CN113388599B - 用于分散生物组织的酶试剂盒和使用其获得单细胞悬液的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种用于分散生物组织的酶试剂盒和使用其获得单细胞悬液的方法。本申请中，所述酶试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括链霉蛋白酶，所述第二试剂中包括木瓜蛋白酶。本申请所述的用于分散生物组织的酶试剂盒成分简单，制备方便，可应用于多种组织的消化，使用该方法获得的单细胞悬液成活率高、成团率低，有利于后续进行分选和单细胞测序。

Description

用于分散生物组织的酶试剂盒和使用其获得单细胞悬液的 方法
技术领域
本发明实施例涉及细胞生物学领域，特别涉及用于分散生物组织的酶试剂盒和使用其获得单细胞悬液的方法。
背景技术
单细胞测序技术在单细胞水平观测基因的变化，更好地对组织进行细胞分类，寻找特定细胞类型中基因表达的变化，该技术被广泛应用于细胞生物学领域的研究。单细胞测序技术的关键，在于获得高质量的单细胞悬液。获得单细胞悬液过程十分复杂，这是由于不同的组织中，参与细胞粘合与细胞连接的成分不尽相同，即使是同一组织，使用不同的制备方法获得的单细胞在表面性质、激素反应状态以及物质能量代谢都可能相差很大。因此，开发合适的制备方法以获得高质量的单细胞悬液至关重要。
现有技术中，常使用酶消化法制备单细胞悬液。酶消化法主要使用链霉蛋白酶(Pronase)作为水解细胞间紧密连接的蛋白质，实现细胞游离，但该方法制备的单细胞悬液细胞碎片较多，细胞成团率高，且细胞活率相对较差，尤其是在脑组织细胞分离的时，由于神经细胞和大脑中其他类型细胞连接复杂，传统的链霉蛋白酶(Pronase)无法将在保证高成活率、低成团率的基础上将复杂的脑组织细胞分散，常常得到碎片很多的单细胞悬液，不利于后续进行分选和单细胞测序。鉴于此，开发一种用于分散生物组织的酶试剂盒和开发一种高质量分离组织细胞获得高成活率、低成团率的单细胞悬液的方法尤为重要。
发明内容
本发明实施方式的目的在于提供一种用于分散生物组织的酶试剂盒和使用其获得单细胞悬液的方法，使得使用该方法获得的单细胞悬液成活率高、成团率低，有利于后续进行分选和单细胞测序。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种用于分散生物组织的酶试剂，所述酶试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括链霉蛋白酶，所述第二试剂中包括木瓜蛋白酶。
在一些优选的方案中，所述生物组织优选为哺乳动物脑组织或哺乳动物耳蜗前庭组织。
基于进一步降低细胞间的粘结性、促进生物组织消化的有益效果出发，在一些优选的方案中，所述第一试剂还包括DNA酶和/或牛血清蛋白(BSA)；所述DNA酶优选为DNaseI。
基于进一步降低细胞间的粘结性、促进生物组织消化的有益效果出发，在一些优选的方案中，所述第二试剂还包括DNA酶和/或牛血清蛋白(BSA)；所述DNA酶优选为DNaseI。
在一些优选的方案中，所述第一试剂还包括HAG培养基。
在一些优选的方案中，所述第二试剂还包括HAG培养基。
在一些优选的方案中，所述第一试剂由HAG培养基、DNA酶、10％牛血清蛋白和链霉蛋白酶组成；所述第二试剂由HAG培养基、DNA酶、10％牛血清蛋白和木瓜蛋白酶组成。
在一些优选的方案中，每毫升所述第一试剂中，包括：
DNA酶 (0.5～1.4)V/V％(0.9)，
10％牛血清蛋白 (5.0～14.0)V/V％(9)，
链霉蛋白酶 (0.5～5.0)mg/mL。
在一些优选的方案中，所述第一试剂由HAG培养基、DNA酶、10％牛血清蛋白和链霉蛋白酶组成。
在一些优选的方案中，每毫升所述第二试剂中包括：
DNA酶 (0.5～1.4)V/V％，
10％牛血清蛋白 (5.0～14.0)V/V％，
木瓜蛋白酶 (0.5～5.0)mg/mL。
在一些优选的方案中，每毫升所述第一试剂中，包括：
DNA酶 (0.8～1.0)V/V％(0.9)，
10％牛血清蛋白 (8.0～10.0)V/V％(9)，
链霉蛋白酶 (1～3)mg/mL。
在一些优选的方案中，每毫升所述第二试剂中包括：
DNA酶 (0.8％～1.0)V/V％(0.9)％，
10％牛血清蛋白 (8.0％～10.0)V/V％(9)，
木瓜蛋白酶 (1～3)mg/mL。
具体地，在一些优选的方案中，所述酶试剂盒由下述方法制备：
第一试剂：每毫升HAG培养基中加入100ul的10％牛血清蛋白、10ul DNA酶以及1-3mg链霉蛋白酶；以及
第二试剂：每毫升HAG培养基中加入100ul的10％牛血清蛋白、10ul DNA酶以及1-3mg木瓜蛋白酶。
一种使用上述的酶试剂盒获得单细胞悬液的方法，所述方法包括步骤：
(1)将待分离的组织碎片分成两份，其中一份使用所述第一试剂进行消化，获得第一消化液，另一份使用所述第二试剂进行消化，获得第二消化液；
(2)取步骤(1)中所得第一消化液和第二消化液置于同一HAG培养基中混合，并进行分散，吸取上清液，即获得所述单细胞悬液。
基于进一步除去细胞悬液中的细胞碎片，获得更纯净的单细胞悬液的有益效果出发，在一些优选的方案中，所述步骤(2)后还包括步骤(3)：取步骤(2)所得的上清液使用细胞筛过滤处理，收集滤液。
基于进一步分离单细胞，获得更纯净的单细胞悬液的有益效果出发，在一些优选的方案中，所述步骤(3)后还包括步骤(4)：取所步骤(3)所得的滤液进行梯度离心，收集下层细胞，置于液体介质中混匀。
在一些优选的方案中，所述步骤(4)中还包括步骤(5)：取步骤(4)中于液体介质中混匀的细胞，使用细胞筛过滤处理，收集滤液，离心弃掉上清，将所得细胞在液体介质中混匀。
基于使所述组织碎片充分消化的有益效果出发，在一些优选的方案中，步骤(1)中，组织碎片和第一试剂的加入量优选为每毫升第一试剂中加入组织碎片0.03～0.1g；
基于使所述组织碎片充分消化的有益效果出发，在一些优选的方案中，步骤(1)中，组织碎片和第二试剂的加入量优选为每毫升第一试剂中加入组织碎片0.03～0.1g；
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述消化优选在恒温摇床上进行；
基于使所述组织碎片充分消化的有益效果出发，在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述消化的时间优选为15～30min；
在一些优选的方案中，步骤(2)中，所述第一消化液和第二消化液的总体积与HAG培养基的体积比优选为1:(0.7～2)，例如：1:1；
在一些优选的方案中，步骤(2)中，所述分散的方式优选为使用气枪吹散细胞；例如：使用1mL移液枪多次吹细胞，直至细胞分散；
在一些优选的方案中，步骤(3)中，优选依次使用70um和40um进行两次过滤处理；
在一些优选的方案中，步骤(4)中，所述梯度离心的转速优选为600～1000g，例如：800g；
在一些优选的方案中，步骤(4)中，所述梯度离心的时间优选为10～20min，例如：15min；
基于进一步去除细胞悬液中的细胞碎片，且充分保留单细胞悬液中所需单细胞的数量和活率的有益效果出发，在一些优选的方案中，步骤(5)中，优选依次使用70um、40um和10um的细胞筛进行三次过滤处理；本发明人经过详尽的实验研究发现，若仅依次使用70um和40um的细胞筛无法充分去除细胞悬液中的更为细小的细胞碎片，若细胞筛的孔径小于10um，细胞悬液中所需单细胞的数量大量减少。
在一些优选的方案中，步骤(5)中，所述离心的次数优选大于1次，更优选为2次。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明实施方式相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明所述的用于分散生物组织的酶试剂盒成分简单，制备方便，可应用于多种组织的消化，获得高成活率、低成团率的单细胞悬液；
(2)本发明所述的用于分散生物组织的酶试剂盒可应用于难以分散的脑组织单细胞悬液的制备中；
(3)本发明所述的获得单细胞悬液的方法，可获得成活率更高、成团率更低的单细胞悬液，有利于后续进行分选和单细胞测序；
(4)本发明所述的获得单细胞悬液的方法在应用于难以分散的脑组织单细胞悬液的制备时，所得碎片较少，神经细胞成活率极高，成团率极低。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例二所得细胞悬液镜检结果示意图；
图2是根据本发明实施例三所得细胞悬液镜检结果示意图；
图3是根据本发明实施例四所得细胞悬液镜检结果示意图；
图4是根据本发明对比例一所得细胞悬液镜检结果示意图；
图5是根据本发明对比例二所得细胞悬液镜检结果示意图；
图6是根据本发明对比例三所得细胞悬液镜检结果示意图；
图7是根据本发明对比例四所得细胞悬液镜检结果示意图；
图8是根据本发明对比例五所得细胞悬液镜检结果示意图；
图9是根据本发明对比例六所得细胞悬液镜检结果示意图；
图10是根据本发明对比例七所得细胞悬液镜检结果示意图；
图11是根据本发明对比例八所得细胞悬液镜检结果示意图；
图12是根据本发明对比例九所得细胞悬液镜检结果示意图；
图13是根据本发明实施例二中所得细胞悬液NeuN免疫荧光染色结果示意图；
图14根据本发明实施例三中所得细胞悬液NeuN免疫荧光染色结果示意图；
图15根据本发明对比例九中所得细胞悬液NeuN免疫荧光染色结果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明人经过大量实验研究，发现由独立地链霉蛋白酶试剂和木瓜蛋白酶试剂组合而成的酶试剂盒相对现有技术在可较高质量地分散生物组织(例如脑组织)获得成活率较高、成团率较低的单细胞悬液，有助于后续细胞分选和单细胞测序的进行。
实施例一、酶试剂盒的制备
本实施例所用Hibernate A培养基来源为Gibco公司，货号A1247501；
本实施例所用GlutaMAX-1(100x)来源为Gibco公司，货号35050-061；
本实施例所用Actinomycin D来源为APExBIO公司，货号A4448；
本实施例所用10％BSA来源为Amresco公司，货号9048-46-8；
本实施例所用DNaseI来源为Sigma公司，货号D5025；
本实施例所用链霉蛋白酶(Pronase)来源为Sigma公司，货号P6911-1G；
本实施例所用木瓜蛋白酶(Papain)来源为Worthington公司，货号LS003126。
(1)HAG培养基制备：30ml Hibernate A培养基中加入75ul GlutaMAX-1(100x),45mM和3.3ul Actinomycin D，即制成HAG培养基。
(2)第一试剂的制备：量取1ml上述制备的HAG培养基，加入100ul 10％BSA、10ulDNaseI和1-3mg链霉蛋白酶混匀，即制成第一试剂；
第二试剂的制备：量取1ml上述制备的HAG培养基，加入100ul 10％BSA、10ulDNaseI和10-50ul木瓜蛋白酶(浓度为42mgP/ml)混匀，即制成第二试剂；
实施例二、小鼠前额叶皮层组织细胞单细胞悬液的制备
(1)取小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g，充分切碎后平均分成两份，取一份放置于第一试剂，另一份放置于第二试剂，用镊子轻轻夹碎组织块，置于37℃恒温摇床上，以200rpm/min的转速消化15～30分钟；
(2)将消化好的两管组织液加入到同一HAG培养基(2ml)中，用1ml的移液枪枪头吹打细胞12次，静置2min后，吸取上清置于新的离心管中，再向原管中加入2ml HAG培养基，重复上述步骤2次，收集细胞悬液；
(3)将收集的细胞悬液依次用70um和40um的无菌细胞筛过滤，收集滤液；
(4)将收集的滤液进行梯度离心，转速为800g离心15min，离心结束去除上层碎片；
(5)将下层细胞收集至5ml 1％BSA中，充分混匀，分别在70um、40um和10um的无菌细胞筛过滤，收集的滤液以200g转速离心5min，弃掉上清收集细胞；
(6)在收集的细胞中加入1ml 1％BSA，轻轻吹打，随后以200g转速离心5min，弃掉上清，再加入50ul 1％BSA重悬细胞，获得细胞悬液。
实施例三、成年人的部分颞叶组织细胞单细胞悬液的制备
(1)取成年人的部分颞叶组织0.03～0.1g，充分切碎后平均分成两份，取一份放置于第一试剂，另一份放置于第二试剂，用镊子轻轻夹碎组织块，置于37℃恒温摇床上，以200rpm/min的转速消化15～30分钟；
(2)将消化好的两管组织液加入到同一HAG培养基(2ml)中，用1ml的移液枪枪头吹打细胞12次，静置2min后，吸取上清置于新的离心管中，再向原管中加入2ml HAG培养基，重复上述步骤2次，收集细胞悬液；
(3)将收集的细胞悬液依次用70um和40um的无菌细胞筛过滤，收集滤液；
(4)将收集的滤液进行梯度离心，转速为800g离心15min，离心结束去除上层碎片；
(5)将下层细胞收集至5ml 1％BSA中，充分混匀，分别在70um、40um和10um的无菌细胞筛过滤，收集的滤液以200g转速离心5min，弃掉上清收集细胞；
(6)在收集的细胞中加入1ml 1％BSA，轻轻吹打，随后以200g转速离心5min，弃掉上清，再加入50ul 1％BSA重悬细胞，获得细胞悬液。
实施例四、耳蜗前庭细胞单细胞悬液的制备
(1)取耳蜗前庭组织0.03～0.1g，充分切碎后平均分成两份，取一份放置于第一试剂，另一份放置于第二试剂，用镊子轻轻夹碎组织块，置于37℃恒温摇床上，以200rpm/min的转速消化15～30分钟；
(2)将消化好的两管组织液加入到同一HAG培养基(2ml)中，用1ml的移液枪枪头吹打细胞12次，静置2min后，吸取上清置于新的离心管中，再向原管中加入2ml HAG培养基，重复上述步骤2次，收集细胞悬液；
(3)将收集的细胞悬液依次用70um和40um的无菌细胞筛过滤，收集滤液；
(4)将收集的滤液进行梯度离心，转速为800g离心15min，离心结束去除上层碎片；
(5)将下层细胞收集至5ml 1％BSA中，充分混匀，分别在70um、40um和10um的无菌细胞筛过滤，收集的滤液以200g转速离心5min，弃掉上清收集细胞；
(6)在收集的细胞中加入1ml 1％BSA，轻轻吹打，随后以200g转速离心5min，弃掉上清，再加入50ul 1％BSA重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例一、使用软骨素酶消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，放入软骨素酶液(浓度为2units/ml)中消化，37℃恒温摇床上，转速为200rpm/min，充分裂解30min；使用与实施例二相同的方式进行密度梯度离心和过滤脑组织细胞，去除碎片和团块；使用与实施例二相同的方式清洗细胞两次，随后重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例二、使用链霉蛋白酶消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，放入链霉蛋白酶液(浓度为1-3mg/ml)中消化，37℃恒温摇床上，转速为200rpm/min，充分裂解30min；使用与实施例二相同的方式进行密度梯度离心和过滤脑组织细胞，去除碎片和团块；使用与实施例二相同的方式清洗细胞两次，随后重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例三、使用木瓜蛋白酶消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，放入木瓜蛋白酶液(浓度为10-50μl 42mgP/ml)中消化，37℃恒温摇床上，200rpm/min，充分裂解30min；使用与实施例二相同的方式进行密度梯度离心和过滤脑组织细胞，去除碎片和团块；使用与实施例二相同的方式清洗细胞两次，随后重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例四、使用透明质酸酶消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，放入透明质酸酶液(浓度为1-3mg/ml)中消化，37℃恒温摇床上，200rpm/min，充分裂解30min；使用与实施例二相同的方式进行密度梯度离心和过滤脑组织细胞，去除碎片和团块；使用与实施例二相同的方式清洗细胞两次，随后重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例五、使用链霉蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合液消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，放入链霉蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合液中(该混合液中链霉蛋白酶的浓度为1-3mg/ml，木瓜蛋白酶的浓度为10-50μl42mgP/ml)消化，37℃恒温摇床上，200rpm/min，充分裂解30min；使用与实施例二相同的方式进行密度梯度离心和过滤脑组织细胞，去除碎片和团块；使用与实施例二相同的方式清洗细胞两次，随后重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例六、使用新格元公司(GEXCOPE)组织解离液消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，放入新格元公司(GEXCOPE)组织解离液进行消化，37℃恒温摇床上，200rpm/min，充分裂解30min；使用与实施例二相同的方式进行密度梯度离心和过滤脑组织细胞，去除碎片和团块；使用与实施例二相同的方式清洗细胞两次，随后重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例七、不使用10um的无菌细胞筛
对比例七中获得小鼠前额叶皮层组织单细胞悬液的步骤与实施例二中的步骤大致相同，区别在于，步骤(5)中无菌细胞筛过滤时，未依次采用70um、40um和10um的无菌细胞筛过滤，仅依次采用70um和40um的无菌细胞筛过滤。
对比例八、使用Hibernate-Ca+木瓜蛋白酶消化脑组织细胞
取实施例二相同来源的小鼠前额叶皮层组织0.03～0.1g充分切碎，置于液体培养基中，并用0.2ml温热HA-Ca充分冲洗。22℃转速为200g的条件下离心分离细胞(转桶式离心机中以1100r.p.m.)，弃去上清液并轻弹试管以分散细胞沉淀。将细胞重悬于0.2ml的Hibernate-Ca+木瓜蛋白酶中。重新悬浮的细胞加入置于加入木瓜蛋白酶的原始培养基中。在环境温度为37℃的CO2(非5％)的环境中孵育10分钟。使用1ml的移液枪枪头吹打细胞12次，静置2min后，吸取上清置于新的离心管中重悬细胞，获得细胞悬液。
对比例九、使用独立地链霉蛋白酶和透明质酸酶消化脑组织细胞
对比例七中获得小鼠前额叶皮层组织单细胞悬液的步骤与实施例二中的步骤大致相同，区别在于，步骤(1)中的第二试剂中添加的酶为透明质酸酶而非木瓜蛋白酶。
测试例一、脑组织细胞悬液细胞活率和成团率测试
取实施例二、实施例三、对比例一、对比例二、对比例三、对比例四、对比例五、对比例六、对比例七和对比例八中所得的小鼠前额叶皮层组织细胞悬液，加入台盼蓝染液混合，使用血球细胞计数板进行镜检，统计小鼠前额叶皮层组织细胞活率和成团率。各实施例和对比例的镜检结果见下表一。
表一
组别 细胞活率 成团率 示意图
实施例二 95％ 低于10％ 附图1
实施例三 96％ 6％ 附图2
实施例四 98％ 低于10％ 附图3
对比例一 34.2％ 9.9％ 附图4
对比例二 67.5％ 19.2％ 附图5
对比例三 69.1％ 17.8％ 附图6
对比例四 46％ 11％ 附图7
对比例五 50％ 50％ 附图8
对比例六 69.5％ 23.4％ 附图9
对比例七 64％ 23.5％ 附图10
对比例八 52.5％ 14.2％ 附图11
对比例九 88％ 10％ 附图12
测试例二、神经元的标记物NeuN免疫荧光染色实验
取实施例二、实施例三和对比例九获得的细胞悬液进行神经元的标记物NeuN免疫荧光染色实验，测试所得细胞悬液中神经元的比例(标尺为20μm，561nm通道标记神经元，405nm通道标记细胞核)，所得结果见表二、图13、图14和图15。
表二
Figure BDA0003033391700000091
Figure BDA0003033391700000101
在神经生物学领域，由于神经元细胞极度脆弱，在分离过程中存活率低，因此通过计数神经元细胞占细胞总量的比例可进一步证明本发明所述获得单细胞悬液的方法所得的细胞具有高的成活率，可应用于脆弱的神经细胞的分离。
由表可知，采用对比例九中的方法所得的小鼠小鼠前额叶皮层组织的单细胞悬液神经元数量占比较少于20％，而采用本发明所述的方法获得的小鼠前额叶皮层组织的单细胞悬液中神经元数量不少于40％(实施例二)，神经元活率增加超过1倍，将本发明所述的方法应用于人脑组织单细胞悬液的制备时，神经元细胞占细胞总量的比例超过70％，证明本发明所述的获得单细胞悬液的方法对脆弱细胞尤其是神经细胞的损伤更小。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种获得单细胞悬液的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
使用用于分散生物组织的酶试剂盒获得单细胞悬液，所述用于分散生物组织的酶试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括链霉蛋白酶，所述第二试剂中包括木瓜蛋白酶；
（1）将待分离的组织碎片分成两份，其中一份使用所述第一试剂进行消化，获得第一消化液，另一份使用所述第二试剂进行消化，获得第二消化液；
（2）取步骤（1）中所得第一消化液和第二消化液置于同一HAG培养基中混合，并进行分散，吸取上清液，即获得所述单细胞悬液；
其中，每毫升所述第一试剂中，包括：
DNA酶 (0.5~1.4)V/V%，
10% 牛血清蛋白 (5.0~14.0) V/V %，
链霉蛋白酶 (0.5~5.0) mg/mL；
和/或，
每毫升所述第二试剂中包括：
DNA酶 (0.5~1.4) V/V %，
10% 牛血清蛋白 (5.0~14.0) V/V %，
木瓜蛋白酶 (0.5~5.0) mg/mL；
其中，所述生物组织为哺乳动物脑组织或耳蜗前庭组织。
2.根据权利要求1所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，所述第一试剂还包括HAG培养基。
3.根据权利要求1所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，所述第二试剂还包括HAG培养基。
4.根据权利要求1所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤（2）后还包括步骤（3）：取步骤（2）所得的上清液使用细胞筛过滤处理，收集滤液。
5.根据权利要求4所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤（3）后还包括步骤（4）：取所步骤（3）所得的滤液进行梯度离心，收集下层细胞，置于液体介质中混匀。
6.根据权利要求5所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤（4）中还包括步骤（5）：取步骤（4）中于液体介质中混匀的细胞，使用细胞筛过滤处理，收集滤液，离心弃掉上清，将所得细胞在液体介质中混匀。
7.根据权利要求1所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，步骤（1）中，组织碎片和第一试剂的加入量为每毫升第一试剂中加入组织碎片0.03~0.1g；
和/或，步骤（1）中，组织碎片和第二试剂的加入量为每毫升第一试剂中加入组织碎片0.03~0.1g；
和/或，步骤（1）中，所述消化在恒温摇床上进行；
和/或，步骤（1）中，所述消化的时间为15~30 min；
和/或，步骤（2）中，所述第一消化液和第二消化液的总体积与HAG培养基的体积比为1:(0.7~2)；
和/或，步骤（2）中，所述分散的方式为使用气枪吹散细胞。
8.根据权利要求6所述的使用获得单细胞悬液的方法，其特征在于，
和/或，步骤（5）中，依次使用70 um、40 um和10 um的细胞筛进行三次过滤处理；
和/或，步骤（5）中，所述离心的次数大于1次。
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