CN109055519A - 一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途 - Google Patents

一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途。利用本发明的反转录引物，以总RNA为起始进行文库构建，能够改进现有技术中的测序数据质量低的问题，并实现低成本mRNA 3’末端混合建库。本发明的反转录引物对于动物和植物群体转录组的研究具有重要意义。

Description

一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途
技术领域
本发明涉及一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物及其用途。
背景技术
随着新一代高通量测序技术的快速发展，转录组测序(RNA-seq)已经成为研究转录组与基因表达的重要手段。然而，常规转录组研究技术主要存在以下问题：基因表达定量不准确、建库和测序价格高。
为了解决上述问题，目前已经开发了mRNA 3’末端测序技术，该技术提高了基因表达定量的敏感性和准确性。目前Lexogen公司的mRNA 3’末端建库试剂盒最多能混合96个样本(Lexogen，https：//www.lexogen.com/quantseq-3mrna-sequencing/# quantseqworkflow)，可以进行96个样本的自动化建库，该试剂盒省去了mRNA分离的复杂操作，前期操作简单成本低，但后期96个样本需要平行独立进行建库操作，而且该产品只有96个双端Index，上机时每条Lane最多只能混合96个样本，不适合目前Novoseq测序仪一条Lane需要混合大量样本产出800G以上数据的需求，不适合大规模群体文库构建。
为了进一步提高混合建库的通量和降低文库构建成本，2017年，Bush等(PLATE-Seq for genome-wide regulatory network analysis of high-throughput screens，Bush，E.C et al.，Nature Communications，8，DOI：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)建立了转录组表达合并文库扩增(PLATE-seq)技术，该技术使建库工作量大大降低，可在一定程度上降低建库成本，然而，PLATE-seq文库进行测序时，测序读段(reads)R1端样本标签Barcode序列以后的碱基质量很差，基本无法用于后续的数据分析。为避免数据浪费，Bush等只将测序读段(reads)R1端测了26bp以读取Barcode序列区分样本，后续分析全部使用测序读段(reads)R2端序列。因此，该方法构建的文库只能使用定制化的测序流程进行测序，如果采用目前反应次数固定的测序试剂盒，进行标准的双端150/100bp测序，测序读段(reads)R1端除barcode以外的碱基基本不能用于后续分析。
此外，本领域已知，Lexogen的Mrna 3’末端测序试剂盒市场价格约为260元/样本，PLATE-seq建库成本约为200元/样本，与常规转录组文库构建价格相比，尽管这两种建库方法的建库成本已经显著降低，但对于大量群体样本的高通量文库构建来讲，这两种建库方法的成本仍然偏高。
因此，对于基因表达定量准确并且建库成本低通量高的建库技术，目前在本领域中还存在着需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物以及混合建库的方法。
根据本发明的一个目的，提供了一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物，所述反转录引物包含VN碱基。
在一个实施方式中，所述反转录引物为96个mRNA的反转录引物。
在一个实施方式中，所述反转录引物选自表1所示的反转录引物：
表1
。
根据本发明的另一个目的，提供了一种mRNA 3’末端混合建库的方法，所述方法包括使用本发明的反转录引物对总RNA进行反转录。
在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mRNA，得到反转录的产物。
在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成。
在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：进行文库片段大小选择，以回收长度150-600bp的片段。
在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：进行PCR扩增，以富集模板DNA。
在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：用等体积的BeckmanAgencourt AMPure XP beads纯化PCR产物，获得mRNA 3’末端混合文库。
根据本发明的另一个目的，提供了一种mRNA 3’末端混合建库的方法，所述方法包括以下步骤：
使用权利要求1至3中的任一项所述的反转录引物对总RNA进行反转录；
将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mRNA，得到反转录的产物；
对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成；
进行文库片段大小选择，以回收150-600bp的片段；
进行PCR扩增，以富集模板DNA；
用等体积的Beckman Agencourt AMPure XP beads纯化PCR产物，获得mRNA 3’末端混合建库。
根据本发明的另一个目的，提供了一种使用本发明的反转录引物进行mRNA 3’末端混合建库的用途。
在一个实施方式中，所述的混合建库是mRNA 3’末端混合建库。
使用本发明的反转录引物能够带来以下有益的技术效果：
1)本发明以总RNA为起始直接进行反转录，省去了PLATE-seq建库技术的mRNA分离的复杂操作流程，降低了建库成本；
2)反转录时加入锚定碱基，保证从poly(A)的起始位点进行反转录，降低了测序读段(reads)中poly(A)碱基被连续测序的比例，显著提高了测序数据的质量；
3)操作简单，成本显著降低，成本降低至常规转录组的10％以下，建库成本约50元/样本；
4)配套测序平台NovoSeq、匹配相应的软件开发，建立了自动化、标准化、均一化、简便化的技术体系，使该项技术能够大规模广泛应用在各种动物和植物中，以满足高通量自动化群体转录组文库构建的要求。
附图说明
图1为总RNA琼脂糖凝胶电泳图，其中Marker是指全式金Trans 15K DNA Marker(货号：BM161-01)，总RNA为提取的植物总RNA(例如，从玉米叶片中提取的总RNA)。
图2为使用Agilent 2100检测的本发明建库片段长度分布图。
图3为使用Agilent 2100检测的对比实施例1建库片段长度分布图，其中对比实施例1与本发明的区别仅在于其反转录引物未加入锚定碱基(即VN碱基)，而本发明的反转录引物加入锚定碱基(即VN碱基)。
图4为使用Agilent 2100检测的对比实施例2(参照PLATE-seq文献方法，即PLATE-Seq for genome-wide regulatory network analysis of high-throughput screens，Bush，E.C et al.，Nature Communications，8，DOI：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)建库片段长度分布图。
图5为本发明和对比实施例1(参见上文描述)构建文库的T碱基频率分布图。
图6为本发明和对比实施例2(参见上文描述)构建文库的T碱基频率分布图。
图7为本发明和对比实施例1(参见上文描述)构建文库的检测基因数目，图7中的重叠基因是对比实施例1和本发明构建文库检测到的相同基因。
图8为本发明和对比实施例2(参见上文描述)构建文库的检测基因数目，图8中的重叠基因是对比实施例2和本发明建库检测到的相同基因。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式进一步阐述本发明的技术特点。应注意的是，以下具体实施方式仅是示例性的，其不应视为是对本发明的限制。
本发明mRNA 3’末端混合建库的反转录引物包含VN碱基；优选地，所述反转录引物为96个mRNA的反转录引物；更优选地，所述反转录引物选自上述表1所示的反转录引物。
本发明所述的建库方法包括如下步骤：
使用本发明的反转录引物对总RNA进行反转录；
将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mRNA，得到反转录的产物；
对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成；
进行文库片段大小选择，以回收150-600bp的片段；
进行PCR扩增，以富集模板DNA；
用等体积的Beckman Agencourt AMPure XP beads纯化PCR产物，获得mRNA 3’末端混合文库。
实施例
材料：
取温室培养的土培材料(玉米)，生长50天时，取顶部倒2叶，用Zymo的Direct-zolTMRNA MiniPrep Plus试剂提取总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，如图1所示，RNA条带清晰，没有明显的降解，可以用于后续的建库操作中。
RNA-seq 3’末端文库构建流程：
合成二链合成引物以及反转录的锚定引物(所述合成由Invitrogen公司进行)，然后用DEPC水稀释到100μM。
本发明文库构建流程：
以总RNA为起始，以本发明改进的反转录引物进行反转录和文库构建，流程如下：
(1)反转录：
以总RNA为起始，不进行mRNA的分离，进行如下操作，使反转录引物和mRNA互补结合；
取RNase/DNase free的200μl PCR管，加入浓度100μM的反转录引物3μl，总RNA 7μl，混匀离心，放置于PCR仪上，运行94℃2min，迅速置于冰上，离心。
加入以下试剂，进行mRNA的反转录：加入0.5mM dNTP，10mM DTT，35.8UProtoscript II Reverse Transcriptase(NEB)，轻混离心，放置于PCR仪上，运行25℃5min，42℃1h。cDNA可以于-20℃冰箱保存。
(2)降解模板mRNA：
加入1μl 4×Exonuclease I(NEB)，放置于PCR仪上，运行25℃1h；
加入20μl体积比为1∶1的NaOH(1M)和EDTA(0.5M)的混合物，放置于PCR仪上，运行65℃15min；
加入6M盐酸中和。
(3)使用QIAGEN MinElute PCR Purification Kit进行纯化(货号：28004)具体操作按照产品说明进行，用16μl超纯水洗脱。
(4)合成cDNA的互补链：
加1μl 10mM的dNTP和5μl 100μM二链合成引物，放置于PCR仪上，运行70℃2min，迅速放置于冰上5min；
加1μl klenow large fragment DNA polymerase(NEB)，放置于PCR仪上，运行37℃30min；
加入EDTA直至cDNA为50μM时终止反应。
(5)片段选择：
配置2％的琼脂糖凝胶，进行电泳，切取长度150-600bp的片段，使用QIAGENMinElute Gel Extraction Kit(货号：28604)进行DNA回收和纯化。
(6)PCR扩增：
将纯化产物加入NEB Phusion高保真酶和0.5μM Illumina RP1 primer和Illumina Index primer，放置于PCR仪上，进行PCR扩增，其中扩增条件为：98℃30s；98℃，15s；62℃，15s；72℃，60s，运行10-12个循环；72℃，7min；4℃，保持。
(7)PCR产物纯化：
使用等体积的Beckman Agencourt AMPure XP beads(货号：A63881)进行PCR产物纯化，具体流程参照产品说明进行，最后用22μl超纯水溶，吸上清，获得文库模板DNA。
对比实施例1
使用表2的未加锚定碱基(即没有VN碱基)的反转录引物进行反转录，其中文库构建实验流程与本发明上述的文库构建流程相同。
表2
对比实施例2
使用表2的未加锚定碱基(即VN碱基)的反转录引物(参见)进行反转录，其中文库构建流程参照Bush文献报道(PLATE-Seq for genome-wide regulatory networkanalysis of high-throughput screens，Bush，E.C et al.，Nature Communications，8，DOI：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)的方法。
对上述文库进行质量检测，文库质量合格后，在Illumina测序平台HiseqX10进行PE150双端测序，每个文库测序数据量0.5Gb以上。文库下机数据进行过滤，去掉接头序列和低质量碱基，根据样本不同barcode标签分离样本数据，用STAR aligner version 2.5.3a2(STAR：Ultrafast universal RNA-seq aligner，Dobin，A.，et al.，Bioinformatics，29(1)，15-21，2012)将reads比对到玉米参考基因组(AGPv4)。
结果与分析
PLATE-seq建库技术首先需要进行mRNA的分离，以mRNA为起始进行反转录，反转录引物3’端为oligo(T)，可以与poly(A)尾不同位点随机结合起始反转录，导致文库插入片段一端含有大量的T碱基，引起测序时碱基质量的下降导致数据不可用。
由图5可以看出，本发明通过加入锚定碱基(即VN碱基)，显著降低了测序读段(reads)中T碱基的比例。对比实施例1中未加入锚定碱基时，测序读段(reads)中长度20～30个连续T碱基的频率为63％，相比之下，本发明加入锚定碱基后，测序读段(reads)中长度20～30个连续T碱基的频率降低为8％，69％的测序读段(reads)中连续T碱基长度降低为20以下。
由图6可以看出，与对比实施例2(Bush文献报道的PLATE-seq方法)相比(其中测序读段(reads)中长度20～30个连续T碱基的频率为67％)，本发明也显著降低了测序读段(reads)中T碱基的比例。
以上结果说明本发明的加入锚定碱基(即VN碱基)后的反转录引物能显著降低测序读段(reads)中T碱基的比例。
此外，对比分析本发明和对比实施例1、2的检测基因的数目，结果表明(参见图7、图8)，使用本发明的反转录引物和方法，在不同测序数据量条件下，检测基因数目平均提高20％以上。
综上所述，以上结果表明，本发明通过对反转录引物进行重新设计并对实验流程进行改进，取得了以下有益效果：①实现了直接以总RNA为起始进行文库构建，简化了mRNA3’末端混合建库的流程，降低了建库成本，建库成本约50元/样本，远低于PLATE-seq建库成本(约为200元/样本)和Lexogen试剂盒的成本(约为260元/样本)；②应用本发明改进的实验流程，显著提高了文库测序数据的质量；③相同测序数据量条件下，与PLATE-seq方法相比，显著提高了检测基因的数目，提高了基因检测的灵敏度。

Claims (12)

1.一种mRNA 3’末端混合建库的反转录引物，所述反转录引物包含VN碱基。
2.根据权利要求1所述的mRNA 3’末端混合建库的反转录引物，其中所述反转录引物为96个mRNA的反转录引物。
3.根据权利要求1或2所述的mRNA 3’末端混合建库的反转录引物，其中所述反转录引物选自下表所示的反转录引物：
。
4.一种mRNA 3’末端混合建库的方法，所述方法包括使用权利要求1至3中的任一项所述的反转录引物对总RNA进行反转录。
5.根据权利要求4所述的方法，还可包括以下步骤：将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mRNA，得到反转录的产物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，还可包括以下步骤：对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成。
7.根据权利要求4至6中的任一项所述的方法，还可包括以下步骤：进行文库片段大小选择，以回收长度150-600bp的片段。
8.根据权利要求4至7中的任一项所述的方法，还可包括以下步骤：进行PCR扩增，以富集模板DNA。
9.根据权利要求4至8中的任一项所述的方法，还可包括以下步骤：用等体积的BeckmanAgencourt AMPure XP beads纯化PCR产物，获得mRNA 3’末端混合文库。
10.一种mRNA 3’末端混合建库的方法，所述方法包括：
使用权利要求1至3中的任一项所述的反转录引物对总RNA进行反转录；
将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mRNA，得到反转录的产物；
对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成；
进行文库片段大小选择，以回收长度150-600bp的片段；
进行PCR扩增，以富集模板DNA；
用等体积的Beckman Agencourt AMPure XP beads纯化PCR产物，获得mRNA 3’末端混合文库。
11.一种使用权利要求1至3中的任一项所述的反转录引物进行混合建库的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述的混合建库是mRNA 3’末端混合文库。
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