CN115074310A - 基于同一肺脏组织样本同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的方法及应用 - Google Patents

基于同一肺脏组织样本同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次创新公开了一种在同一肺脏样本中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液制备、同时进行单细胞测序和单细胞核测序的方法。本发明还公开用于前述方法中的试剂盒。本发明所述技术方案提高了样本的使用效率，同时又能够挖掘更全面的生物学信息，解答更深层次的生物学问题，具有广泛应用前景。

Description

基于同一肺脏组织样本同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液 制备的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及适用于同时开展单细胞测序、单细胞核测序的同一份肺脏组织中制备细胞核、细胞悬液的方法。
背景技术
单细胞测序和单细胞核测序作为解析细胞网络的强有力的技术手段，能够绘制组织或器官的细胞图谱，明确细胞间的调控模式和状态变化，从而为洞悉生命机制提供细胞层次分辨率的系统见解。
单细胞测序是通过酶解法获得单细胞悬液进行的，酶解法即通过蛋白酶在适宜的条件下将细胞间连接介质分解，继而使组织中的细胞分离为单细胞悬液。但碍于样本类型异质性问题的存在，即不同组织中细胞的连接方式不同，且不同细胞之间的连接紧密程度不同，这种现象决定了酶解法后进行单细胞转录组测序的研究会因为实验方法的不够科学与完善而使组织中细胞类型的信息丢失。其中免疫细胞占比较高，同时一些不易解离的细胞类型难以获得。因此，单细胞测序过程中导致一些稀有细胞类型的丢失，如基质细胞。而在单细胞核测序过程中主要通过选用适宜的去污剂裂解组织释放获得细胞核，由于得到细胞核种类全面且细胞核数量多伴生的出现免疫细胞检出不理想的情况，难以检测到DC或NK等免疫细胞。因此，仅通过单细胞测序或者单细胞核测序难以获得完整细胞类型图谱。现今已有文献报道通过单细胞、单细胞核测序，进行全面系统的分析，构建完整的肝脏转录图谱，并已证明了单细胞、单细胞核测序能够达到相互补充的作用。然而在现有技术中是将组织一分为二分别进行单细胞、单细胞核测序，并非在同一份组织中进行，组织间存在较大的差异性，会对后续数据结果的真实性带来一定偏差。因此，为减少或避免这种偏差，急需开发在同一份组织同时制备单细胞、单细胞核以便同时开展单细胞、单细胞核测序。
肺脏是机体内重要的呼吸器官，单细胞(核)测序可以解析肺脏组织在特定生理、病理状态下的功能，并深入分析了分子机理机制，目前正要成为肺部疾病学研究中最强有力的技术手段。因此，使用单细胞测序技术获得足够免疫细胞；单细胞核测序技术获得难以酶解的稀有细胞类型，从而获得比较完整的肺脏组织细胞图谱，为解答更深层次生物学问题提供研究基础。现有技术中对于皮肤组织、脂肪、脑组织等实体组织都有报道单细胞悬液、细胞核悬液的制备方法，但其不适用于小鼠肺脏组织，在细胞悬液制备实验中，不同组织差异性较大，采用相同制备方法，其制备的细胞悬液碎片比例、细胞活性等差异很大，即使是同一组织，不同的酶浓度也会带来不一样结果。因此，需要根据组织特异性，选择合适酶解液、采用恰当浓度及操作方法才能快速制备高质量的单细胞悬液。而小鼠肺脏组织具有复杂的结构，包括实质和间质，并且有特殊结构的细胞外基质，因此，制备单细胞悬液，采用现有技术方法难以快速获得高质量的单细胞悬液。本发明多种酶组合方式能够快速高效制备得到单细胞悬液。与此同时在同一份小鼠肺脏组织中同时制备单细胞悬液、细胞核悬液，其过程繁杂，由于小鼠肺脏组织含有丰富的上皮细胞、肺泡细胞等，其代谢活跃，使用现有细胞核制备技术无法获得合格的细胞核悬液，即利用现有技术无法同时顺利开展单细胞、单细胞核测序实验。因此，亟需开发一种能在同一份小鼠肺脏组织同时快速高效制备单细胞、单细胞核悬液制备方法和技术流程。
发明内容
现有技术中，尚未报道在同一份小鼠肺脏组织中同时制备单细胞悬液及单细胞核悬液的技术。为了解决现有技术存在的空白，本发明所述技术方案是能够快速稳定的在同一小鼠肺脏组织中同时制备单细胞悬液、单细胞核悬液，同时为得到的高质量的单细胞悬液及单细胞核悬液，能够顺利进行单细胞测序及单细胞核测序实验。本发明采用多种酶组合法即胶原酶Ⅳ、胰酶及DNaseⅠ，以快速获得高质量单细胞悬液，同时后续制备细胞核悬液时，本发明为确保操作过程中细胞核完整性良好，提供酶解后的组织固定液及固定方法。因此，本发明所述技术方案提高了样本的使用效率，同时又能够挖掘更全面的生物学信息，解答更深层次的生物学问题。
本发明术语“同时进行”指的是可在同一份组织中获得单细胞与单细胞核悬液，不分先后顺序，同时获得即可。
本发明的目的是提供一种在同一肺脏组织中同时进行细胞、细胞核悬液的制备方法，包括如下具体步骤：
(一)样本准备：
取小鼠肺脏组织，清洗，剪碎，将剪碎的组织块转移至离心管中；
(二)酶解：
加入酶解液，恒温摇床；
(三)分离：
分离得到上清、沉降的组织沉淀；
(四)悬液制备：
单细胞悬液的制备：取前述上清进行过筛、加入红细胞裂解液混匀后静置，离心，加入预冷的HBSS(含1％BSA)重悬洗涤，得到单细胞悬液；
单细胞核悬液的制备：向前述沉降的组织沉淀中加入nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)，洗涤、第一次离心后弃上清；然后使用预冷固定液重悬细胞核沉淀，第二次离心后弃上清；接着加入cell lysis buffer(细胞核裂解液)，冰上孵育；随后加入nucleiwash buffer(细胞核洗涤缓冲液)，第三次离心弃上清；最后用含有0.4U/μL SUPERaseRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％BSA的PBS 重悬以得到最终的细胞核悬液。
在具体方案中，本发明方法包括如下步骤：
I：准备试剂
1.1配置酶解液。
1.2配置cell lysis buffer(细胞核裂解液)、nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)、固定液。
II制备步骤
2.1组织处理：新鲜取材的小鼠肺脏组织，置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷HBSS(含1％BSA)洗涤，弃掉洗涤液。使用无菌眼科剪刀剪碎组织，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的离心管中。
2.2酶解：加入步骤1.1配置的酶解液，上下颠倒混匀后，置37℃恒温摇床。
2.3过筛：加入预冷HBSS(含1％BSA)，反复吹打组织，静置待组织块完全沉降，并将组织沉淀转移至新的15mL的离心管中备用，用移液器吸取上清，滴加至40μm的筛网过滤，离心，弃上清。
按以下2.4制备单细胞悬液：
2.4优化及镜检：加入红细胞裂解液混匀后，静置，离心弃上清。加入预冷HBSS(含1％BSA)，离心弃上清，再加入1mL的预冷HBSS(含1％BSA)重悬洗涤，得到最终细胞悬液。镜检。
2.5上机测序：依照10x Genomics公司说明书进行单细胞测序操作。
本发明按以下步骤2.6-2.10制备单细胞核悬液
2.6洗涤组织沉淀：加入步骤1.2配置的nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)至所述步骤2.3保留的酶解后组织沉淀中洗涤，离心弃上清。
2.7固定：使用预冷的步骤1.2配置的固定液重悬细胞核沉淀，冰上孵育，离心弃上清。
2.8裂解：加入步骤1.2配置的cell lysis buffer(细胞核裂解液)，冰上孵育。
2.9过筛：使用细胞筛进行酶解液过滤，收集滤液至新的离心管，离心弃上清。
2.10纯化：加入步骤1.2配置的nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)，离心弃上清，得到细胞核沉淀。
2.11洗涤及镜检。加入步骤1.2配置的nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)，离心弃上清，最后用含有0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％BSA的PBS重悬以得到最终的细胞核悬液，镜检。
2.12上机测序
依照10x Genomics公司说明书进行单细胞核测序操作。
步骤1.1，所述配置酶解液主要成分及终浓度为:0.2％～0.3％胰蛋白酶、 30～40U/mL胶原酶Ⅳ、0.05％～0.2％DNaseⅠ、HBSS；优选地，为0.25％胰蛋白酶、35U/mL胶原酶Ⅳ、0.1％DNaseⅠ、HBSS。
步骤1.1，所述试剂分别购自胰蛋白酶编号为Solarbio，T8150；DNaseⅠ编号：Solarbio，D8071、胶原酶Ⅳ编号为Solarbio，C8160、HBSS编号为Gibco,14175095。
步骤1.2，所述细胞核裂解液cell lysis buffer成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、0.3％～0.5％NP40+0.3％～0.5％Tritonx-100 (v/v)、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1mM DTT、1％ ProteaseInhibitor Cocktail(蛋白酶抑制剂)。
步骤1.2，所述细胞核裂解液cell lysis buffer主要成分为 0.3％～0.5％NP40+0.3％～0.5％Tritonx-100；优选地，为0.3％NP40+0.3％Tritonx-100。
步骤1.2，所述细胞核洗涤缓冲液nuclei wash buffer：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、 0.1mM EDTA、10mM NaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1mMDTT、1％BSA、1％Protease Inhibitor Cocktail(蛋白酶抑制剂)。
步骤1.2，所述的固定液主要成分及终浓度为：0.1％～0.3％甲醛+0.05％～0.1％乙醇、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、PBS；优选地，浓度为0.1％甲醛+0.05％乙醇。
步骤1.2，所述试剂成分购自：Tris-HCl(pH＝7.4)(Sigma,T4661)、EDTA (ThermoFisher Scientific；AM9260G)、NaCl(Sigma；T4661)、NP40(Thermo Scientific；85124)、TritonX-100(Thermo Scientific；85111)、SUPERase RNase Inhibitor(Thermo FisherScientific；AM2696)、Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich；P8340)、DTT(Solarbio；D1070-5ml)、BSA(MACS；130091376)、甲醛溶液(Thermo Fisher Scientific；28906)、乙醇溶液(sigma；E7023-500ML)。
步骤2.1，所述的小鼠肺脏组织大小为150～200mg；优选地，为200mg。
步骤2.1，所述的使用预冷HBSS(含1％BSA)洗涤目的是为去除残留的血液，减少红细胞占比。
步骤2.1，所述洗涤次数为1～3；优选地，为3次。
步骤2.1，所述剪碎组织似“糊状”即可停止，其目的是促进细胞释放。
步骤2.1，所述离心管是指15mL的离心管，编号为Corning；430790。
步骤2.2，所述的酶解液体积为4～6mL；优选地，为5mL。
步骤2.2，所述摇床的时间为10～15min；优选地，为10min。
步骤2.3，所述的加入预冷HBSS(含1％BSA)体系为3～7mL；优选地，为5mL。
步骤2.3，所述的组织沉淀转移至新的15mL离心管的目的是用于单细胞核的制备。
步骤2.3，所述的离心条件为500～800×g、4～6℃、离心7～10min；优选地，为500×g、4℃、10min。
步骤2.4，所述的红细胞裂解液编号为上海生工生物工程股份有限公司；B541001-0100。
步骤2.4，所述加入的红细胞裂解液的体积为5～10mL；优选地，为8mL。
步骤2.4，所述的静置的时间为3～7min；优选地，为5min。
步骤2.4，所述离心条件为500-800×g、4～6℃、离心7～10min；优选地，为 600×g、4℃、8min。
步骤2.4，所述的加入预冷HBSS(含1％BSA)的体积为5～10mL；优选地，为7mL。
步骤2.4，所述洗涤条件为100～300×g、4～6℃、5～10min；优选地，为300×g、 4℃、10min。
步骤2.4，所述镜检使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，进行镜检。
步骤2.6，所述洗涤的次数为1～3次；优选地，为2次。
步骤2.6，所述洗涤目的主要是为了去除残留胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶、DNaseⅠ，避免对细胞核造成损伤。
步骤2.6，所述nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)的体积为5～10mL；优选地，为7mL。
步骤2.6，所述离心条件为500～1000×g、4～6℃、5～10min；优选地，为800×g、 4℃、10min。
步骤2.7，所述加入固定液的体积为2～4mL；优选地，为4mL。
步骤2.7，所述冰上固定孵育的条件为0～4℃、孵育5～10min；优选地，为0℃置于冰上孵育5min。
步骤2.7，所述离心的条件为：800～1000×g、4～6℃、5～10min；优选地，为 1000×g、4℃、10min。
步骤2.8，所述加入cell lysis buffer(细胞核裂解液)的体积为1～3mL；优选地，为2mL。
步骤2.8，所述冰上孵育是指0～4℃；优选地，为0℃，置于冰上孵育；孵育时间为5～7min，优选地，为5min。
步骤2.9，所述细胞筛为40μm的筛网，购自BD falcon，货号352340。
步骤2.9，所述离心的条件是指500～1000×g、4～6℃、离心时间为7～10min；优选地，为800×g、4℃、10min。
步骤2.10，所述加入nuclei washbuffer(细胞核洗涤缓冲液)的体积为5～7mL；优选地，为5mL。
步骤2.10，所述离心条件为300～500×g、4～6℃、5～10min；优选地，500×g、 4℃、5min。
步骤2.11，所述加入nuclei wash buffer(细胞核洗涤缓冲液)的体积为5～7mL；优选地，为5mL。
步骤2.11，所述离心条件为100～300×g、4～6℃、5～10min；优选地，为300×g、 4℃、5min。
步骤2.11，所述镜检使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
本发明还提供了上述方法同时制备得到的适用于同时开展小鼠肺脏单细胞测序及单细胞核测序的细胞及细胞核悬液。
其中，所述细胞悬液的细胞总量为300万-400万、细胞碎片比例为4％-5％、细胞结团比例2％-3％、活细胞比例为97％-98％；所述细胞核悬液细胞核总量为 200万-300万、细胞核碎片比例为5％-6％、细胞核结团比例为3％-5％。
本发明还提供了所述细胞悬液及细胞核悬液在小鼠肺脏组织单细胞及单细胞核测序中的应用。
本发明还提供可用于在同一份小鼠肺脏组织中适用于同时开展单细胞测序和单细胞核测序的单细胞及单细胞核悬液制备的试剂/试剂盒，其包括但不限于细胞酶解液、组织固定液、cell lysis buffer、nuclei wash buffer。本发明还提出了所述试剂/试剂盒的应用，其可用于高效、快速、稳定且同时获得总量多、碎片及结团比例均较低的单细胞悬液及单细胞核悬液，可应用于在同一小鼠肺脏组织同时进行单细胞测序和单细胞核测序。
其中，所述细胞酶解液主要成分及终浓度为:0.2％～0.3％胰蛋白酶、 30～40U/mL胶原酶Ⅳ、0.05％～0.2％DNaseⅠ、HBSS；优选地，为0.25％胰蛋白酶、35U/mL胶原酶Ⅳ、0.1％DNaseⅠ、HBSS。
其中，所述组织固定液主要成分及终浓度为:0.1％～0.3％甲醛+0.05％～0.1％乙醇、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、PBS；优选地，浓度为0.2％甲醛+0.05％乙醇。
其中，所述cell lysis buffer主要成分及终浓度为:10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、0.3％～0.5％NP40+0.3％～0.5％Tritonx-100(v/v)、 0.4U/μLSUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％Protease Inhibitor Cocktail。
其中，所述nuclei washbuffer主要成分及终浓度为：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、 1％BSA、1％Protease Inhibitor Cocktail。
本发明遇到技术难点主要包括以下三方面：
(1)基于同一组织制备细胞及细胞核悬液，为避免蛋白酶对细胞核造成过度损伤以及制备完整合格的细胞核悬液，需要通过大量验证实验摸索，提高细胞及细胞核的制备效率，达到能够同时开展单细胞测序、单细胞核测序。
(2)针对小鼠肺脏组织特殊结构的细胞外基质，难以短时间内快速高效制备单细胞悬液。
(3)针对小鼠肺脏组织内含丰富的上皮细胞、肺泡细胞等，因这些细胞类型代谢活跃，肺组织经单一酶的酶解后经受不了去污剂的直接处理，会对细胞核完整性造成破坏，无法获得完整细胞核。
本发明在同一小鼠肺脏组织中同时进行细胞、细胞核悬液的制备过程中，小鼠肺脏组织具有复杂的结构，包括实质和间质，并且有特殊结构的细胞外基质，难以短时间内快速高效制备单细胞悬液；因此，本发明为不影响后续细胞核的制备，本发明采用组合酶解液方式在短时间内10～15min内制备碎片比例、结团比例少，细胞活率及总量高的单细胞悬液。与此同时，因小鼠肺脏组织含有丰富的上皮细胞、肺泡细胞等，其代谢活跃，导致肺组织经酶解后经受不了去污剂的直接处理，会对细胞核完整性造成破坏，本发明在细胞核制备前采用本发明提供的固定液及技术方案解决了这一问题。综上，本发明通过这些独特巧妙的设计，提供一种同时在同一肺脏组织中进行细胞、细胞核悬液的制备方法。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果：(1)填补了目前的技术空白：目前并未有在同一份小鼠肺脏组织中同时制备细胞悬液和细胞核悬液的技术，主要原因在于在小鼠肺脏组织中含有特殊结构的细胞外基质及包含上皮细胞、肺泡细胞等多种细胞类型代谢活跃，若在同一份小鼠肺脏组织中同时制备细胞悬液和细胞核悬液，因操作过程繁杂，难以同时获得满足10x Genomics单细胞实验要求的细胞及细胞核悬液。本发明提供的技术方案解决了这一问题。(2)同一份小鼠肺脏中同时制备得到的细胞总量为300万-400万、细胞碎片比例为4％-5％、细胞结团比例2％-3％、活细胞比例为97％-98％及细胞核总量为200万-300万、细胞核碎片比例为5％-6％、细胞核结团比例为3％-5％。能够顺利同时完成单细胞测序及单细胞核测序实验。因此，本发明所述技术方案能够同时制备获得单细胞及单细胞核悬液，并进一步提升了制备到的单细胞及单细胞核悬液的各项质量指标，其中包括降低了碎片杂质和结团比例、提高了细胞及细胞核总量。(3)本发明提供的技术方案可以在同一份样本中获得更多有意义的数据，更深入解析的生物学问题与内在的生物学机制。
附图说明
图1是小鼠肺脏细胞悬液镜检结果的示意图。
图2是小鼠肺脏细胞核悬液镜检结果的示意图。
图3是小鼠肺脏细胞核RNA质检结果的示意图。
图4是小鼠肺脏单细胞测序的细胞类型鉴定结果的示意图。
图5是小鼠肺脏单细胞核测序的细胞类型鉴定结果的示意图。
图6是本发明基于同一小鼠肺脏组织样本同时进行单细胞悬液和细胞核悬液制备以及单细胞测序和单细胞核测序流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
表1是本发明方法中用于同一小鼠肺脏组织组织样本同时进行单细胞悬液和细胞核悬液制备以及单细胞测序和单细胞核测序试剂盒。
Figure BDA0003712168360000091
实施例1
本实施例描述本发明所述的同一组织中同时制备单细胞悬液和单细胞核悬液。
1制备单细胞悬液
1.1准备试剂：配置酶解液。具体包括:0.2％胰酶、30U/mL胶原酶Ⅳ、 0.05％DNaseⅠ、HBSS。
1.2组织处理：新鲜取材的200mg的小鼠肺脏组织，置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷HBSS(含1％BSA)洗涤，弃掉洗涤液。使用无菌眼科剪刀剪碎组织，似“糊状”即可停止，将培养皿中剪碎的组织块转移至新的15mL的离心管中。
1.3酶解：加入5mL酶解液，上下颠倒混匀后，置37℃恒温摇床10min。
1.4过筛：加入5mL预冷HBSS(含1％BSA)，用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。盛有滤液的离心管进行500×g、4℃离心 10min弃上清，得到初步的细胞沉淀。
1.5优化及镜检：加入5mL的红细胞裂解液混匀后，静置5min后，500×g、 4℃离心10min弃上清。加入5mL预冷HBSS(含1％BSA)，100×g、4℃、10min，弃上清。再加入1mL的预冷HBSS(含1％BSA)重悬以得到最终细胞悬液。镜检。
1.6上机测序：依照10x Genomics公司说明书进行单细胞测序操作。
2单细胞核悬液制备
2.1准备试剂：配置cell lysis buffer、nuclei wash buffer、固定液
具体包括：
cell lysis buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.3％NP40+0.3Tritonx-100(v/v)、1mM DTT、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor；1％Protease Inhibitor Cocktail；
nuclei wash buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％BSA、1％Protease InhibitorCocktail；
固定液主要成分：0.1％甲醛+0.05％乙醇、PBS、0.4U/μL SUPERase RNaseInhibitor、1％BSA。
2.2洗涤组织沉淀：加入7mL的nuclei wash buffer至所述步骤1.4保留的酶解后组织沉淀中，800×g、4℃离心7min弃上清，洗涤3次。
2.3固定：使用4mL预冷固定液重悬细胞核沉淀，冰上固定5min，离心弃上清。
2.4裂解：加入2mL的cell lysis buffer，冰上孵育5min
2.5过筛：使用40μm细胞筛进行酶解液过滤，收集滤液至新的离心管，离心弃上清,初步得到细胞核沉淀。
2.6纯化：加入nuclei wash buffer，离心弃上清，得到细胞核沉淀。
2.7镜检：加入含有0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1％BSA的预冷PBS 重悬细胞核沉淀得到最终的细胞核悬液。最后使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行染色镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
2.8上机测序
依照10x Genomics公司说明书进行单细胞核测序操作。
结果显示：通过本发明所述的技术方法分离同一小鼠肺脏组织同时制备单细胞和单细胞核悬液，经分离结束后，细胞、细胞核均以台盼蓝染色，细胞、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表2)。
实施例2
本实施例描述本发明所述的同一小鼠肺脏组织中同时制备单细胞悬液和单细胞核悬液。
1制备单细胞悬液
1.1准备试剂：配置酶解液。具体包括:0.3％胰酶、40U/mL胶原酶Ⅳ、0.2％ DNaseⅠ、HBSS；
1.2组织处理：新鲜取材的200mg的小鼠肺脏组织，置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷HBSS(含1％BSA)洗涤，弃掉洗涤液。使用无菌眼科剪刀剪碎组织，似“糊状”即可停止，将培养皿中剪碎的组织块转移至新的15mL的离心管中。
1.3酶解：加入5mL酶解液，上下颠倒混匀后，置37℃恒温摇床15min。
1.4过筛：加入5mL预冷HBSS(含1％BSA)，用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。盛有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min弃上清，得到初步的细胞沉淀。
1.5优化及镜检：加入5mL的红细胞裂解液混匀后，静置5min后，500×g、 4℃离心10min弃上清。加入5mL预冷HBSS(含1％BSA)，100×g、4℃、10min，弃上清。再加入1mL的预冷HBSS(含1％BSA)重悬以得到最终细胞悬液。镜检。
1.6上机测序：依照10x Genomics公司说明书进行单细胞测序操作。
2单细胞核悬液制备
2.1准备试剂：配置cell lysis buffer、nuclei wash buffer、固定液
具体包括：
cell lysis buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.5％NP40+0.5％Tritonx-100(v/v)、1mM DTT、0.4U/μL SUPERase RNaseInhibitor；1％Protease Inhibitor Cocktail；
nuclei wash buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％BSA、1％Protease InhibitorCocktail；
固定液主要成分：0.3％甲醛+0.1％乙醇、PBS、0.4U/μL SUPERase RNaseInhibitor、1％BSA。
2.2洗涤组织沉淀：加入7mL的nuclei wash buffer至所述步骤1.4保留的酶解后组织沉淀中，800×g、4℃离心7min弃上清，洗涤3次。
2.3固定：使用4mL预冷固定液重悬细胞核沉淀，冰上孵育10min，
2.4裂解：加入2mL的cell lysis buffer，冰上孵育5min
2.5过筛：使用40μm细胞筛进行酶解液过滤，收集滤液至新的离心管，离心弃上清,初步得到细胞核沉淀。
2.6纯化：加入nuclei wash buffer，离心弃上清，得到细胞核沉淀。
2.7镜检：加入含有0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1％BSA的预冷PBS 重悬细胞核沉淀得到最终的细胞核悬液。最后使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
2.8上机测序
依照10x Genomics公司说明书进行单细胞核测序操作。
结果显示：通过本发明所述的技术方法分离同一小鼠肺脏组织同时制备单细胞和单细胞核悬液，经分离结束后，细胞、细胞核使用台盼蓝染色镜检，细胞浓度与细胞核浓度、细胞与细胞核碎片杂质比例、细胞核结团比例，均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表2)。
对比实施例1
制备单细胞悬液使用胶原酶Ⅰ(Solarbio；C8140-1g)进行酶解10min，其终浓度为0.1％。
1单细胞悬液制备
1.1准备试剂：HBSS(加入0.1％BSA)、1％胶原酶Ⅰ(V/V)。
1.2样品准备：新鲜取材的200mg的小鼠肺脏组织，置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷HBSS(含1％BSA)洗涤，弃掉洗涤液。
1.3机械破碎：使用无菌眼科剪刀剪碎组织，似“糊状”即可停止，将培养皿中剪碎的组织块转移至新的离心管中。
1.4酶解：加入0.1％胶原酶Ⅰ(V/V)的酶解液5mL，上下颠倒混匀后，置37℃恒温摇床10min。
1.5结束酶解：加入5mL预冷HBSS(含1％BSA)，使用移液器吹打组织，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。盛有滤液的离心管进行500×g、4℃离心 10min弃上清。
1.6去除红细胞：加入10mL的红细胞裂解液混匀后，静置5min。
1.7洗涤：加入7mL预冷含0.1％BSA培养基，300g、4℃、10min，弃上清。加入1mL的预冷HBSS(含1％BSA)重悬以得到最终细胞悬液。镜检。
1.8镜检：使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取 1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，进行镜检。
2单细胞核悬液制备
利用10x genomic现有技术方法制备。
2.1准备试剂：配置cell lysis buffer、nuclei wash buffer
cell lysis buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.1％～0.2％NP40、1mM DTT、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor；1％ ProteaseInhibitor Cocktail。
nuclei wash buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1％BSA、1mM DTT、1％Protease InhibitorCocktail。
2.2组织沉淀洗涤：加入7mL的nuclei wash buffer洗涤2次，800×g、4℃离心7min弃上清。
2.3裂解：加入2mL的cell lysis buffer，冰上孵育5min。
2.4过筛：采用40μm细胞筛过滤至新的离心管，800×g、4℃离心10min 弃上清。
2.5洗涤：加入5mL的nuclei washbuffer，500×g、4℃离心5min弃上清，加入含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀以得到细胞核悬液。
2.6镜检。使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取 1μL台盼蓝溶液与9μL解离液混匀，进行镜检。
结果：见表3。
对比实施例2
1单细胞悬液制备
采用50U/mL木瓜蛋白酶进行单细胞悬液制备，其余操作步骤同对比实施例 1一致。
2单细胞核悬液制备
利用10x genomic现有技术方法制备，同对比实施例1一致。
结果：见表3
对比实施例3
1单细胞悬液制备
采用0.2％胰酶进行单细胞悬液制备，其余操作步骤同对比实施例1一致。
2单细胞核悬液制备
利用10x genomic现有技术方法制备，同对比实施例1一致。
结果：见表3。
对比实施例4
1单细胞悬液制备
加入终浓度为0.3％透明质酸酶，其余操作步骤与对比实施例1完全一致。
2单细胞核悬液制备
利用10x genomic现有技术方法制备，同对比实施例1一致。
结果：见表3。
对比实施例5
1单细胞悬液制备
加入终浓度30U/mL胶原酶Ⅳ(Solarbio；9001-12-1)，其余操作步骤与对比实施例1一致。
2单细胞核悬液制备
利用10x genomic现有技术方法制备，同对比实施例1一致。
结果：见表3。
对比实施例6
1单细胞悬液制备
除酶解的时间变为30min外，操作步骤同对比实施例5一致。
2制备单细胞核悬液
利用10x genomic现有技术方法制备，同对比实施例1
结果：见表3。
对比实施例7
1单细胞悬液制备
除胶原酶Ⅳ浓度变为100U/mL外，操作步骤同对比实施例5一致。
2单细胞核悬液制备
利用10x genomic现有技术方法制备，同对比实施例1一致。
对比实施例8
加入30U/mL胶原酶Ⅳ、0.1％透明质酸酶，单细胞悬液制备操作步骤与对比实施例1一致。
结果：见表3。
对比实施例9
加入0.1％透明质酸酶、0.2％胰蛋白酶，其余操作步骤与对比实施例1一致。
结果：见表3。
对比实施例10
加入30U/mL胶原酶Ⅳ、0.2％胰蛋白酶，其余操作步骤与对比实施例2～5、 8～9一致。
结果：见表3。
对比实施例11
在酶解液中额外加入3％BSA。其余操作步骤与对比实施例10一致。
结果显示：见表3。
对比实施例12
除3％BSA变为加入3％FBS外。其余操作步骤与对比实施例11一致。
结果显示：见表3。
对比实施例13
采用终浓度30U/mL胶原酶Ⅳ、0.3％胰酶，0.05％DNaseⅡ进行单细胞悬液的制备。其余操作步骤与对比实施例11～12一致。
结果：见表3。
对比实施例14
采用组合酶解液30U/mL胶原酶Ⅳ+0.2％胰酶+0.05％DNaseⅠ进行单细胞悬液的制备。其余操作步骤与对比实施例11～13一致。
对比实施例15
将组合酶解液中主要成分浓度变换为10U/mL胶原酶Ⅳ+0.1％胰酶+0.02％DNaseⅠ，其余操作步骤与对比实施例14一致。
结果显示：见表3。
对比实施例16
将组合酶解液中主要成分浓度变换为80U/mL胶原酶Ⅳ+0.5％胰酶+0.5％ DNaseⅠ，其余操作步骤与对比实施例14一致。
结果显示：见表3。
对比实施例17
1单细胞悬液制备
将组合酶解液中主要成分浓度变换为40U/mL胶原酶Ⅳ+0.3％胰酶+0.2％ DNaseⅠ，其余操作步骤与对比实施例14一致。
2制备单细胞核悬液
同对比实施例6操作一致。
结果：见表3。
对比实施例18
除酶解的时间缩短至10min。其余操作步骤与对比实施例14一致。
结果显示：见表3。
对比实施例19
除酶解的时间缩短至5min。其余操作步骤与对比实施例14一致。
结果显示：见表3。
对比实施例20
1单细胞悬液制备
除酶解的时间延长至15min，其余操作步骤与对比实施例14一致。
2细胞核悬液制备
操作步骤同对比实施例6。
结果显示：见表3。
对比实施例21
1单细胞悬液制备
除酶解的时间延长至30min，其余操作步骤与对比实施例14一致。
2细胞核悬液制备
操作步骤同对比实施例6。
结果显示：见表3。
对比实施例22
对酶解后的组织沉淀未经洗涤，直接进行单细胞核制备。具体制备单细胞、单细胞核制备操作步骤如下：
1单细胞悬液制备
操作步骤同实施例1一致。
2单细胞核悬液制备
同对比实施例6
结果显示：见表4。
对比实施例23
对酶解后的组织沉淀洗涤3次，具体制备单细胞、单细胞核的操作步骤如下：
1制备单细胞悬液
操作步骤同本发明实施例1一致。
2制备单细胞核悬液
2.1准备试剂：配置cell lysis buffer、nuclei wash buffer
cell lysis buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.1％～0.2％(V/V)NP40、1mM DTT、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor； 1％Protease Inhibitor Cocktail。
nuclei wash buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1％BSA、1mM DTT、1％Protease InhibitorCocktail。
2.2组织沉淀洗涤：加入7mL的nuclei wash buffer洗涤3次，800×g、4℃离心7min弃上清。
2.3裂解：加入2mL的cell lysis buffer，冰上孵育5min。
2.4过筛：采用40μm细胞筛进行过滤至新的离心管，800×g、4℃离心10min 弃上清。
2.5洗涤：加入5mL的nuclei washbuffer，500×g、4℃离心5min弃上清，加入含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀以得到细胞核悬液。
2.6镜检：使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取 1μL台盼蓝溶液与9μL解离液混匀，进行镜检。
2.7抽提质检：抽取细胞核内RNA质检。
结果分析：见表4
对比实施例24
1制备单细胞悬液
操作步骤同本发明实施例1一致。
2制备单细胞核悬液
除对酶解后组织沉淀洗涤1次外，其余操作步骤与对比实施例23一致。
结果显示：见表4。
对比实施例25
1制备单细胞悬液
操作步骤同本发明实施例1一致。
2制备单细胞核悬液
除对酶解后组织沉淀洗涤5次外，其余操作步骤与对比实施例23一致。
结果显示：见表4。
对比实施例26
1制备单细胞悬液
操作步骤同本发明实施例1一致。
2制备单细胞核悬液
2.1准备试剂：配置cell lysis buffer、nuclei wash buffer、固定液。具体包括：
cell lysis buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.1％(V/V)NP40、1mM DTT、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor；1％ ProteaseInhibitor Cocktail；
nuclei wash buffer主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％BSA、1％Protease InhibitorCocktail；
固定液主要成分：100％甲醇、PBS、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、 1％BSA。
2.2洗涤组织沉淀：加入7mL的nuclei wash buffer至所述步骤1.4保留的酶解后组织沉淀中，800×g、4℃离心7min弃上清，洗涤3次。
2.3固定：使用4mL预冷固定液重悬细胞核沉淀，冰上孵育5min，
2.4裂解：加入2mL的cell lysis buffer，冰上孵育5min
2.5过筛：使用40μm细胞筛进行酶解液过滤，收集滤液至新的离心管，离心弃上清,初步得到细胞核沉淀。
2.6纯化：加入nuclei wash buffer，离心弃上清，得到细胞核沉淀。
2.7镜检：加入含有0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1％BSA的预冷PBS 重悬细胞核沉淀得到最终的细胞核悬液。最后使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientific,T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
2.8：核RNA抽提质检。
结果：见表4。
对比实施例27
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除固定液主要成分100％甲醇变换为0.1％戊二醛，其余步骤同对比实施例26。
结果显示：见表4。
对比实施例28
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2一致。
2细胞核制备
除将固定液主要成分变换为0.1％甲醛，操作步骤与对比实施例26一致。
结果显示：见表4。
对比实施例29
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2一致。
2细胞核制备
除将固定液主要成分变换为0.1％甲醛+0.05％乙醇，操作步骤与对比实施例 28一致。
结果显示：见表4。
对比实施例30
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2一致。
2细胞核制备
将固定液甲醛浓度终更换为0.05％，操作步骤与对比实施例29一致。
结果显示：见表4。
对比实施例31
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2一致。
2细胞核制备
将固定液甲醛浓度终更换为0.3％，操作步骤与对比实施例29一致。
结果及分析：见表4。
对比实施例32
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2一致。
2细胞核制备
将固定液甲醛终浓度更换为0.5％，操作步骤与对比实施例29一致。
结果及分析：见表4。
对比实施例33
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2细胞核悬液制备
将固定液乙醇终浓度更换为0.01％，操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例34
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2细胞核悬液制备
将固定液乙醇终浓度更换为0.1％，操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例35
1单细胞悬液制备
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2细胞核悬液制备
将固定液主要成分中乙醇终浓度更换为0.2％，操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例36
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除固定时间变为3min外，其余操作步骤同对比实施例29一致。
对比实施例37
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除固定时间变为10min外，其余操作步骤同对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例38
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除固定时间变为15min外，其余操作步骤同对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例39
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.1％～0.2％NP40变换为0.3％IGEPAL CA-630外，其余操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例40
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.1％～0.2％NP40变换为0.3％Tritonx-100外，其余操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例41
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.1％～0.2％NP40变换为0.3％IGEPALCA-630+0.3％Tritonx-100外，其余操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例42
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.1％～0.2％NP40变换为0.3％IGEPALCA-630+0.3％NP40外，其余操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例43
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.1％～0.2％NP40变换为0.3％NP40+0.3％Tritonx-100外，其余操作步骤与对比实施例29一致。
结果：见表4。
对比实施例44
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.3％NP40+0.3％Tritonx-100变换为0.1％NP40+0.1％Tritonx-100外，其余操作步骤与对比实施例43一致。
结果：见表4。
对比实施例45
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.3％NP40+0.3％Tritonx-100变换为0.5％NP40+0.5％Tritonx-100外，其余操作步骤与对比实施例43一致。
结果：见表4。
对比实施例46
1制备单细胞悬液
操作步骤与本发明实施例1、2完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将0.3％NP40+0.3％Tritonx-100变换为1％NP40+1％Tritonx-100外，其余操作步骤与对比实施例43一致。
结果：见表4。
对比实施例47
将实验材料小鼠肺脏变换为小鼠心脏组织，具体操作步骤与本发明实施例1 完全一致。
结果：见表5
对比实施例48
将实验材料小鼠肺脏变换为小鼠脑组织，具体操作步骤与本发明实施例1 完全一致。
结果：见表5
对比实施例49
将实验材料小鼠肺脏变换为小鼠肾脏，具体操作步骤与本发明实施例1完全一致。
结果：见表5
进一步地，根据本发明表2提供的关于本发明实施例1和2的实验结果，说明本发明所提供的技术方案能够在小鼠肺脏组织中同时制备单细胞悬液与单细胞核悬液，且得到的单细胞悬液及单细胞核悬液均能够满足10x Genomics单细胞测序实验各项质量指标的要求(见图1～图5)
表2本发明所述技术方法制备同一份小鼠肺脏同时制备单细胞、单细胞核结果
Figure BDA0003712168360000241
Figure BDA0003712168360000251
为了开发适用于同一小鼠肺脏组织单细胞、单细胞核测序实验，即同一组织中同时制备细胞悬液及细胞核悬液技术方法，本发明进行了一系列对比实验，如表3、表4所示。由于动物细胞悬液的制备主要是通过酶解法获得；细胞核悬液是通过非离子去污剂，因去污剂会破坏磷脂双分子层，溶解胞质和细胞膜，对细胞损伤较大，可能会导致后续单细胞悬液制备时收集不到足量的完整的细胞。因此，根据酶解液、离子去污剂的理化性质，要想在同一组织同时制备单细胞、细胞核悬液，需要优先制备单细胞悬液。故依照整个流程的操作顺序，先验证同一组织的细胞悬液制备方法，如对比实施例1～21所述；接下来通过对比实施例 22～46对细胞核制备方法进行了验证。
依据操作流程，首先需要对小鼠肺脏单细胞悬液制备方法进行比较验证实验。对比实施例1～5进行比较验证加入0.1％胶原酶Ⅰ、50U/mL木瓜蛋白酶、0.2％胰酶、0.3％透明质酸酶、30U/mL胶原酶Ⅳ，对比实施例1～3的结果显示细胞总量不足40万。但对比实施例5中采用30U/mL胶原酶Ⅳ制备得到的细胞数量略高于对比实施例1～4所用的酶，细胞总量达到50万。因此，接下来基于对比实施例4中胶原酶Ⅳ制备细胞数量较多，对比实施例6、7尝试通过延长胶原酶Ⅳ的酶解时间或提高胶原酶Ⅳ的浓度，以提高细胞数量、细胞悬液质量，结果显示虽然细胞数量提高至80-90万，并将剩余组织制备细胞核，结果显示细胞核数量极少，说明经长时间酶解过程或高浓度蛋白酶对核膜具有损伤性，影响下游实验的顺利进行，无法完成在同一份组织中同时制备细胞、细胞核悬液。因此，要想在同一份组织中同时制备细胞、细胞核，需要快速高效制备细胞悬液，而对比实施例1～7实验结果已说明对于小鼠肺脏组织采用单一蛋白酶不仅无法得到高效的酶解效果，后续使用现有技术10x Genomics细胞核制备方法制备得到的细胞核，镜检结果显示细胞核完整性被破坏，推测肺脏组织内含丰富的上皮细胞、肺泡细胞等，因这些细胞类型代谢活跃，肺组织酶解后经受不了去污剂的直接处理，所以在后续制备细胞核前对组织尝试进行固定处理，达到维持细胞核完整性的目的。
在对比实施例1～7验证基础上，同时依据整个技术流程，需要先对细胞制备方法进行验证，尝试通过混合酶解验证是否能提高细胞总量及细胞悬液质量同时缩短细胞悬液的制备时间，由于胶原酶1、胶原酶Ⅳ是属于胶原酶不同亚型，因胶原酶1仅包含一种蛋白酶成分，而胶原酶Ⅳ包含多种蛋白酶成分，可以用于消化多种组织。因此，对比实施例8～10采用胶原酶Ⅳ、透明质酸酶与胰酶两两组合，结果显示对比实施例10采用的胶原酶Ⅳ与胰酶进行组合酶解，结果显示细胞总量较其他两种组合较多且细胞活性提升至95％以上，说明胶原酶Ⅳ与胰酶组合不仅能够破除小鼠肺脏特殊基质的组织连接，促进细胞脱落以此提高细胞数量，同时通过混合酶解破碎死细胞达到提高单细胞悬液质量的目的。说明对于有特殊胞外基质的小鼠肺脏组织，胶原酶Ⅳ与胰酶的组合酶方式更适用。但经胶原酶Ⅳ与胰酶的组合酶处理仍无法改善细胞结团问题。因此，为进一步提高细胞悬液质量，对比实施例11～14比较验证降低细胞结团比例的方法，对比实施例11、12 尝试加入3％BSA、3％FBS以降低细胞结团比例，结果均没有达到预期效果，细胞结团现象仍未改善。推测可能是胰酶将死细胞酶解成小碎片，死细胞破碎后会造成胞内DNA释放到溶液中，细胞结团可能是由于破碎细胞DNA泄露而导致，造成细胞悬液中结团比例偏高。因此，为进一步降低细胞悬液的结团比例，采用 DNA消化酶以消除游离DNA造成的细胞聚集，DNA消化酶主要包括DNaseⅠ和DNaseⅡ两种类型，对比实施例13～14分别对DNaseⅡ、DNaseⅠ进行比较验证实验，结果显示DNaseⅡ、DNaseⅠ均能消除游离的DNA，但DNaseⅡ也会促进细胞凋亡，细胞活性降至68％，而DNaseⅠ在防止DNA导致的细胞团块的同时不会对细胞的活性产生影响，故在酶解液中加入DNaseⅠ的组合能够进一步提高细胞悬液质量。综上，本发明所述对于小鼠肺脏组织解离组合酶成分采用胶原酶Ⅳ、胰酶、DNaseⅠ。
其次，在确定组合酶成分基础上，接下来对组合酶的成分浓度进行一系列比较验证实验，对比实施例15～18，组合酶浓度分别为10U/mL胶原酶Ⅳ+0.1％胰酶+0.02％DNaseⅠ、80U/mL胶原酶Ⅳ+0.5％胰酶+0.5％DNaseⅠ、40U/mL胶原酶Ⅳ+0.3％胰酶+0.2％DNaseⅠ、30U/mL胶原酶Ⅳ+0.2％胰酶+0.05％DNase Ⅰ，结果显示对比实施例17、18酶解效率基本一致，细胞总量高、碎片杂质及结团比例均较低满足单细胞测序实验要求。同时，对比实施例17、18酶解效果优于对比实施例15～16，说明组合酶浓度分别为在30U/mL～40U/mL胶原酶Ⅳ+0.2％～0.3％胰酶+0.05％～0.2％DNaseⅠ能够达到理想的解离结果，组合酶浓度过低会导致组织无法得到充分酶解，细胞总量较低，无法满足单细胞测序实验；组合酶浓度过高浓度胶原酶Ⅳ对核膜造成损伤，无法制备得到足量的细胞核。因此，也就无法在同一份组织中同时开展单细胞及单细胞核测序实验。综上，说明对于小鼠肺脏组织，采用30～40U/mL胶原酶Ⅳ+0.2％～0.3％胰酶+0.05％～0.2％ DNaseⅠ组合酶的方式能够制备细胞数量较高，碎片比例、结团比例较低的优质单细胞悬液。
最后，在确定组合酶成分及浓度的基础上，对比实施例18～21比较验证酶解的时间10min、5min、15min、30min，实验结果显示10～15分钟效果最佳。酶解 5min，细胞数量低；酶解30min后，细胞悬液各项指标达到单细胞测序实验要求，但进行单细胞核制备结果显示细胞核数量极少、碎片比例较高不符合单细胞核测序实验要求。因此，本发明所述技术方法酶解的时间确定为10～15min。
综上，同一组织中制备单细胞悬液、单细胞核悬液技术方法中，先制备单细胞悬液，酶解后的组织用于制备单细胞核悬液。进一步明确单细胞悬液的制备技术，酶解液主要成分胶原酶Ⅳ(终浓度为30～40U/mL)、胰酶(终浓度：0.2％～0.3％)、 DNaseⅠ(终浓度：0.05％～0.2％)、酶解的时间为10～15min。
表3不同处理方式制备小鼠肺脏单细胞悬液
Figure BDA0003712168360000271
Figure BDA0003712168360000281
确定了单细胞悬液制备方案基础之上，接下来通过对比实施例22～46对单细胞核制备方案比较验证实验。对比实施例22～25对酶解后组织沉淀预处理比较验证实验，对比实施例22选择未经洗涤直接进行提取细胞核实验，结果显示完整的细胞核极少，碎片占比高，结果显示视野区中难以发现单个完整的细胞核，说明残留的胶原酶Ⅳ、胰酶、DNaseⅠ对核膜具有损伤。对比实施例22是对酶解后组织进行了洗涤，结果显示细胞核数量增多，碎片杂质比例较低。因此，本发明所述技术方法对酶解后组织沉淀进行洗涤以防止残留的胶原酶、胰酶、DNaseⅠ对核膜造成的损伤。对比实施例22～25比较验证了洗涤次数，结果显示洗涤次数少于3次，细胞核碎片仍较多，高达80％，单个细胞核较少，仅5万左右。洗涤次数为5次时，实验结果显示，细胞核数量与洗涤3次的结果没有明显区别，均能提高细胞核总量。本发明所述技术方法酶解后组织沉淀洗涤次数确定为3～5 次。
在确定组织沉淀预处理基础上，对细胞核悬液制备方法进行验证，如前对比实施例1～7所述采用现有技术10x Genomics细胞核制备方法制备得到细胞核，镜检结果显示细胞核完整性被破坏，推测肺脏组织内含丰富的上皮细胞、肺泡细胞等，因这些细胞类型代谢活跃，肺组织经单一酶的酶解后经受不了去污剂的直接处理，会对细胞核完整性造成破坏。同样的，对比实施例25采用10x细胞核制备方法制备细胞核，结果显示细胞核完整性被破坏，无法满足单细胞核测序实验要求。所以尝试通过固定方式来解决这一问题。接下来对固定液配方进行验证，对比实施例26～29分别采用100％甲醇、0.1％戊二醛、0.1％甲醛、0.1％甲醛+0.05％乙醇，结果显示甲醇对细胞核膜造成损伤，细胞核破碎，细胞核悬液变成乳白色液体，无法继续进行实验；采用戊二醛、0.1％甲醛固定，细胞核完整性仍受到破坏、碎片比例较高，无法满足单细胞测序实验要求。对比实施例29采用0.1％甲醛+0.05％乙醇固定方法，固定效果优于对比实施例26～28。因此，最终确定固定液主要成分为0.1％甲醛+0.05％乙醇。随后，对比实施例30～35是对固定液主要成分浓度进行比较验证实验，分别采用0.05％甲醛+0.05％乙醇、0.3％甲醛+0.05％乙醇、0.5％甲醛+0.05％乙醇，0.1％甲醛+0.01％乙醇、0.1％甲醛+0.1％乙醇，0.1％甲醛+0.2％乙醇，结果显示甲醛浓度低于0.1％或乙醇浓度低于0.05％，会造成细胞核完整性造成破坏；甲醛高于0.3％或乙醇高于0.1％，细胞核破碎，碎片比例较高。因此，本发明所述技术方法中固定液主要试剂成分选用0.1％～0.3％甲醛 +0.05％～0.1％乙醇。
在确定了固定液主要成分及浓度基础上，接下来对固定时间进行摸索确定，对比实施例36～38固定时间分别采用3min、10min、15min，结果显示低于5min 会使得固定液没有充分渗透细胞核，也就无法达到真正的固定效果；高于10min 细胞核完整性被破坏，碎片比例较高，无法满足单细胞测序实验要求，说明长时间的固定，固定液会对细胞核膜具有损伤性。因此，本发明最终确定固定时间为 5～10min。
采用现有技术即10x的技术方法制备细胞核，结果显示细胞核总量较低、碎片比例偏高，无法达到单细胞测序实验要求，推测可能由于优先经过酶解处理、组织沉淀经固定处理后的缘故。因此，对比实施例39～40需要对细胞核制备方法即裂解液主要成分及浓度，进行一系列摸索对比验证，将NP40分别变换为 0.3％IGEPALCA-630、0.3％Tritonx-100，结果显示，单一非离子型去污剂裂解纯化方法得到细胞核悬液，细胞核总量低、碎片比例较高，无法顺利开展单细胞测序实验。推测可能组织沉淀固定后，采用单一的去污剂难以将细胞核充分释放出来。接下来对比实施例41～43采用裂解去污剂混合方式即 0.3％IGEPALCA-630+0.3％Tritonx-100、0.3％IGEPALCA-630+0.3％NP40、 0.3％NP40+0.3％Tritonx-100进行验证，结果显示0.3％NP40+0.3％Tritonx-100混合裂解纯化方式优于对比实施例41～42，能够提高细胞核总量至200万，碎片比例降低至6％以下，满足单细胞测序实验要求。因此，最终确定cell lysis buffer 主要成分NP40、Tritonx-100混合裂解液。
在确定细胞核制备裂解cell lysis buffer主要成分基础上，对比实施例44～46进一步对混合裂解液的浓度范围比较验证实验，分别0.1％NP40+0.1％Tritonx-100、0.5％NP40+0.5％Tritonx-100、1％NP40+1％Tritonx-100，结果显示NP40或 Tritonx-100低于0.2％，细胞核总量较低、碎片比例较高；NP40或Tritonx-100 高于0.5％，细胞核碎片比例较高，高达40％以上，推测可能混合去污剂浓度过高对核膜造成损伤，细胞核裂解过度发生破碎。因此，最终确定cell lysis buffer 中主要成分混合去污剂浓度为0.3％～0.5％NP40+0.3～0.5％Tritonx-100。
综上，同一组织中制备单细胞悬液、单细胞核悬液技术方法中，在确定了单细胞悬液制备方法后，进一步明确单细胞核悬液的制备技术：包括酶解后组织沉淀的洗涤次数3～5次、酶解后组织沉淀固定液主要成分0.1％～0.3％甲醛 +0.05％～0.1％乙醇、固定时间5～10min、cell lysis buffer中主要成分为 0.3％～0.5％NP40+0.3～0.5％Tritonx-100。
表4针对酶解后小鼠肺脏组织沉淀的不同方式制备单细胞核悬液
Figure BDA0003712168360000311
Figure BDA0003712168360000321
Figure BDA0003712168360000331
Figure BDA0003712168360000341
确定了同一小鼠肺脏组织中同时制备单细胞、单细胞核的技术方案基础上，对比实施例47、48、49，选用小鼠心脏组织、小鼠脑组织及小鼠肾脏组织采用本发明所述技术方法进行同时制备单细胞、单细胞核，结果显示小鼠心脏、脑、肾脏制备得到的细胞、细胞核碎片杂质均较高，各项指标无法满足单细胞、单细胞核测序实验要求。
表5不同组织类型单细胞、单细胞核悬液的制备结果
Figure BDA0003712168360000342
综上所述，本发明所述同一组织同时制备单细胞与单细胞核技术方法，小鼠肺脏、制备单细胞技术方法(酶解主要成分：0.2％～0.3％胰蛋白酶、30～40U/mL 胶原酶Ⅳ、0.05％～0.2％DNaseⅠ、HBSS、酶解时间10～15min)；制备单细胞核方法(包括酶解后组织沉淀洗涤次数3～5次、固定液主要成分0.1％～0.3％甲醛等) 之间是一一对应关系的，如本发明实施例1、2所述，小鼠肺脏、制备单细胞技术方法(酶解液主要成分0.2％～0.3％胰蛋白酶、30～40U/mL胶原酶Ⅳ、0.05％～0.2％ DNaseⅠ、HBSS、酶解的时间10～15min)；制备单细胞核方法(包括酶解后组织沉淀洗涤次数3～5次、固定液主要成分0.1％～0.3％甲醛+0.05％～0.1％乙醇、cell lysis buffer中主要成分为0.3％～0.5％NP40+0.3～0.5％Tritonx-100等)同时依次序进行，能够有效地同时制备高质量的单细胞悬液及单细胞核悬液，且获得单细胞悬液及单细胞核悬液能够顺利进行单细胞(核)测序实验要求。

Claims (11)

1.在同一肺脏组织中同时进行细胞、细胞核悬液的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(一)样本准备：
取小鼠肺脏组织，清洗，剪碎，将剪碎的组织块转移至离心管中；
(二)酶解：
加入酶解液，恒温摇床；
(三)分离：
分离得到上清、沉降的组织沉淀；
(四)悬液制备：
单细胞悬液的制备：取前述上清进行过筛、加入红细胞裂解液混匀后静置，离心，加入预冷的含1％BSA的HBSS重悬洗涤，得到单细胞悬液；
单细胞核悬液的制备：向前述沉降的组织沉淀中加入nuclei wash buffer，洗涤、第一次离心后弃上清；然后使用预冷固定液重悬细胞核沉淀，第二次离心后弃上清；接着加入cell lysis buffer，冰上孵育；随后加入nuclei wash buffer，第三次离心弃上清；最后用含有0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1％BSA的PBS重悬以得到最终的细胞核悬液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(一)中，所述的小鼠肺脏组织大小为150～200mg；使用预冷的含1％BSA的HBSS进行清洗，其中，所述清洗的次数为1-3次；所述离心管是指15mL的离心管。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(二)中，所述酶解液成分及终浓度为:0.2％～0.3％胰蛋白酶、30～40U/mL胶原酶Ⅳ、0.05％～0.2％DNaseⅠ、HBSS；所述酶解液的体积为4～6mL；所述摇床的条件为：37℃恒温摇床10～15min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(三)中，所述分离的具体步骤为：加入预冷的含1％BSA的HBSS吹打组织，静置待组织块完全沉降，并将所述组织沉淀转移至新的15mL的离心管中备用；然后用移液器吸取上清，滴加至40μm的筛网过滤，离心。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的加入预冷的含1％BSA的HBSS的体积为3～7mL；所述的离心条件为500～800×g、4～6℃、离心7～10min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(四)中，所述单细胞悬液的制备中，所述加入的红细胞裂解液体积为5～10mL；所述的静置的时间为3～7min；所述离心条件为500-800×g、4～6℃、离心7～10min；所述的加入预冷HBSS(含1％BSA)的体积为5～10mL；所述洗涤条件为100～300×g、4～6℃、5～10min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(四)中，所述单细胞核悬液的制备中，所述nuclei wash buffer的成分及终浓度为：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mMNaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％BSA、1％Protease InhibitorCocktail；所述nuclei wash buffer的体积为5～10mL；所述第一次离心条件为500～1000×g、4～6℃、5～10min；所述的固定液主要成分及终浓度为:：0.1％～0.3％甲醛+0.05％～0.1％乙醇、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、PBS；所述加入固定液的体积为2～4mL；所述冰上固定孵育条件为0～4℃、孵育5～10min；所述第二次离心的条件为：800～1000×g、4～6℃、5～10min；所述cell lysis buffer的成分及终浓度为：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、0.3％～0.5％NP40+0.3％～0.5％Tritonx-100(v/v)、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％Protease Inhibitor Cocktail；所述冰上孵育是指0～4℃；所述第三次离心条件为300～500×g、4～6℃、5～10min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法得到的单细胞悬液为细胞悬液的细胞总量为300万-400万、细胞碎片比例为4％-5％、细胞结团比例2％-3％、活细胞比例为97％-98％；所述方法得到的单细胞核悬液为细胞核悬液细胞核总量为200万-300万、细胞核碎片比例为5％-6％、细胞核结团比例为3％-5％。
9.一种基于同一组织样本的同时进行单细胞测序和细胞核测序的方法，其特征在于，所述方法按如权利要求1所述方法制备得到单细胞悬液及单细胞核悬液，然后测序。
10.一种试剂盒，其特征在于，其包括细胞酶解液、组织固定液、cell lysis buffer、nuclei wash buffer；
其中，所述细胞酶解液成分及终浓度为:0.2％～0.3％胰蛋白酶、30～40U/mL胶原酶Ⅳ、0.05％～0.2％DNaseⅠ、HBSS；
所述组织固定液成分及终浓度为:0.1％～0.3％甲醛+0.05％～0.1％乙醇、0.4U/μLSUPERase RNase Inhibitor、PBS；
所述cell lysis buffer成分及终浓度为:10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、0.3％～0.5％NP40+0.3％～0.5％Tritonx-100(v/v)、0.4U/μL SUPERaseRNase Inhibitor、1mM DTT、1％Protease Inhibitor Cocktail；
所述nuclei wash buffer主要成分及终浓度为：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1mMEDTA、10mM NaCl、0.4U/μL SUPERase RNase Inhibitor、1mM DTT、1％BSA、1％ProteaseInhibitor Cocktail。
11.如权利要求10所述的试剂盒在同一肺脏组织样本中同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液的制备、同时进行单细胞测序及单细胞核测序中的应用。
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