CN113604539A - 一种适用于单细胞测序的低温解离试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于单细胞测序的低温解离试剂盒，所述试剂盒包括酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2。本发明还公开了所述试剂盒在单细胞测序中的应用。本发明提供的适用于单细胞测序的低温解离试剂盒将有力的促进低温解离的开展和广泛应用，进一步提升单细胞测序数据质量。本发明提供的试剂盒成分可以直接使用，操作人员不需要再进行解离液的配置；提升效率的同时，使操作步骤实现“标准化”，更有利于避免因为人为配置带来的操作误差，提升数据质量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于动物组织低温解离的试剂盒及其在单细胞测序中的应用和使用方法。
背景技术
单细胞测序技术业已成为生命科学研究的基础技术手段，为人们理解生命现象背后的机制提供了无与伦比的数据。单细胞测序主要流程为：1)解离组织制备单细胞悬液；2)构建测序文库；3)测序；4)数据分析。其中制备单细胞悬液是进行单细胞测序的第一步也是最关键的一步。目前单细胞悬液的制备主要采取酶解消化的方式，其酶解体系由胰蛋白酶、胶原蛋白酶等多种酶组成。这些酶起作用的温度通常在37℃左右，因此解离组织通常在37℃的条件下进行。而这一温度会对细胞的转录组造成很大的“应激”，引起细胞转录组在解离过程中发生较大变化，从而造成“解离偏好”，极大影响结果的准确性与可靠性。
为了应对这一难题，目前学术界已开发了低温解离流程，在6℃条件下进行组织解离，从而避免引起细胞的“应激”，例如《Psychrophilic proteases dramatically reducesingle-cell RNA-seq artifacts:a molecμLar atlas of kidney development》一文中，应用低温蛋白酶进行解离可以有效避免37℃引起的“人为偏好”，保证结果准确、可靠，真实反映样本的生物学差异。但这一技术方案目前尚未形成相关试剂盒，蛋白酶无法长期保存活性等问题有待解决，限制了该技术方案的广泛应用，亟需开发一款试剂盒填补这一空白。
发明内容
现有低温解离技术中，酶解液无法长期保存，必须现用现配，在不同实验室之间可能因为试剂、配置步骤等原因而造成结果差异。以上因素阻碍了低温解离以及单细胞测序技术应用的广泛开展。针对以上技术问题，本发明在大量的深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于单细胞测序的低温解离试剂盒，包括酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2三种主要成份。
所述酶解液包含以下成份：保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5～10mg/mL的低温蛋白酶、40-50％(v/v)甘油、DPBS；优选地，为保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5mg/mL的低温蛋白酶、40％甘油、DPBS。
其中，所述低温蛋白酶具体是指购买自Creative Enzymes公司，编号为NATE0633的低温蛋白酶。所述低温蛋白酶包含纯化自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白混合成份，主要成份为枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)，是一种丝氨酸内切蛋白酶；所述低温蛋白酶的具体信息详见试剂公司的网站：https://www.creative-enzymes.com/product/native-bacillus-licheniformis-protease_936.html。
所述低温是指4～6℃。
在一个优选地实施方案中，所述酶解液各成份分别为：购买自Creative Enzymes，编号为NATE0633的低温蛋白酶；购买自Sigma-Aldrich，编号为G5516的甘油；购买自Sigma-Aldrich,编号为D8537-500ML的DPBS。
所述酶解缓冲液1包含以下成份：保存浓度为20mM，工作浓度为5～10mM的CaCl2、DPBS；优选地，为保存浓度为20mM，工作浓度为10mM的CaCl2、DPBS。
在一个优选地实施方案中，所述酶解缓冲液1各成份分别为：购买自Sigma-Aldrich，编号为21115-100ML的CaCl2；购买自Sigma-Aldrich，编号为D8537-500ML的DPBS。
所述酶解缓冲液2包含以下成份：保存浓度为500U/mL，工作浓度为100～200U/mL的DNase I、DPBS；优选地，为保存浓度为500U/mL，工作浓度为100U/mL的DNase I、DPBS。
在一个优选地实施方案中，所述酶解缓冲液2各成份分别为：购买自Applichem，编号为A3778的DNase I；购买自Sigma-Aldrich，编号为D8537-500ML的DPBS。
本发明还提供了所述低温解离试剂盒在单细胞测序中的应用。
本发明还提供了一种利用所述低温解离试剂盒对单细胞进行测序的方法，包括如下具体步骤：
(1)准备试剂：将冷藏后的所述酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
(2)制备样本：将待解离的组织置于培养皿中，然后置于冰上并使用DMEM培养基进行漂洗、剪碎，得组织块并转移到离心管中。
(3)低温解离：向含有组织块的离心管中加入酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，和酶解液，移液器吹打混匀。
(4)摇动混匀：将离心管置于摇床中进行摇动解离。
(5)镜检：每间隔一段时间，吸取解离的单细胞悬液进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。根据镜检结果，决定是否停止解离。
(6)终止酶解：向装有消化液的离心管加入预冷的培养基，混匀，终止酶解。
(7)过筛：使用的细胞筛网进行过滤，离心弃上清。
(8)裂红及洗涤：往细胞沉淀中加入红细胞裂解液混匀，冰上静置，离心后弃上清，使用培养基重悬细胞沉淀，再离心，弃上清。
(9)细胞计数及形态观察：用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
步骤(1)中，所述冷藏的温度为-20℃。
步骤(1)中，所述冰上预冷是指将离心管插于碎冰之中。
步骤(1)中，所述酶解液的体积为200μL装于1.5mL离心管中。
步骤(1)中，所述酶解液包含以下成份：保存浓度为100mg/mL的低温蛋白酶、40％-50％甘油、DPBS；优选地，为保存浓度为100mg/mL的低温蛋白酶、40％甘油、DPBS。
在一个优选地实施方案中，所述酶解液各成份分别为：购买自Creative Enzymes，编号为NATE0633的低温蛋白酶；购买自Sigma-Aldrich，编号为G5516的甘油；购买自Sigma-Aldrich，编号为D8537-500ML的DPBS。
步骤(1)中，所述酶解缓冲液1的体积为1mL，装于1.5mL离心管中。
步骤(1)中，所述酶解缓冲液1包含以下成份：保存浓度为20mM的CaCl2；DPBS。
在一个优选地实施方案中，所述酶解缓冲液1各成份分别为：购买自Sigma-Aldrich，编号为21115-100ML的CaCl2；购买自Sigma-Aldrich，编号为D8537-500ML的DPBS。
步骤(1)中，所述酶解缓冲液2体积为0.8mL，装于1.5mL离心管中。
步骤(1)中，所述酶解缓冲液2包含以下成份：保存浓度为500U/ml的DNase I；DPBS。
在一个优选地实施方案中，所述酶解缓冲液2各成份分别为：购买自Applichem，编号为A3778的DNase I；购买自Sigma-Aldrich，编号为D8537-500ML的DPBS。
步骤(1)中，所述离心管为Eppendorf Protein
Tubes低吸附离心管，货号0030108442。
步骤(2)中，所述离心管为15mL离心管。
步骤(2)中，进行DMEM培养基冲洗的目的是将样本上的血液充分洗涤。
步骤(2)中，所述DMEM培养基冲洗的次数为1-3次；优选地，为3次。
步骤(2)中，加入的DMEM培养基用量为5～10mL；优选地，为10mL。
步骤(2)中，所述DMEM培养基来源为ATCC，货号30-2002。
步骤(2)中，所述冰是指制冰机产生的碎冰，装于适当大小的泡沫盒中，离心管插于碎冰内。
步骤(2)中，所述DMEM培养基为事先预冷的，其温度为0～5℃；优选地，为冰上预冷。
步骤(2)中，所述组织包括肺脏组织、扁桃体组织、肝脏组织、肺癌组织、脾脏组织、四头肌肉组织、肠腹膜组织、宫颈肿瘤组织、卵巢组织、肾组织等。
步骤(2)中，所述组织块的厚度不超过5mm；优选地，为2～3mm。
步骤(3)中，所述混合后的酶解液中，蛋白酶的工作浓度(终浓度)为5～10mg/mL；优选地，为5mg/mL。
步骤(3)中，所述混合后的酶解液中，CaCl2工作浓度(终浓度)为5～10mM；优选地，为10mM。
步骤(3)中，所述混合后的酶解液中，DNase I的工作浓度(终浓度)为100～200U/mL；优选地，为100U/mL。
步骤(3)中，所述混匀操作在冰上进行。
步骤(3)中，根据组织大小情况再加入2mL DPBS进行酶解消化。
步骤(4)中，所述摇动操作目的是使组织块与酶解液尽量接触，增强酶解效率。
步骤(4)中，所述解离的条件为6℃、20rpm。
步骤(5)中，所述间隔时间为10～60分钟；优选地，为15分钟。
步骤(5)中，所述镜检使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL解离液混匀，进行镜检。
步骤(5)中，所述根据镜检结果，决定是否停止解离，是指细胞总量达到10万～100万，或者经过两次镜检细胞总量无明显增加时，即可终止酶解。
步骤(6)中，加入的DMEM培养基用量为5mL。
步骤(6)中，所述DMEM培养基来源为ATCC，货号30-2002。
步骤(7)中，所述过筛目的去除杂质和未消化完全组织；所述优选过40μm筛网。
步骤(7)中，所述离心的条件为500～1000×g、4℃、10min；优选地，为500×g、4℃、10min。
步骤(8)中，所述红细胞裂解液来源为上海生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B541001-0100。
步骤(8)中，所述加入的红细胞裂解液的体积为5～8mL；优选地，为5mL。
步骤(8)中，所述离心条件为300～500×g、5min；优选地，为300×g、5min。
步骤(8)中，所述加入DMEM培养基来源同步骤(2)。
步骤(9)所述镜检使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL解离液混匀，进行镜检。
本发明还提供了所述方法在单细胞测序中的应用。
本发明还提供了一种适用于单细胞测序的酶解液，所述酶解液由以下组分组成：保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5～10mg/mL的低温蛋白酶、40-50％(v/v)甘油、DPBS；优选地，为保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5mg/mL的低温蛋白酶、40％甘油、DPBS，或保存浓度为100mg/mL，工作浓度为10mg/mL的低温蛋白酶、50％甘油、DPBS。
本发明还提供了所述的酶解液在单细胞测序中的应用。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果包括：填补了目前的技术空白：目前缺少适用于单细胞测序实验的低温解离试剂盒，严重阻碍了低温解离技术在单细胞测序中的应用。本发明提供的技术方案解决了这一问题，将有力的促进低温解离的开展和广泛应用，进一步提升单细胞测序数据质量。操作简便、标准，有力提升数据质量。本发明提供的试剂盒成分可以直接使用，操作人员不需要再进行解离液的配置。提升了效率的同时，使操作步骤实现“标准化”，更有利于避免因为人为配置带来的操作误差，提升数据质量。
附图说明
图1是大鼠肺脏组织解离镜检结果。
图2是人扁桃体组织解离镜检结果。
图3是小鼠肝脏组织解离镜检结果。
图4是人肺癌组织解离镜检结果。
图5是小鼠脾脏组织解离镜检结果。
图6是人股四头肌肉组织解离镜检结果。
图7是人肠腹膜组织解离镜检结果。
图8是小鼠宫颈肿瘤组织解离镜检结果。
图9是小鼠卵巢组织解离镜检结果。
图10是小鼠肾组织解离镜检结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下面是本发明所述低温解离试剂盒具体成分表。
表1低温解离试剂盒具体成分
注：低温蛋白酶为购买自Creative Enzymes公司，编号为NATE0633的低温蛋白酶。
实施例1
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在大鼠肺脏组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析：
结果显示：通过本发明所述的低温解离试剂盒解离大鼠肺脏组织以制备单细胞悬液，经解离结束后，细胞以台盼蓝染色，活细胞比例、碎片杂质比例、细胞结团比例，均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表2)。
实施例2
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在人扁桃体组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析：
结果显示：活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10xGenomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1没有区别(表2)。
实施例3
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠肝脏组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肝脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析
结果显示：活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10xGenomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1、2没有区别(表2)。
实施例4
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在人肺癌组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人肺癌组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～3没有区别(表2)。
实施例5
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠脾脏组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠脾脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
各项指标均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～5没有区别(表2)。
实施例6
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在人股四头肌组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人股四头肌组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40um的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
各项指标均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～5没有区别(表2)。
实施例7
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在人肠腹膜组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人肠腹膜组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
各项指标均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～6没有区别(表2)。
实施例8
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠宫颈肿瘤组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠宫颈肿瘤组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
各项指标均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～7没有区别(表2)。
实施例9
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠卵巢组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为5mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为100U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠卵巢组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～8没有区别(表2)。
实施例10
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠肾组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为10mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为200U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～9没有区别(表2)。
实施例11
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在大鼠肺脏组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为10mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为200U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析：
结果显示：通过本发明所述的低温解离试剂盒解离大鼠肺脏组织以制备单细胞悬液，经解离结束后，细胞以台盼蓝染色，活细胞比例、碎片杂质比例、细胞结团比例，均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表2)。
实施例12
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在人扁桃体组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为10mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为200U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析：
结果显示：活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10xGenomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1没有区别(表2)。
实施例13
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠肝脏组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为10mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为200U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肝脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析
结果显示：活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10xGenomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1、2没有区别(表2)。
实施例14
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在人肺癌组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为10mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为200U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人肺癌组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～3没有区别(表2)。
实施例15
本实施例描述本发明所述试剂盒(-20℃，保存6个月)在小鼠脾脏组织单细胞测序中的应用。本发明所述试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为10mM，酶解缓冲液2中DNaseⅠ的工作浓度为200U/mL。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠脾脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。将培养皿置于冰上，使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
各项指标均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～5没有区别(表2)。
对比实施例1
将试剂盒中酶解液的低温蛋白酶替换为胶原酶Ⅰ(货号为Collagenase Type I,Gibco；17100017)且现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
与实施例10结果相比，活细胞比例没有明显区别，但细胞总量较少，碎片比例较高，开展10x Genomics公司单细胞测序实验存在较高失败风险(表2)。
对比实施例2
将试剂盒中酶解液中低温蛋白酶换为胶原酶Ⅱ(货号为Collagenase TypeⅡ,Gibco；17101015)且现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
结果显示开展10x Genomics公司单细胞测实验具有较高的失败风险(表2)。
对比实施例3
将试剂盒中酶解液中低温蛋白酶换为胶原酶Ⅳ(货号为Collagenase TypeⅣ,Gibco；17104019)，且现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
结果显示开展10x Genomics公司单细胞测序实验具有较高的失败风险(表2)。
对比实施例4
将试剂盒中酶解液的低温蛋白酶成分换为胰蛋白酶(货号为Trypsin,Sigma；T4799-5G)，且现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
结果显示开展10x Genomics公司单细胞测实验具有较高的风险(表2)。
对比实施例5
将试剂盒中酶解缓冲液1主要成分液中CaCl2改为MgCl2，(货号为Sigma Aldrich；63069)，并现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
与实施例10相比，结果显示制备得到单细胞悬液活细胞比例偏低、碎片比例较高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求(表2)。
对比实施例6
将试剂盒中酶解缓冲液2主要成分液中DNase I省去，并现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
结果显示细胞结团比例较高，无法开展10x Genomics公司单细胞测序实验(表2)。
对比实施例7
将试剂盒中酶解缓冲液2主要成分液中CaCl2的工作浓度改为1mM，并现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、碎片比例和细胞浓度无法达到10x Genomics公司单细胞测序的实验要求(表2)。
对比实施例8
将试剂盒中酶解缓冲液2主要成分液中CaCl2的工作浓度改为15mM，并现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、碎片比例和细胞浓度均无法满足10x Genomics公司单细胞测序实验要求(表2)。
对比实施例9
将试剂盒酶中解缓冲液2主要成分液中DNase I的工作浓度改为30U/mL，并现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
结果显示制备得到的单细胞悬液的细胞结团比例较高无法开展单细胞测序实验(表2)。
对比实施例10
将试剂盒中酶解缓冲液2主要成分液中DNase I的工作浓度改为300U/mL，并现用现配外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的小鼠肾组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40um的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均达到10x Genomics公司单细胞测序要求，其效果与实施例1～15没有区别(表2)。
对比实施例11
除试剂盒中各成分均是现用现配及酶解液中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL外，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，将试剂盒中各组分配置齐全，放置冰上备用。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均达到10x Genomics公司单细胞测序要求，其效果与实施例1～15没有区别(表2)。
对比实施例12
试剂盒中酶解液不加任何的保存介质，酶解液中低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，-20℃保存1周。试剂盒中各组分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本之前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，其效果与实施例1没有区别(表2)。
对比实施例13
除低温蛋白酶的工作浓度为10mg/mL，并将试剂盒组装完毕后放置-20℃保存1个月外，试剂盒成分见表2，操作步骤与本发明实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本之前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度虽然满足能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，与实施例11相比活细胞比例偏低、碎片比例及结团比例较高，开展单细胞测序具有较高的失败风险(表2)。
对比实施例14
除试剂盒酶解液中保存介质变换为50％PEG(货号为Sigma Aldrich；528877)外，试剂盒成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本之前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析
结果显示活细胞比例、细胞碎片比例无法达到单细胞测序实验的要求。
对比实施例15
除试剂盒中酶解液保存介质变换为1mMDTT(货号为Sigma Aldrich；10197777001)，试剂盒成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本之前，自-20℃冰箱中取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2放置冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析
活细胞比例、碎片比例无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表2)。
对比实施例16
除酶解液中保存介质变换为10％(v/v)甘油，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与实施例1、实施例2完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液1、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
活细胞比例、碎片杂质比例、细胞结团比例和细胞浓度基本能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，但相比本发明实施例2和12(表2)，开展单细胞测序实验有较高失败风险。
对比实施例17
除酶解液中保存介质变换为25％(v/v)甘油，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液1、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管中加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
各项指标可以用于后续开展单细胞测序实验，但相比实施例2，碎片比例偏高，具有较高的失败风险。
对比实施例18
除酶解液中保存介质变换为50％(v/v)甘油，试剂盒其余组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的人扁桃体组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液1、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管中加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，其效果与实施例1～9没有区别(表2)。
对比实施例19
除试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度变换为20mg/mL，试剂盒中成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析：
活细胞比例、碎片杂质比例无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例20
除试剂盒中低温蛋白酶的工作浓度变换为2mg/mL，试剂盒中成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)制备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。
使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入融化后的酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果及分析
碎片杂质比例较高，开展10x Genomics公司单细胞测序实验具有较高的失败风险。
对比实施例21
试剂盒除将保存条件变换为常温保存1个月，试剂盒中各成分见表2，操作步骤与实施例1～10完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，分别取出试剂盒中酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上。
2)准备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、碎片杂质比例、细胞浓度无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例22
试剂盒除将保存条件变换为4℃保存3个月，试剂盒中各成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上。
2)准备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，终止酶解。以滤除碎片杂质和未消化完全的组织。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g，离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
结果显示各项指标均无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例23
除试剂盒是在-20℃冰箱中保存3个月外，试剂盒中各成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500rpm离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、碎片杂质比例、细胞结团比例和细胞浓度均达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。
对比实施例24
除试剂盒是在-80℃冰箱中保存6个月外，试剂盒中各成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂
开始准备样本前，自-80℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样本
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500rpm离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、碎片杂质比例、细胞结团比例和细胞浓度均达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。
对比实施例25
除试剂盒是在-20℃冰箱中保存12个月外，试剂盒中各成分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500rpm离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
与本发明实施例11相比，活细胞比例较低、碎片比例偏高，进行单细胞测序实验具有较高的失败风险。
对比实施例26
除了将本发明的试剂盒保存管变换为上海生工品牌的离心管(货号为F602620-0001)且未经BSA润洗外，试剂盒中各组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
结果显示活细胞比例、碎片杂质比例无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表2)。
对比实施例27
除了将本发明的试剂盒保存管变换为Axygen品牌的离心管(MCT-150-C)且未经BSA润洗外，试剂盒中各组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样品。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
相比较本发明实施例1，碎片比例偏高，无法达到单细胞测序实验要求。
对比实施例28
除了将本发明的试剂盒保存管变换为上海生工品牌的离心管(货号为F602620-0001)且经BSA润洗(BSA：MACS,130091376)外，试剂盒中各组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样本。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
相比较本发明实施例11，碎片比例稍高，可以进行单细胞测序实验，但具有一定的失败风险。
对比实施例29
除了将本发明的试剂盒保存管变换为Axygen品牌的离心管(MCT-150-C)且经BSA润洗(BSA：MACS,130091376)试剂盒中各组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
1)准备试剂。
开始准备样前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样品。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
相比较本发明实施例11，碎片比例稍高，可以进行单细胞测序实验，但具有一定的失败风险。
对比实施例30
除了将本发明的试剂盒保存管变换为Eppendorf Protein
Tubes低吸Eppendorf Protein
Tubes品牌的离心管(货号为0030108442)且经BSA润洗(BSA：MACS,130091376)外，试剂盒中各组分见表2，操作步骤与实施例1～15完全一致。
准备试剂。
1)准备试剂。
开始准备样本前，自-20℃冰箱中分别取出酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，置于冰上待其融化。
2)准备样品。
将新鲜取材的大鼠肺脏组织置于培养皿中，培养皿中含有事先冰上预冷的DMEM培养基。使用冰上预冷后的DMEM培养基对组织进行漂洗，吸出漂洗后的培养基，再加入新的预冷培养基，如此反复3次，至看不到明显的血液残留。使用手术剪将组织小心地剪为厚度不超过5mm的小组织块。将剪碎得到的组织块小心的转移到15mL离心管中。
3)低温解离。
向含有组织块的离心管中加入酶解液、酶解缓冲液1和酶解缓冲液2，移液器吹打混匀后，将离心管于6℃冰箱中静置。
4)摇动混匀。
将离心管置于6℃摇床中，以20rpm摇动解离，便于酶与组织充分接触。
5)镜检。
酶解过程中，每隔15分钟，吸取9μL解离的单细胞悬液，使用1μL 0.4％的台盼蓝溶液染色后进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例。
6)终止酶解。
向装有消化液的离心管加入5mL预冷的培养基，混匀，终止酶解。
7)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，500×g、4℃离心10min弃上清。
8)裂红及洗涤。
往细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液混匀，冰上静置10min，500×g离心5min后弃上清，使用5mL培养基重悬细胞沉淀，再300×g离心5min，弃上清。
9)细胞计数及形态观察。
用培养基重悬细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
结果分析：
活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x Genomics公司单细胞测要求，其效果与实施例1～15没有区别(表2)。
根据本发明表2提供的关于本发明实施例1～15实验结果，说明针对常规动物组织解离，本发明所述的低温解离试剂盒中酶解液中低温蛋白酶的工作浓度可为5～10mg/mL、酶解缓冲液1主要成分CaCl2的工作浓度为5～10mM，酶解缓冲液2中主要成分DNase I工作浓度为100～200U/mL。本发明所述的低温解离试剂盒能够有效分离出单细胞，且制备得到的单细胞悬液满足10x Genomics公司单细胞测序实验要求。
为了进一步证实本发明所述的低温解离试剂盒适用于单细胞测序。本发明进行了一系列对比实验，先通过对比实施例1～10，比较验证低温解离试剂盒成分，结果如表2所示。其次通过对比实施例11～30验证低温解离试剂盒的酶解液中低温蛋白酶的浓度、低温蛋白酶的保存介质、试剂盒保存条件进行对比验证，结果如表2中对比实施例11～30所示。
对比实施例1～4中，通过对酶解液中酶类型进行验证，与实施例10操作步骤一致，均是在低温环境(6℃)中，酶解30min后，终止酶解得到单细胞悬液。对比实施例1是采用胶原酶Ⅰ，与实施例10结果相比，活细胞比例没有明显区别，但细胞总量较少，碎片比例较高，开展10x Genomics公司单细胞测序实验存在较高失败风险。对比实施例2是采用胶原酶Ⅱ，结果显示与实施例10结果相比，开展10x Genomics公司单细胞测序实验存在较高失败风险。对比实施例3采用的是胶原酶Ⅳ，结果显示开展10x Genomics公司单细胞测序实验存在较高失败风险。对比实施例4使用的是胰蛋白酶，结果显示制备得到单细胞悬液碎片比例与实施例10相比较高，开展10x Genomics公司单细胞测序实验存在较高失败风险。胶原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ及胰蛋白酶属于37℃活性酶，起作用的温度通常在37℃左右，因此，解离组织通常在37℃的条件下进行，酶解的效果较好。但在37℃进行解离时，细胞中的转录仍然很活跃，这会引起偏差，从而导致最终数据的失真，6℃进行解离时，细胞中的转录活性相对较低。因此，低温解离能够避免人为造成的“解离偏好”，低温环境中使用胶原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ或胰蛋白酶在解离动物组织，则需要延长时间，无法在短时间内高效的制备单细胞悬液。因此，本发明所述的试剂盒中酶解液是选取具有低温活性的Creative Enzyme蛋白酶。
对比实施例5是对酶解缓冲液1主要成分进行验证。对比实施例5将酶解缓冲液的主要成分CaCl2改为MgCl2，结果与本发明实施例10相比较，制备得到的单细胞悬液活细胞比例偏低、碎片比例高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。
对比实施例6是对酶解缓冲液2主要成分进行验证，将酶解缓冲液2主要成分DNaseI省去不添加，与本发明实施例10相比，结果显示细胞结团比例较高，制备得到的单细胞悬液无法进行10x Genomics公司单细胞测序实验。由于DNase1能够消除破碎的细胞的DNA导致的细胞粘连，降低细胞结团比例，因此本发明所述试剂盒中酶解缓冲液2主要成分是DNase I。
以上对比实施例说明低温解离试剂盒由creative Enzyme低温蛋白酶、酶解缓冲液1(主要成分：CaCl2)、酶解缓冲液2(主要成分：DNase I)组成，可有效制备单细胞悬液。本发明所述的低温解离试剂盒中酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2之间是一一对应关系的，即，酶解液与酶解缓冲液1、酶解缓冲液2存在配伍关系。
对比实施例7、8比较了酶解缓冲液1中主要成分CaCl2浓度对最终解离效果影响。对比实施例7、对比实施例8结果显示制备得到的单细胞悬液碎片比例较高，无法达到单细胞测序实验的要求。说明本发明试剂盒中酶解缓冲液1的主要成分CaCl2的工作浓度为5～10mM。
对比实施例9、10比较了酶解缓冲液2中主要成分DNase I浓度对最终解离效果影响。与本发明实施例10相比，对比实施例9结果显示细胞结团比例较高，无法开展10xGenomics公司单细胞测序实验。对比实施例10单细胞悬液各项指标与本发明实施例10没有明显差异，均能达到10x Genomics公司单细胞测序实验。为了进一步节约成本，本发明所述试剂盒中酶解缓冲液2的主要成分DNase I工作浓度可以在100～200U/mL。
对比实施例11～13中试剂盒不加任何保存介质，对比实施例11是文献中报道的方法，即“现有技术”，对比实施例11、12结果显示制备得到的单细胞悬液各项指标均达到10xGenomics公司单细胞测序实验要求，对比实施例13是保存1个月，结果显示制备得到的单细胞悬液各项指标无法达到单细胞测序实验的要求，说明通过对比实施例11～13配置方法组装的试剂盒，有效期短，仅能保存1周，因此酶解液中必须加入保护介质。
对比实施例14、15是对酶保护介质的比较和验证，通过在试剂盒的酶解液中加入50％PEG6000、1mMDTT，结果显示与本发明实施例12相比，活细胞比例偏低且碎片杂质比例较高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。对比实施例16～18是尝试在试剂盒中酶解液里加入不同浓度的甘油保护剂，对不同甘油浓度进行的比较，对比实施例16、17结果显示各项指标虽然可以进行单细胞测序实验，但存在较高的失败风险，推测是较低甘油浓度对酶活性保存效果较差，因此解离受到影响，造成细胞总量较少，并进一步升高了碎片杂质比例。对比实施例18结果显示与本发明实施例12无明显区别，能满足10x Genomics公司单细胞测序实验要求。说明低温解离试剂盒中的酶解液里加入40％～50％甘油，其解离效果一致。考虑节约成本，减少后续操作产生的影响，因此，本发明所述的试剂盒可优先采取加入40％甘油保护剂。
对比实施例19、20比较了不同的酶浓度对最终解离效果的影响。对比实施例19、20结果显示碎片比例较高，无法达到单细胞实验测序要求。因此说明试剂盒中酶解液中低温蛋白酶工作浓度可以为5～10mg/mL。
对比实施例21～25是不同保存温度及保存时间对酶活性的影响的比较。对比实施例21、22分别为常温保存及4℃保存，结果显示细胞悬液的各项指标无法达到单细胞实验的测序要求。对比实施例23是-20℃保存3个月，对比实施例24是-80℃保存6个月，结果表明在-80℃保存6个月的试剂盒解离动物组织以制备得到的单细胞悬液的各项指标与实施例11、对比实施例23一致，均满足单细胞测序实验要求。对比实施例25结果与本发明实施例11、对比实施例23、24相比，活细胞比例偏低，碎片杂质比例较高，开展单细胞测序实验有非常高的失败风险。对比实施例21～25结果说明低温解离试剂盒可在-20℃保存6个月，并且可采取干冰运输。
为了排除长期保存过程中内包材管壁对酶的吸附，导致的活性降低，对比实施例26～30是比较了不同品牌离心管及对管子的预处理(采用1％BSA润洗离心管，“封闭”管壁能够结合蛋白质的位点，从而降低保存过程中离心管对蛋白酶的吸附，达到提高蛋白酶保存活性的效果)对酶活性的影响。对比实施例26、27显示各项指标无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。对比实施例28、29是对离心管进行预处理，结果显示可以达到单细胞测序实验的要求，但碎片比例稍高，具有一定风险。对比实施例30采用Protein
离心管进行预处理，与本发明实施例11结果没有明显区别，说明Eppendorf Protein
Tubes低吸附离心管，不需要进行预处理，为了节约时间及成本，同时排除残留BSA对后续操作的影响，可以直接用于低温解离试剂盒的配置。
综上所述，本发明所述的低温解离试剂盒中酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2之间是一一对应关系的，即，酶解液与酶解缓冲液1、酶解缓冲液2存在配伍关系。如，本发明实施例1～15提到的酶解液、酶解缓冲液1及酶解缓冲液2，当同时、依次序使用，才能有效的保证低温解离组织以制备得到单细胞悬液各项指标能够达到单细胞测序的相关要求。
本发明所述的低温解离试剂盒能够高效地从常规动物组织中解离得到单细胞悬液，且得到的单细胞悬液能够达到10x Genomics公司单细胞测序各项指标。本发明所述的低温解离试剂盒可有效用于动物组织解离，操作简单，重复性高并具有长期稳定性。
表2不同配置类型的低温解离试剂盒解离效果比较。
本发明的保护内容不局限以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (11)
1.一种适用于单细胞测序的低温解离试剂盒，其特征在于，所述低温解离试剂盒包括酶解液、酶解缓冲液1、酶解缓冲液2。
2.如权利要求1所述的低温解离试剂盒，其特征在于，所述酶解液包含以下成份：保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5～10mg/mL的低温蛋白酶、40-50％甘油、DPBS。
3.如权利要求1所述的低温解离试剂盒，其特征在于，所述酶解缓冲液1包含以下成份：保存浓度为20mM，工作浓度为5～10mM的CaCl2、DPBS；
和/或，所述酶解缓冲液2包含以下成份：保存浓度为500U/mL，工作浓度为100～200U/mL的DNase I、DPBS。
4.一种利用如权利要求1-3之任一项所述的低温解离试剂盒对单细胞进行测序的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)准备试剂：将冷藏后的所述酶解液、所述酶解缓冲液1、所述酶解缓冲液2，置于冰上待其融化；
(2)制备样本：将待解离的组织置于培养皿中，然后置于冰上并使用DMEM培养基进行漂洗、剪碎，得组织块并转移到离心管中；
(3)低温解离：向所述步骤(2)中含有组织块的离心管中加入所述步骤(1)融化后的所述酶解缓冲液1、酶解缓冲液2，和酶解液，移液器吹打混匀；
(4)摇动混匀：将所述步骤(3)混匀后的离心管置于摇床中进行摇动解离；
(5)镜检：每间隔一段时间，吸取所述步骤(4)解离后的单细胞悬液进行镜检，检测细胞数量及活细胞比例；根据镜检结果，决定是否停止解离；
(6)终止酶解：向装有消化液的离心管加入预冷的培养基，混匀，终止酶解；
(7)过筛：使用细胞筛网对所述步骤(6)酶解后混合物的进行过滤，离心弃上清；
(8)裂红及洗涤：往所述步骤(7)离心后的细胞沉淀中加入红细胞裂解液混匀，冰上静置，离心后弃上清，使用培养基重悬细胞沉淀，再离心，弃上清；
(9)细胞计数及形态观察：用培养基所述步骤(8)重悬后的细胞沉淀，吸取单细胞悬液进行检测细胞数量、活细胞比例、碎片杂质比例及细胞结团比例。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶解液包含以下成份：保存浓度为100mg/mL的低温蛋白酶、40％-50％甘油、DPBS；所述酶解缓冲液1包含以下成份：保存浓度为20mM的CaCl2、DPBS；所述酶解缓冲液2包含以下成份：保存浓度为500U/ml的DNaseI、DPBS。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述组织包括肺脏组织、扁桃体组织、肝脏组织、肺癌组织、脾脏组织、四头肌肉组织、肠腹膜组织、宫颈肿瘤组织、卵巢组织、肾组织。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述混合后的酶解液中，所述低温蛋白酶的工作浓度为5～10mg/mL；所述混合后酶解缓冲液1中CaCl2的工作浓度为5～10mM；所述混合后酶解缓冲液2中DNase I的工作浓度为100～200U/mL。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述解离的条件为6℃、20rpm；
和/或，步骤(5)中，所述间隔时间为10～60分钟；
和/或，步骤(5)中，所述镜检使用0.4％台盼蓝进行；
和/或，步骤(7)中，所述离心的条件为500～1000×g、4℃、10min；
和/或，步骤(8)中，所述离心条件为300～500×g、5min。
9.一种适用于单细胞测序的酶解液，其特征在于，所述酶解液由以下组分组成：保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5～10mg/mL的低温蛋白酶、40-50％甘油、DPBS。
10.如权利要求9所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液由以下组分组成：保存浓度为100mg/mL，工作浓度为5mg/mL的低温蛋白酶、40％甘油、DPBS；或保存浓度为100mg/mL，工作浓度为10mg/mL的低温蛋白酶、50％甘油、DPBS。
11.如权利要求1-3之任一项所述的低温解离试剂盒、或如权利要求4-8之任一项所述的方法、或如权利要求9或10所述的酶解液在单细胞测序中的应用。
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