重PCR引物在检测猪BCR多样性中的应用。
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