CN115074309B - 基于同一组织样本同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的方法及应用 - Google Patents
基于同一组织样本同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明首次创新公开了一种在同一小鼠肾脏样本中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液制备、同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法。本发明还公开用于前述方法中的试剂盒。本发明填补现有技术空白，获取样本中更全面的细胞类型，为挖掘更深层次生物学机理提供了新的技术方案，具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于同一小鼠肾脏组织样本中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法，及同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法，以及用于悬液制备的试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，单细胞转录组研究业已成为生命科学研究的基本手段。包括单细胞测序(scRNA-seq,single cell RNA sequencing)与单细胞核测序(snRNA-seq,single nucleusRNA sequencing)都已成为很多研究不可或缺的技术方法。
由于涉及酶解过程，scRNA-seq经常造成一些细胞类型的丢失，如上皮细胞等不耐受酶解的细胞类型，通常较难捕获；成纤维细胞和内皮细胞更多嵌于细胞外基质和基底膜中，因此更难以分解。而免疫细胞类型因为本身“游离于组织环境中”的特性，很容易酶解得到。这样，就造成了scRNA-seq数据经常出现对免疫细胞类型的“偏好”。与之相对，snRNA-seq能够反映组织中真实的细胞类型比例，因而受到众多研究者的青睐。但因为免疫细胞本身占比不高，同时10x Genomics等细胞上机系统对细胞量有限制，因此snRNA-seq对免疫细胞类型通常捕获较少，这对很多关注免疫机制的研究者造成了很大困扰。尽管有报导可以将同一组织一分为二分别进行scRNA-seq及snRNA-seq，但这样的处理方式，对很多具有很大异质性的样本来说同样会产生偏好性，不能真实反映组织的细胞组成，导致结果的真实性和准确性大打折扣。
综上，目前亟需建立一种在同一组织中能够同时进行scRNA-seq和snRNA-seq的方法，使用scRNA-seq收集到较多的免疫细胞后，再通过snRNA-seq将其他细胞类型补充完整，从而达到“较为全面的捕获组织中的细胞类型的同时也能对免疫细胞类型进行突出”的目标，即可满足研究者的多种需求。
肾脏在维持机体内环境稳定方面发挥着重要的功能。目前现有技术中，仅有将一份组织分为两份去进行scRNA-seq&snRNA-seq，但此方法存在一定的问题：组织样本不同部位的信息都或多或少会存在差异，也就是说一份组织一分为二分别进行单细胞转录组与单细胞核转录组测序，会引入取样部位不同给结果造成的干扰。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明首次创新提出了一种基于同一组织样本(例如，同一小鼠肾脏组织)同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法和应用。至目前现有技术中有关这方面的技术研究还处于空白阶段，尚未见有报道。本发明方法不仅可避免实验差异性，而且可以更全面获得组织样本中的细胞类型。本发明建立了在同一组织样本中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液的制备，得到质量较高的单细胞及单细胞核悬液，并同时进行单细胞测序与单细胞核测序，创建scRNA-seq&snRNA-seq流程，克服了现在技术存在的技术障碍和困难，具有广泛应用前景。
本发明术语“同时进行”指的是可在同一份组织中获得单细胞与单细胞核悬液，不分先后顺序，同时获得即可。因为核裂解液会对细胞有损伤，所以先制备单细胞悬液再制备单细胞核悬液。
本发明提供了一种从同一组织样本出发，基于同一组织样本同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法，包括如下步骤：
(一)样本准备：
取小鼠肾脏组织，清洗，剪碎，将剪碎的组织块转移至离心管中；
(二)酶解：
加入培养基，加入胶原酶Ⅱ溶液进行消化酶解，酶解后加入胰酶溶液，混匀后室温静置；
(三)分离：
离心分离得到上清、沉降的组织沉淀；
(四)悬液制备：
单细胞悬液的制备：
取前述上清进行过筛处理、过筛处理结束后第一次离心，离心结束后弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后室温静置，裂红结束后第二次离心，离心结束后弃上清，用预冷的培养基对细胞沉淀进行第三次离心洗涤，洗涤结束后加入预冷的培养基重悬细胞沉淀，得到单细胞悬液；
细胞核悬液的制备：
取前述沉降的组织沉淀，使用PBS洗涤、第一次离心后弃上清，共洗涤3次，洗涤结束后加入Lysis Buffer(裂解缓冲液)重悬组织沉淀，置于冰上孵育，过筛，收集滤液，第二次离心后弃上清，加入ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)重悬细胞核沉淀，第三次离心后弃上清，洗涤、第四次离心弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到单细胞核悬液。
所述组织样本为小鼠肾脏组织。
在具体方案中，本发明方法包括如下步骤：
I.准备试剂
1.1培养基、胰酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、预冷的PBS溶液、裂红液。
2.1配置Lysis Buffer(裂解缓冲液)及ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)，并将配置好的溶液置于碎冰上预冷。
II.制备
1.2样品准备
取新鲜的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的离心管中。
1.4组织酶解
加入预冷的培养基，加入胶原酶Ⅱ溶液，上下颠倒混匀后，置于杂交炉中37℃消化酶解，消化结束后向离心管中加入胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置。
1.5结束酶解
加入预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清，并将剩余的组织沉淀转移至新的15mL的离心管中备用，将上清滴加至40μm的筛网过滤，离心后，弃上清。
按以下步骤1.6-1.7制备单细胞悬液：
1.6裂红
加入红细胞裂解液混匀后，静置，静置结束后离心弃上清。
1.7洗涤
加入预冷的培养基，4℃离心洗涤，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入预冷的培养基重悬细胞沉淀，镜检，确定最终的细胞总量、细胞活率及碎片占比。
1.9上机测序
依照10x Genomics公司说明书进行单细胞测序操作。
按以下步骤2.2-2.6制备单细胞核悬液：
2.2洗涤组织
加入PBS至上述步骤1.5所保留的酶解后的组织沉淀中，对组织进行洗涤处理，离心结束弃上清。
2.3裂解
根据上述组织沉淀量加入Lysis Buffer(裂解缓冲液)重悬组织沉淀，置于碎冰上孵育一定时间。
2.4过筛
使用细胞筛对细胞核悬液进行过滤，收集滤液至新的离心管中，离心后弃上清。
2.5洗涤纯化
加入ST Wash Buffer重悬上述的细胞核沉淀，离心后弃上清。
2.6洗涤
向上一步得到的细胞核沉淀中加入ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)，离心弃上清后，用最终Buffer(含1％BSA的PBS)重悬细胞核沉淀，得到上机所用的细胞核悬液。
2.7质检
取少许2.6步骤中得到的细胞核悬液进行镜检，确定最终的细胞核浓度、细胞核碎片比例及细胞核结团比例。
2.8上机测序
依照10x Genomics公司说明书进行单细胞核测序操作。
在具体实施方案中，
步骤1.1中，所述预冷的PBS的预冷温度为0～5℃；优选地，为碎冰上预冷。
步骤1.1中，所述的PBS厂家为Gibco，货号为10010-031。
步骤1.1中，所述的培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA。其中，RPMI1640培养基厂家为Corning，货号为CGR-10-040-CV。其中，BSA厂家为MACS，货号为130091376。
步骤1.1中，所述的胰酶溶液是指将胰酶冻干粉溶于PBS中，配置浓度为2.5％(m/v)的胰酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用。
步骤1.1中，所述的胶原酶Ⅱ溶液是指将胶原酶冻干粉溶于含有钙镁离子的HBSS溶液中，配置浓度为1％(m/v)的胶原酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用。
步骤1.1中，所述胰酶干粉厂家为索莱宝，货号为T8150-10g。
步骤1.1中，所述的胶原酶干粉厂家为Gibco，货号为17101-015。HBSS厂家为Gibco，货号为14025-076。
步骤1.2中，所述的新鲜小鼠肾脏组织的鲜重为200～500mg；优选地，为300mg。
步骤1.2中，所述的使用PBS以及培养基洗涤组织，目的是为了将肾脏样本上残留的血液充分清洗，减少后续处理的红细胞占比。
步骤1.2中，所述的洗涤样本，次数为1～2次，优选地为2次。
步骤1.3中，所述的离心管为15mL离心管，厂家为Corning，货号为430790。
步骤1.3中，所述的剪刀为高温灭菌后的无菌眼科剪刀。
步骤1.4中，所述的胶原酶Ⅱ的终浓度为0.5％(v/v)。
步骤1.4中，所述的杂交炉中37℃消化酶解，酶解时间为10～15min，优选地为10min。
步骤1.4中，所述的胰酶的终浓度为0.25％(v/v)。
步骤1.4中，所述的室温静置的时间为5～10min，优选地为5min。
步骤1.5中，所述的预冷培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA，其中，预冷温度为4℃。
步骤1.5中，所述的加入培养基体系的体积为4～8mL，优选地为6mL体系。
步骤1.5中，所述的将剩余组织沉淀转移至新的15mL离心管备用的目的是用于制备细胞核悬液。
步骤1.5中，所述的离心条件为500～800×g、5～10min、4～6℃，优选地，500×g、4℃、10min。
步骤1.6中，所述的红细胞裂解液厂家为上海生工生物工程股份有限公司，货号为B541001-0100。
步骤1.6中，所述的红细胞裂解液的体积为5～10mL，优选的为7mL。
步骤1.6中，所述静置的温度为25～37℃，优选地，为室温静置。
步骤1.6中，所述的静置的时间为4～8min，优选地为5min。
步骤1.6中，所述的离心条件为500g～800×g、4～6℃、离心5～7min，优选地，为500g、4℃、5min。
步骤1.7中，所述的预冷培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA，其中，预冷温度为4℃。
步骤1.7中，所述的加入培养基洗涤体系为5～8mL，优选地为7mL体系。
步骤1.7中，所述的离心条件为300～500×g，离心5～10min，优选地为300×g，4℃，离心10min。
步骤1.7中，所述的洗涤次数为1～3次，优选地为2次。
步骤1.8中，所述的预冷培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA，其中，预冷温度为4℃。
步骤1.8中，所述的加入培养基体系为0.5～1mL，优选地为1mL。
步骤1.8中，所述的镜检是指取9μL单细胞悬液与1μL 0.4％台盼蓝溶液混匀后，进行镜检。
步骤1.8中，所述的台盼蓝溶液厂家为Thermo Fisher Scientifc，货号为T10282。
步骤1.8中，所述的细胞悬液的细胞总量为180万、细胞活率为95％、碎片占比为4％。
步骤2.1中，所述的Lysis Buffer(裂解缓冲液)包括以下成份(终浓度)：10mMTris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4％～0.5％(v/v)TritonX-100、0.4％～0.5％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
步骤2.1中，所述的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)包含以下成分(终浓度)：10mMTris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
步骤2.1中，所述的最终Buffer中BSA的终浓度为1％～2％(v/v)，优选地，为1％(v/v)。
步骤2.1中，所述成份分别购自Tris-HCl(Invitrogen；15567027)、CaCl2(Sigma-Aldrich；21115-100ML)、NaCl(Thermo Fisher Scientific；AM9760G)、NP40(ThermoScientificTM；28324)、RNA酶抑制剂(Enzymatics&QIAGEN；Y9240L)、BSA(MACS,130091376)。
步骤2.1中，所述的冰是指制冰机产生的碎冰，装于适当大小的泡沫盒中，离心管插于碎冰内。
步骤2.2中，所述的PBS的体积为5～10mL，优选地，为10mL。
步骤2.2中，所述的离心条件为500g～1000×g，离心5～10min，优选地为1000×g，4℃，离心10min。
步骤2.2中，所述的洗涤组织次数为1～3次，优选地，为3次。
步骤2.2中，所述的洗涤组织的目的为将组织残留的酶液清洗干净，以免对后续细胞核的制备产生影响。
步骤2.3中，所述的Lysis Buffer(裂解缓冲液)的体积为1～2.5mL；优选地，为2mL。
步骤2.3中，所述的置于冰上孵育裂解一定时间为5～10分钟；优选地，为7分钟。
步骤2.4中，所述的细胞筛孔径为40μm。
步骤2.4中，所述的细胞筛购自BD falcon，货号352340。
步骤2.4中，所述的新的离心管为15mL离心管，厂家为Corning，货号为430790。
步骤2.4中，所述离心机的条件为800～1000×g、4～6℃离心10～15分钟，优选地，为1000×g，4℃离心10分钟。
步骤2.5中，所述的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)的体积为6～8mL，优选地为7mL。
步骤2.5中，所述洗涤时离心条件为500～1000×g、4℃离心5～10分钟；优选地，为1000×g，4℃离心10分钟。
步骤2.5中，所述的洗涤次数为1～3次，优选地为2次。
步骤2.6中，所述的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)的体积为5～7mL；优选地，为5mL。
步骤2.6中，所述的离心的条件为800～1000×g，5～10min，4℃；优选为1000×g，5min，4℃。
步骤2.6中，所述的含1％BSA的PBS的体积为1～2mL；优选地，为1mL。
步骤2.7中，所述的镜检使用0.4％台盼蓝(v/v)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
步骤2.7中，所述的台盼蓝溶液，厂家为Thermo Fisher Scientifc，货号为T10282。
步骤2.7中，所述的细胞核悬液的细胞核浓度应为1200～1600个/μL、细胞核碎片比例为4％～5％、细胞核结团比例为5％～6％。
本发明还提出了可用于在同一小鼠肾脏组织样本中同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的试剂/试剂盒，其包括但不限于细胞酶解液、Lysis Buffer(裂解缓冲液)、ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)。本发明还提出了所述试剂/试剂盒的应用，其可用于高效、快速、稳定且同时获得总量多、碎片及结团比例低的单细胞悬液及单细胞核悬液，可应用于在同一小鼠肾脏组织同时进行scRNA-seq和snRNA-seq。
其中，所述细胞酶解液为0.5％胶原酶II、0.25％胰蛋白酶；
所述Lysis Buffer(裂解缓冲液)为10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4％～0.5％(v/v)TritonX-100、0.4％～0.5％(v/v)吐温20、0.4U/μLRNaseInhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA；
所述ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)为10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
本发明还提出了所述试剂盒在同一小鼠肾脏组织样本中同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液的制备、同时进行单细胞测序及单细胞核测序中的应用。
本发明提供的试剂盒在使用时，不同人员操作影响小，重复性好、即拆即用、无需复杂流程，操作简便、温和且高效获得高质量的单细胞悬液。
与现有技术相比，本发明有益效果还包括：本发明填补了目前的技术空白。目前并未有在同一组织、同一肾组织中同时进行单细胞悬液和细胞核悬液制备的技术。本发明提供的技术方案解决了这一问题，填补了技术空白。本发明提供的技术方案可以在同一份样本中得到更多有意义的数据，挖掘到更深层次的生物学信息。本发明创新改进地将单细胞悬液制备和单细胞核悬液制备两种技术相结合，突破现有的技术障碍，得到样本中更全面的细胞类型从而丰富了研究数据，为挖掘更深层次的生物学机理提供了基础。
附图说明
图1是本发明方法中的小鼠肾脏单细胞悬液镜检结果的示意图。
图2是本发明方法中的小鼠肾脏细胞核悬液镜检结果的示意图。
图3是本发明方法中的小鼠肾脏细胞RNA质检结果的示意图。
图4是本发明方法中的小鼠肾脏细胞核RNA质检结果的示意图。
图5是本发明方法中的小鼠肾脏细胞核tsne图谱结果的示意图。
图6是本发明基于同一小鼠肾脏组织样本同时进行单细胞悬液和细胞核悬液制备以及scRNA-seq+snRNA-seq流程示意图。
图7是本发明方法中用于同一小鼠肾脏组织样本同时进行单细胞悬液和细胞核悬液制备以及scRNA-seq+snRNA-seq试剂盒示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
本实施例以同一小鼠肾脏为样本，同时制备单细胞悬液与细胞核悬液，并分别开展单细胞测序和单细胞核测序。
1.1准备试剂
培养基、胰蛋白酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、PBS。
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入6mL预冷的培养基，加入终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。消化结束后向离心管中加入0.25％(v/v)的胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置5min。
1.5结束酶解
加入6mL预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清。
按以下1.6-1.7制备单细胞悬液：
1.6裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.7洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2.1准备试剂
分别配置Lysis Buffer(裂解缓冲液)及ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)，并将配置好的溶液预冷。
Lysis Buffer(裂解缓冲液)包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4％(v/v)TritonX-100、0.4％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNaseInhibitor(RNA酶抑制剂)。
ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％(v/v)BSA。
按以下2.2-2.6制备单细胞核悬液：
2.2组织沉淀洗涤
加入10mL的PBS将上述1.5中所述剩余组织洗涤3次，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.3裂解组织
向组织沉淀中，加入2mL的cell Lysis buffer(裂解缓冲液)，置于冰上孵育7min。
2.4过筛
裂解结束后采用40μm细胞筛对其进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
加入7mL的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)至细胞核沉淀中，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.6洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入7mL的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)，以300×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入含1％BSA的预冷PBS。用起重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.7镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
结果及分析：
以上实验结果显示：通过本发明方法在同一小鼠肾脏组织中同时制备单细胞悬液和单细胞核悬液，制备结束后，单细胞悬液、细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表1)。
实施例2
本实施例以同一小鼠肾脏组织为样本，同时制备单细胞悬液与细胞核悬液，并分别开展单细胞测序和单细胞核测序。
1.1准备试剂
培养基、胰蛋白酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、PBS。
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入6mL预冷的培养基，加入终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。消化结束后向离心管中加入0.25％(v/v)的胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置5min。
1.5结束酶解
加入6mL预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清。
按以下1.6-1.7制备单细胞悬液：
1.6裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.7洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2.1准备试剂
分别配置Lysis Buffer(裂解缓冲液)及ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)，并将配置好的溶液预冷。
Lysis Buffer(裂解缓冲液)包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.5％(v/v)TritonX-100、0.5％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNaseInhibitor(RNA酶抑制剂)。
ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、2％(v/v)BSA。
按以下2.2-2.6制备单细胞核悬液：
2.2组织沉淀洗涤
加入10mL的PBS将上述1.5中所述剩余组织洗涤3次，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.3裂解组织
向组织沉淀中，加入2mL的Lysis Buffer(裂解缓冲液)，置于冰上孵育7min。
2.4过筛
裂解结束后采用40μm细胞筛对其进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
加入7mL的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)至细胞核沉淀中，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.6洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入7mL的ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)，以300×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入含1％BSA的预冷PBS。用起重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.7镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
结果及分析：
结果显示：通过本发明所述的技术方法在同一小鼠肾脏组织中同时制备单细胞悬液和单细胞核悬液，制备结束后，单细胞悬液、细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表1)。
对比实施例1
使用小鼠肾脏作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加酶处理，于37℃放置。
1单细胞核悬液制备
1.1准备试剂、仪器、耗材
开始取材前，预先准备好离心管、剪刀、培养皿、PBS、离心机等。参考10X单细胞核制备方法分别配置裂解缓冲液及洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于冰上预冷。
裂解缓冲液成份包括(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.1％～0.2％NP40、21mM MgCl2、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、21mM MgCl2、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
1.2样本清洗
将新鲜组织取出后，使用冰上预冷的PBS漂洗2次，直至看不到明显的血液残留为止。
1.3细胞核悬液制备
一边向培养皿中加入2mL裂解缓冲液，一边使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织在培养皿中剪碎，组织剪碎后冰上静置7分钟，裂解完成后加入洗涤缓冲液，再经过40μm孔径的细胞筛过滤，将滤液转移至新的15mL离心管中，然后以1000×g、4℃离心10分钟。将剩余组织回收用于单细胞悬液的制备。离心结束后细胞核沉淀使用洗涤缓冲液重悬，再经过洗涤纯化，制备得到单细胞核悬液。
1.4细胞核悬液质检
将9μL上述1.3步骤中得到的细胞核悬液与1μL的台盼蓝染色液混匀，进行镜检，确定最终细胞核的浓度、碎片比例及细胞核结团比例。
2单细胞核悬液静置
2.1室温静置
用移液器吸取制备好的单细胞核悬液至15mL离心管中，置于37℃中静置20min。
2.2 RNA抽提
静置结束后对单细胞核悬液进行细胞核RNA抽提。
2.3 RNA质检
对抽提的细胞核RNA进行nanodrop，4150质检。
2.4镜检
取9μL上述步骤中静置后的单细胞核悬液与1μL台盼蓝溶液混匀后，进行镜检。
结果显示：细胞核RNA于37℃放置20min后未发生降解。
对比实施例2
使用小鼠肾脏作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加酶处理，于37℃放置。
除放置时间由20min替换成40min外，其余操作与对比实施例1完成相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1有所升高；细胞核RNA于37℃放置40min后，RNA主峰出现些许偏移。
对比实施例3
使用小鼠肾脏作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加酶处理，于37℃放置。
除放置时间由20min替换成60min外，其余操作与对比实施例1完成相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例2有所升高；细胞核RNA于37℃放置60min后，开始降解。
对比实施例4
使用小鼠肾脏作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加酶处理，于37℃放置。
除放置时间由20min替换成80min外，其余操作与对比实施例1完成相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例3有所升高；细胞核RNA于37℃放置80min后，细胞核RNA基本完全降解。
对比实施例5
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
根据文献《High-Dimensional Single-Cell Analysis Identifies Organ-Specific Signatures and Conserved NK Cell Subsets in Humans and Mice》提供的现有技术，即不加任何酶液制备单细胞悬液。
1.1试剂准备
预冷的DPBS
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用DPBS清洗后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将洗涤后的小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。向离心管中加入5mL预冷的DPBS，使用一次性滴管反复吹打组织。静置待组织块完全沉降后，用移液器吸取上清经40μm的筛网进行过滤处理，将滤液过滤至新的15mL离心管中，将底部剩余的组织沉淀留存用于后续细胞核的制备。将过滤后的上清进行离心操作，500×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
1.4裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.5洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.6镜检
加入1mL的预冷含0.1％BSA培养基重悬，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，进行镜检。
结果显示：通过现有技术制备小鼠肾脏组织单细胞悬液，经制备结束后，细胞总量较少，活率较低，且碎片杂质高，不满足10x Genomics单细胞测序上机要求，无法进行10xGenomics公司单细胞测序实验。
对比实施例6
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
依据文献《A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for freshand frozen human tumors》提供的技术方法。
1.1准备试剂
预冷的PBS，酶液混合物(Liberase TM、elastase(LE),DNase I)
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，结束后弃掉洗涤液。
1.3酶解组织
将洗涤后的肾脏组织转移至装有3mL解离酶液混合物(Liberase TM、elastase(LE),DNase I)的离心管中，用剪刀将其剪碎后，在水平转速为14转的速度下，37℃孵育10min。10分钟后，使用一次性滴管在室温下吹打混匀20次，再旋转孵育10min。孵育结束后使用一次性滴管再次吹打混匀20次。使用40μm细胞筛进行过筛处理，过筛后的组织沉淀保留用于后续细胞核的制备，单细胞悬液继续进行后续处理。300-580×g，4℃离心4-7min。离心结束后弃上清，进行裂红、洗涤操作。
1.4镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
2单细胞核悬液制备
2.1准备试剂
分别配置裂解缓冲液及洗涤缓冲液，并将配置好的溶液预冷。
裂解缓冲液成份包括以下(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％NP40、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
2.2组织沉淀洗涤
加入10mL的PBS将上述所述的剩余组织洗涤3次，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.3裂解组织
向组织沉淀中，加入2mL的cell lysis buffer，置于冰上孵育7min。
2.4过筛
裂解结束后采用40μm细胞筛网进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
加入7mL的洗涤缓冲液至细胞核沉淀中，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.6洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入7mL的洗涤缓冲液，以300×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入含1％BSA的预冷PBS。用起重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.7镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
2.8上机测序
2.9细胞核质检
对单细胞核进行RNA抽提，抽提结束后使用nanodrop及进行质检。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液、细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例7
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
根据文献《Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone ofthe Embryonic Mouse Kidney》提供的现有技术。
1.1准备试剂
HBSS、DNase、0.25％CollagenaseA(w/v)、1％Pancreatin digest(w/v)
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用HBSS溶液清洗后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，结束后弃掉洗涤液。
1.2组织酶解
向小鼠肾脏组织中加入1.5mL Collagenase A/Pancreatin溶液，使用无菌剪刀将组织剪碎后，使用一次性滴管将其转移至新的离心管中，37℃，孵育15min。孵育结束后，将其取出，加入15μL的FBS，颠倒混匀三次后，静置2min。静置结束后，取1.4mL的细胞悬液至装有3μL DNase(1U/ml)的离心管中，剩余的肾脏组织留存备用，用于制备细胞核。将细胞悬液与DNase的混合物继续在预37℃下孵育10min。将细胞悬液在329×g，4℃下，离心5min。离心结束后弃上清。
1.4裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.5洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.6镜检
加入1mL的预冷含0.1％BSA培养基重悬，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，进行镜检。
2单细胞核悬液制备
其细胞核制备操作步骤与对比实施例1完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液、细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例8
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
根据文献《Pediatric brain tumor cancer stem cells:cell cycle dynamics,DNA repair,and etoposide extrusion》提供的现有技术。
1.1试剂准备
HBSS、0.04％Collagenase Type 1、0.01％Hyaluronidase、0.02％DNaseI、0.008％Neutral Protease
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用HBSS清洗后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织酶解
使用无菌剪刀将洗涤后的小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止。将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。向离心管中加入预冷的DMEM，并同时加入酶混合液(0.04％Collagenase Type 1、0.01％Hyaluronidase、0.02％DNaseI、0.008％Neutral Protease)。上下颠倒混匀后，在37℃下，70rpm，消化60min。消化结束后，用移液器吸取上清经40μm的筛网进行过滤处理，将滤液过滤至新的15mL离心管中，将底部剩余的组织沉淀留存用于后续细胞核的制备。将过滤后的上清进行离心操作，室温，180×g、离心5min，离心结束后弃上清。
1.4裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.5洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.6镜检
加入1mL的预冷含0.1％BSA培养基重悬，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，进行镜检。
2单细胞核悬液制备
其细胞核制备操作步骤与对比实施例1完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液、细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但单细胞核RNA有降解。
对比实施例9
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
1.1试剂准备
PBS，培养基，CaCl2，DNase1，地衣芽孢杆菌酶(sigma，P5380)
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。注意全程冰上操作。
1.4组织酶解
加入4mL预冷的培养基，加入终浓度为2mg/mL地衣芽孢杆菌酶溶液，40μL DNase1，4μLCaCl2，上下颠倒混匀后，放入4℃，消化酶解30min。
1.5结束酶解
加入6mL预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清。注意全程冰上操作。
1.6裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.7洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2单细胞核悬液制备
其细胞核制备操作步骤与对比实施例1完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、碎片杂质比例、结团比例，可以达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但无法制备到细胞核。
对比实施例10
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将低温酶解时间替换成15min外，其余操作步骤均与对比实施例9一致。
2单细胞核悬液制备
其细胞核制备操作步骤与对比实施例1完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、碎片杂质比例、结团比例，可以达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但无法制备到细胞核。
对比实施例11
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将低温酶浓度减半外，其余操作步骤均与对比实施例9一致。
2单细胞核悬液制备
其细胞核制备操作步骤与对比实施例1完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、碎片杂质比例、结团比例，可以达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但无法制备到细胞核。
对比实施例12
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将低温酶浓度减半以及低温酶解时间替换成15min外，其余操作步骤均与对比实施例9完全一致。
2单细胞核悬液制备
其细胞核制备操作步骤与对比实施例1完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞核总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例13
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
1.1准备试剂
培养基、胶原酶Ⅰ溶液、PBS。
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入6mL预冷的培养基，加入终浓度为0.2％的胶原酶Ⅰ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。
1.5结束酶解
加入6mL预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清。
1.6裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.7洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例14
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶解消化时间增加到20min外，其余操作与对比实施例13完全一致。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例15
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅱ外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例16
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅱ以及酶解时间增加到20min外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例17
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例18
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅳ以及酶解时间增加到20min外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例19
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.25％胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例20
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.25％胰蛋白酶以及酶解时间增加到20min外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例21
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例22
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％木瓜蛋白酶以及酶解时间增加到20min外，其余操作与对比实施例13完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例23
本实施例以小鼠肾脏为样本，同时制备单细胞悬液与细胞核悬液，并分别开展单细胞测序和单细胞核测序。
1单细胞悬液制备
1.1准备试剂
培养基、胶原酶Ⅰ溶液、胶原酶Ⅱ溶液、PBS。
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入6mL预冷的培养基，加入终浓度为0.2％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。消化结束后向离心管中加入0.2％胶原酶Ⅰ溶液，上下颠倒混匀后，室温静置10min。(加入6mL预冷的培养基，加入终浓度为0.2％的胶原酶Ⅰ溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。消化结束后向离心管中加入0.2％胶原酶Ⅱ溶液，上下颠倒混匀后，室温静置10min。)
1.5结束酶解
加入6mL预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清。
1.6裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.7洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例24
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅰ和0.2％胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例25
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅰ和0.25％胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例26
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅰ和0.2％木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例27
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅱ和0.2％胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例28
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅱ和0.25％胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，单细胞悬液可达到10xGenomics公司单细胞测序要求，且单细胞核RNA未发生降解。
对比实施例29
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％胶原酶Ⅱ和0.2％木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例30
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.25％胰蛋白酶和0.2％胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例31
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％木瓜蛋白酶和0.2％胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例32
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将酶换为0.2％木瓜蛋白酶和0.25％胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞核RNA发生降解。
对比实施例33
本实施例以小鼠肾脏为样本，同时制备单细胞悬液与细胞核悬液，并分别开展单细胞测序和单细胞核测序。
1单细胞悬液制备
1.1准备试剂
培养基、胰蛋白酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、PBS。
1.2样品准备
取新鲜的300mg的小鼠肾脏组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入6mL预冷的培养基，加入终浓度为0.1％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。消化结束后向离心管中加入0.25％胰蛋白酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置10min。
1.5结束酶解
加入6mL预冷培养基，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清。
1.6裂解红细胞
向细胞沉淀中加入7mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.7洗涤
向细胞沉淀中加入7mL培养基，300×g、4℃、离心10min，离心结束后弃上清。
1.8镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例28下降。
对比实施例34
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.3％外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例28有所提升。
对比实施例35
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.4％外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例34有所提升。
对比实施例36
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.5％外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例35有所提升。
对比实施例37
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.6％外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例36有所下降。
对比实施例38
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.5％、胰蛋白酶浓度换为0.2％外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例28有所下降。
对比实施例39
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.5％、胰蛋白酶浓度换为0.3％外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例28有所下降。
对比实施例40
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
除将胶原酶Ⅱ浓度换为0.5％、胰蛋白酶消化时间换为5min外，其余操作与对比实施例33完全相同。
2单细胞核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3单细胞核RNA质控
将细胞核RNA进行抽提后，采用Nanodrop、4150对细胞核RNA进行质控。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液质量较对比实施例36有所提升。
对比实施例41
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀未经洗涤，直接进行单细胞核制备。
2.1准备试剂
分别配置裂解缓冲液及洗涤缓冲液，并将配置好的溶液预冷。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％(v/v)NP40、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
2.2裂解组织
向组织沉淀中，加入2mL的cell lysis buffer，置于冰上孵育7min。
2.3过筛
裂解结束后采用40μm细胞筛对其进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.4洗涤
加入7mL的洗涤缓冲液至细胞核沉淀中，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入7mL的洗涤缓冲液，以300×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入含1％BSA的预冷PBS。用起重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.6镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但细胞核基本破碎，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例42
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤1次，洗涤后进行单细胞核制备。其余操作与对比实施例41完全一致。
结果及分析：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但细胞核量较少，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例43
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤2次，洗涤后进行单细胞核制备。其余操作与对比实施例41完全一致。
结果及分析：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。但细胞核量较少，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例44
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤3次，洗涤后进行单细胞核制备。其余操作与对比实施例41完全一致。
结果及分析：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。同时细胞核悬液也能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例45
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤4次，洗涤后进行单细胞核制备。其余操作与对比实施例41完全一致。
结果及分析：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。同时细胞核悬液也能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例46
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
2.1准备试剂
配置洗涤缓冲液，并将配置好的溶液预冷。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
2.2组织沉淀洗涤
加入10mL的PBS将上述1.5中所述剩余组织洗涤2次，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.3组织破碎
将装有组织的离心管放入液氮中，迅速冷冻后取出。将液氮速冻过的组织置于培养皿中，全程置于冰上将其剪碎，使用1mL洗涤缓冲液重悬。
2.4过筛
剪碎重悬后采用40μm细胞筛对其进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
加入7mL的洗涤缓冲液至细胞核沉淀中，1000×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.6洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入7mL的洗涤缓冲液，以300×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入含1％BSA的预冷PBS。用起重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.7镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
结果及分析：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求。细胞核经处理后完整性较差，出现破碎，导致碎片比例稍高，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例47
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液的主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％TritonX-100外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％TritonX-100、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞核碎片比例稍高，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例48
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％吐温20外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％吐温20、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞核碎片比例稍高，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例49
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％NP40外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％NP40、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞核碎片比例稍高，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例50
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％NP40外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％NP40、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，不能够达到10xGenomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例51
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％TritonX-100外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％TritonX-100、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，能够达到10xGenomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例52
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分变更为0.3％TritonX-100+0.3％吐温20外，其单细胞核悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.3％TritonX-100+0.3％吐温20、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，不能够达到10xGenomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例53
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分变更为0.4％TritonX-100+0.4％吐温20外，其单细胞核悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4％TritonX-100+0.4％吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，能够达到10xGenomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例54
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分变更为0.5％TritonX-100+0.5％吐温20外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.5％TritonX-100+0.5％吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，能够达到10xGenomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例55
使用小鼠肾脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核悬液的方式。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与本发明实施例1～2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将裂解缓冲液主要成分变更为0.6％TritonX-100+0.6％吐温20外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.6％TritonX-100+0.6％吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)
结果及分析：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，碎片率较对比实施例54升高，不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例56
使用小鼠心脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核的方式。除组织样本不同外，其余所有操作与本发明实施例1完全相同。
结果显示：采用本发明所述技术方法对小鼠心脏组织同时进行单细胞悬液与细胞核悬液制备。结果显示小鼠心脏组织无法同时进行单细胞测序和单细胞核测序。
对比实施例57
使用小鼠脑作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核的方式。除组织样本不同外，其余所有操作与本发明实施例1完全相同。
结果显示：采用本发明所述技术方法对小鼠脑组织同时进行单细胞悬液与细胞核悬液制备。结果显示小鼠脑组织无法同时进行单细胞测序和单细胞核测序。
对比实施例58
使用小鼠肺脏作为样本。采用先制备单细胞悬液再制备细胞核的方式。除组织样本不同外，其余所有操作与本发明实施例1完全相同。
结果显示：采用本发明所述技术方法对小鼠肺组织同时进行单细胞悬液与细胞核悬液制备。结果显示小鼠肺组织无法同时进行单细胞测序和单细胞核测序。
进一步地，根据本发明表1提供的关于本发明实施例1～2的实验结果，说明本发明所提供的实验方法在小鼠肾脏组织中同时制备单细胞悬液与单细胞核悬液，能够满足10xGenomics单细胞及单细胞核测序实验各项质量指标的要求，顺利完成同一小鼠肾脏组织单细胞+单细胞核测序实验。(见图1～图5)。
表1本发明方法中基于同一小鼠肾脏组织同时制备单细胞悬液及细胞核悬液的实验结果
本发明提出的一种可在同一小鼠肾脏组织中同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备、同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法，并通过一系列对比实验，如对比实施例1～58所示，表明本发明具有突出的实质性特点和显著进步。
本发明创造性地将单细胞和单细胞核测序两者结合起来。由于制备单细胞核悬液的裂解缓冲液中的去污剂，会破坏磷脂双分子层，溶解胞质和细胞膜，对细胞损伤较大，可能会导致后续单细胞悬液制备时收集不到足量的完整的细胞，无法满足10x Genomics上机要求。为此本发明采用先制备单细胞悬液再制备单细胞核悬液的操作顺序，以便在同一组织中同时获得单细胞悬液及单细胞核悬液。
对比实施例1～4按照10x Genomics制备细胞核方式制备了单细胞核悬液，然后将制备好的单细胞核悬液分别分装到四个15mL离心管中，置于37℃静置，模拟酶解过程中温度对细胞核悬液的影响。每隔20min，抽取一份单细胞核悬液，对细胞核悬液进行台盼蓝染色镜检以及RNA抽提质控。结果显示，随着时间的增加(20min，40min，60min，80min)，单细胞核悬液细胞核碎片杂质比列、结团比例均有升高；且放置40min后，RNA主峰出现了些许偏移，放置60min后，细胞核RNA出现明显降解，放置80min后，细胞核RNA基本上完全降解。综上所述，推测同一小鼠肾脏组织中，要进行scRNA-seq&snRNA-seq，在制备单细胞悬液时，37℃酶解时间一定要控制在40min内，且尽量不要超过20min，以此避免影响后续单细胞核悬液质量。
表2制备好的单细胞核悬液，室温放置时间变化
根据对比实施例1～4的结果，要保证较高质量的单细胞核RNA完整性，酶解时间应控制在40分钟以内。接下来对不同的单细胞悬液制备方式进行验证，如对比实施例5～40所示，依次确定了单细胞悬液制备的酶解配方及浓度。参照10x Genomics公司标准，以细胞总量、碎片比例、结团比例以及细胞核RNA质量作为主要质控指标，综合进行比较和判定。对比实施例5根据文献提供的现有技术，即不加任何酶液制备单细胞悬液。结果显示，细胞活率较低，死细胞较多，无法达到10x Genomics公司标准。接下来继续尝试其他酶解法。对比实施例6～8分别根据文献中的现有技术，对酶解配方进行测试，结果显示对比实施例6～7依据文献提供的技术方法进行了单细胞悬液的制备，单细胞悬液能够达到10x Genomics公司上机要求。对比实施例8根据文献提供的对脑组织进行单细胞悬液制备的现有技术，进行了小鼠肾脏的单细胞悬液制备，结果显示单细胞悬液能够达到10x Genomics公司要求，但对细胞核RNA质控后，发现细胞核RNA完整性较差，RNA出现降解，综合对比实施例1～4结果推测可能因为酶解消化时间(60min)过长所造成。对比实施例9～12采用了地衣芽孢杆菌酶对小鼠肾脏组织进行解离，分别验证了地衣芽孢杆菌酶的浓度(2mg/mL、1mg/mL)及酶解时间(15min、30min)。结果显示，使用地衣芽孢杆菌酶低温酶解小鼠肾脏组织，无法制备到高质量的单细胞核悬液。对比实施例13～22采用单个蛋白酶配方(0.2％胶原酶Ⅰ、0.2％胶原酶Ⅱ、0.2％胶原酶Ⅳ、0.25％胰蛋白酶、0.2％木瓜蛋白酶)进行解离(10min、20min)，同样无法获得较好的细胞活率和细胞量，均无法满足10x Genomics公司上机标准。推测可能是时间较短，解离不够充分导致。由于单个酶成份配方均无法在20分钟内实现有效解离，因此，尝试着组合酶配方，希望能通过不同酶切位点的组合方式，来尽可能充分的解离，以避免单个酶解的时间太短导致解离不充分的缺陷。为避免不同酶的相互间彼此酶解，采用先后加入的方式，总时间仍控制在20分钟以内。对比实施例23～32对组合酶配方进行了验证，结果显示，对比实施例23～27,对比实施例29～32细胞核RNA有降解的现像，可能是由于这些组合对细胞核膜具有一定的损伤，导致核内RNA降解。对比实施例28结果显示，胶原酶Ⅱ和胰酶的先后处理，可以同时获得满足上机要求的单细胞悬液和单细胞核悬液。因此，接下来对酶的浓度和作用时间再进行优化。对比实施例33～40验证了胶原酶Ⅱ与胰蛋白酶的浓度及酶解时间，结果显示，胶原酶Ⅱ与胰蛋白酶浓度以及酶解时间过高或过低，均无法满足实验需求。结果显示对比实施例40可满足10x Genomics公司上机标准。对比实施例6、7、40均可满足单细胞测序要求，接下来将对比实施例6、7、40进行上机测序，对下机后的数据进行分析得到tsne图谱，对比发现后对比实施例40可捕获到更全面和完整的细胞类型。综合考虑方法的简便性、成本、数据结果以及按照10x Genomics公司标准，以细胞总量、碎片比例、结团比例细胞核RNA质量作为主要质控指标，确定了制备单细胞悬液的配方。因此最终确定了制备单细胞悬液的方法，即将组织使用无菌剪刀剪碎后，加入6mL培养基，使用终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min，消化结束后向离心管中加入0.25％(v/v)的胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置5min。
表3现有技术制备单细胞悬液方法比较
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样本制备单细胞悬液的方法确定后，需要对细胞核制备和纯化进行摸索和改进。对比实施例41～45对制备单细胞悬液后的剩余组织沉淀的预处理进行了比较。结果如对比实施例41～45所示。结果显示，当剩余组织未经过洗涤进行细胞核制备时，制备到的细胞核量很少，碎片率较高，推测是剩余组织残留的酶对核膜造成损伤。将酶解后的剩余组织洗涤三次时，制备到的细胞核量最高，碎片率最低。洗涤4次与洗涤3次，并未有较大差别，所以最终确定了酶解后的剩余组织洗涤次数为3次。
表4酶解后的剩余组织洗涤次数比较
对比实施例46～55对制备细胞核的方式进行了比较。对比实施例46结果显示将酶解后剩余组织经液氮速冻不加入裂解缓冲液去制备细胞核，细胞核发生了膨胀破碎，碎片率较高。推测可能是酶解后的组织经液氮速冻后，在细胞核内形成冰晶，冻融后破坏了细胞核的完整性。由于使用10X方法进行细胞核制备，碎片率稍高，推测可能是酶解法造成，所以对比实施例47～55对细胞核裂解缓冲液的成分进行了验证，裂解缓冲液的主要成分为非离子型去污剂，所以接下来分别将10x制备单细胞核时，裂解缓冲液的主要成分0.1％～0.2％NP40换成了0.1％～0.2％TritonX-100、0.1％～0.2％吐温20、0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％NP40、0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％NP40、0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％NP40。以细胞总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，能够达到10xGenomics公司单细胞测序要求为标准对结果进行质控，结果显示对比实施例47～48，细胞核悬液碎片率都偏高，推测因为在制备单细胞悬液时，酶解法导致了碎片率过高，所以可能需要比较强的去污剂成分进行单细胞核悬液的纯化，单一的去污剂成分可能很难提高单细胞核悬液的质量。接下来对比实施例49～51尝试了以去污剂组合的方式作为裂解缓冲液的主要成分，如：0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％NP40、0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％NP40、0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％吐温20。结果显示对比实施例50质控结果高于对比实施例46～49，所以最终确定了裂解缓冲液的主要成分，以去污剂TritonX-100+吐温20的组合方式。在确定了裂解液配方的基础上，接下来对比实施例52～55对裂解缓冲液主要成分去污剂浓度进行了验证。结果显示，随着去污剂浓度的提高，单细胞核悬液碎片率有所降低。当使用浓度为0.4％～0.5％TritonX-100+0.4％～0.5％吐温20时，单细胞核悬液质量偏差不大，基本相同。当对比实施例55使用浓度为0.6％TritonX-100+0.6％吐温20时，单细胞核悬液碎片率开始较之前升高，推测可能去污剂浓度过高，细胞核裂解过度而发生了破碎所导致。所以最终确定了裂解缓冲液去污剂的浓度为0.4％～0.5％TritonX-100+0.4％～0.5％吐温20。
表5细胞核悬液制备方法比较
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经以上对比实施例1～55确定了小鼠肾脏组织中同时制备单细胞悬液、单细胞核悬液技术方案的基础上，对比实施例56～58使用该技术方案对其它几种类型的小鼠组织进行了重复实验。结果显示，均无法同时进行单细胞悬液与单细胞核悬液的制备。
表6不同组织制备单细胞悬液与细胞核结果比较
综上所述，本发明提出的基于同一小鼠肾脏组织样本中同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备、同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法，单细胞悬液制备方法(酶解配方、酶解的时间)，单细胞核悬液制备方法(酶解剩余组织洗涤次数，裂解缓冲液配方、裂解缓冲液浓度等)之间是一一对应的。使用本发明所述的实施例1与实施例2方法能够有效制备到高质量的(即总量高，碎片率及杂质偏低)单细胞悬液及单细胞核悬液，且获得单细胞悬液及单细胞核悬液能够满足单细胞测序实验要求。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (3)
1.一种基于同一组织样本的同时进行单细胞测序和细胞核测序的方法，其特征在于，所述方法在同一组织样本中同时制备单细胞悬液和单细胞核悬液，然后测序；
所述方法包括如下步骤：
（一）样本准备：
取小鼠肾脏组织，清洗，剪碎，将剪碎的组织块转移至离心管中；
（二）酶解：
加入培养基，加入胶原酶Ⅱ溶液进行消化酶解，酶解后加入胰酶溶液，混匀后室温静置；所述培养基是指向RPMI1640培养基中加入1% BSA；所述的胰酶溶液是指将胰酶冻干粉溶于PBS中，配置浓度为2.5% m/v的胰酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用；所述的胶原酶Ⅱ溶液是指将胶原酶冻干粉溶于含有钙镁离子的HBSS溶液中，配置浓度为1％ m/v的胶原酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用；所述消化酶解的温度为37℃，酶解的时间为10~15min；所述的加入胰酶混合后室温静置时间为5~10min；所述的酶解顺序为先加入胶原酶Ⅱ再加入胰酶；
（三）分离：
分离得到上清、沉降的组织沉淀；
（四）悬液制备：
单细胞悬液的制备：
取前述上清进行过筛处理、过筛处理结束后第一次离心，离心结束后弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液混匀后室温静置，裂红结束后第二次离心，离心后弃上清，用预冷的培养基对细胞沉淀进行第三次离心洗涤，洗涤结束后加入预冷的培养基重悬细胞沉淀，得到单细胞悬液；
所述单细胞悬液的制备中，所述静置的温度为25~37℃；所述的静置时间为4~8min；所述的第一次离心条件为500~800×g、5~10min、4~6℃；所述的红细胞裂解液的体积为5~10mL；所述的第二次离心条件为500g~800×g、4~6℃、离心5~7min，所述的第三次离心条件为300~500×g，离心5~10min；所述的预冷培养基是指向RPMI1640培养基中加入1% BSA，其中，预冷温度为4℃；所述的加入培养基体系为0.5~1mL；
细胞核悬液的制备：
取前述沉降的组织沉淀，使用PBS对其进行洗涤、第一次离心后弃上清，共洗涤3次，洗涤结束后加入裂解缓冲液重悬组织沉淀，冰上孵育，过筛，收集滤液，第二次离心后弃上清，加入ST 洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀，第三次离心后弃上清，洗涤、第四次离心弃上清，用含1% BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到细胞核悬液；同时进行单细胞测序与单细胞核测序；
所述细胞核悬液的制备中，所述的第一次离心条件为500g~1000×g，离心5~10min；所述第二次离心的条件为800~1000×g、4~6℃离心10~15分钟；所述第三次离心的条件为500~1000×g、4℃离心5~10分钟；所述第四次离心的条件为800~1000×g，5~10min，4℃；所述裂解缓冲液为10mM Tris-HCl pH=7.5、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4%~0.5% v/v TritonX-100、0.4%~0.5% v/v 吐温20、0.4U/μL RNA酶抑制剂、1%~2% v/v BSA；所述ST 洗涤缓冲液为10mM Tris-HCl pH=7.5、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4U/μL RNA酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（一）中，所述小鼠肾脏组织鲜重为200~500mg；和/或，所述清洗的次数为1~2次。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述方法得到的单细胞悬液为的细胞总量为180万、细胞活率为95％、碎片占比为4％；
和/或，所述方法得到的单细胞核悬液的细胞核浓度应为1200~1600个/μL、细胞核碎片比例为4%~5%、细胞核结团比例为5%~6%。
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