CN108265104A - 染色体构型捕捉文库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种染色体构型捕捉文库及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：该构建方法包括将组织样品制备成单细胞悬液；对单细胞悬液进行交联固定以得到DNA‑蛋白交联复合体；从DNA‑蛋白交联复合体中获取DNA片段进行文库构建，得到染色体构型捕捉文库。通过先将组织样品制备成单细胞悬液后再进行交联固定，避免了组织交联固定效果受组织大小影响严重的问题，还避免了部分组织交联固定过度而使得文库中小片段的比例增高，染色体构型中DNA与蛋白之间相互作用的信息减少的现象。避免了细胞形态发生变化而导致的染色体构象捕获不准确的问题，提高了多组织构建的文库的稳定性和普适性，还大大节省了人力和试剂费用。

Description

染色体构型捕捉文库及其构建方法

技术领域

本发明涉及高通量测序的文库构建领域，具体而言，涉及一种染色体构型捕捉文库及其构建方法。

背景技术

随着测序技术的发展，人类对生物物种信息了解的越来越透彻，但重测序通常是基于参考基因组进行变异信息检测，而染色体作为遗传物质的载体，其活性和功能是由结构和空间构象共同决定的，染色体三维构象的也成为基因组研究的代表技术，Hi-C技术源于染色体构象捕获(Chromosome conformation capture,3C)技术，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息分析方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系，通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。2009年，Job Dekker研究团队首次提出了Hi-C测序的概念，并利用该技术得到人类正常淋巴细胞基因组的三维结构图。该技术可以准确、无偏差，并且系统地在全基因范围内研究染色体的折叠情况。可聚焦于分析整个基因组中一对多和多对多的相互作用。

细胞水平的Hi-C技术虽然能够带领研究者对染色质三维构象进行了解，但随着研究的深入和研究需求的增加，从组织直接进行染色质三维构象的捕获意义更大，染色体处于一种动态平衡，不经过细胞传代培养直接从组织中获取染色体三维构象的信息能使对同一组织不同时期、不同处理方式(饥饿、给药、刺激等)的研究更为清晰明朗。

传统的方法从组织制备单细胞对细胞数目的需求不高，多为后续用于细胞培养，而哺乳动物组织“基于高通量测序的染色体构型捕捉”文库的构建需要较高的细胞起始量，且细胞需要经过DNA与染色体进行固定，所以常规的组织制备单细胞悬液方法所收获的细胞不能满足Hi-C文库的构建。

如前述，目前报道较多的染色体构型捕捉的建库方法绝大部分是基于细胞培养、传代扩大到一定数目进行文库构建。但对真实世界的研究中，可能对不同时期或不同条件的不同组织均有研究需求，但成熟的细胞系不能满足现有这些在特定时间、空间下的组织的情况。对于将组织制备细胞后进行再培养会存在两方面问题：第一，培养条件可能特殊，需要更为专业的细胞培养人员，且培养费用较为昂贵。第二，特殊组织的细胞在体外培养一段时间会发生形态学等变化，且因非永生化的细胞系，可能在有限的传代次数内仍不易达到建库的细胞数目。

目前已经有报道的组织Hi-C文库的构建是用小鼠肝脏进行Hi-C的研究。通过对肝脏进行甲醛交联，使DNA和蛋白之间固定，用匀浆器肝脏研磨至匀浆得到单细胞悬液，再通过细胞滤筛过滤得到单细胞悬液，制备好的单细胞悬液通过限制性内切酶的完全切割，将DNA切割成片段，末端补平后通过连接酶连接、解交联，最终将获得的DNA片段通过二代测序方法进行建库，进一步的，通过生物信息学分析，经过单倍体构建和互作的研究，最终获得染色体三维折叠结构。下面结合图1对目前组织Hi-C建库的步骤做一个具体介绍。

(1)将肝脏组织用10％甲醛进行固定，固定时间20min。

(2)取1g组织剪碎，用杜恩斯匀浆器进行匀浆，杜恩斯匀浆器松锤研磨十次，紧锤研磨十次。

(3)用70um滤网进行过滤。用适量PBS冲洗滤网两次。

(4)PBS重悬细胞并离心，4℃条件离心:852rcf时间5min,弃上清。

(5)重复步骤(3)一次。

(6)用1％的甲醛进行二次固定，室温条件下固定5分钟。

(7)用0.125M甘氨酸室温下进行终止反应，终止时间5min，用10ml PBS清洗细胞两遍。

(8)将固定好的细胞进行离心，储存于-80℃。

(9)将固定好的细胞使用裂解液进行裂解，裂解之后使用NEB Buffer2进行重悬，加入HindIII，37℃进行过夜酶切；

(10)将过夜酶切的细胞，使用生物素标记的dCTP以及未生物素标记的dATP、dTTP、dGTP进行末端修复，修复酶为klenow fragment；

(11)将修复后的细胞使用T4连接酶进行过夜连接，连接后将产生新的NlaIII酶切位点；

(12)加入蛋白酶K过夜裂解，然后使用酚氯仿抽提进行DNA提取；

(13)取5ug提取的DNA进行末端修复，去除片段未连接的但末端存在生物素dCTP，防止捕获时捕获到末端未连接但存在生物素的片段；

(14)将处理完的样品进行建库，使用covaris进行打断至300bp，并使用XP磁珠进行片段选择，去掉过大或过小的片段；

(15)将上述产物进行末端修复、加A反应；

(16)使用链霉素亲和磁珠处理，对中间产物中带有生物素标记的片段进行捕获，得到目的片段。

(17)将捕获到的目的片段连接illumina接头，使用P5、P7进行PCR扩增进行目的片段富集。

(18)将富集到的产物使用xp磁珠纯化，去掉引物二聚体等，纯化完的产物即为构建好的文库，使用NheI进行酶切检测文库质量。

(19)将构建完成的文库进行库捡，使用Hiseq 2500PE125进行测序，得到的数据进行信息分析，将reads中含有NheI位点的数据作为有效数据进行后续信息分析。

染色体是遗传物质的载体，其活性和功能是由其结构和空间构象所决定的。染色体组成长期处于一种动态的平衡，即在整个细胞周期，乃至在不同类型的细胞中都是不同的。这种不同组成及活性对于染色体的形态建成以及基因的表达调控和复制等方面具有重要的作用。Job Dekker等在2002年最早发明了这种研究染色体空间构象的方法，即染色体构型捕捉(Chromosome Conformation Capture)方法，即3C方法，该方法可以用来研究染色体任意两个遗传位点相互作用频率。3C方法的原理是：首先分离待研究物种细胞核，经过甲醛处理最终使全基因组范围内具有物理上相互作用的DNA和其结合蛋白进行交联，通过解交联和测序分析获得相对各个位点相对互作频率数据。全基因组范围内互作频率分析即可反应出染色体的空间构象。

基于高通量测序的染色体构型捕捉(Hi-C)方法是3C方法与新一代测序方法的完美结合。该方法可以准确研究染色体三维结构的折叠和长距离调控。与3C方法相比，该方法可以更准确、无偏差，系统地在全基因范围内研究染色体的折叠情况。3C方法聚焦于某个位点，能进行两个区域间―一对应相互作用的分析。而Hi-C方法则是通过广泛撒网，聚焦于分析整个基因组中一对多或―多对多的相互作用。

Hi-C的方法原理是经过甲醛固定细胞后，DNA或蛋白间的连接体也同时固定，用一种限制酶完全切割片段，再用连接酶连接、拆分交联体，最后将获得的DNA片段建库用于新一代测序，进一步通过生物信息学分析，最终获得染色体的三维折叠结构。下面结合图1对目前Hi-C方法的文库构建步骤做一个具体介绍：

(1)将2x10⁷～2.5x10⁷个哺乳动物的细胞用1％甲醛进行固定，固定后用甘氨酸终止反应，将固定后的细胞置于-80℃冰箱(可放置一年)；

(2)将固定好的细胞使用裂解液进行裂解，裂解之后使用NEB Buffer 2进行重悬，加入HindIII，37℃进行过夜酶切；

(3)将过夜酶切后的细胞，使用生物素标记的dCTP以及未生物素标记的dATP、dTTP、dGTP进行末端修复，修复酶为klenow片段(klenow fragment)；

(4)将修复后的细胞使用T4连接酶进行过夜连接，连接后将产生新的NlaIII酶切位点；

(5)加入蛋白酶K过夜裂解，然后使用酚氯仿抽提进行DNA提取；

(6)从提取得到的DNA中取5ug进行去除片段未连接的但末端存在生物素dCTP，防止捕获时捕获到末端未连接但存在生物素的片段；

(7)将处理完的样品进行建库，使用covaris进行打断至300bp，并使用XP磁珠进行片段选择，去掉过大或过小的片段；

(8)将上述打断的产物进行末端修复、加A反应；

(9)使用链霉素亲和磁珠处理，对中间产物中带有生物素标记的片段进行捕获，得到目的片段。

(10)将捕获到的目的片段连接illumina接头，使用P5、P7进行PCR扩增进行目的片段富集。

(11)将富集到的产物使用XP磁珠纯化，去掉引物二聚体等，纯化完的产物即为构建好的文库，使用NheI进行酶切检测文库质量。

(12)将构建完成的文库进行库捡，使用Hiseq 2500PE125进行测序，得到的数据进行信息分析，将测序所得序列(reads)中含有NheI位点的数据作为有效数据进行后续信息分析，该建库方法有效数据约为40-50％。

因而，急需对对现有技术进行改进，以改善现有的基于组织的染色体构型捕捉方法难以进行有效建库的缺陷。

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种染色体构型捕捉文库及其构建方法，以改善现有的基于组织的染色体构型捕捉方法难以进行有效建库的缺陷。

为了实现本申请的目的，根据本申请的一个方面，提供了一种染色体构型捕捉文库的构建方法，该构建方法包括：步骤S1，将组织样品制备成单细胞悬液；步骤S2，对单细胞悬液进行交联固定以得到DNA-蛋白交联复合体；以及步骤S3，从DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段进行文库构建，得到染色体构型捕捉文库。

进一步地，步骤S1包括：步骤S11，采用红细胞裂解液对组织样品进行裂解，得到裂解产物；步骤S12，对裂解产物依次进行研磨、过滤以及重悬，得到单细胞悬液。

进一步地，红细胞裂解液包括：0.01mol/L pH7.6的Tris-HCl、0.01mol/L的NaCl以及0.005mol/L MgCl₂；优选地，按照每克组织样品添加0.8～1.5ml红细胞裂解液的比例对组织样品进行裂解；更优选，采用红细胞裂解液对组织样品进行裂解2～3遍，每次裂解之后还包括在1500～2000rpm的转速下离心5～10min的步骤。

进一步地，步骤S11包括：步骤S111，将组织样品剪碎，得到破碎组织；步骤S112，采用红细胞裂解液对破碎组织进行裂解，得到裂解产物；优选地，破碎组织的体积≤1mm³。

进一步地，步骤S12包括：步骤S121，对裂解产物进行研磨，得到研磨产物；步骤S122，对研磨产物进行过滤，得到滤液；步骤S123，对滤液进行离心后用PBS重悬细胞，得到单细胞悬液；优选地，在对裂解产物进行研磨之前，步骤S12还包括用预冷的PBS对裂解产物进行洗涤后离心的步骤，洗涤后离心的转速≤1500rpm；优选地，采用杜恩斯匀浆器对裂解产物进行松锤研磨不少于十次，紧锤研磨不少于十次，得到研磨产物；优选地，采用40μm的滤网对研磨产物进行过滤，得到滤液；优选地，在1500～2000rpm的转速下对滤液离心5～10min后，采用2～5倍于细胞体积的PBS重悬细胞，得到单细胞悬液。

进一步地，在步骤S2中，向单细胞悬液加入甲醛进行交联固定，其中，甲醛的终浓度为1.8～2wt％；优选地，交联固定的时间为3～5min；更优选，在交联固定3～5min后，步骤S2还包括向单细胞悬液中加入2～3倍于甲醛体积的甘氨酸溶液终止交联固定。

进一步地，步骤S3包括：步骤S31，从DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段；步骤S32，利用核酸外切酶对DNA片段进行酶切，其中，核酸外切酶是指作用于双链DNA，具有3’→5’核酸外切酶活性而不具有DNA聚合酶活性的核酸酶；以及步骤S33，对酶切后的DNA片段进行文库构建，得到染色体构型捕捉文库；优选地，核酸外切酶为核酸外切酶III；优选地，采用8～12U的核酸外切酶对每μgDNA片段进行酶切；更优选酶切的反应条件为先在35～39℃反应8～12min，然后在70～74℃反应18～25min。

进一步地，步骤S31包括：S311，利用蛋白酶对DNA-蛋白交联复合体进行解交联，得到DNA和蛋白的混合物；以及S312，对混合物进行DNA提取，得到DNA片段；优选地，步骤S311包括以下步骤：利用核酸内切酶对DNA-蛋白交联复合体进行酶切，得到酶切交联体片段，优选核酸内切酶为HindIII、MboI、EcoRI或DpnII；对酶切交联体片段进行末端修复标记，得到标记交联体片段；对标记交联体片段进行DNA连接，得到标记交联体连接片段；以及采用蛋白酶K对标记交联体连接片段进行解交联，得到DNA和蛋白的混合物。

进一步地，标记交联体片段上的标记为生物素标记，优选地，末端修复标记的步骤中，利用带生物素标记的dCTP及生物素未标记的dATP、dTTP和dGTP在Klenow片段修复酶的作用下，对酶切交联体片段进行末端修复标记，得到标记交联体片段。

根据本申请的另一方面，提供了一种染色体构型捕捉文库，染色体构型捕捉文库采用上述任一种方法构建而成。

应用本申请的技术方案，通过先将组织样品制备成单细胞悬液后再进行交联固定，避免了组织交联固定效果受组织大小影响严重的问题，同时还避免了部分组织交联固定过度而使得文库中小片段的比例增高，染色体构型中DNA与蛋白之间相互作用的信息减少的现象。而且，本申请的上述方法不仅实现了对组织的染色体构象捕捉的可行性，而且也实现了多种不同组织样品建库的普适性。该建库方法避免了在细胞培养过程中，细胞形态发生变化而导致的染色体构象捕获不准确的问题，而且提高了多组织构建的文库的稳定性，同时还大大节省了人力和试剂费用。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了现有技术中的高通量测序文库的构建方法流程示意图；

图2示出了本发明一种典型的实施方式中高通量测序文库的构建方法流程示意图；

图3示出了本发明一种优选的实施例中高通量测序文库的构建方法的详细流程示意图；以及

图4示出了本发明与现有技术所构建的高通量测序文库的电泳结果比较图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明中的核酸外切酶是指作用于双链DNA，具有3’→5’核酸外切酶活性而不具有DNA聚合酶活性的核酸酶。适用于本发明的核酸外切酶所具有的共同点是：都以双链DNA为底物，且具有从3’-OH端将单个核苷酸逐一切除的活性而不具有DNA聚合酶的活性，满足上述条件的核酸酶都在本发明的保护范围内，而且，除了具有上述活性之外，本发明的核酸外切酶还可以具有其他相对较弱的核酸酶活性，比如，BAL-31核酸酶，除了具有3’→5’核酸外切酶活性外，还具有核酸内切酶活性，但其3’→5’核酸外切酶活性比其核酸内切酶活性强20倍。因此，适用于本发明的核酸外切酶可以是来源于大肠杆菌的核酸外切酶III和核酸外切酶V，也可以是来源于埃氏交替单胞菌BAL-31培养物的BAL-31核酸外切酶，还可以是ATP依赖型脱氧核糖核酸酶(如Plasmid-safe^TM ATP-dependent DNase)。

如背景技术所提到的，目前基于高通量测序的染色体构型捕捉的建库流程存在以下缺点：大多基于细胞培养、传代扩大培养到一定数目后进行文库构建，而很多情况下，研究并不局限于能够进行体外扩大培养的细胞，而且，有些样本的细胞根本无法进行体外扩大培养或者体外扩大培养后会发生形态学变化而不能真实反映待实际状态下的染色体构型。虽然现有技术也有公开从组织样本中分离单细胞的方法，但传统的单细胞分离的目的是为了进行细胞培养，因而对细胞数目要求不高。而若要构建用于高通量测序的文库，对细胞的起始量要求较高(至少需要2x10⁷个细胞)，传统的分离方法不能满足建库的需要。

为了改善目前难以构建基于组织样品的染色体构型捕捉文库这一问题，发明人对现有的染色体构型捕获文库构建方法进行详细研究。通过对基于组织样本进行染色体捕获文库建库的最新报道进行了大量分析和研究，发现该建库方法存在如下缺陷：

1)先对组织样品进行交联，再制备单细胞悬液。因组织块远大于细胞，在交联固定过程中易造成组织外周交联固定过度，但组织中间无法充分实现交联固定，因而，交联固定的效率和效果会因组织块大小的不同而受到严重影响。

2)采用70μm的细胞筛仍会有杂质通过滤网。

3)重悬细胞后的二次甲醛交联固定会造成部分动物组织的过度交联固定，使得所构建的文库插入片段中小片段的比例增多，造成数据的浪费和互作信息的减少。

4)由于klenow片段修复酶对末端进行修复的步骤为一个动态平衡的过程，该步骤的原理是利用大浓度的不带标记的dCTP替换小浓度末端带有标记的dCTP，从而将提取得到的DNA片段中未连接的但末端存在生物素标记的dCTP替换下来，以防止这些非目的片段被捕获到。但由于该klenow片段修复酶的酶作用原理的限制，必定有一部分是替换不下来而且该酶的替换效率也比较低，从而使得很多无用的小片段被捕获到，从根本上导致了数据的浪费，造成了最后信息分析中目的片段的有效数据仅有40-50％。

基于上述研究结果，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种染色体构型捕捉文库的构建方法，该构建方法包括：步骤S1，将组织样品制备成单细胞悬液；步骤S2，对单细胞悬液进行交联固定以得到DNA-蛋白交联复合体；以及步骤S3，从DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段进行文库构建，得到染色体构型捕捉文库。

本申请所提供的方法，通过先将组织样品制备成单细胞悬液后再进行交联固定，避免了组织交联固定效果受组织大小影响严重的问题，同时还避免了部分组织交联固定过度而使得文库中小片段的比例增高，染色体构型中DNA与蛋白之间相互作用的信息减少的现象。而且，本申请的上述方法不仅实现了对组织的染色体构象捕捉的可行性，而且也实现了多种不同组织样品建库的普适性。该建库方法避免了在细胞培养过程中，细胞形态发生变化而导致的染色体构象捕获不准确的问题，而且提高了多组织构建的文库的稳定性，同时还大大节省了人力和试剂费用。

上述构建方法中，先将组织样品制备成单细胞悬液后再进行交联固定的发明思想，不仅实现对染色体构型的有效交联固定及文库构建的可行性，而且避免了交联固定过度现象，使之尽可能地保持待检组织中的原有DNA-蛋白互作状态，进而使得所构建的文库中的有效信息量增加。因而，任何能够实现从组织样品中分离出能够满足建库所需量的单细胞悬液的操作或方法均适用于本申请。

在一种优选的实施例中，步骤S1包括：步骤S11，采用红细胞裂解液对组织样品进行裂解，得到裂解产物；以及步骤S12，对裂解产物依次进行研磨、过滤以及重悬，得到单细胞悬液。红细胞裂解液不仅能够对组织细胞进行裂解，而且还能使单细胞悬液更干净且在计数过程中能有效排除红细胞的干扰。该步骤从根本上改善了组织异质性给染色体构型捕获文库构建带来的困难，使得实验流程更稳定，且节省了不同组织样品单独摸索各自适合的实验条件的时间成本和人力成本，且还能使有效数据利用率得到提升，也使得上机数据量按比例降低，降低了数据成本。

上述红细胞裂解液可以采用现有的细胞裂解液，也可以对现有的红细胞裂解液进行合理调整后使用。在一种优选的实施例中，红细胞裂解液包括：0.01mol/L pH7.6的Tris-HCl、0.01mol/L的NaCl以及0.005mol/L MgCl₂；优选地，按照每克组织样品添加0.8～1.5ml红细胞裂解液的比例对组织样品进行裂解；更优选，采用红细胞裂解液对组织样品进行裂解2～3遍，每次裂解之后还包括在1500～2000rpm的转速下离心5～10min的步骤。上述红细胞裂解液的添加量及裂解次数能够更有效地从组织样品中分离得到数量相对更多的单细胞，且在上述转速下进行离心分离能够尽可能地减少对细胞的形态或结构变形的影响。

本申请中，红细胞裂解液的使用方法与现有的单细胞分离方法中的红细胞裂解液的使用方法和目的不同。具体有如下几方面：(1)本申请中，通过利用红细胞裂解液中的盐离子浓度差进行红细胞裂解，而非采用常用的含酶的红细胞裂解液进行裂解，这样有效地避免了新的蛋白的引入，从而不给后续蛋白固定带来影响；(2)红细胞裂解液的使用能够将组织中的红细胞有效地裂解，进而使后续显微镜下细胞计数更准确；(3)红细胞裂解液的应用能是红细胞的蛋白被释放出来，通过离心更换上清被去除，避免了后续该部分蛋白在细胞的固定在产生影响。

为了进一步提高红细胞裂解液对组织样品的裂解效果，在一种优选的实施例中，步骤S11包括：步骤S111，将组织样品剪碎，得到破碎组织；以及步骤S112，采用红细胞裂解液对破碎组织进行裂解，得到裂解产物；优选地，破碎组织的体积≤1mm³。先对组织样品进行剪碎，能够使红细胞裂解液更充分更彻底与组织样品接触，从而提高裂解效率。组织样品越小，裂解效率越高，裂解效果也越好。从兼顾操作容易度及裂解效率的角度考虑，破碎组织的尺寸不超过1mm³。此处的尺寸是指根据破碎组织的形状的不同，从不同角度测量的最大长度。比如，当将组织样品剪成长方形时，尺寸是指长边的长度，当剪成正方形时，尺寸是指任一边的长度。

上述对组织样品进行裂解的目的是使组织更分散，以便释放出单细胞。而后续进行研磨的步骤更有利于细胞的分离。具体研磨、过滤及重悬的步骤在现有技术的基础上适当改进即可。为了进一步提高单细胞的分离效率，在一种优选的实施例中，步骤S12包括：步骤S121，对裂解产物进行研磨，得到研磨产物；步骤S122，对研磨产物进行过滤，得到滤液；以及步骤S123，对滤液进行离心后用PBS重悬细胞，得到单细胞悬液；优选地，在对裂解产物进行研磨之前，步骤S12还包括用预冷的PBS对裂解产物进行洗涤后离心的步骤，洗涤后离心的转速≤1500rpm；优选地，采用杜恩斯匀浆器对裂解产物进行松锤研磨不少于十次，紧锤研磨不少于十次，得到研磨产物；优选地，采用40μm的滤网对研磨产物进行过滤，得到滤液；优选地，在1500～2000rpm的转速下对滤液离心5～10min后，采用2～5倍于细胞体积的PBS重悬细胞，得到单细胞悬液。

上述优选的实施例中，采用杜恩斯匀浆器对裂解产物进行松锤研磨不少于十次，紧锤研磨不少于十次，使得裂解产物被研磨的更细小，然后通过采用40μm的滤网对研磨产物进行过滤能够将绝大部分的组织杂质出去，从而使分离得到的单细胞悬液更干净。在上述转速范围内进行离心既能实现对裂解固相与液相的分层，又对细胞的形态无不良影响。

为了对分离得到的单细胞进行合理交联固定，在一种优选的实施例中，在步骤S2中，向单细胞悬液加入甲醛进行交联固定，其中，甲醛的最终质量浓度为1.8～2wt％；优选地，交联固定的时间为3～5min；更优选，在交联固定3～5min后，步骤S2还包括向单细胞悬液中加入2～3倍于甲醛体积的甘氨酸溶液终止交联固定。

上述优选实施例中，通过仅在得到单细胞悬液后进行甲醛交联固，并且控制甲醛的终浓度在上述范围内，既能实现对细胞内的DNA-蛋白的有效交联固定，又不会过度交联固定，而避免了后续解交联时产生过多的小片段。采用上述适量的甘氨酸进行终止交联固定进一步避免了过度的交联固定。具体地，在实际操作中，可以加入两倍于甲醛体积的甘氨酸溶液进行终止，室温放置5分钟，冰上放置15分钟。然后将固定好的细胞进行离心，离心条件可以是2000转5分钟。弃掉上清，细胞沉淀可储存在-80℃冰箱或直接进行下一步操作。

上述构建方法中，从DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段进行文库构建的步骤采用现有的文库构建步骤进行处理即可。为了进一步提高所构建的文库的有效数据率，在一种优选的实施例中，步骤S3包括：步骤S31，从DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段；步骤S32，利用核酸外切酶对DNA片段进行酶切，其中，核酸外切酶是指作用于双链DNA，具有3’→5’核酸外切酶活性而不具有DNA聚合酶活性的核酸酶；以及步骤S33，对酶切后的DNA片段进行文库构建，得到染色体构型捕捉文库；优选地，核酸外切酶为核酸外切酶III；优选地，采用8～12U的核酸外切酶对每μg DNA片段进行酶切；更优选酶切的反应条件为先在35～39℃反应8～12min，然后在70～74℃反应18～25min。

上述文库构建方法，通过在从DNA-蛋白交联复合体中获取到DNA片段之后，以及利用该DNA片段进行文库构建之前，用核酸外切酶替代现有技术中的具有3’→5’核酸外切酶活性且具有DNA聚合酶酶活性的klenow片段，本发明的核酸外切酶是以双链DNA为底物，具有3’→5’核酸外切酶活性而不具有DNA聚合酶活性，因而能够将非目的片段中的标记去除的更彻底，使所得到的DNA片段的纯度大大提高，进而提高所构建的文库测序所得数据的有效量，大大减少了无效数据。

上述所获得的DNA片段既包含带有标记的目的片段也含有部分带有标记但因为物理距离或空间较大而无法在酶切后的连接步骤中实现连接的片段，而未连接的片段表明相互之间不存在互作，因而不是测序所需的目的片段，因而在建库步骤需要将其去除。而现有技术中采用的是klenow片段修复酶进行去除，是利用了klenow片段修复酶的3’→5’核酸外切酶活性，但如前面所提到的，klenow片段修复酶对末端进行去除及修复的步骤是一个动态平衡的过程，其在切除一个核苷酸后，会利用其DNA聚合酶活性再添加上一个核苷酸，而其通过添加不带标记的核苷酸替换切下来的带标记的核苷酸的思路，是建立在不带标记的核苷酸的浓度大于切下来的带有标记的核苷酸的浓度基础上的，而这种去除方式无法将未连接的非目的片段末端的标记彻底去除，从而影响了产出数据的有效量。因而，本发明的上述核酸外切酶也是指能够以双链DNA为底物，具有从3’→5’方向切除单个核苷酸的核酸外切酶，但该核酸外切酶并不包括现有技术中的既具有3’→5’核酸外切酶活性又具有DNA聚合酶活性的核酸酶，比如klenow片段修复酶。

在本申请的上述构建方法中，在步骤S2中用具有3’→5’核酸外切酶活性且不具有DNA聚合酶活性的核酸外切酶替代现有技术中的klenow片段对DNA片段进行酶切时，可以根据具体所使用的核酸外切酶的不同进行适当调整酶切体系和反应条件。上述优选的实施例中，核酸外切酶为核酸外切酶III；更优选利用8～12U的核酸外切酶对每μg所述DNA片段进行酶切，进一步优选酶切的反应条件为35～39℃反应8～12min，然后70～74℃反应18～25min。酶与底物的用量比和反应条件在上述范围内能够将末端修复后未连接上的带有标记的非目的片段的3’末端切掉，即将其所带有的标记切掉，使得后续亲和纯化时便不会被捕获到，进而提高了目的片段的纯度，从而大大提高所构建的文库后续产出的有效数据。

在本发明的上述方法中，步骤S31的目的是从交联的DNA-蛋白复合体中获取DNA用于后续文库构建，因而现有技术中所有能够获取DNA的步骤均适用于本发明。在本发明一种优选的实施例中，上述步骤S31包括：S311，利用蛋白酶对DNA-蛋白交联复合体进行解交联，得到DNA和蛋白的混合物；以及S312，对混合物进行DNA提取，得到DNA片段。该优选实施例采用蛋白酶将交联的复合体中的蛋白进行酶解，使得DNA释放出来，进而从DNA蛋白混合物中利用常规的DNA提取方法进行DNA提取即可得到DNA片段。更优选采用常用的蛋白酶K进行DNA-蛋白交联复合体的解交联，蛋白酶K能够酶解的蛋白种类多，活性高。

在本发明的另一种优选的实施例中，上述步骤S311包括：利用核酸内切酶对DNA-蛋白交联复合体进行酶切，优选核酸内切酶为HindIII、MboI、EcoRI或DpnII，得到酶切交联体片段；对酶切交联体片段进行末端修复标记，得到标记交联体片段；对标交联体片段进行DNA连接，得到连接带标记交联体片段；以及采用蛋白酶K对连接带标记交联体片段进行解交联，得到DNA和蛋白的混合物。

上述优选实施例中，采用核酸内切酶对DNA-蛋白交联复合体进行酶切是为了将基因组中交联的复合体进行割断，形成相对独立的酶切交联体片段，为了使各个独立的酶切交联体片段形成一个完整的片段用于后续建库，需要对片段进行连接，但连接之前需要对酶切片段进行末端修复补平；在修复补平的过程中通过使用带有标记的底物可以使修复的末端带上标记，进而不仅有利于标记连接的两个片段的作用位点，而且便于后续建库过程中对目的片段的捕获，因而蛋白酶K解交联后得到的DNA和蛋白混合物中的DNA是带有标记的连接片段和带有标记的未连接的片段。

上述优选实施例中，将DNA-蛋白交联复合体进行酶切的核酸内切酶可以根据实验目的差异或DNA物种来源的不同进行合理选择，本发明优选上述核酸内切酶为HindIII、MboI、EcoRI、DpnII等限制性内切酶。这些核酸内切酶在不同物种中的酶切位点相对都较多，可以尽可能多地获得酶切交联体片段。

上述标记交联体片段上的标记可以是任何能够起到标记作用的物质，比如生物素标记、地高辛标记或者同位素标记等。本发明优选采用生物素标记，生物素标记不仅能够起到最基本的标记作用，而且可以通过DNA末端修复的过程中通过底物dNTP(如dCTP)来进行添加，此外，还没有同位素标记等放射性的危害，操作安全简单。

在本发明一种更优选的实施例中，上述末端修复标记的步骤中，利用带生物素标记的dCTP及生物素未标记的dATP、dTTP和dGTP在Klenow片段修复酶的作用下，对酶切交联体片段进行末端修复标记，得到标记交联体片段。只对其中一种底物进行生物素标记即可起到标记的作用，因而无需对所有的底物都进行标记，且既能实现标记的目的，又能节约成本。

上述文库构建的步骤，既可以采用现有技术中通用的方法来进行文库的构建，也可以在现有技术的文库构建步骤基础上进行适当改进得到。在本发明一种优选的实施例中，为了进一步提高所构建的DNA文库的数据有效量，提供了一种改进的文库构建步骤，该步骤包括：对经酶切后的DNA片段进行随机打断，得到片段化DNA；对片段化DNA进行亲和纯化，得到纯化DNA；对纯化DNA依次进行末端修复、加“A”、接头连接，得到带接头DNA；以及对带接头DNA进行扩增富集，得到染色体构型捕捉文库。

本发明的上述优选实施例中的文库构建步骤，通过将现有技术中的在随机打断后随即进行末端修复加A反应，然后才进行亲和纯化的操作步骤进行改进，在DNA随机打断后立即进行亲和纯化的步骤，通过纯化将未连接的带有标记的非目的片段去除后，再有针对性地进行末端修复和加A以及后续的接头连接、富集等步骤。这种改进仅通过简单的操作步骤上的调换，提早一步对目的DNA进行纯化，不仅提高了目的DNA的纯度，减少后续无效数据的产出，而且还能进一步使末端修复加A步骤所消耗的试剂大大减少，降低文库构建成本。

在上述优选实施例中，亲和纯化的步骤可以根据所带标记的不同而进行不同的亲和纯化。本发明优选采用链霉素磁珠对片段化DNA进行亲和纯化，得到纯化DNA。链霉素磁珠不仅能够特异性纯化DNA而且能够与DNA上的标记结合，使得带有标记的DNA被高度纯化富集。在本发明一种更优选的实施例中，采用M-280的链霉素磁珠对片段化DNA进行亲和纯化，该磁珠能够特异性地结合DNA的生物素标记，进而将带有生物素标记的DNA进行富集。

在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种染色体构型捕捉文库，该文库采用上述任一种方法构建而成。利用本申请所提供的方法所构建的文库实现了对组织的染色体构象捕捉的可行性和多组织样品建库的普适性，不仅避免了在细胞培养过程中，细胞形态发生变化而导致的染色体构象捕获不准确的问题，而且提高了多组织所构建的文库的稳定性，同时还大大节省了人力和试剂费用。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。

下面以小鼠肝脏肺癌组织和肌肉组织作为实验材料进行实验，按照图2所示的文库构建方法的详细流程进行操作，具体实验步骤如下：

一、单细胞制备及染色体的交联固定

1、取1g新鲜组织剪碎至1mm或更小，用红细胞裂解液处理2-3遍(将1毫升红细胞裂解液加入至装有组织的1.5毫升EP管中，颠倒混匀2～3分钟，离心。离心条件：2000转5分钟)，用预冷的PBS洗涤一遍，1500转离心5分钟，杜恩斯匀浆器松锤研磨十次，紧锤研磨十次。

2、用40um滤网进行过滤，用适量冷PBS冲洗滤网及滤渣。

3、收集滤液离心，离心条件：转速：2000rpm,时间：5min。

4、用20毫升常温PBS重悬细胞，加入终浓度为2％的甲醛固定5分钟。

5、加入两倍于甲醛体积的甘氨酸溶液进行终止，室温放置5分钟，冰上放置15分钟。

6、将固定好的细胞进行离心，离心条件：2000转5分钟。弃掉上清，细胞沉淀可储存在-80℃冰箱或直接进行下一步操作。

二、细胞裂解和DNA酶切

1、将每份细胞加入550μl裂解液(500μl 10mM Tris-HCL pH8.0、10mM NaCl、0.2％Igepal CA-630以及50μl protease inhibitors)，混匀后在冰上放置15min，；

2、用杜恩斯匀浆器进行裂解，在冰上进行，缓慢的上下30次，；

3、将裂解液转入1.5mL管，室温5000rpm离心10min；

4、弃上清，用50μl 1x NEB buffer2重悬沉淀，向管中加入312μl 1xNEB buffer2，混匀后再加入38μl 1％SDS，再次混匀后在65℃放置10min；

5、每管加入44μl Triton X-100充分混匀，加入400U HindIII(NEB)，37℃酶切过夜。

三、生物素标记DNA末端、稀释和连接

2、将样品放置在冰上，依次加入以下试剂，充分混匀，在37℃放置45min；

0.4mM biotin-14-dCTP 37.5μl

dA/T/GP mix 4.5μl

Klenow 5U/μl 10μl

3、反应结束后将样品放置在冰上，加入86μl 10％SDS，65℃放置30min，结束后置在冰上；

4、准备15mL管并放置在冰上，加入7.61mL的ligation mix(体系如下)，然后将酶切产物分别加入其中，颠倒混匀，16℃放置4小时；

5、向每个管中加入50μl 10mg/ml proteinase K,混匀后在65℃放置过夜。

四、DNA提取

1、第二天再向每管加入50μl 10mg/ml proteinase K，65℃放置2小时，然后取出冷却至室温；

2、将管内的溶液转移到50ml离心管中，加入10ml pH 8.0phenol,vortex 2min,3500rpm离心10min，将上清转移至新的50ml管；

3、向管中加入10ml phenol pH8.0:chloroform(1:1)，vortex混匀，3500rpm离心10min将上清转移至新的50ml离心管；

4、用1x TE将溶液体积补充至10ml，向其中加入1ml 3M NaOAc,25ml无水乙醇，颠倒混匀后在-80℃放置至少1hr；

5、将管取出，在4℃ 10000g离心20min。弃掉上清，加入450μl 1x TE溶解；

6、将上述450μl产物使用Zymo Genomic DNA Clean&Concentrator(D4011)试剂盒对所提取的基因组进行纯化，详细步骤见试剂盒说明书。

五、除去末端标记但没有连接的DNA

1、将上述Hi-C产物定量，取3-5ug(建议5ug)加入以下体系，充分混匀。如果产物足够多，可取若干份5ug准备反应体系。

37℃反应10min，72℃反应20min，立即置于冰上；

3、将上述产物补足至130μl，使用covaris进行打断，参数如下；

Covaris S220参数设置：

4、将片断化的产物用QIAquick PCR产物纯化试剂盒进行纯化(按照试剂盒说明)，产物用50μl洗脱液洗脱。(Qbuti定量)

六、目标区域捕获

使用M-280Streptavidin magnetic beads磁珠对上述产物进行捕获，具体实验步骤如下：

1、振荡重悬M-280Streptavidin magnetic beads磁珠，吸取20μl重悬的磁珠置于1.5ml离心管，将离心管放置在磁分离架上等待1分钟，小心吸取弃上清，用50μlBead Binding Buffer洗涤磁珠，去上清。

2、用50μl Bead Binding Buffer重悬磁珠；

3、加入上一步的样品50μl，20℃温浴15分钟。

七、文库构建

(一)末端修复

1、将离心管放置在磁分离架上，用200μl Bead Wash BufferⅠ洗涤磁珠三次，每次轻弹磁珠后，微离心；

2、将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μl的EB洗涤磁珠两次，每次轻弹磁珠后，微离心，移去最后一次洗涤的缓冲液(EB)；

3、在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系：

4、轻轻地吹打末端修复反应体系确保磁珠在反应体系中充分悬浮，20℃温浴30min。

(二)末端加A

1、200μl Bead Wash BufferⅠ洗涤磁珠三次，然后使用200μlEB洗涤磁珠两次，第二次加入EB后，需先将磁珠转移至一新1.5ml离心管，移去最后一次洗涤的缓冲液(EB)；

2、在1.5ml的离心管中配制末端加“A”反应体系：

3、37℃温浴30min。

(三)加接头

1、200μlBead Wash BufferⅠ洗涤磁珠三次，200μl EB洗涤磁珠两次，第二次加入EB后，需先将磁珠转移至一新1.5ml离心管；

2、移去最后一次洗涤的缓冲液(EB)，加入19μl的EB重悬磁珠，加入新的1.5离心管中，在1.5ml的离心管中配制Adapter连接反应体系：

2×Rapid ligation Buffer 25μl

Adapter 1μl

T4DNA ligase(L603-HC-L) 5μl

3、20℃温浴15min。

(四)PCR扩增

1、200μlBead Wash BufferⅠ洗涤磁珠三次，200μl 200μlBead Wash BufferII(0.1MNaOH)洗涤磁珠一次，200μl的EB洗涤磁珠两次，移去最后一次洗涤的缓冲液(EB)，加入23μl的EB重悬磁珠，移至新的pcr管中；

2、在0.2ml的离心管中配制PCR反应体系：

Phusion DNA Polymerase 25μl

P7(25μm) 1μl

P5(25μm) 1μl

在PCR仪中运行下列程序：

5、反应结束后用磁分离架移取PCR反应体系的上清，取上清进行电泳；

6、使用2％的胶进行电泳，100V 1h10min，切胶范围：350-500bp；

7、Qiagen柱子进行胶回收，50μl EB洗脱；

8、使用0.8倍XP磁珠进行纯化，30μl EB溶解，Qubit定量，文库出库。

七、文库质量检测

基因组提取后应为较完整且片段较大的条带，酶切后部分条带切成开环状态，部分片段切为弥散，但因弥散片段片段短，结合染料少，弥散条带较浅。连接后的条带为闭环，电泳速度变快，所以连接后的条带较酶切后条带变低。

将各中间过程留样20μl，加入20μl蛋白酶K进行65℃消化30min，进行电泳检测结果见图3。图3中P1为原文献流程，N1为本发明优化流程，1为基因组完整性检测，2为酶切效率检测，3为连接效率检测。Marker为Trans 15k DNA Marker。根据图中电泳结果可以得知，经过本发明改进过的方法酶切连接效率明显高于原文献流程的酶切连接效率，可见本申请的先分离单细胞悬液再进行甲醛固定的固定效率有助于提高后续的酶切连接效率。电泳图显示，本发明改进的方法适用多种动物组织类型，且效果稳定。

因酶切之后经过末端修复连接会产生新的酶切位点即NheI，可使用该酶进行酶切鉴定文库中目的片段的含量，目的片段含量高的经过NheI酶切之后条带会出现弥散。

将所构建文库取20ng进行酶切检测，酶切体系如下：

37℃反应1h，将产物进行电泳。

图4为按照原文献方法及改进之后的方法所建文库进行的酶切鉴定结果。图4中P1为原文献流程，N1为本发明优化流程，NheI-为未加NheI内切酶的阴性对照组，NheI+为加入NheI内切酶酶切结果。Marker为Trans 100bp Marker。根据图中电泳结果可以得知，经过本申请改进过的方法所构建的文库中目的片段比例高于原方法中的比例。

八、下机数据进行分析

对所构建文库使用Hiseq X10PE150进行测序，对下机数据进行处理。将测序得到的原始测序序列(Sequenced Reads)或者raw reads，里面含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到clean reads，后续分析都基于cleanreads。数据处理的步骤如下：

(1)去除带接头(adapter)的reads；

(2)去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10％的reads；

(3)去除低质量reads(质量值sQ<＝5的碱基数占整个reads的50％以上的reads)。

将得到的clean reads进行分析，统计其每个文库NheI酶位点两侧reads距离及数据有效利用率，统计结果如下表1：

表1：

从以上的描述中，可以看出，经过本申请改进过的方法所构建的文库中小片段的比例，相比原方法所构建的文库中小片段的比例大大降低，从而使得测序数据的有效利用率有较大提高。

组织的固定从根本上要达到的目的是细胞充分且在有效浓度范围内实现固定，固定过度则会造成DNA互作较差，更易发生自连或跟附近1kb内片段连接，造成插入片段普遍较小，数据浪费，因为不同组织蛋白含量有较大差异，所以现有的基于组织的染色体构型捕获文库的构建方法通用性差。

而本申请通过将组织破碎制备成单细胞悬液后再固定则会使细胞固定的更为充分且适度。这样也排除了不同组织来源区别较大需单独摸索固定条件的弊端，达达提高了建库成功率和文库质量及文库的有效利用率，且具有较好的普适性。同时本发明在组织处理过程中添加了红细胞裂解液处理，使所获得的单细胞悬液更干净且在计数过程中能有效排除红细胞的干扰。

由此可见，本申请通过以更合理的单细胞悬液的制备和DNA-蛋白的交联进行优化改进，使得组织的染色体构型捕获文库的构建流程操作通用性更强，更稳定。上述改善步骤从根本上解决了组织异质性给Hi-C文库构建带来的困难，使得实验流程更稳定，节省了不同组织分开摸索实验条件的成本，而有效数据利用率也有所提升，也使得上机数据量按比例降低，降低了数据成本。

此外，本申请的上述实施例通过以核酸外切酶处理代替了现有技术中利用Klenow片段进行的末端修复步骤，使得未连接的片段但末端存在生物素标记的dCTP去除的更彻底，从而在后续的目的片段捕获过程中不被生物素亲和磁珠捕获到，从根本上提高了文库中有效数据的比例，改善文库的质量，也提高了文库中数据信息的多样性。同时通过现有技术中的文库构建步骤，进行先捕获后建库的步骤，并对中间产物进行多次漂洗，提高反应效率，去除结合在生物素亲和磁珠上的非目的片段，大大提高了建库成功率及文库质量。捕获得到目的片段含量的提高，使得对样本的起始量以及后续价格较高的试剂的用量也得到了改善，不仅降低了实验成本(由原来的8000元/样本降低至4000元/样本)，也大大降低了基于高通量测序的染色体构型文库构建的难度。

本发明的上述改进步骤从根本上解决了基于高通量测序的染色体构型文库因无效数据量过高而导致的质量低的问题，使得有效数据比例大大提高，提高了数据利用率，从而使得上机数据量按比例降低，大幅度降低了数据成本和实验成本，适合大规模应用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种染色体构型捕捉文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

步骤S1，将组织样品制备成单细胞悬液；

步骤S2，对所述单细胞悬液进行交联固定以得到DNA-蛋白交联复合体；以及

步骤S3，从所述DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段进行文库构建，得到所述染色体构型捕捉文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1包括：

步骤S11，采用红细胞裂解液对所述组织样品进行裂解，得到裂解产物；

步骤S12，对所述裂解产物依次进行研磨、过滤以及重悬，得到所述单细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述红细胞裂解液包括：0.01mol/LpH7.6的Tris-HCl、0.01mol/L的NaCl以及0.005mol/L MgCl₂；

优选地，按照每克所述组织样品添加0.8～1.5ml所述红细胞裂解液的比例对所述组织样品进行裂解；

更优选，采用所述红细胞裂解液对所述组织样品进行裂解2～3遍，每次所述裂解之后还包括在1500～2000rpm的转速下离心5～10min的步骤。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S11包括：

步骤S111，将所述组织样品剪碎，得到破碎组织；

步骤S112，采用所述红细胞裂解液对所述破碎组织进行裂解，得到所述裂解产物；

优选地，所述破碎组织的体积≤1mm³。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S12包括：

步骤S121，对所述裂解产物进行研磨，得到研磨产物；

步骤S122，对所述研磨产物进行过滤，得到滤液；

步骤S123，对所述滤液进行离心后用PBS重悬细胞，得到所述单细胞悬液；

优选地，在对所述裂解产物进行研磨之前，所述步骤S12还包括用预冷的PBS对所述裂解产物进行洗涤后离心的步骤，所述洗涤后离心的转速≤1500rpm；

优选地，采用杜恩斯匀浆器对所述裂解产物进行松锤研磨不少于十次，紧锤研磨不少于十次，得到所述研磨产物；

优选地，采用40μm的滤网对所述研磨产物进行过滤，得到所述滤液；

优选地，在1500～2000rpm的转速下对所述滤液离心5～10min后，采用2～5倍于细胞体积的PBS重悬细胞，得到所述单细胞悬液。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，向所述单细胞悬液加入甲醛进行交联固定，其中，甲醛的终浓度为1.8～2wt％；

优选地，所述交联固定的时间为3～5min；

更优选，在所述交联固定3～5min后，所述步骤S2还包括向所述单细胞悬液中加入2～3倍于所述甲醛体积的甘氨酸溶液终止所述交联固定。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3包括：

步骤S31，从所述DNA-蛋白交联复合体中获取DNA片段；

步骤S32，利用核酸外切酶对所述DNA片段进行酶切，其中，所述核酸外切酶是指作用于双链DNA，具有3’→5’核酸外切酶活性而不具有DNA聚合酶活性的核酸酶；

以及

步骤S33，对酶切后的DNA片段进行文库构建，得到所述染色体构型捕捉文库；

优选地，所述核酸外切酶为核酸外切酶III；

优选地，采用8～12U的所述核酸外切酶对每μg所述DNA片段进行酶切；更优选所述酶切的反应条件为先在35～39℃反应8～12min，然后在70～74℃反应18～25min。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S31包括：

S311，利用蛋白酶对所述DNA-蛋白交联复合体进行解交联，得到DNA和蛋白的混合物；以及

S312，对所述混合物进行DNA提取，得到所述DNA片段；

优选地，所述步骤S311包括以下步骤：

利用核酸内切酶对所述DNA-蛋白交联复合体进行酶切，得到酶切交联体片段，优选所述核酸内切酶为HindIII、MboI、EcoRI或DpnII；

对所述酶切交联体片段进行末端修复标记，得到标记交联体片段；

对所述标记交联体片段进行DNA连接，得到标记交联体连接片段；以及

采用蛋白酶K对所述标记交联体连接片段进行解交联，得到所述DNA和蛋白的混合物。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述标记交联体片段上的标记为生物素标记，

优选地，所述末端修复标记的步骤中，利用带生物素标记的dCTP及生物素未标记的dATP、dTTP和dGTP在Klenow片段修复酶的作用下，对所述酶切交联体片段进行末端修复标记，得到所述标记交联体片段。

10.一种染色体构型捕捉文库，其特征在于，采用权利要求1至9中任一项所述的方法构建而成。