CN117210404A - 一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法 - Google Patents
一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117210404A CN117210404A CN202311119478.1A CN202311119478A CN117210404A CN 117210404 A CN117210404 A CN 117210404A CN 202311119478 A CN202311119478 A CN 202311119478A CN 117210404 A CN117210404 A CN 117210404A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- peripheral blood
- autologous
- medium
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims abstract description 11
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims abstract description 11
- NKHAVTQWNUWKEO-UHFFFAOYSA-N fumaric acid monomethyl ester Natural products COC(=O)C=CC(O)=O NKHAVTQWNUWKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- NKHAVTQWNUWKEO-NSCUHMNNSA-N monomethyl fumarate Chemical compound COC(=O)\C=C\C(O)=O NKHAVTQWNUWKEO-NSCUHMNNSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229940005650 monomethyl fumarate Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- -1 CD antibody Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 18
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 abstract 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 1
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000589301 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 102000014823 calbindin Human genes 0.000 description 1
- 108060001061 calbindin Proteins 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002637 fluid replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基以及体外培养方法摘要：本发明公开了一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基以及体外培养方法。通过淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞，将分离的单个核细胞加入到含环孢霉素A、CD336抗体、CD337抗体、IL‑2、IL15、IL21、灭活自体血浆的无血清免疫细胞培养基中培养3天；之后用含IL‑2、IL15、灭活自体血浆的无血清免疫细胞培养基继续培养至第11天，第13天用含富马酸单甲酯、IL‑2、IL15、IL21、灭活自体血浆的无血清免疫细胞培养基培养，第14～16天即可收获细胞，所收获的NK细胞纯度、杀伤活性高于现有方法。本发明用环孢霉素A抑制T细胞、B细胞增殖，用CD336抗体、CD337抗体活化、刺激NK细胞增殖，用富马酸单甲酯增强NK细胞杀伤活性，并协同IL‑2、IL15、IL21促进NK细胞增殖，能够克服现有外周血自体NK细胞培养的不足之处，可以提高外周血自体NK细胞纯度，增强NK细胞杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于NK细胞培养技术领域，涉及一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基以及体外培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NK)，是一种CD3-CD56+淋巴细胞，是非特异性免疫系统的重要组成部分，以MHC(major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体)限制方式对恶性肿瘤和被病毒感染的细胞具有细胞毒作用，所以不识别靶细胞特异性的肿瘤抗原，但功能上类似于T淋巴细胞。精确调节NK细胞活化和抑制信号之间的平衡能介导细胞的溶解反应。NK细胞上的抑制信号是通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)主要通过与靶细胞上表达的MHC I类分子的相互作用。与此相反，NK细胞表面各种活化受体能介导激活信号，例如NKG2D，NKp30下(CD337)，NKp44(CD336)，和NKP46。所以，增强NK细胞活化受体表达或者减少肿瘤细胞MHC的表达能促进NK细胞介导的对肿瘤的杀伤作用。
现在有许多细胞免疫疗法是从外周血单个核细胞(PBMC)中提取NK细胞，并将其在体外大量扩增后用于患者回输，但是不使用饲养细胞难以在体外扩增临床所需的大量NK细胞，这是因为把饲养细胞作为人工抗原呈递细胞，如辐照的外周血单核细胞(PBMC)，基因修饰的K562细胞和存在Epstein-Barr病毒转化的类淋巴母细胞系(EBV-LCL)，能够增强NK细胞的增殖能力。特别是，以K562为基础的人工抗原呈递细胞的表达IL-21诱导以PBMC为起始细胞的NK细胞培养技术，培养21天可以获得增殖倍数的中位数为30853。然而，一些研究人员认为，用饲养细胞扩增的NK细胞这项技术是有问题的。例如，有人担心NK细胞的培养时间要长达21天，在输注后，由于已经脱离了饲养细胞对NK细胞提供培养的最佳环境，导致NK细胞的体内存活期缩短和细胞毒作用降低。为此，研究人员发展了纯因子的NK培养法，剔除了饲养细胞，但随之出现了NK细胞纯度低的缺点，这是由于PBMC中除了含有5～10％的NK细胞外，占据主要含量的是T细胞、B细胞，这些因子在刺激NK细胞增殖的同时，也在刺激T细胞、甚至B细胞增殖。
为解决上述问题，本发明提出了一种抑制T细胞和B细胞增殖、刺激NK细胞增殖、提高NK细胞杀伤活性的培养方法，以解决NK细胞纯度低的问题。
环孢霉素A是一种强效免疫抑制剂，其发挥作用的主要机制是环孢霉素A与亲环孢素形成复合物再与依赖钙/钙结合蛋白的钙调磷酸酶作用，抑制NF-AT的去磷酸化使其不能进入核内，从而抑制IL-2的产生，导致T细胞、B细胞的生成受抑制。NKp30(CD337)和NKp44(CD336)是NK细胞上的活化受体，激活这两类受体可刺激NK细胞增殖。富马酸单甲酯通过NK细胞脱颗粒和NKp46和CD107a的表达上调来增强NK细胞对肿瘤细胞的裂解能力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有外周血自体NK细胞培养的不足之处，提供一种高纯度外周血NK细胞培养基以及体外培养方法，可以提高外周血自体NK细胞纯度，增强NK细胞杀伤活性。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基(包括但不限于Corning581培养基等)，所述添加物包括：环孢霉素A、CD337抗体、CD336抗体、富马酸单甲酯、自体血浆、IL-2、IL-15、及IL-21。
所述无血清免疫细胞培养基在所述NK细胞培养基中的体积百分数为90～99％。
所述自体血浆在所述NK细胞培养基中的体积百分数为1～10％。
优选地，其他各添加物在上述NK细胞培养基中的占比为：
本发明还提供了一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，包含以下技术步骤：
(1)应用淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞；
(2)将分离的单个核细胞加入到培养基A中培养3天，培养基A为添加有环孢霉素A、CD336抗体、CD337抗体、IL-2、IL-15、IL-21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(3)培养至第3天，补充一次培养基B进行培养，培养基B为添加有IL-2、IL-15及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(4)此后每2天补充一次培养基B，直至第11天；
(5)第13天，补充一次培养基C，培养基C为添加有富马酸单甲酯、IL-2、IL-15、IL-21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(6)第14～16天收获细胞。
优选地，所述培养基A中含有30ng/mL环孢霉素A、50ng/mLCD336抗体、50ng/mLCD337抗体、100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、10％自体血浆及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。
优选地，所述培养基B中含有100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、5％自体血浆及95％v/v的无血清免疫细胞培养基。
优选地，所述培养基C中含有100ng/mL富马酸单甲酯、100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、1％自体血浆及99％v/v的无血清免疫细胞培养基。
优选地，步骤(1)包括：
1)将外周血转入离心管中800g离心10min，吸取上层部分获得自体血浆，备用；
2)将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温700g离心30min；
3)吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下500g离心10min，重复两次，离心沉淀即为外周血单个核细胞；
4)自体血浆56℃放置40min，灭活血浆中的补体；4℃放置20min，1200g离心15min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用。
优选地，步骤(2)—步骤(6)中NK细胞均在37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
优选地，步骤(2)中，用培养基A将细胞密度调整为2×106/ml。
优选地，步骤(3)—步骤(5)中，如果细胞密度>1×106/ml，用培养基B将细胞密度调整至1×106/ml。
优选地，步骤(6)中，如果细胞密度>1×106/ml，用培养基C将细胞密度调整至1×106/ml。
本发明的创新之处在于：
⑴无需滋养层细胞无致瘤风险，可快速实现NK细胞的高纯度扩增。
⑵NK细胞纯度高，可达到86％。
⑶获得的NK细胞杀伤力强。
附图说明
图1流式细胞术检测本发明与现有方法NK细胞纯度结果图。
图2本发明与现有方法NK细胞杀伤活性对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行说明，以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可以借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改，均落在本发明的保护范围内。
本发明提供的实施例中所应用的耗材和试剂均可从商业途径；且不同来源对产品性能不具有显著性影响。
实施例
本实施例的主要步骤如下：
1.外周血单个核细胞的分离和血浆的准备
1)用肝素钠采血管采集健康人30ml外周血，转入50ml离心管中800g离心10min，吸取上层部分获得自体血浆，备用；
2)将生理盐水与血细胞沉淀以1：1体积稀释，吹打混匀；
3)取15ml淋巴细胞分离液(Ficoll)注入50ml离心管中，将稀释的血液缓慢加到Ficoll层上，室温700g离心30min；
4)吸出离心后的白膜层，用PBS缓冲液重悬白膜层细胞，室温下500g离心10min，重复两次，离心沉淀即为外周血单个核细胞；
5)自体血浆56℃放置40min，灭活血浆中的补体；4℃放置20min，1200g离心15min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用。
2.细胞接种(Day0)
1)配制培养基A：含30ng/mL环孢霉素A、50ng/mLCD336抗体、50ng/mLCD337抗体、100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、10％自体血浆及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。
2)用10ml培养基A重悬上述PBMC细胞，并进行细胞计数，将细胞密度调整为2×106/ml。
3)将细胞悬液移至T75细胞培养瓶，把培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中静置培养，在前3天培养中勿移动细胞培养瓶。
3.细胞扩增(Day3—Day11)
1)配制培养基B：含100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、5％自体血浆及95％v/v的无血清免疫细胞培养基。
2)用移液管将细胞团吹打成单个细胞，计数，加入一定量培养基B，使终浓度为1×106/ml。
3)把培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
4)每2天补充一次培养基B，使补液后细胞密度为1×106/ml。
4.细胞收获(Day13—Day16)
1)配制培养基C：含100ng/mL富马酸单甲酯、100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、1％自体血浆及99％v/v的无血清免疫细胞培养基。
2)用移液管将细胞团吹打成单个细胞，计数，加入一定量培养基C，使终浓度为1×106/ml。
3)把培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
4)第14—16天即可收获细胞进行检测。
对比例
采用现有的纯因子培养方法，即用50ng/ml CD16抗体包被T75培养瓶，4℃冰箱平放过夜。次日，取健康人外周血，经过分离血浆、取PBMC、洗涤细胞等步骤，计数后按照2×106/ml的密度将细胞接种于包被好的培养瓶中。完全培养基为含100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、10％自体血浆及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。第3天至第13天补液时加入上述完全培养基，使细胞终浓度为1×106/ml，每2天补液一次。第14—16天收获细胞进行检测。
检测项目1：NK细胞纯度检测
NK细胞采用流式细胞法进行表型分析，APC-H7标记的anti-CD3，PE标记的anti-CD56，两种抗体与NK细胞孵育后，用流式细胞仪进行检测。结果显示，实施例培养的NK细胞纯度(CD3-CD56+指标)达到86％，而对比例培养的NK细胞纯度仅仅只有35％。
检测项目2：NK细胞杀伤活性检测
采用Promega CytoTox96杀伤检测试剂盒检测NK细胞对靶细胞K562肿瘤细胞的杀伤效果，NK细胞与靶细胞的比例为10：1、20：1、40：1，检测方法参照上述试剂盒说明书。结果显示，在各个比例，本实施例培养的NK细胞比对比例培养的NK细胞具有更强的杀伤活性。
结果表明，相比现有的纯因子NK细胞培养方法，本发明提供的高纯度外周血自体NK细胞培养基及其培养方法培养的NK细胞纯度更高，杀伤活性更强，具有更好的临床应用价值。
以上所诉仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基，所述添加物包括：环孢霉素A、CD337抗体、CD336抗体、富马酸单甲酯、自体血浆、IL-2、IL-15、及IL-21。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基，其特征在于，所述无血清免疫细胞培养基在所述高纯度的外周血自体NK细胞培养基中的体积百分数为90-99％。
3.根据权利要求1或2所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞培养基，其特征在于，各添加物在所述高纯度的外周血自体NK细胞培养基中的占比为：
4.一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，包包含以下技术步骤：
(1)应用淋巴细胞分离液从外周血中分离单个核细胞；
(2)将分离的单个核细胞加入到培养基A中培养3天，培养基A为添加有环孢霉素A、CD336抗体、CD337抗体、IL-2、IL-15、IL-21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(3)培养第3天至第11天，每隔2天补充一次培养基B，培养基B为添加有IL-2、IL-15及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(4)第13天，补充一次培养基C，培养基C为添加有富马酸单甲酯、IL-2、IL-15、IL-21及自体血浆的无血清免疫细胞培养基；
(5)第14～16天收获细胞。
5.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基A中含有30ng/mL环孢霉素A、50ng/mLCD336抗体、
50ng/mLCD337抗体、100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、10％自体血浆及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。
6.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基B中含有100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、5％自体血浆及95％v/v的无血清免疫细胞培养基。
7.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基C中含有100ng/mL富马酸单甲酯、100ng/mL的IL-2、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-21、1％自体血浆及99％v/v的无血清免疫细胞培养基。
8.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(1)包括：
1)将外周血转入离心管中800g离心10min，吸取上层部分获得自体血浆，备用；
2)将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温700g离心30min；
3)吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下500g离心10min，重复两次，离心沉淀即为外周血单个核细胞；
4)自体血浆56℃放置40min，灭活血浆中的补体；4℃放置20min，1200g离心15min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用。
9.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(2)—步骤(5)中NK细胞均在37℃、5％CO2培养箱中静置培养。
10.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，用培养基A将细胞密度调整为2×106/ml。
11.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(3)中，如果细胞密度>1×106/ml，用培养基B将细胞密度调整至1×106/ml。
12.根据权利要求4所述的一种高纯度的外周血自体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤(4)中，如果细胞密度>1×106/ml，用培养基C将细胞密度调整至1×106/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311119478.1A CN117210404A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311119478.1A CN117210404A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117210404A true CN117210404A (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=89050387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311119478.1A Pending CN117210404A (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117210404A (zh) |
-
2023
- 2023-08-31 CN CN202311119478.1A patent/CN117210404A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109666640A (zh) | 自然杀伤细胞体外纯培养的方法 | |
| CN104845934B (zh) | 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法 | |
| CN108588022B (zh) | 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法 | |
| CN113151168B (zh) | 一种人nk细胞培养体系及制备方法 | |
| CN112251406A (zh) | 一种nk细胞活化阶段的外泌体分选方法 | |
| CN111394310A (zh) | 一种强免疫调节，强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强nk细胞和其制备方法与试剂盒 | |
| CN108251369B (zh) | 一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途 | |
| CN109706180A (zh) | 一种脐带间充质干细胞过表达ido增强免疫抑制的方法及应用 | |
| WO2022194118A1 (zh) | 一种car-t细胞灌流培养方法 | |
| CN108486039B (zh) | 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法 | |
| US20230015932A1 (en) | Method of generation of lympho-myeloid niches | |
| CN109957543A (zh) | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 | |
| CN111172110B (zh) | 一种脐带血cik细胞的培养方法 | |
| WO2023216799A1 (zh) | 一种人nkt细胞系及其应用 | |
| CN112852728A (zh) | 基于外周血的lcl-nk细胞联合培养方法、细胞及产品 | |
| CN109535241B (zh) | Dc-cik共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用 | |
| CN110862962A (zh) | 一种没食子酸在体外培养扩增nk细胞的方法 | |
| CN114438028B (zh) | 一种体外扩增外周血nk的方法 | |
| CN117210404A (zh) | 一种高纯度的外周血自体nk细胞培养基以及体外培养方法 | |
| CN111690607B (zh) | 一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒及培养方法 | |
| CN110747167B (zh) | 一种半合子bak细胞的制备方法及其应用 | |
| CN112725273A (zh) | 一种nk细胞及其制备方法和应用 | |
| CN108441473B (zh) | 一种体外富集cd8+*t细胞的方法 | |
| CN115678845A (zh) | 肿瘤特异性ctl细胞的培养方法及细胞治疗产品 | |
| US20210087530A1 (en) | Compositions and methods for culturing and expanding cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |