CN106755337A - 一种细胞染色体分析快速建库方法及试剂盒 - Google Patents

一种细胞染色体分析快速建库方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞染色体分析快速建库方法，包括以下步骤：(1)细胞中直接加入蛋白酶K裂解细胞；(2)直接往步骤1反应体系中加入DNA破碎酶和DNA末端补平试剂，(3)直接向步骤2反应体系中加入DNA连接试剂，使目标待测DNA与DNA接头连接。本发明可供高通量测序仪检测的测序文库，可实现单管试验，无需基因组DNA提取、无需PCR扩增、无需步骤间纯化，从而使基于微量细胞的染色体测序检测更快速和更简便。本发明还公开了一种细胞染色体分析快速建库试剂盒。

Description

一种细胞染色体分析快速建库方法及试剂盒
技术领域
本发明属于细胞染色体检测领域，具体涉及一种用于检测染色体结构变异的DNA测序文库的构建方法及试剂盒。
背景技术
每一个人类细胞都有23对染色体，在遗传和自然过程中，有些染色体结构发生了改变，从而造成了各种出生缺陷、不明原因的流产。常见的染色体结构变异有以下几类：
1.缺失：染色体中某一片段的缺失例如，猫叫综合征是人的第5号染色体部分缺失引起的遗传病，因为患病儿童哭声轻，音调高，很像猫叫而得名。
2.重复：染色体增加了某一片段果蝇的棒眼现象就是X染色体上的部分重复引起的。
3.倒位：染色体某一片段的位置颠倒了180度，造成染色体内的重新排列如女性习惯性流产(第9号染色体长臂倒置)
4.易位：染色体的某一片段移接到另一条非同源染色体上或同一条染色体上的不同区域如惯性粒白血病(第14号与第22号染色体部分易位)。
为了更好地理解出生缺陷的原因，反复流产的原因以及预防，经常需要对细胞的染色体进行检测分析。最常规的方法为细胞核型，核型指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色体数目、大小、形态特征的总和。细胞核型分析是在有经验的遗传技术人员操作下，通过显微镜肉眼观察所得，因此检测的分辨率只能基于大于5mb的区域的插入缺失以及大范围的平衡异位，至于大量发生的微缺失微重复常规的核型分析的方法无法发现。
近年来开始出现利用高通量测序进行染色体结构变异分析的方法。高通量测序是通过大规模平行测序，每次检测数千万条序列，可以精准的定性、定量微缺失微重复、碱基变异、插入缺失等等。
市场上主流的高通量测序仪主要由Illumina、ThermoFisher等提供，任何一种高通量测序平台在进行检测前都会要求首先把待测DNA样本构建测序文库，即在待测DNA两端连接上测序仪通用的接头DNA序列，从而让该待测片段DNA可以在测序仪不同的芯片上进行测序反应。
高通量测序文库构建的基本流程是：1.DNA打碎；2.末端补平；3.碱基最后增加一个A；4.连接接头；5.PCR扩增。由于每一步都有独立的酶和缓冲体系，所以在常规的高通量测序文库构建过程中，每一次反应中间都需要进行基于硅胶柱或磁性颗粒的DNA纯化。也就说常规的高通量测序文库构建流程有：1.DNA打碎；2.纯化；3.末端补平；4.纯化；5.碱基最后增加一个A；6.纯化；7.连接接头；8.纯化；9.PCR扩增等9个步骤。整个试验流程需要8个小时，费时费力。
同时建库的起始样本为基因组DNA，所有临床样本都需要经过基因组DNA提取这个步骤，一般来说是通过蛋白酶K裂解蛋白，高盐溶液变性蛋白质，将基因组DNA和蛋白质解离出来，和硅胶柱或磁性颗粒进行结合，经过2～3次80％乙醇清洗去除杂质，最后用洗脱液把DNA从硅胶柱或磁性颗粒上洗脱下来。整个过程需要40～60分钟。
因此整个试验过程，每个样本需要9个小时时间，费时费力。
发明内容
本发明提供了一种细胞染色体分析快速建库方法，用于检测细胞染色体结构变异，是一种可实现单管、无基因组DNA提取、无需PCR扩增、无纯化的DNA建库方法，整个过程可在1个小时内完成。
一种细胞染色体分析快速建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)细胞中直接加入蛋白酶K，裂解细胞；
2)直接往步骤1反应体系中加入DNA破碎酶和DNA末端补平试剂；
3)直接往步骤2反应体系中加入DNA连接试剂，使目标待测DNA与DNA接头连接。
本发明首先省却了常规所需的基因组DNA提取过程，让蛋白酶K在没有高盐的缓冲液情况下直接裂解细胞，因为没有高盐和常见的异丙醇等核酸提取的试剂的存在，虽然提取效率和效果不如常规的方法，但是反应的体系环境适合后续试剂持续加入的单管法。
其次本发明整合DNA破碎和末端补平加A在一步完成，在完成DNA破碎的同时进行末端的补平和加A，反应时间大大缩短，随后不需要纯化DNA，直接在反应体系中加入DNA连接酶及DNA接头，完成文库构建。
整个过程在一个反应体系中完成，细胞样本加入试管后，分别加入三步试剂，不需要纯化和PCR扩增，反应体系在一个试管中完成。最终产物可直接在illumina HiSeq、NextSeq CN500、NextSeq 550AR、MiSeq、Miseq Dx、MiniSeq等测序仪上直接检测使用。
进一步地，细胞来源可以为全血、白细胞、胎儿有核红细胞、羊水中胎儿脱落细胞等。
步骤1为直接在细胞中加入蛋白酶K裂解细胞，反应条件是60℃20分钟，95℃5分钟灭活。
步骤2所述DNA破碎酶为脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、核酸外切酶III的一种或多种；所述DNA末端补平试剂由DNA末端补平酶、dNTPs和Tris缓冲液组成，DNA末端补平酶为T4 DNA聚合酶、Klenowexo-、T4 DNA磷酸激酶(T4 DNA PNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一种或多种。步骤2反应条件是37℃20分钟，75℃5分钟灭活，反应后无需纯化。
所述DNA连接试剂主要由T4 DNA连接酶和DNA接头组成。步骤3反应条件是20℃15～20分钟，反应后无需纯化。
本发明的细胞染色体快速分析建库方法中包括四种酶蛋白：(1)蛋白酶K；(2)DNA破碎酶(脱氧核糖核酸酶I和或脱氧核糖核酸酶II、核酸外切酶III)；(3)DNA末端补平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-、T4 DNA PNK、Taq或Klenow酶)；(4)DNA连接酶。
本发明依靠这四类酶的组合以及无盐的缓冲体系，创新地把细胞染色体快速建库方法缩短到3步，更重要的整个反应在一个试管进行，速度大大加快，每一步试验环节为向试管内添加下一步试剂，反应继续进行。
本发明创造性地仅仅使用蛋白酶K进行降解细胞，而不使用常规都会采用的高浓度盐离子缓冲系统以及异丙醇等附加液体，使得整个反应体系环境中和，便于后续反应试剂持续添加。
本发明又创造性地把DNA破碎和DNA补平加A放在一步进行，常规的DNA破碎有机械力方式和酶切方式，本发明选用了酶切方式，并把DNA补平酶加A酶一起加入反应体系，在一个反应体系中酶切下来的DNA被直接进行了末端补平和加A，两个反应体系之间不冲突，大大节约了反应时间。
本发明还实现了前步产物和DNA接头连接后可以直接测序，无需通过常规的PCR扩增，从而也大大加快了试验流程，减少了PCR扩增常见的核酸气溶胶污染可能。
针对细胞染色体结构分析文库构建，本发明大大简化了试验流程、减少了制备过程中的损耗、避免了PCR气溶胶污染，使得的染色分析更加稳定，所需样本量更低，成本更低，病人依从度更高。这种无需扩增的细胞染色体分析测序文库构建技术，是一个更快速、更准确的高通量测序检测技术。
本发明的第二个目的是提供一种构建用于细胞染色体检测的试剂盒，采用该试剂盒，无需进行PCR扩增。
一种构建游离DNA文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要包括蛋白酶K、DNA破碎酶、DNA末端补平酶、dNTP、ATP、DNA连接酶和DNA接头。
上述试剂中分成三组试剂，第一组为蛋白酶K：由100ul 20mg/ml蛋白酶K，55mM的Tris缓冲液组成，裂解细胞的反应条件为60℃20分钟，95℃5分钟灭活。
第二组试剂为DNA破碎酶和DNA末端补平试剂：DNA破碎酶由10单位/ul脱氧核糖核酸酶I和脱氧核糖核酸酶II，或脱氧核糖核酸酶I和核酸外切酶III。DNA末端补平试剂：由2单位/ulDNA末端补平酶(T4 DNA聚合酶或、Klenowexo-、T4 DNA PNK、Taq或Klenow酶)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟，75度5分钟灭活，反应后无需纯化。
第三组试剂为DNA连接试剂：由100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成。反应条件是20℃15～20分钟，反应结束后直接由硅胶柱或磁性颗粒纯化即可直接上高通量测序仪检测。
细胞染色体分析快速建库方法，在待检细胞中加入蛋白酶K 60℃20分钟，95℃5分钟灭活；继续加入DNA破碎酶和DNA末端补平试剂，37℃温浴20分钟，75度变性蛋白酶5分钟，不用纯化，直接加入连接试剂和DNA接头，20℃15～20分钟，反应即完成。直接可放置到高通量测序仪进行检测。由于试验步骤少，损失小，操作速度快，所以本发明试剂盒检测灵敏度更高、起始样本需要量更少、结果更稳定。
本发明通过多个蛋白酶的选择、组合，以及它们之间的互相作用、温度，缓冲体系的建立，实现了单管、无基因组DNA提取、无需PCR扩增的细胞染色体分析测序文库构建，大大加快了染色体分析的建库流程，避免了由于常规试验所需PCR扩增而引起的气溶胶污染，从而使今后基于细胞的基因组检测制备流程大大简化。
本发明具有以下技术特点：
(1)单管法：常规的细胞染色体建库试剂盒需要有1.DNA打碎；2.纯化；3.末端补平；4.纯化；5.碱基最后增加一个A；6.纯化；7.连接接头；8.纯化；9.PCR扩增等9个步骤，每次纯化都要由试验反应条件的PCR管换成1.5ml的EP管，从而在整个试验过程有多个液体转移、开闭管盖的步骤，存在样本转移出错及开闭管盖引起的气溶胶污染。本发明方法只要在一个试管中完成，中间没有纯化步骤，只需要持续在一个试管加入反应液体，减少了样本转移过程可能出错的可能。同时由于没有PCR环节，开关管盖也不会引起气溶胶污染。
(2)无需PCR扩增：本发明通过工程酶的组合、缓冲体系的优化、反应温度优化、试验步骤的减少，让最后的结果无需PCR扩增就可以稳定得到，从而也大大减少了PCR可能引起的气溶胶污染的可能。
(3)快速：由于试验步骤减少到两步，同时在一管完成，以往常规需要在9个小时完成的文库构建工作，本方法可以在1个小时完成，大大加快了整个试验流程。
附图说明
图1是常规细胞染色体测序文库构建方法流程图。
图2是本发明细胞染色体测序文库构建方法流程图。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
本发明中使用的生物材料来源：
(1)细胞样本来源于人外周血、足跟血、羊水胎儿脱落细胞。
(2)DNA接头由大连宝生物公司合成。
实施例1
本实施例用于说明本方法能快速构建细胞染色体分析测序文库。
1、20ul人体外周血或足跟血和200ul PBS混合，1600g离心10分钟，去除上清，细胞悬垂在50ul PBS中。
2、加入50ul 20mg/ml蛋白酶K，60℃20分钟，95℃5分钟灭活。
3、加入10单位/ul脱氧核糖核酸酶I和脱氧核糖核酸酶II及DNA末端补平试剂2单位/ul末端补平酶(T4 DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟，75度5分钟灭活。
4、直接在试管中加入DNA连接试剂：100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成。反应条件是20℃20分钟，反应结束后直接由硅胶柱或磁性颗粒纯化即可直接上高通量测序仪检测。
5、文库可用于illumine HiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。
实施例2
本实施例用于说明本方法能快速构建羊水胎儿脱落细胞染色体分析测序文库。
1、2～5ml羊水1600g离心10分钟，去除上清，细胞悬垂在50ul PBS中。
2、加入50ul 20mg/ml蛋白酶K，60℃20分钟，95℃5分钟灭活。
3、加入10单位/ul脱氧核糖核酸酶I和脱氧核糖核酸酶II及DNA末端补平试剂2单位/ul末端补平酶(T4 DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟，75度5分钟灭活。
4、直接在试管中加入DNA连接试剂：100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成。反应条件是20℃20分钟，反应结束后直接由硅胶柱或磁性颗粒纯化即可直接上高通量测序仪检测。
5、文库可用于illumine HiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。

Claims (10)

1.一种细胞染色体分析快速建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)细胞中直接加入蛋白酶K，裂解细胞；
2)直接往步骤1反应体系中加入DNA破碎酶和DNA末端补平试剂；
3)直接往步骤2反应体系中加入DNA连接试剂，使目标待测DNA与DNA接头连接。
2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤1中细胞的来源为全血、白细胞、胎儿有核红细胞或羊水中胎儿脱落细胞。
3.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤1裂解细胞的反应条件是60℃20分钟，95℃5分钟灭活。
4.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤2所述DNA破碎酶为脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II或核酸外切酶III的一种或多种；所述DNA末端补平试剂由DNA末端补平酶、dNTPs和Tris缓冲液组成，DNA末端补平酶为T4 DNA聚合酶、Klenowexo-、T4 DNA磷酸激酶(T4 DNA PNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的建库方法，其特征在于，步骤2反应条件是37℃20分钟，75℃5分钟灭活，反应后无需纯化。
6.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤3所述DNA连接试剂主要由T4 DNA连接酶和DNA接头组成。
7.根据权利要求6所述的建库方法，其特征在于，步骤3反应条件是20℃15～20分钟，反应后无需纯化。
8.一种细胞染色体分析快速建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要包括蛋白酶K、DNA破碎酶、DNA末端补平酶、dNTP、ATP、DNA连接酶和DNA接头。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA破碎酶为脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、核酸外切酶III的一种或多种；所述DNA末端补平酶为T4 DNA聚合酶、Klenowexo-、T4 DNA磷酸激酶(T4 DNA PNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA连接试剂主要由T4 DNA连接酶和DNA接头组成。
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