CN115475181A - 羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途。一方面，本发明涉及从羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述外泌体具有50～200nm的平均粒径，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％。本发明的外泌体是使用羊膜间充质干细胞经IL‑1β处理后在低氧分压条件下培养得到的。还涉及使用外泌体调控外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF‑α水平的方法，以及使用羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体和其制法。本发明外泌体具有生物调控性能。

Description

羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养间充质干细胞获取外泌体的方法。具体涉及一种采用炎性因子及低氧环境下诱导培养间充质干细胞分泌外泌体并提取的方法，该方法获取的外泌体在可显著的提高细胞的抗炎活性。

本发明的间充质干细胞是从羊膜分离和传代培养获得的。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新自我复制和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等(可参见：Polchert D,Sobinsky J,Douglas G,Kidd M,Moadsiri A,Reina E,et al.IFN-gamma activation of mesenchymal stem cells fortreatment and prevention of graft versus host disease.European journal ofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及Spaggiari GM,Abdelrazik H,Becchetti F,Moretta L.MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function byselectively interfering with the generation of immature DCs:central role ofMSC-derived prostaglandin E2.Blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：Corcione A,Benvenuto F,Ferretti E,Giunti D,Cappiello V,Cazzanti F,et al.Human mesenchymal stem cellsmodulate B-cell functions.Blood.2006；107(1):367-72.以及Di Nicola M,CarloStella C,Magni M,Milanesi M,Longoni PD,Matteucci P,et al.Human bonemarrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellularor nonspecific mitogenic stimuli.Blood.2002；99(10):3838-43.)。

间充质干细胞的免疫原性低。基于MSCs的细胞治疗已成功应用于心血管系统疾病，骨、软骨缺损，糖尿病等疾病的治疗。MSCs通过旁分泌和自分泌释放多种细胞因子和生长因子，这些分泌的生物活性因子能够抑制纤维化和凋亡，增强血管生成，参与组织修复再生。

间充质干细胞来源丰富，可取自脐带、胎盘、骨髓、脐血、脂肪、羊膜等组织。

外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～200nm、密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：Yanez-Mo M,Siljander PR,Andreu Z,Zavec AB,Borras FE,Buzas EI,et al.Biological properties ofextracellular vesicles and their physiological functions.Journal ofextracellular vesicles.2015；4:27066.)。Lai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：Lai RC,Arslan F,Lee MM,Sze NS,Choo A,Chen TS,etal.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusioninjury.Stem cell research.2010；4(3):214-22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：Xin H,Li Y,Buller B,Katakowski M,Zhang Y,Wang X,et al.Exosome mediated transfer of miR-133b frommultipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neuriteoutgrowth.Stem cells.2012；30(7):1556-64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkiller group 2,member D)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可参见：Filipazzi P,Burdek M,Villa A,Rivoltini L,Huber V.Recent advances on the role of tumor exosomes inimmunosuppression and disease progression.Seminars in cancer biology.2012；22(4):342-9)。

外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。已有的研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。

外泌体作为一种纳米级的脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中、包括血液、唾液、尿液、母乳等。外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。包括肿瘤在内的几乎所有的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可以被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。宿主细胞抑或是肿瘤细胞分泌的外泌体都参与了细胞的生长、增值，代谢和调控等作用。免疫细胞和肿瘤细胞之间也可以通过外泌体进行信息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用：外泌体即可以通过抑制免疫细胞(DCs、NK细胞、CD4+、CD8+T细胞等)引发抗肿瘤反应，又可以诱导免疫抑制或调节细胞群(MDSCs、Tregs、Bregs)的免疫抑制。

目前研究发现，间充质干细胞的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHC I/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。

目前进行外泌体提取的方法和途径也多种多样，现有的外泌体提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的外泌体质量不均一、不能保证外泌体所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的外泌体获取，并且成本昂贵。

现有技术已有一些关于外泌体的分离提取方法的报道。例如，CN106282107A(中国专利申请号201610779165.2)公开了一种从人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，CN105708861A(中国专利申请号201610149852.6)公开了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，CN105267240A(中国专利申请号201410781765.3)公开了间充质干细胞来源的外泌体的用途，CN104382827A(中国专利申请号201410705462.3)公开了人羊膜间充质干细胞外泌体的用途，CN103767985A(中国专利申请号201210402915.6)公开了人源血液或间充质干细胞分泌外泌体的制备与应用。然而，现有技术中，采用各种来源的间充质干细胞培养上清液来提取外泌体，这些方法均存在产量偏低、工艺复杂等的不足。

因此，本领域仍然期待有新的方法来分离提取外泌体，特别是以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。此外，本领域还期待提供一种治疗炎性疾病的方法例如通过使用外泌体治疗炎性疾病的方法。

尤其是，本领域特别期待提供一种通过人羊膜间充质干细胞培养分离的外泌体治疗炎性疾病的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的方法来分离提取外泌体，特别是这种方法能够以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。已经出人意料的发现通过本发明方法能够有益的实现上述目的。本发明基于此发现而得以完成。

本发明涉及的间充质干细胞是羊膜来源的。

为此，本发明第一方面提供了一种使用羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径。

根据本发明第一方面的外泌体，其表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第一方面的外泌体，所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(c)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(d)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(e)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(f)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(g)P2代细胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞。

以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

根据本发明第一方面的外泌体，其是使用羊膜间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P6代的细胞。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第一方面的外泌体，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

进一步的，本发明第二方面提供了一种使用羊膜间充质干细胞分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P6代的细胞。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第二方面的方法，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第二方面的方法，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第二方面的方法，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第二方面的方法，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第二方面的方法，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

根据本发明第二方面的方法，所得外泌体的平均粒径为50～200nm，例如平均粒径为75～150nm。

根据本发明第二方面的方法，所得外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第二方面的方法，所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(c)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(d)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(e)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(f)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(g)P2代细胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞。

以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

进一步的，本发明第三方面提供了羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径。

根据本发明第三方面的用途，所述外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第三方面的用途，所述外泌体是使用羊膜间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(c)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(d)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(e)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(f)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(g)P2代细胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第三方面的用途，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根据本发明第三方面的用途，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

根据本发明第三方面的用途，以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P6代的细胞。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第三方面的用途，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第三方面的用途，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第三方面的用途，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第三方面的用途，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第三方面的用途，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

进一步的，本发明第四方面提供了使用外泌体调控外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α水平的方法，该方法包括使所述外周血单个核细胞暴露于所述外泌体的操作；其中，所述外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径，并且所述外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

根据本发明第四方面的方法，所述外泌体是使用羊膜间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(c)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(d)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(e)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(f)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(g)P2代细胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％ O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

根据本发明第四方面的方法，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。

根据本发明第四方面的方法，以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

根据本发明第四方面的方法，以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P6代的细胞。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞。在一个实施方案中，步骤(1)使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

根据本发明第四方面的方法，步骤(3)中，在37℃、2％ O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

根据本发明第四方面的方法，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟。

根据本发明第四方面的方法，步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存。

根据本发明第四方面的方法，步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬。

根据本发明第四方面的方法，步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

尽管MSC来源的外泌体具有促进血管生成、促进细胞增殖、生长、迁移等诸多优势，但是目前绝大多数采用常规方法培养的MSC来源的外泌体在介导炎症调控方面的作用却并不明显。基于此，本发明设计了一种低氧分压联合炎症因子刺激方式诱导MSC培养并分离纯化其分泌的外泌体，在体外显示出良好的炎症调控作用，为外泌体治疗炎症性疾病提供了新的方案。

附图说明

图1：实施例2所得羊膜间充质干细胞外泌体电镜图。

图2：实施例3所得羊膜间充质干细胞外泌体电镜图。

图3显示了实施例3外泌体的粒度分布散点图。

图4显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD9表达量。

图5显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD81表达量。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

如无另外说明，本发明使用的一些试剂试药是本领域常规的或者可以容易从市售途径购得的。例如无血清培养基(Gibco)购自ThermoFisher Scientific；人血小板裂解物购自Precicion BioMedicals公司；磷酸盐缓冲液(pH6.8，PBS)制法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，121℃灭菌15min，即得；组织清洗液(PRS-TCR-1)购自普瑞昇。本文所述MSC完全培养基是含2％人血小板裂解物的无血清培养基。

实施例1：羊膜间充质干细胞原代及传代培养

通过羊膜获得原代和传代的间充质干细胞的方法已在诸多文献报道，本发明制备外泌体所用的间充质干细胞可以使用这些文献方法获得，并且虽然本发明技术的关键核心并不在于，示例性的，本发明仍然愿意在此描述一种制备间充质干细胞的方法。

本实施例参考本申请发明团队的中国专利号ZL2016111295528(实施例4)中所记载的方法来制备羊膜间充质干细胞，所用的材料及来源亦均参考该专利文献，该文献的全部内容并入本文作为参考。

(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(3)组织消化：在37度恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液(内含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶)以100rpm振荡消化40min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基(本实施例所用特定配方且区别于本发明其它场合使用的完全培养基，其配方为：DMEM-F12(1：1)培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.02％硝酸硫胺、0.085％麦芽糖)重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率(通常可得大于1×10⁷细胞，细胞活率大于95％)；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养12天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养12天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(6)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(7)P2代细胞再以步骤(6)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞。

如ZL2016111295528所述，上述方法所得人羊膜间充质干细胞的细胞形态、细胞表型、分化潜能等方面呈现优良性能，例如具有优良的诱导分化成骨、成软骨、成脂等性能。

实施例2：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P4代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加15mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(24小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度10ng/mL，继续培养24小时；[本领域技术人员理解，可以改用其它规格的培养瓶例如T25、T75瓶，根据培养面积不同可以改变细胞接种数量和/或培养基添加量，例如在MSC培养时以上述浓度并添加约15ml培养基是本领域的常规操作]

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

[上述2％ O₂、5％ CO₂培养箱中的气氛是指氮气平衡的气氛，而前述5％ CO₂培养箱中的气氛是指21％氧和余量氮气平衡的气氛，此类表述方式的含义是本领域技术人员一般都公认的含义]

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以300g、4℃离心10分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2000g、4℃离心20分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以10000g、4℃离心30分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以100000g、4℃离心90分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加20ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以100000g、4℃离心90分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

上述步骤中所用不同离心力要求的离心管和离心机均购自Beckman Coulter。

实施例2a：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P3代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加17mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(20小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8ng/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以250g、4℃离心12分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2500g、4℃离心18分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以8000g、4℃离心35分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以120000g、4℃离心75分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加15ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000g、4℃离心120分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例2b：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P6代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加13mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(30小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度12ng/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以350g、4℃离心8分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以1500g、4℃离心25分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以12000g、4℃离心25分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以80000g、4℃离心120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加25ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以120000g、4℃离心75分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P4代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加15mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(24小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、赖氨酸分别至浓度10ng/mL、0.15mg/mL、2.2mg/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

[上述2％ O₂、5％ CO₂培养箱中的气氛是指氮气平衡的气氛，而前述5％ CO₂培养箱中的气氛是指21％氧和余量氮气平衡的气氛，此类表述方式的含义是本领域技术人员一般都公认的含义]

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以300g、4℃离心10分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2000g、4℃离心20分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以10000g、4℃离心30分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以100000g、4℃离心90分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加20ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以100000g、4℃离心90分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3a：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P3代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加17mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(20小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、盐酸赖氨酸分别至浓度8ng/mL、0.175mg/mL、2mg/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以250g、4℃离心12分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以2500g、4℃离心18分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以8000g、4℃离心35分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以120000g、4℃离心75分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加15ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000g、4℃离心120分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3b：使用IL-1β处理间充质干细胞并用差速离心法分离纯化外泌体

(1)将实施例1所得间充质干细胞(P6代)按照6×10^5个细胞接种至T75培养瓶中，每瓶添加13mL的MSC完全培养基，置37℃、5％ CO₂培养箱中培养(30小时)使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、盐酸赖氨酸分别至浓度12ng/mL、0.125mg/mL、2.5mg/mL，继续培养24小时；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％ CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗3次，然后向每瓶中添加MSC完全培养基15mL，再置于37℃、2％O₂、5％ CO₂培养箱中培养48小时；

(4)吸取细胞上清液(30ml，来自2个培养瓶中的上清液量)置(50ml)离心管中，进行如下离心处理：

以350g、4℃离心8分钟(去除死细胞及较大的细胞碎片)，吸取上清液至另一(50ml)离心管中；

以1500g、4℃离心25分钟(进一步去除细胞碎片等杂质)，吸取上清液至另一(高速)离心管中；

以12000g、4℃离心25分钟(进一步去除较小的细胞碎片及杂质)，上清液用0.22μm滤膜(PES滤膜，millipore)过滤后置于另一(超速)离心管中；

以80000g、4℃离心120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加25ml无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以120000g、4℃离心75分钟，弃上清液，加1mL无菌PBS使外泌体重悬，得到外泌体悬液1ml，其可置于-80℃保存和/或分装用于性能测定。

实施例3c：分别参照实施例3、实施例3a和实施例3b，不同的仅是步骤(1)不添加酒石酸钠，得到三批外泌体，可分别记为实施例3c1、实施例3c2、实施例3c3。

实施例3d：分别参照实施例3、实施例3a和实施例3b，不同的仅是步骤(1)不添加盐酸赖氨酸，得到三批外泌体，可分别记为实施例3d1、实施例3d2、实施例3d3。

实施例4：外泌体颗粒的透射电镜观察

1、取分离纯化后的外泌体沉淀50μl，向其中加入等体积的2.5％戊二醛，置于4℃冰箱中固定1hr；

2、将固定后的外泌体悬液20μl，滴加到铜网的正面，静止20min；

3、用吸水滤纸小心的吸去多余的溶液；然后用超纯水清洗铜网5次，每次30秒中，用滤纸吸干；

4、向铜网正面滴加1滴2％醋酸双氧铀染色液，染色1min，然后用滤纸延铜网边缘吸干多余的染液；

5、将铜网放置在室温空气中自然干燥，待晾干后上机进行观察，同时计算并统计外泌体的粒径和分布。

使用以上方法对本发明各实施例所得外泌体(悬液)进行检测。计算由1.2×10^6个细胞(2个培养瓶)得到的各实施例外泌体数量，结果为：实施例2、实施例2a和实施例2b的外泌体颗粒数分别为5.3×10^9粒、6.1×10^9粒和4.6×10^9粒，实施例3、实施例3a和实施例3b的外泌体颗粒数分别为64.4×10^9粒、76.2×10^9粒和60.7×10^9粒，实施例3c1、实施例3c2和实施例3c3的外泌体颗粒数分别为6.7×10^9粒、4.9×10^9粒和6.2×10^9粒，实施例3d1、实施例3d2和实施例3d3的外泌体颗粒数分别为7.3×10^9粒、4.4×10^9粒和6.3×10^9粒。以实施例2的外泌体为例，初始的MSC细胞量为1.2×10^6细胞，得到的外泌体体积为1ml，测得其中外泌体浓度为5.3×10^9粒/mL，相当于由1.2×10^6细胞得到5.3×10^9粒外泌体。以上“5.3×10^9粒外泌体”表示5.3乘以10的9次方外泌体，其它类似表述有类似含义。

图1和图2分别显示了实施例2和实施例3所得羊膜间充质干细胞外泌体电镜图。经测定，上述实施例2、实施例2a和实施例2b，实施例3、实施例3a和实施例3b，实施例3c、实施例3d所得全部的外泌体的平均粒径均在94～142nm范围内，例如实施例3外泌体的峰值粒径106.3±3.6nm，平均粒径98.4±1.2nm。图3显示了实施例3外泌体的粒度分布散点图。

实施例5：流式细胞仪检测外泌体颗粒表面蛋白表达

1、将Thermofisher CD63磁珠(货号10606D)成分颠倒混匀10min；吸取20μl磁珠悬液至1.5mL圆底EP管中；

2、向EP管中添加200μl磁珠清洗液，用枪头充分混匀；

3、将EP放置在磁力架上1min；然后吸弃上清液；

4、取提取后的血浆外泌体悬液50μl，添加50μl清洗液至终体积为100μl，充分混匀；

5、将外泌体-清洗液混合液置于旋转混匀器上，设定转速为10rpm，置于2～8℃旋转孵育过夜；

6、隔天将样本进行3～5秒快速离心收集沉淀；

7、向样本中添加300μl清洗液，用枪头充分混匀30秒；

8、将样本置于磁力架上约1min，吸弃上清液；

9、向样本中添加400μl清洗液，用枪头充分混匀30秒；

10、将样本置于磁力架上约1min，吸弃上清液，用300μl清洗液重悬；

11、各取100μl样本，向样本中分别添加CD9-PE、CD81-FITC流式抗体，置于4℃避光孵育30min，

12、将孵育后的样本置于磁力架上约1min，吸弃上清液，添加300μl清洗液洗涤；

13、重复步骤12一次后，用300μl PB重悬选样本后上机检测。

图4显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD9表达量，图5显示了实施例3所得外泌体膜蛋白CD81表达量，CD9的阳性表达率为78.3％，CD81的阳性表达率为93.7％。其它实例所得外泌体的膜蛋白CD9和CD81表达量与图4和图5无明显差异。

实施例6：外泌体蛋白含量检测

本实施例使用Pierce^TM蛋白定量试剂盒(货号：23225，Thermo Scientific)进行测试。

1、取5mg/mL的BCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠)标准品10μl，用PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL，作为BCA标准品溶液，将该标准品溶液按0、2、4、6、8、12、16、20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20μL；

2、将外泌体样品作适当稀释，加20μL到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品浓度点落在标准线1/2后。

3、各孔加入200μL的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm的OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

标准曲线为y＝0.9999x-0.0488，其中x是OD值，y是单位为mg/ml的外泌体蛋白浓度。

使用以上方法对本发明各实施例所得外泌体(悬液)进行检测。计算由1.2×10^6个细胞得到的各实施例外泌体蛋白含量，结果为：实施例2、实施例2a和实施例2b的蛋白含量分别为52.6μg、72.3μg和59.3μg，实施例3、实施例3a和实施例3b的蛋白含量分别为297.4μg、322.6μg和283.8μg，实施例3c和实施例3d的6个外泌体样本的蛋白含量在47～71μg范围内。

实施例7：Elisa检测外泌体对PBMC细胞分泌TNF-α水平的免疫调控实验

肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，并在体内以跨膜型(tmTNF)和分泌型(sTNF)两种形式发挥作用，tmTNF以膜蛋白的形式分布于分泌TNF-α的细胞上，经过TACE(TNF-α-converting enzyme)酶活化切割后产生sTNF。TNFα受体分为2种(TNFRⅠ和TNFRⅡ)，存在于多种细胞表面，TNFα与TNFR的结合通常会引起细胞凋亡、炎症和肿瘤的发生等。

本发明方法中的间充质干细胞分泌的外泌体可以抑制淋巴细胞释放TNF-α，本实验中间充质干细胞提取纯化的外泌体和PBMC按照一定的比例共培养，然后采用ELISA的方法检测细胞上清中的TNF-α表达水平，通过分析TNF-α表达水平的变化检测外泌体对淋巴细胞释放TNF-α的抑制能力。

1、采用Ficoll法从健康成人外周血中分离单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)，用免疫细胞无血清培养基(Miltenyi，含2.5％血清替代物)重悬PBMC，将PBMC的密度调整成4×10^5/ml，然后向每ml PBMC悬液中加入50μl CD3/CD28磁珠(Thermofisher)；混匀PBMC和磁珠后，将0.5ml PBMC加入到24孔板的孔中，并向该孔内添加50μl含有1×10^7个外泌体的悬液。设置试验组孔(已用磁珠激活且添加外泌体的PBMC)、对照组孔(已用磁珠激活且不添加外泌体的PBMC)、阴性组孔(未用磁珠激活的PBMC)、空白组孔(只含有免疫细胞无血清培养基)；

2、共培养5天后，收集共培养基的上清；然后用2000rpm的速度离心5分钟；收集上清液；

3、将检测TNF-α的ELISA试剂盒(R&D Systems)和试剂从冰箱取出，室温下放置(使用前平衡至室温)，取下微孔板条放在微孔板条支架里面，将剩余的微孔板条放回箔纸袋里面，封口，并放回冰箱；

4、取出一支TNF-α标准品，加入0.95ml去离子水，用吸头轻轻吹打几下，使PGE2溶解，制备成浓度是10000pg/ml的标准品原液；将溶解后的PGE2标准品放在室温下分钟，每4-5分钟用手晃动TNF-α标准品2-3次；然后取7个1.5ml EP管，用Calibrator Diluent RD6-12将TNF-α标准品稀释成不同的浓度梯度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml和15.6pg/ml；

5、释样本：对于每个检测样本，取待检测样本适量用Calibrator Diluent RD6-12稀释至外泌体蛋白浓度5μg/ml；

6、加样并孵育：分别将50μl的Assay Diluent RD1F加到微孔板的每个孔里面；将50μl培养基加到微孔板里面，重复3个孔，作为对照组；将50μl不同浓度的标准品溶液加到微孔板里面，分别重复3个孔；将50μl稀释后的样本加到微孔板里面，分别重复3个孔；小心盖上微孔板贴膜，使用450rpm的转速在室温下震荡2个小时；

7、小心撕去贴膜，倒掉微孔板里面的液体，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；向每个孔里面加入300μl 1×Wash Buffer，然后倒掉1×Wash Buffer，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；重复3次；

8、向每个孔里面加入200μl TNF-αConjugate，小心盖上一个新的贴膜，在室温下孵育2小时；

9、小心撕去贴膜，倒掉微孔板里面的液体，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；向每个孔里面加入300μl 1×Wash Buffer，然后倒掉1×Wash Buffer，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打几次；重复3次；

10、向每个孔里面加入200μl Substrate Solution，在室温避光的条件下放置30分钟；再向每个孔里面加入50μl Stop Solution；

11、读取OD值：把微孔板放入酶标仪(Thermofisher，Multiscan)中，然后设置酶标仪程序,在波长为450nm处检测吸光度，并进行数据分析；

12、结果减去培养基空白组的OD值的平均值后利用Origin软件，以标准曲线各点的理论浓度为X轴，以吸光值为Y轴，两边同时进行对数转换，四参数法进行拟合，绘制标准曲线，输入样本的吸光值，计算出样本的TNF-α浓度值。

使用上述方法测定外泌体抑制PBMC分泌TNF-α水平，结果：

阴性组TNF-α水平为802.2pg/ml，

对照组TNF-α水平为5203.7pg/ml，

实施例2、实施例2a、实施例2b试验组的TNF-α水平为1193～1386pg/ml例如实施例2试验组的TNF-α水平为1237.4pg/ml，

实施例3、实施例3a、实施例3b试验组的TNF-α水平为1142～1292pg/ml例如实施例3试验组的TNF-α水平为1174.3pg/ml，

实施例3c和实施例3d试验组的TNF-α水平在1246～1423pg/ml范围内。

实施例8：RT-PCR分析外泌体对PBMC的TNF-α基因表达水平的抑制作用

1、PBMC总RNA的提取：将实施例7，步骤2中共培养5天后的各组(实验组、对照组、阴性组)PBMC细胞1ml从24孔板中吸出，置于1.5ml的EP管中，300g，离心5分钟后吸弃上清液，沉淀加入1ml的Trizol试剂(Life公司)，室温放置5分钟，充分裂解；

2、将EP管放入高速离心机，4℃，12000rpm，离心5分钟后，弃沉淀；

3、加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置15分钟；

4、将EP管放入高速离心机，12000rpm，离心15分钟；

5、吸取上层水相至另一离心管中；添加0.5ml异丙醇溶液，混匀，室温放置10分钟；

6、将EP管放入高速离心机，4℃，12000rpm，离心10分钟后，弃上清，RNA沉淀于管底；

7、添加1mL的75％乙醇溶液，温和震荡离心管悬浮沉淀；

8、将EP管放入高速离心机，4℃，8000rpm，离心5分钟后，弃上清液；室温晾干5～10分钟，用20μl无菌去离子水重悬RNA；

9、用nanodrop仪器检测RNA浓度；

10、反转录cDNA：按照Bestar qPCR kit试剂盒(货号：DBI-2220)操作说明书进行RNA反转录为cDNA；

11、qPCR检测TNF-α基因表达水平：按照Bestar qPCR(SyberGreen)kit(货号：DBI-2043)试剂盒操作说明书进行实时荧光定量PCR检测TNF-α基因表达水平。

实时荧光定量PCR检测TNF-α基因表达水平以相对mRNA水平(倍)表征，阴性组的相对mRNA水平为1，计算其余各组的相对mRNA水平，结果：

对照组的相对mRNA水平为114.6倍，

实施例2、实施例2a、实施例2b试验组的相对mRNA水平为59～71倍例如实施例2试验组的相对mRNA水平为68.3倍，

实施例3、实施例3a、实施例3b试验组的相对mRNA水平为65～77倍例如实施例3试验组的相对mRNA水平为72.4倍，

实施例3c和实施例3d试验组的相对mRNA水平为62～75倍。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.从羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述外泌体具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径；并且所述外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。

2.根据权利要求1的用途，其中所述外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，例如大于75％；和/或，所述外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％，例如大于85％。

3.根据权利要求1的用途，所述外泌体是使用羊膜间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(c)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(d)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(e)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(f)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(g)P2代细胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。

4.根据权利要求1的用途，其中：以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液；以上制备羊膜间充质干细胞的方法中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶；和/或，以上制备羊膜间充质干细胞的方法步骤(e)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。

5.根据权利要求1的用途，其中：

步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P6代的细胞；

步骤(1)中，所述培养瓶中以(0.5～5)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)×10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞；

步骤(1)中，使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)×10^5个细胞例如6×10^5个细胞，添加培养基10～20ml；

步骤(1)中，培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁；和/或，

步骤(1)中，添加IL-1β后继续培养20～30小时例如培养24小时。

6.根据权利要求1的用途，其中：

步骤(3)中，在37℃、2％O₂、5％CO₂培养箱中培养48小时；

步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟；

步骤(4)中，首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟；

步骤(4)中，首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟；

步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟；

步骤(5)中，所得的外泌体悬液置-80℃保存；

步骤(5)中，以步骤(1)之1.2×10^6个细胞获得的外泌体用0.5～5ml无菌PBS重悬，例如用0.5～2ml无菌PBS重悬，例如用1ml无菌PBS重悬；和/或，

步骤(1)中，在添加IL-1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.1～0.2mg/mL例如0.125～0.175mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。

7.使用外泌体调控外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α水平的方法，该方法包括使所述外周血单个核细胞暴露于所述外泌体的操作；其中，所述外泌体如权利要求1～6任一项所述。

8.使用羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径；并且其表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。

9.根据权利要求8的外泌体，其具有如权利要求1～6任一项所述特征。

10.使用羊膜间充质干细胞分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将羊膜间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(a)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；

(b)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；

(c)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；

(d)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：

滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×10⁶个细胞接种于75cm²培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；

组织块部分：将收集的组织块置于75cm²培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO₂、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；

(e)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；

(f)纯化培养和传代：以5000～15000个/cm²的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；

(g)P2代细胞再以步骤(f)的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3～P8代间充质干细胞；

(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；

(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％O₂、5％CO₂培养箱中培养42～56小时；

(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：

以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；

以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；

以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；

(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体；进一步的，该方法具有如权利要求1～6任一项所述特征。

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