CN113234677A

CN113234677A - 一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法

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Publication number: CN113234677A
Application number: CN202110461666.7A
Authority: CN
Inventors: 韩云炜; 郭露; 曾浩; 陈晓静
Original assignee: Affiliated Hospital of Southwest Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Southwest Medical University
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2021-08-10

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法。包括以下步骤：将肿瘤组织剪碎后、消化；终止消化后，离心，保留上清液；将上清液在4‑10℃条件下以2000‑3000g离心10‑20min，保留上清液；将上清液在4‑10℃条件下以10000‑12000g离心20‑30min，保留上清液；将上清液进行过滤、收集滤液进行超滤；将超滤后所得液体进行多次超速离心，收集沉淀即得。本发明方法简单、易于操作且，不需要过多试剂及装置，有利于推广应用。本发明方法提取得到的外泌体含量较为可观，且纯度较高，后续可用于多种生物实验。

Description

一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法。

背景技术

外泌体(exosome)最早发现于1986年，是一种由活细胞分泌，直径在40-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，除了在外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，外泌体也存在于各种组织中。目前主要使用的外泌体提取方法主要为超速离心法、超滤法、密度梯度离心法、试剂盒提取、免疫磁珠法等。

应用超速离心法提取外泌体大体包括以下4个步骤：(1)低速离心去除残留细胞；(2)高速离心去除细胞碎片；(3)0.22μm滤膜过滤去除大直径囊泡；(4)超速离心沉淀外泌体，为提高纯度可选用蔗糖密度梯度离心。如中国专利申请CN109666622A公开了一种细胞外泌体提取分离的方法，其包括如下步骤：S1、快速地将细胞培养液用0.22μm的过滤筛过滤，分离完整地细胞和残渣，并用离心机以10000-11500g的速度超速离心2小时；S2、用1mL常温的磷酸缓冲盐溶液重新悬浮和清洗小囊泡，再次用离心机以10000-11500g的速度超速离心2小时；S3、用100μL常温的磷酸缓冲盐溶液重新悬浮后转移到低粘附的管中，得到高浓度外分泌体，细胞培养液是来自无菌的80％-90％的培植细胞。

目前的技术手段可容易分离出外周血、腹水、尿液等体液中的外泌体，但对于肿瘤组织等固体组织外泌体的提取尚未有高效的方法。中国专利申请CN112538459A公开了一种肝癌组织中的外泌体的分离方法，包括：手术后的新鲜HCC组织标本一经离体，立即浸泡于含链霉素、青霉素双抗的PBS中；在无菌操作条件下，用剪刀将组织块剪成大小1～3mm的组织碎块；用含双抗的PBS漂洗净血液后，置于DMEM/F12培养基，同时加入I型、IV型胶原蛋白酶和透明质酸酶降解细胞外基质，并加入DNA酶消化死亡细胞所释放的基因组DNA；恒温摇床孵育30～60分钟；消化液经70μm过滤器过滤，去除未被消化的组织碎片；梯度离心法获得外泌体。该方法主要针对新鲜离体肝癌组织，对样品要求较高，需在肝癌组织离体后立即进行提取试验，不便于实际操作和应用；并且对于实际实验操作中常用的冻存肝癌组织效果较为局限。

综上，目前需要一种实用性强，方法简单，成本较低的肿瘤组织外泌体的提取方法。

发明内容

本发明主要目的在于提供一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法。本发明方法简单、易于操作且，不需要过多试剂及装置，有利于推广应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法，其包括以下步骤：

收集肿瘤组织样品；将肿瘤组织剪碎后置于工作液中消化15-30min；终止消化后，离心去除组织残渣和细胞碎片，保留上清液；将上清液在4-10℃条件下以2000-3000g离心10-20min，去除沉淀保留上清液；将上清液在4-10℃条件下以10000-12000g离心20-30min，去除沉淀保留上清液；将上清液进行过滤、收集滤液进行超滤；进行多次超速离心，收集沉淀即得。

进一步地，超速离心具体方法为：将超滤后所得液体在4-10℃条件下以120000-150000g超速离心60-70min，收集沉淀；将收集得到的沉淀重悬，重悬液在4-10℃条件下120000-150000g超速离心60-70min，即得。

进一步地，终止消化后，300-500g离心10-15min。

进一步地，所述工作液包含胰蛋白消化酶和IV型胶原蛋白酶。肝癌组织细胞外基质成分复杂，IV型胶原蛋白酶含有多种酶活性，适用于组织分离，可充分水解肝癌组织细胞外基质中的多种蛋白质、多糖和脂质成分。胰蛋白消化酶可作用于细胞间的蛋白质，使肝癌组织块中的细胞分散成为单个细胞。

更进一步地，所述工作液中胰蛋白消化酶浓度为0.125％-0.25％，IV型胶原蛋白酶浓度为50-100U/mL。

进一步地，将上清液进行滤膜过滤，收集滤液进行超滤。

进一步地，超滤的具体步骤：将滤液转移至超滤管中，在4-10℃温度条件下以2000-3000rpm离心15-20min。

进一步地，采用PBS缓冲液进行重悬。

与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：

本发明所述方法采用胰蛋白消化酶和IV型胶原蛋白酶两种混合液酶液，消化肿瘤组织释放外泌体，结合超速离心法和超滤法，操作简便，省时省力，且不需要特殊试剂及装置，成本较低，易于推广应用。

本发明方法提取得到的外泌体含量较为可观，且纯度较高，后续可用于多种生物实验。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1所述方法提取得到的小鼠肿瘤组织外泌体的透射电镜图片；

图2为本发明实施例1所述方法提取得到的小鼠肿瘤组织外泌体NTA粒径分析结果；

图3为本发明实施例1所述方法提取得到的小鼠肿瘤组织外泌体westernblot检测结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法，以小鼠肝癌组织为例，包括以下步骤：

1)收集适量小鼠肝癌组织样品；

2)将小鼠肝癌组织剪碎为黄豆大小颗粒；

3)将0.25％胰蛋白消化酶与IV型胶原蛋白酶以体积比1:1比例混合制成工作液，将小鼠肝癌组织置于适量工作液中，以能完全覆盖肿瘤组织为宜，消化20min；所用IV型胶原蛋白酶浓度为100U/mL。

4)加入与工作液等体积的DMEM培养基终止消化，震荡片刻，在室温下，以300g离心10分钟去除组织残渣和细胞碎片，保留上清液；

5)将步骤4)中上清液在4℃下以2,000g离心15分钟，去除沉淀保留上清液；

6)将步骤5)中上清液在4℃下以10,000g离心30分钟，去除沉淀保留上清液；

7)将步骤6)中得到的上清液通过孔径为0.22μm的滤膜，收集滤液；

8)将步骤7)中收集到的滤液转移至超滤管中，在4℃下以2,700rpm离心20分钟，富集外泌体；

9)将步骤8)中富集的液体在4℃下以120,000g超速离心70分钟，得到的沉淀用PBS液重悬；

10)将步骤9)中得到的重悬液在4℃下以120,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即所需肿瘤组织外泌体；

11)将步骤10)得到的沉淀以100ul PBS液重悬，分装，分别使用透射电镜对所提取的外泌体形态进行检测，使用Westernblot对外泌体的标记蛋白进行检测，使用粒径检测仪对所提取的外泌体直径范围进行检测。

所得鉴定结果，具体如下：

1)采用透射电镜观察外泌体的大小与形态，透射电镜下可见，所提取的小鼠肝癌组织外泌体呈大小均一的圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径约为80～120nm，如图1所示；

2)通过NTA粒径分析发现，所提取的小鼠肝癌组织外泌体粒径大小集中于80～100nm，最大峰值约为85.04nm，符合外泌体直径的范围，如图2所示；

3)采用Westernblot检测小鼠细胞和以上所得小鼠肿瘤组织外泌体中外泌体表面特异蛋白TSG101、CD9、CD63、和Calnexin表达情况，如图3所示。

实施例2

一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法，以人体肺癌组织为例，包括以下步骤：

1)将体外肺癌组织剪碎为黄豆大小颗粒；

2)将0.25％胰蛋白消化酶与IV型胶原蛋白酶以体积比1:1的比例混合制成工作液，将体外肺癌组织置于工作液中工作也完全覆盖肺癌组织，消化30min；所用IV型胶原蛋白酶100U/mL；

3)加入与工作液等体积的DMEM培养基终止消化，震荡片刻，在室温下，以500g离心15分钟去除组织残渣和细胞碎片，保留上清液；

4)将步骤3)中上清液在4℃下以3,000g离心10分钟，去除沉淀保留上清液；

5)将步骤4)中上清液在4℃下以12,000g离心20分钟，去除沉淀保留上清液；

6)将步骤5)中得到的上清液通过孔径为0.22μm的滤膜，收集滤液；

7)将步骤6)中收集到的滤液转移至超滤管中，在10℃下以2000rpm离心20分钟，富集外泌体；

8)将步骤7)中富集的液体在4℃下以150,000g超速离心60分钟，得到的沉淀用PBS液重悬；

9)将步骤8)中得到的重悬液在4℃下以150,000g超速离心60分钟，得到的沉淀即所需肿瘤组织外泌体；

10)将得到的沉淀以100uL PBS液重悬，分装，置于-80℃保存备用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：收集肿瘤组织样品；将肿瘤组织剪碎后置于工作液中消化15-30min；终止消化后，离心去除组织残渣和细胞碎片，保留上清液；将上清液在4-10℃条件下以2000-3000g离心10-20min，去除沉淀保留上清液；将上清液在4-10℃条件下以10000-12000g离心20-30min，去除沉淀保留上清液；将上清液进行过滤、收集滤液进行超滤；进行多次超速离心，收集沉淀即得。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，超速离心具体方法为：将超滤后所得液体在4-10℃条件下以120000-150000g超速离心60-70min，收集沉淀；将收集得到的沉淀重悬，重悬液在4-10℃条件下120000-150000g超速离心60-70min，即得。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，终止消化后，300-500g离心10-15min。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述工作液包含胰蛋白消化酶和IV型胶原蛋白酶。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述工作液中胰蛋白消化酶浓度为0.125％-0.25％，IV型胶原蛋白酶50-100U/mL。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将上清液进行滤膜过滤，收集滤液进行超滤。

7.根据权利要求1或6所述方法，其特征在于，超滤的具体步骤：将滤液转移至超滤管中，在4-10℃温度条件下以2000-3000rpm离心15-20min。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，采用PBS缓冲液进行重悬。