CN104630211B

CN104630211B - 一种Small RNA cDNA文库的构建方法

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Publication number: CN104630211B
Application number: CN201310572334.1A
Authority: CN
Inventors: 郭良让; 孙少华; 苗茹
Original assignee: SUZHOU GENEPHARMA CO Ltd
Current assignee: SUZHOU GENEPHARMA CO Ltd
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2033-11-15
Also published as: CN104630211A

Abstract

本发明公开了一种Small RNA cDNA文库的构建方法。本发明公开的一组DNA分子，该组分子由如下（1）‑（4）所示的四种分子组成：（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。本发明公开的一种Small RNA快速分离的方法解决了目前丙烯酰胺凝胶电泳分离Small RNA时间长，操作复杂，要求较高、毒性大的问题。并且，本发明公开的一种Small RNA cDNA文库的构建方法减少了非特异性产物，增加了目的产物含量，并且该方法较传统方法简便快捷。

Description

一种Small RNA cDNA文库的构建方法

技术领域

本发明涉及一种Small RNA cDNA文库的构建方法。

背景技术

生物技术和生命科学将成为21世纪引发新科技革命的重要推动力量，包括我国在内的诸多国家已将其列入优先发展的重点研究领域，而基因测序技术作为生物产业发展的核心共性技术，已成为各发达国家竞相抢占的科技制高点，而相关的技术均被少数几家欧美公司所垄断且设备价格昂贵。

基因测序要用基因测序仪和测序试剂，而基因测序仪和试剂盒的生产因为涉及有机化学合成，基因改造，催化酶合成和测序等多方面的技术，工艺复杂，质量要求高，目前主要只有三个美国生产厂家，而一台仪器一年的试剂费用达1000多万元。因为消耗高，我国很多高价购置的测序仪都处于闲置和瘫痪状态。

基因测序工作仍然与我们密切相关,因为蛋白质组仅能告诉我们疾病的分子症状,而基因才是引发疾病的根本原因。若要进行疾病预测,疾病敏感基因的鉴定就必不可少。只有综合运用遗传学,蛋白组学,转录组学和代谢组学才能推动个体化医疗前进。

高通量测序技术，是近几年出现的一项革命性测序技术,利用其高通量高覆盖度的优势,可以在极短的时间内获取数百万甚至数十亿的序列数据信息。目前在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。

科学往往是在技术的竞争中发展进步的,高通量测序技术的发展亦是如此,随着第三代测序技术的发展,个体化医疗等诸多生命科学与医学问题的解决很大程度上依托测序技术的发展，应用前景非常广阔，市场非常巨大。

发明内容

本发明的目的是提供一种Small RNA（microRNAs、siRNAs和piRNAs）cDNA文库的构建方法。

本发明提供的一组DNA分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：

（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。

一组3’接头分子也属于本发明的保护范围，该组分子是将上述DNA分子的5’末端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团制成；

所述封闭基团具体为氨基、2',3'-双脱氧胞嘧啶核苷或3’倒置的脱氧腺嘌呤核苷。

一组反转录引物也属于本发明的保护范围，该组引物由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：

（1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；

（2）SEQ ID No.6所示的DNA分子；

（3）SEQ ID No.7所示的DNA分子；

（4）SEQ ID No.8所示的DNA分子。

5’接头分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID No.9所示。

上述5’接头分子中，所述分子的碱基全部进行2’甲氧基修饰或硫代修饰。

一对引物也属于本发明的保护范围，该对引物由如下（1）和（2）所示的两种分子组成：

（1）SEQ ID No.11所示的DNA分子；

SEQ ID No.11所示的DNA分子中的5’-GTCTCCGACTCAG-3’序列与上述任一所述的5’接头分子的部分序列一致；

（2）SEQ ID No.12所示的DNA分子；

SEQ ID No.12所示的DNA分子中的5’-TCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’序列与上述一组DNA分子或上述3’接头分子的部分序列互补。

一种构建Small RNA cDNA文库的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述DNA分子或上述3’接头分子、上述反转录引物、上述任一所述的5’接头分子和所述的引物组成。

上述试剂盒中，所述试剂盒还包含RNA连接酶反应缓冲液、DMSO或PEG、不含核酸酶的水、截短型T₄RNA连接酶2、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏糖醇、反转录酶、ATP、T₄RNA连接酶1、高保真PCR扩增缓冲液、dNTPs和高保真DNA聚合酶。

一种分离Small RNA的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：

（一）提取总RNA；

（二）将总RNA转移至超滤柱中，12000rpm离心15min，得滤液；

（三）转移滤液至管中，加滤液1/10体积的3M NaAc和3倍体积无水乙醇，-20℃冻存30min；

（四）4℃12000rpm离心30min，去上清，得沉淀；

（五）在沉淀中加体积百分含量为80%的乙醇水溶液，4℃12000rpm离心5min，去上清，风干得沉淀；

（六）重复步骤（五）一次，得沉淀，即为Small RNA。

一种构建Small RNA cDNA文库的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：

（一）从样品中分离Small RNA；

（二）在Small RNA分子的3’末端连接上述3’接头分子；

（三）将步骤（二）得到的分子与上述反转录引物退火，得到退火产物；退火产物中引物与上述3’接头分子互补成双链结构；

（四）将退火产物进行cDNA第一链的合成；

（五）在步骤（四）的产物的5’末端连接上述任一所述的5’接头分子；

（六）以步骤（五）的产物为模板，以上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（七）回收PCR扩增产物中长度为100±10bp条带，进行纯化，得Small RNA cDNA文库；

所述步骤（一）中分离Small RNA的方法具体为上述分离Small RNA的方法；

上述方法中，所述步骤（二）的具体步骤如下：

（一）将步骤（一）分离的Small RNA、上述3’接头分子、RNA连接酶反应缓冲液、DMSO或PEG、不含核酸酶的水混合，得体系1；将体系1置于95℃30s,立即冰上放置2min，得反应液1；

所述体系1的体积为13.5ul，所述Small RNA在体系1中的质量大于等于45ng，所述3’接头分子在体系1中的质量为2×10^-11μmol，所述RNA连接酶反应缓冲液的商品名称为T₄RNA Ligase Reaction Buffer，购自NEB公司，产品目录号为B0216，所述DMSO在体系1中的体积百分含量为5-20%，或所述PEG在体系1中的体积百分含量为10-50%；

（二）在反应液1中加入截短型T₄RNA连接酶2和RNA酶抑制剂，得体系2；将体系2置于22℃连接1-2小时，得到在3’末端连接上述3’接头分子的Small RNA分子；

所述体系2的体积为15ul，所述截短型T₄RNA连接酶2在体系2中的酶活为300U，所述RNA酶抑制剂在体系2中的酶活为20U；

所述截短型T₄RNA连接酶2的商品名称为T₄RNA Ligase2,truncated，购自NEB公司，产品目录号为M0242；

所述RnaseOut购自Life Technologies公司，产品目录号为10777-019。

上述任一所述的方法中，所述步骤（三）的具体步骤如下：

将步骤（二）得到的产物与上述反转录引物混合，得体系3；将体系3置于90℃30s，50℃5min，然后25℃放置10min，得到退火产物；

所述体系3的体积为16ul，所述步骤（二）得到的产物在体系3中的体积为15ul，所述反转录引物中各引物的质量为5×10^-12mol。

上述任一所述的方法中，所述步骤（四）的具体步骤如下：

将退火产物与不含核酸酶的水、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏糖醇、反转录酶混合，进行cDNA第一链的合成。

上述任一所述的方法中，所述步骤（五）的具体步骤如下：

将步骤（四）的产物与上述任一所述的5’接头分子、ATP、T₄RNA连接酶1混合，得体系4；将体系4置于20℃连接1小时，得连接产物；

所述体系4的体积为20ul，所述步骤（四）的产物在体系4中的体积为16ul，所述T₄RNA连接酶1的酶活为20U，所述ATP在体系4中的浓度为1mM，所述5’接头分子在体系4中的浓度为1uM；

所述T₄RNA连接酶1的商品名称为T₄RNA Ligase1，购自NEB公司，产品目录号为#M0204。

上述任一所述的方法中，所述步骤（七）的纯化方法具体步骤如下：

将步骤（六）得到产物进行PAGE凝胶电泳，切下长度为100±10bp的凝胶条带，用0.3M NaCl浸泡，将凝胶转移至凝胶过滤管中，收集滤液；加入1μL用ddH₂O配制的20mg/mL糖原以及2-5倍体积的无水乙醇，-20℃放置半小时，12000rpm离心，弃上清，加入体积百分含量为80%的乙醇水溶液；12000rpm离心，弃上清，加入体积百分含量为80%的乙醇水溶液；12000rpm离心弃上清，室温风干，得Small RNA cDNA 沉淀，即为Small RNA cDNA文库。

和/或，

上述DNA分子、上述3’接头分子、上述反转录引物、上述任一所述的5’接头分子和/或上述引物在构建Small RNA cDNA文库中的应用也属于本发明的保护范围；

和/或，

上述任一所述的试剂盒在构建Small RNA cDNA文库中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的一种Small RNA快速分离的方法解决了目前聚丙烯酰胺凝胶电泳分离Small RNA时间长，操作复杂，要求较高、毒性大的问题。

另外，本发明的一种Small RNA cDNA文库的构建方法减少了非特异性产物，增加了目的产物含量，并且该方法简便快捷，解决了传统方法的分步连接、多步聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶分离的周期长、成功率低、接头污染高导致的Small RNA cDNA文库质量不高等问题。

附图说明

图1为Small RNA cDNA文库的构建路线图。

图2为Small RNA cDNA的PAGE凝胶电泳。

图3为Small RNA cDNA文库Agilent2100生物分析仪质检图。

图4为Small RNA cDNA文库高通量测序长度分布图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用以限定本发明。

超滤柱购自Millipore公司，产品目录号为FC503024。

糖原购自Fermentas公司，产品目录号为#R0551。

T₄RNA Ligase2,truncated购自NEB公司，产品目录号为M0242。

T₄RNA Ligase1购自NEB公司，产品目录号为#M0204。

Superscript III ReverseTranscriptase购自Life Technologies公司，产品目录号为18080-093。

Phusion High-Fidelity DNA Polymerases购自NEB公司，产品目录号为M0530L。

293T细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，产品目录号为SCSP-q04。

5×First Stand Buffer购自Life Technologies公司。

5×Phusion HF buffer购自NEB公司。

T₄RNA Ligase Reaction Buffer购自NEB公司，产品目录号为B0216。

RnaseOut购自Life Technologies公司，产品目录号为10777-019。

实施例1、Small RNA cDNA文库的构建

Small RNA cDNA文库的构建路线图如图1所示。

一、Small RNA的分离

（一）提取293T细胞的总RNA，取10μg用不含核酸酶的水稀释至200μL。

（二）将总RNA转移至超滤柱中，12000rpm离心15min，得滤液。

（三）转移滤液至1.5mL管中，加1/10体积的3M NaAc和3倍体积无水乙醇，-20℃冻存30min。

（四）4℃12000rpm离心30min，去上清，得沉淀。

（五）在沉淀中加1mL体积百分含量为80%的乙醇水溶液，4℃12000rpm离心5min，去上清，风干，得沉淀。

（六）重复步骤（五）一次，加10μL不含核酸酶的水充分溶解沉淀，得Small RNA。

二、连接3’接头

（一）按照表1配制3’接头连接体系

表1 3’接头连接体系

体系中的DMSO也可以用体积百分含量为10%-50%的PEG代替。

表1中的3’接头序列为如下四种单链DNA经过修饰后的序列的混合物。

5’-AATCACCGACTGCCCATAGAGA-3’；（SEQ ID No.1）

5’-TATCACCGACTGCCCATAGAGA-3’；（SEQ ID No.2）

5’-CATCACCGACTGCCCATAGAGA-3’；（SEQ ID No.3）

5’-GATCACCGACTGCCCATAGAGA-3’。（SEQ ID No.4）

将上述四种单链DNA的5’末端由rApp修饰，3’末端由氨基，ddC（2',3'-双脱氧胞嘧啶核苷）或IDT（3’倒置的脱氧腺嘌呤核苷，3’inverted dT）等封闭基团修饰。

本实施例中3’接头序列由如下四种序列组成，各序列浓度均为5μmol/L。

5’-rAppAATCACCGACTGCCCATAGAGAddC-3’；

5’-rAppTATCACCGACTGCCCATAGAGAddC-3’；

5’-rAppCATCACCGACTGCCCATAGAGAddC-3’；

5’-rAppGATCACCGACTGCCCATAGAGAddC-3’。

（二）将表1的连接体系置于95℃30s,立即冰上放置2min。

（三）在连接体系中加入200U/ul的T₄RNA Ligase2,truncated1.5ul，40U/ul的RnaseOut0.5ul。

（四）将体系置于22℃连接1-2小时，得到连接3’接头的RNA序列，一个Small RNA分子的3’末端连接一个3’接头序列。

三、与反转录引物退火

将1μL反转录引物与15μL步骤二制备的连接有3’接头序列的Small RNA分子退火，退火条件为90℃孵育30s，50℃孵育5min，然后25℃放置10min，形成双链，得到退火产物。

反转录引物为如下四种DNA序列的混合物，各序列浓度均为5uM。

5’-GTCTCTATGGGCAGTCGGTGATT-3’；（SEQ ID No.5）

5’-GTCTCTATGGGCAGTCGGTGATA-3’；（SEQ ID No.6）

5’-GTCTCTATGGGCAGTCGGTGATG-3’；（SEQ ID No.7）

5’-GTCTCTATGGGCAGTCGGTGATC-3’。（SEQ ID No.8）

SEQ ID No.5与SEQ ID No.13’末端加ddC的序列互补；SEQ ID No.6与SEQ IDNo.23’末端加ddC的序列互补；SEQ ID No.7与SEQ ID No.33’末端加ddC的序列互补；SEQID No.8与SEQ ID No.43’末端加ddC的序列互补。

四、合成cDNA第一链

按照表2在冰上配制如下体系。

表2 cDNA第一链合成体系

将表2的体系置于48℃反转录60min，得到cDNA第一链。

五、连接5’接头

（一）5’接头序列为5’-GUCUCCGACUCAGNNNNNNNNNNGAU-3’(SEQ ID No.9)其中5’-NNNNNNNNNN-3’包括但不限于以下序列中的任一种：

（1）5’-cuaagguaac-3’；

（2）5’-uaaggagaac-3’；

（3）5’-aagaggauuc-3’；

（4）5’-uaccaagauc-3’；

（5）5’-cagaaggaac-3’；

（6）5’-cugcaaguuc-3’；

（7）5’-uucgugauuc-3’；

（8）5’-uuccgauaac-3’；

（9）5’-ugagcggaac-3’；

（10）5’-cugaccgaac-3’；

（11）5’-uccucgaauc-3’；

（12）5’-uaggugguuc-3’；

（13）5’-ucuaacggac-3’；

（14）5’-uuggaguguc-3’；

（15）5’-ucuagagguc-3’；

（16）5’-ucuggaugac-3’。

本实施例是将5’接头序列5’-GUCUCCGACUCAGCUAAGGUAACGAU-3’(SEQ ID No.10)进行2’甲氧基修饰，或硫代修饰，或无修饰。本实施例中的5’接头序列进行全部碱基2’甲氧基修饰，再将其置于70℃加热2min。

（二）按照表3配制5’接头连接体系

表3 5’接头连接体系

将表3的体系置于20℃连接1小时。

六、cDNA扩增

按照表4配制cDNA扩增体系。

表4 cDNA扩增体系

表4中的引物如下：

正向引物：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3’；（SEQ ID No.11）

下划线所示序列与5’接头序列的部分序列一致。

反向引物：5’-CCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’。（SEQ ID No.12）

下划线所示序列与3’接头序列的部分序列互补。

扩增程序：98℃30s；98℃10s,60℃30s，72℃20s，20个循环；72℃5min。

此步骤得到产物即为Small RNA cDNA。

同时，提取293T细胞的总RNA，取10μg总RNA用传统的cDNA文库构建过程中的15%PAGE尿素胶分离Small RNA，切下18-35bp的条带，用枪头捣碎后，用0.3M NaCl洗脱，转移洗脱液至1.5mL离心管中，沉淀，风干后分离得到Small RNA,用10μL DEPC水溶解。按照步骤二到步骤六的方法得到对照Small RNA cDNA。

步骤六得到的Small RNA cDNA和对照Small RNA cDNA进行PAGE凝胶电泳，结果如图2所示。

图2A为对照Small RNA cDNA PAGE凝胶电泳。

图2B为Small RNA cDNA PAGE凝胶电泳。

图2A中，1为对照Small RNA cDNA，M为DNA Marker。

图2B中，1为Small RNA cDNA，M为DNA Marker。

图2表明，Small RNA cDNA条带在100bp左右，清晰可见，而对照Small RNA cDNA有许多弥散条带。

七、cDNA纯化

（一）切下Small RNA cDNA条带（100±10bp），用枪头捣碎处理，得到含有SmallRNA cDNA的凝胶。

（二）用0.3M NaCl浸泡凝胶四小时。

（三）转移凝胶至凝胶过滤管中，收集滤液至1.5mL离心管中。

（四）加入1μL用ddH₂O配制的20mg/mL糖原以及2-5倍体积的无水乙醇，-20℃放置半小时。

（五）12000rpm离心30分钟，弃上清，加入1mL体积百分含量为80%的乙醇水溶液。

（六）12000rpm离心5分钟，弃上清，加入1mL体积百分含量为80%的乙醇水溶液。

（七）12000rpm离心5分钟，弃上清，室温风干，得Small RNA cDNA沉淀。

（八）用10μL DEPC水溶解沉淀，得Small RNA cDNA文库。

八、文库的检测

Agilent2100生物分析仪对文库进行质检。

按照Agilent2100生物分析仪操作说明书对Small RNA cDNA文库进行质检，结果如图3所示。

图3表明，Small RNA cDNA文库片段（连有接头序列）长度分布在100bp左右，正是Small RNA cDNA条带（连有接头序列）分布的范围，证明该文库构建正确。

九、高通量测序验证文库

按照Ion Torrent个体化操作基因组测序仪操作说明书对Small RNA cDNA文库进行测序，统计各个长度的序列分布，结果如图4所示。

图4表明，文库中的片段（除去接头序列）长度主要为18-25bp之间，而microRNA长度正好在这一范围内，进一步证明该文库构建正确。

Claims

1.一种构建Small RNA cDNA文库的试剂盒，该试剂盒包含一组3’接头分子、一组反转录引物、5’接头分子和一对引物；

所述一组3’接头分子是将一组DNA分子的5’末端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团制成；

所述一组DNA分子由如下(1)-(4)所示的四种分子组成：

(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(4)SEQ ID No.4所示的DNA分子。

所述封闭基团具体为氨基、2',3'-双脱氧胞嘧啶核苷或3’倒置的脱氧腺嘌呤核苷；

所述一组反转录引物由如下(1)-(4)所示的四种分子组成：

(1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.6所示的DNA分子；

(3)SEQ ID No.7所示的DNA分子；

(4)SEQ ID No.8所示的DNA分子；

所述5’接头分子的序列如SEQ ID No.9所示；

所述5’接头分子的序列中的碱基全部进行2’甲氧基修饰或硫代修饰；

所述一对引物由如下(1)和(2)所示的两种分子组成：

(1)SEQ ID No.11所示的DNA分子；

SEQ ID No.11所示的DNA分子中的5’-GTCTCCGACTCAG-3’序列与所述5’接头分子的部分序列一致；

(2)SEQ ID No.12所示的DNA分子；

SEQ ID No.12所示的DNA分子中的5’-TCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’序列与所述3’接头分子的部分序列互补。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含RNA连接酶反应缓冲液、DMSO或PEG、不含核酸酶的水、截短型T₄RNA连接酶2、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏糖醇、反转录酶、ATP、T₄RNA连接酶1、高保真PCR扩增缓冲液、dNTPs和高保真DNA聚合酶。

3.一种构建Small RNA cDNA文库的方法，包括如下步骤：

(一)从样品中分离Small RNA；

(二)在Small RNA分子的3’末端连接权利要求1或2所述试剂盒中所述的3’接头分子；

(三)将步骤(二)得到的分子与权利要求1或2所述试剂盒中所述的反转录引物退火，得到退火产物；退火产物中的反转录引物与所述3’接头分子互补成双链结构；

(四)将退火产物进行cDNA第一链的合成；

(五)在步骤(四)的产物的5’末端连接权利要求1或2所述试剂盒中所述的5’接头分子；

(六)以步骤(五)的产物为模板，以权利要求1或2所述试剂盒中所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(七)回收PCR扩增产物中长度为100+10bp条带，进行纯化，得Small RNA cDNA文库；

所述步骤(一)中分离Small RNA的方法包括如下步骤：

(一)提取总RNA；

(二)将总RNA转移至超滤柱中，12000rpm离心15min，得滤液；

(三)转移滤液至管中，加滤液1/10体积的3M NaAc和3倍体积无水乙醇，-20℃冻存30min；

(四)4℃12000rpm离心30min，去上清，得沉淀；

(五)在沉淀中加体积百分含量为80％的乙醇水溶液，4℃12000rpm离心5min，去上清，风干得沉淀；

(六)重复步骤(五)一次，得沉淀，即为Small RNA。

4.权利要求1或2所述的试剂盒在构建Small RNA cDNA文库中的应用。