CN109706180A

CN109706180A - 一种脐带间充质干细胞过表达ido增强免疫抑制的方法及应用

Info

Publication number: CN109706180A
Application number: CN201910025708.5A
Authority: CN
Inventors: 陈相波; 雷鸣; 田朋飞
Original assignee: Hangzhou Rong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Rong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2019-05-03

Abstract

为了解决现有技术存在的干细胞免疫抑制能力有限的问题，本发明涉及成体干细胞与细胞治疗领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及一种脐带间充质干细胞过表达IDO增强免疫抑制的方法。该方法包括构建过表达IDO基因的慢病毒，通过慢病毒转染体系构建过表达IDO的脐带间充质干细胞，并加入基因开启剂；并用过表达IDO的脐带间脐带间充质干细胞与免疫细胞共培养，大大提高了脐带间充质干细胞的免疫抑制能力；能够减少干细胞临床使用的数量，节省了大量的时间、人力及物力成本。

Description

一种脐带间充质干细胞过表达IDO增强免疫抑制的方法及应用

技术领域

本发明涉及干细胞制备领域，具体地，本发明涉及脐带间充质干细胞过表达IDO增强免疫抑制的方法。

背景技术

近代以来，器官移植已经成为治疗器官功能衰竭的有效手段，但免疫排斥一直是影响器官移植领域最大的问题之一。尽管半相合骨髓移植和去除造血干细胞中αβTCR细胞在治疗移植物抗宿主反应(Graft Versus Host Disease,GVHD)取得了一定的进展，但是其治疗效果还需要进一步的临床研究。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有免疫调节功能，通过细胞间的直接相互作用及分泌细胞因子的间接作用，可以抑制T细胞的增殖及免疫反应，从而发挥免疫重建功能且不存在免疫排斥的副作用。单从MSC被批准用于治疗心肌梗死以来，鲜有MSC用于的临床免疫疾病的治疗。究其原因，最根本还在于临床免疫治疗效果仍不尽如人意。

吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)，是肝脏以外唯一可催化色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶。它通过降解局部组织的色氨酸，色氨酸是T细胞发挥免疫作用的必须氨基酸，IDO介导色氨酸的降解，使局部环境色氨酸含量下降，以抑制T细胞的活性，从而诱发宿主免疫防御、抑制T细胞免疫和实现抗肿瘤免疫。通过构建过表达IDO-MSC，希望在MSC的抑制免疫的基础上，通过IDO加强免疫抑制的效果，能够减少细胞的用量的同时，提高免疫抑制的效果，从而能够在治疗GVHD等免疫抑制性疾病中发挥更佳的功能。

发明内容

本发明的目的是构建过表达IDO的MSC的方法，并应用于制备GVHD等免疫抑制性疾病治疗制剂中的应用，可以达到更强免疫抑制效果，从而为临床应用过表达IDO的UC-MSC进行免疫抑制性疾病的靶向治疗提供依据。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种脐带间充质干细胞过表达IDO增强免疫抑制的方法，包括以下步骤：

1)准备脐带来源的间充质干细胞；

2)构建含有基因开启元件和IDO表达基因的慢病毒载体，并通过共转293V细胞获得含有IDO基因的慢病毒；

3)选择步骤1)中第2～3代处于对数生长期的细胞，用步骤2)中的慢病毒和辅助慢病毒进行转染，并通过筛选和鉴定过表达IDO的间充质干细胞；

4)选择步骤1)中第3～4代处于对数生长期的细胞，与免疫细胞进行共培养，用以确定过表达IDO基因的间充质干细胞的免疫抑制能力。

进一步地，所述步骤1)中的脐带原代分离、扩增、培养均在符合GMP实验室系统内进行，在净化室内(B级)内的生物安全柜内进行(相当于A级)。

进一步地，所述步骤中脐带组织中间充质干细胞分离、扩增的具体步骤如下：无菌条件下取得脐带组织，组织经生理盐水清洗3次后，去除残留的血细胞，把脐带剪成2cm左右的片段并剔除血管，取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1mm³的组织块，然后置于培养瓶中，6h后加入10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，7天后换液，此后每隔3天换液1次。观察贴壁组织周围细胞生长个的状况，当细胞达到80-90％融合时，用胰酶消化、传代，依此法传代2-3次，达到纯化和扩增脐带间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。

进一步地，脐带来源的间充质干细胞特征在于：取细胞融合达80-90％的第2～3代间充质干细胞制备单细胞悬液，采用流式细胞术检测CD105、CD90、CD73、CD34、CD45、CD19、CD11b和HLA-DR，具有间充质干细胞的基本特性。

进一步地，所述步骤2)中所用慢病毒载体为pLV-TRE3G-Cas9-Puro，通过双酶切的方法将其中Cas9基因替换为IDO基因从而构建pLV-TRE3G-IDO-Puro载体，将pLV-TRE3G-IDO-Puro载体与pH1和pH2辅助质粒通过Polyfect-V转染试剂共转入293V细胞中，从而获得过表达IDO基因的慢病毒。

优选地，所述脐带组织为足月妊娠分娩胎儿脐带组织，所述IDO基因为human-IDO基因。

优选地，慢病毒载体pLV-TRE3G-IDO-Puro与辅助质粒按照质量比为5:3.75:1.25。

优选地，293V细胞接种前的密度为90％，培养条件为DMEM高塘培养基和10％胎牛血清，5％CO₂37℃培养。

优选地，转染4-6h，用10ml新鲜完全培养基换液，转染后24小时，用10ml含1mM丙酮酸钠的完全培养基换液，48～72h收集细胞上清。

进一步地，将制备的过表达IDO基因的慢病毒与pLV-TetON3G-Neo慢病毒，共同感染间充质干细胞，通过嘌呤霉素和G418筛选，从而获得Dox启动的IDO过表达间充质干细胞。

优选地，pLV-TRE3G-IDO-Puro慢病毒与pLV-TetON3G-Neo慢病毒的比例为1:1。

优选地，G418的筛选浓度为200-500μg/ml，嘌呤霉素的筛选浓度为2～6μg/ml。

优选地，Dox的诱导IDO表达的浓度为300-500ng/ml，每48h补充Dox。

进一步地，通过对间充质干细胞中的IDO基因进行RT-qPCR的方法来鉴定过表达IDO的间充质干细胞；

进一步地，所述步骤中RT-qPCR的具体步骤如下：IDO-MSC采用荧光定量PCR鉴定IDO的表达：消化收集细胞后，采用Roche公司的TitanOneTubeRT-PCR试剂盒进行RT-RNA的抽提和逆转录，并采用Fragment的ThermoFisher公司的AppliedBiosystem^TM SYBR^TM试剂盒在ABI7500荧光定量PCR仪上进行定量PCR分析。PCR体系为：SYBR-10μL；IDO上下游引物各2μL；ROX2-0.4μL；水-1.6μL；模板-4μL；PCR反应条件为：94℃预变性30s，随后94℃5s，60℃30s，40个循环。

进一步地，所用鉴定IDO基因的qPCR引物序列如下：

IDO-F:5’-AAAGGCAACCCCCAGCTATC-3’

IDO-R:5’-GGAACTGAGCAGCATGTCCT-3’

进一步地，所述的免疫抑制活性评估方法采用与免疫细胞共培养的方法，步骤如下：

①将相应的IDO-UCMSC或UCMSC、DC细胞、T细胞计数后，分别调整细胞密度为1×10⁶个/mL。

②按照1:1:1的比例混合培养，培养时加入LPS(5μg/mL)，共培养48h后进行流式检测。

③实验分组：过表达IDO干细胞组1：IDO-UCMSC与DC细胞共培养，IDO-UCMSC与T细胞共培养，IDO-UCMSC与DC和T细胞共培养；过表达GFP干细胞组2：GFP-UCMSC与DC细胞共培养，GFP-UCMSC与T细胞共培养，GFP-UCMSC与DC和T细胞共培养；干细胞组3：UCMSC与DC细胞共培养，UCMSC与T细胞共培养，UCMSC与DC和T细胞共培养；DC细胞实验组4；T细胞实验组5；DC细胞核T细胞共培养组6。

④共培养48小时后，通过流式细胞术检测免疫细胞活性相关表面标志物CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62，通过液相芯片技术检测免疫细胞分泌的细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-18、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等，用来反映表达IDO的UCMSC调节免疫细胞活性及细胞因子分泌的能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

目前，干细胞技术用于治疗器官移植后多器官衰竭是一个有效的手段，目前受限于干细胞在体内存活时间和免疫抑制效果的限制，干细胞一直未能在免疫排斥领域并不成功，一个重要的原因就是调节免疫抑制能力的较弱，通过在间充质干细胞中表达IDO基因，用来增强MSC的免疫抑制能力，本发明通过慢病毒转染体系构建过表达IDO的脐带间充质干细胞，并加入基因开启剂；并用过表达IDO的脐带间脐带间充质干细胞与免疫细胞共培养，大大提高了脐带间充质干细胞的免疫抑制能力；能够减少干细胞临床使用的数量，节省了大量的时间、人力及物力成本。

附图说明

图1为脐带间充质流式细胞仪鉴定结果图；

图2为构建IDO-UCMSC慢病毒目标载体和辅助载体说明示意图；

图3为IDO-UCMSC和UCMSC中IDO基因表达丰度的RT-PCR结果示意图；

图4为不同实验组MSC细胞与DC细胞共培养48h后流式细胞检测结果示意图；

图5为不同实验组MSC细胞与DC和T细胞共培养48h后流式细胞检测结果示意图；

图6为不同实验组MSC细胞与T细胞共培养48h后流式细胞检测结果示意图；

图7为不同实验组MSC细胞与T细胞共培养48h后细胞上清中细胞因子液相芯片结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，其只作为范例，本发明并不限制的保护范围于。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

下列实例中所述的方法如果特殊说明，均为常规方法。所述实例中所需要的试剂耗材，如果特殊说明，均可在市场购得。实例中的各种生物材料取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应该对本发明生物材料来源的限制。

准备脐带来源的间充质干细胞：

无菌条件下取得脐带组织，组织经生理盐水清洗3次后，去除残留的血细胞，把脐带剪成2cm左右的片段并剔除血管，取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1mm3的组织块，然后置于培养瓶中，6h后加入10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，7天后换液，此后每隔3天换液1次。观察贴壁组织周围细胞生长个的状况，当细胞达到80-90％融合时，用胰酶消化、传代，依此法传代2-3次，达到纯化和扩增脐带间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。

取细胞融合达80-90％的第2～3代间充质干细胞制备单细胞悬液，1000rpm5min分钟收集细胞，用磷酸缓冲液PBS细胞浓度调整为1.0×10⁷/ml，通过BD试剂盒HumanMSCAnalysisKit(BD,562245)将细胞与流式抗体在PBS中染色后，并在BeckmanFlexLV流式细胞仪上进行流式细胞检测，如图1所示，所得脐带间充质干细胞符合基本的CD105、CD90、CD73阳性以及CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR阴性的标准，具有间充质干细胞的基本特性。

慢病毒载体及基因开启技术构建过表达IDO-UCMSC：

本发明中所使用的慢病毒载体是pLV-TRE3G-Cas9-Puro(北京英茂盛业生物科技有限公司，CR2011)，通过基因合成的方法合成人IDO基因(GenBank:AY221100)，将其通过BamHI和NotI双酶切将Cas9基因替换为IDO基因，可得过表达IDO基因的pLV-TRE3G-IDO-Puro载体；293V细胞培养于10cm培养皿中，培养条件为DMEM高塘培养基和10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，转染前24小时，将293V细胞以4-5×10⁶/10cm平皿密度接种，加入10ml293V培养基37℃，5％CO2培养，细胞转染前密度应达到90％，将慢病毒载体pLV-TRE3G-IDO-Puro与辅助质粒按照质量比5:3.75:1.25，同时20μl Polyfect-V转染试剂，加入到终体积500μl DMEM无血清培养基中，充分混匀，室温孵育转染混合液15分钟。将1ml转染混合液逐滴加入293V细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀，37℃培养4-6小时，用10ml新鲜完全培养基换液，转染后24小时，用10ml含1mM丙酮酸钠的完全培养基换液。转染后48、72小时收集细胞培养上清，500g离心10min去除细胞碎片。该上清可以直接用于慢病毒感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。构建的pLV-TRE3G-IDO-Puro和pLV-TetON3G-Neo慢病毒载体如图2所示。

建立完整的IDO诱导表达系统，按照病毒1:1的比例同时转染脐带间充质干细胞pLV-TRE3G-IDO-Puro和pLV-TetON3G-Neo慢病毒，首先用TetON3G慢病毒转导间充质干细胞，然后用200-500μg/ml G418进行单克隆筛选，选出TetON3G高表达的克隆，然后用TRE3G-IDO慢病毒转导表达TetOn3G的克隆，使用2～6μg/ml嘌呤霉素选择双转导的间充质干细胞。

强力霉素诱导IDO-UCMSC过表达IDO蛋白：

在没有Dox(Doxycline)存在的情况下，TetOn3G蛋白不能与TRE3G启动子结合。加入Dox后，TetOn3G蛋白构象发生改变，结合到TRE3G启动子，启动IDO蛋白表达。Dox的使用浓度为100-1000ng/ml,采用TRE3G-EGFP对照基因做Dox浓度梯度诱导实验，确定最佳诱导浓度为300-500ng/ml。Dox在培养基中半衰期为24小时，为持续表达，需要每48小时补充Dox。

IDO-UCMSC采用荧光定量PCR鉴定IDO的表达：

48小时后，消化收集IDO-UCMSC细胞后，采用Roche公司的Titan One Tube RT-PCR试剂盒进行RT-RNA的抽提和逆转录，并采用Fragment的ThermoFisher公司的AppliedBiosystem^TMSYBR^TM试剂盒在ABI7500荧光定量PCR仪上进行定量PCR分析。PCR体系为：SYBR-10μL；IDO上下游引物各2μL；ROX2-0.4μL；水-1.6μL；模板-4μL；PCR反应条件为：94℃预变性30s，随后94℃5s，60℃30s，40个循环。如图3所示，IDO-UCMSC实验组相对于UCMSC组来说，IDO基因表达丰度是对照组的71907.32倍(P＜0.05)。

DC细胞核T细胞的分离培养：

从健康志愿者取外周血10mL，采用STEMCELL SepMate^TM新型离心管和Lymphoprep分离液，以1200g离心10min，迅速将管中上清倒出至新的50ml离心管中，从而得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。用Thermo AIM V无血清免疫细胞培养液悬浮PBMC细胞，加入GM-CSF(20ng/ml)、IL4(10ng/ml)、青霉素和链霉素(1mL/L)，37℃5％CO₂培养箱中培养。隔天半量换液、全量换细胞因子，培养10天后可见聚集成团的半悬浮状态的DC细胞。其鉴定标准为OX62阳性细胞并采用电镜进行形态学检测。

取PBS稀释为5×10⁷cells/ml的PBMCs细胞，加入到5ml流式Falcon管中，加入50μL(浓度为50μL/ml)EasySep^TM Human T Cell Isolation Cocktail，常温下静置5min。加入40μL EasySep^TM Dextran RapidSpheres^TM磁珠，用PBS定容至2.5mL。将Falcon管开盖放入EasySep^TM Magnet磁珠分选器中，常温静置3min，进行磁珠负选。拿住磁珠分选器，将液体倒入新洁净离心管中。1200rpm离心3min，倒掉上清液，底层即分离提纯的T细胞。

IDO-UCMSC与免疫细胞共培养：

将相应的IDO-UCMSC或UCMSC、DC细胞、T细胞计数后，分别调整细胞密度为1×10⁶个/mL。按照1:1:1的比例混合培养，培养时加入LPS(5μg/mL)，共培养48h后进行流式检测。实验分组：过表达IDO干细胞组1：IDO-UCMSC与DC细胞共培养，IDO-UCMSC与T细胞共培养，IDO-UCMSC与DC和T细胞共培养；过表达GFP干细胞组2：GFP-UCMSC与DC细胞共培养，GFP-UCMSC与T细胞共培养，GFP-UCMSC与DC和T细胞共培养；干细胞组3：UCMSC与DC细胞共培养，UCMSC与T细胞共培养，UCMSC与DC和T细胞共培养；DC细胞实验组4；T细胞实验组5；DC细胞核T细胞共培养组6。。

共培养48小时后，用Beckman CytoFlex LV流式细胞仪检测共培养细胞中的表面标志物，其中1A、2A、3A、4A组检测CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62。1B、2B、3B、4B组检测Treg和CD3、CD4、CD8共表达量。1C、2C、3C、4C组检测CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62和Treg、CD3、CD4、CD8。Treg需同时表达CD4、CD25和Foxp3。如图4所示，IDO-UCMSC+DC实验组CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA+CD45RB、CD45RA、OX62表达量最低，与其他各组具有显著性差异(P＜0.05)，同时该组CD274(PD-L1)表达量最高，与其他各组有显著性差异(P＜0.05)，表明DC细胞的免疫耐受性增强，活化能力减弱。如图5所示，IDO-UCMSC+DC&T实验组与IDO-UCMSC+DC组结果相似。如图6所示，IDO-UCMSC+T实验组Treg表达量最高，与其他组差异显著(P＞0.05)，同时该组CD8+细胞表达量最低，与其他组差异显著(P＞0.05)，CD4+细胞表达量无显著差异。这些结果都表明，过表达IDO提高了UCMS对如DC细胞或T细胞等免疫细胞有显著的免疫抑制效果

同样地，在相应时间点取其共培养48小时后的细胞培养液上清，用于Merck公司RECYTMAG-65K-07和TGFBMAG-64K-03试剂盒，在Luminex200^TM液相芯片分析平台上对上清液中的IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-18、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等细胞因子的表达量进行液相芯片检测。如图7所示，IDO-UCMSC+DC&T实验组上清中IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-2、IFN-γ、IL-18的表达量降低，而IL-10、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的表达量升高，与其他各组差异显著(P＜0.05)。通过分泌细胞因子表达量的检测结果也可知，表达IDO基因的MSC均对如DC细胞或T细胞等免疫细胞有显著的免疫抑制效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种脐带间充质干细胞过表达IDO增强免疫抑制的方法，包括以下步骤：

(1)准备脐带来源的间充质干细胞：无菌条件下取得脐带组织，组织经生理盐水清洗3次后，去除残留的血细胞，把脐带剪成2cm左右的片段并剔除血管，取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1mm³的组织块，然后置于培养瓶中，6h后加入10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，7天后换液，此后每隔3天换液1次。观察贴壁组织周围细胞生长个的状况，当细胞达到80-90％融合时，用胰酶消化、传代，依此法传代2-3次，达到纯化和扩增脐带间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；

(2)构建含有基因开启元件和IDO表达基因的慢病毒载体：将扩增的IDO基因替换慢病毒包装质粒pLV-TRE3G-Cas9-Puro中的Cas9，构建pLV-TRE3G-IDO-Puro重组慢病毒包装质粒，将其通过与辅助质粒共转293V细胞，获得表达IDO慢病毒；

(3)通过pLV-TRE3G-IDO-Puro慢病毒和pLV-TRE3G-IDO-Puro慢病毒共感染体系构建过表达IDO脐带间充质干细胞，且通过强力霉素DOX基因开启IDO基因的表达。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于：所述脐带组织为足月妊娠分娩胎儿脐带组织，所述IDO基因为human-IDO基因。

3.如权利要求1所述方法，携带IDO基因的脐带来源的间充质干细胞，其特征在于：取细胞融合达80-90％的第2～3代间充质干细胞制备单细胞悬液，采用流式细胞术检测CD105、CD90、CD73、CD34、CD45、CD19、CD11b和HLA-DR，具有间充质干细胞的基本特性。

4.如权利要求1所述方法，携带IDO基因的脐带来源的间充质干细胞，其特征在于：可提高间充质干细胞对免疫细胞的抑制效果。

5.如权利要求1所述方法，携带IDO基因的脐带来源的间充质干细胞在制备免疫抑制性疾病治疗制剂中的应用。

6.如权利要求3～5任一所述的应用，其特征在于：所抑制的细胞为CD8+T细胞，DC细胞。

7.如权利要求1～6之一所述的利用IDO制备具有增强免疫抑能力干细胞T的方法，以及获得的干细胞或细胞系或其次代培养物。