CN111394310A - 一种强免疫调节，强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强nk细胞和其制备方法与试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞和其制备方法及制备试剂盒，其采用Transwell培养体系使用间充质干细胞对活化前的NK细胞进行孵育驯化，从而，Transwell培养体系对间充质干细胞与NK细胞共培养，驯化了NK细胞的免疫调节能力。此外，本发明利用CD16单抗联合IFN‑γ、OK432、IL‑2、IL‑21和IL‑15活化培养NK细胞，IL‑2和烟酰胺扩增培养NK细胞，增强了NK细胞的增殖能力和促进NK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤活性。

Description

一种强免疫调节，强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK 细胞和其制备方法与试剂盒
技术领域
本说明书涉及细胞培养领域，尤其涉及一种强免疫调节，强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞和其制备方法、试剂盒。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，属于我们人体免疫第一道防线，也是人体免疫细胞大家族中的一个重要成员，常年战斗在保卫人体健康的第一线上，被誉为天然免疫核心细胞。NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调解有关，甚至参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。
自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。
NK细胞是一群主要针对肿瘤细胞和病毒感染细胞发挥杀伤活性的免疫细胞，具有无需预先致敏、高效性等特点，在抗肿瘤和抗感染免疫以及调节特异性免疫反应中发挥重要作用。通常认为，NK细胞的功能状态取决于细胞表面一系列活化和抑制性受体信号的平衡，而肿瘤细胞和病毒感染细胞由于失去了NK细胞抑制性受体的配体或过量产生活化性受体的配体而被识别并杀伤。人类主要NK细胞活化性受体包括NKG2D和自然细胞毒性受体(nat—ural cytotoxicity receptors，NCRs)，后者包括NKp46、NKp30和NKp44等。
NK细胞主要分布于外周血、肝脏和脾脏，在人体内NK细胞主要特征为CD3-CD56+淋巴细胞群，其中血液中主要为CD16+CD56dim亚型(根据细胞上CD56分子表达密度的差异，将NK细胞分为CD56dim和CD56bright两个亚群；CD56dim占NK细胞90％以上，主要为细胞毒作用，表达中度亲和力的IL-2受体(IL-2R)，具有更强的杀伤活性；CD56bright可产生大量细胞因子，主要起免疫调节作用，高表达IL-2R)。
IL-2是白细胞介素家族中的重要成员之一，它能促进T细胞增殖，刺激细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的增殖与分化，增强自然杀伤(natural killer，NK)细胞的细胞毒活性。而且，IL-2在生物体内具有显著的抗肿瘤作用。
IFN-γ主要由活化的Th细胞和NK细胞产生，其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子，活化单核细胞、巨噬细胞并增强溶菌活性及分泌IL-1、TNF-α等。IFN-γ还能活化中性粒细胞、NK细胞，刺激血管内皮细胞和白细胞合成的粘附分子，促进Th1细胞发育和抑制TH2细胞活化与增殖，刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变。
OK432制剂是一种作用于肿瘤的药物。是将A群溶血性链球菌(Su株)以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用。能够与单核细胞等的细胞表面TLR结合，活化单核细胞，激活免疫反应。
间充质干细胞(MSCs)因其独特的免疫调节及其他生物学特性,在组织损伤,免疫调控和再生医学领域受到了广泛的研究,并在临床试验中用于治疗一系列免疫相关的疾病.然而,临床试验结果表明,MSCs既可以抑制免疫应答,也可以促进免疫应答,MSCs具有免疫调节的可塑性。
目前，NK细胞的大量获得仍然主要是通过与X射线辐射过的K562作为饲养细胞共培养获得；或者是采用磁珠分选及流式分选。但是这些方法都有明显的缺点。使用饲养细胞无疑引入了外源性的细胞，增加了临床应用的风险；而磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。因此，研发一种低风险、高数量、强杀伤的NK细胞培养方法称为一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞和其制备方法及试剂盒，以提高外周血来源体外NK细胞增殖效率、免疫调节能力及增强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的活性。
在一个实施例中，本发明提供了一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法采用Transwell培养体系进行培养。
进一步地，所述方法使用间充质干细胞对活化前的NK细胞进行孵育驯化。
进一步，所述方法包括配制NK细胞活化培养液和NK细胞增殖培养液。
进一步地，所述NK细胞活化培养液的配制方法为基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、OK432、IL-2、IL-21和IL-15及5ml灭活的血浆。
进一步地，所述NK细胞增殖培养液的配制方法为基础无血清培养基1000ml加入IL-2、烟酰胺及5ml灭活的血浆。
进一步地，所述方法包括在Transwell上室中加入用活化培养液重悬的分离的PBMC，在Transwell下室中加入间充质干细胞和间充质干细胞培养液，PBMC与间充质干细胞的数量比为1：1或2：1。
进一步地，PBMC与间充质干细胞的数量比为1：1。
进一步地，Transwell培养体系的培养时间为12-72小时。
进一步地，Transwell培养体系的培养时间为24小时。
在一个实施例中，本发明提供一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法可以包括：
采用Transwell培养体系使用间充质干细胞对活化前的NK细胞进行孵育驯化；
基于新鲜的肝素抗凝的患者外周血对PBMC进行分离处理；
将分离得到的细胞用配置的活化培养基进行重悬，转移至预处理后的Transwell上室中；
向Transwell下室加入与上室1：1或2：1数量的间充质干细胞，并加入间充质干细胞培养液，将Transwell培养体系置于恒温培养箱中培养12-72小时；
12-72小时后，弃掉下室间充质干细胞，将上室NK细胞转移至CD16单抗预处理的T75培养瓶中，基于设定时长和/或细胞生长情况，向培养瓶中补加活化培养基，随后继续补加增殖培养基；培养预设天数后，收集增殖的NK细胞。
进一步地，所述NK细胞活化培养液的配制方法为基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、OK432、IL-2、IL-21和IL-15及5ml灭活的血浆。
进一步地，所述NK细胞增殖培养液的配制方法为基础无血清培养基1000ml加入IL-2、烟酰胺及5ml灭活的血浆。
在一个实施例中，本发明提供一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法可以包括以下步骤：
步骤1：NK细胞培养瓶预处理：将CD16单抗溶于DPBS中，转移至T75培养瓶中，37℃避光放置3小时，或4℃放置过夜。
步骤2：PBMC分离
子步骤2.1：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。
子步骤2.2：将30ml新鲜的肝素抗凝的患者外周血倒入50ml离心管内，配平，700g/min离心20min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用。
子步骤2.3：上述外周血离心后的下层加入DPBS混匀，定容50ml。各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
子步骤2.4：收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
步骤2.5：NK细胞活化培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、OK432、IL-2、IL-21和IL-15及5ml上述灭活的血浆。
NK细胞增殖培养液的配制：基础无血清培养基1000ml加入IL-2、烟酰胺及5ml上述灭活的血浆。
步骤2.6：NK细胞培养：将步骤2.4得到的细胞用NK细胞活化培养液重悬，转移Transwell上室中，每孔接种1×105或5×104个细胞。
步骤2.7：间充质干细胞(MSCs)培养液配置：基础培养基加入3％的血清替代物。
步骤2.8：MSCs培养：从细胞库取出P3-P5代细胞，复苏，用配置的MSCs培养液重悬细胞，转移Transwell下室中，每孔接种1×105个细胞。将Transwell培养体系置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养12-72小时。
步骤2.9：培养12-72小时后，取出预处理的T75培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤2.6Transwell上室的细胞转移至T75培养瓶中，用少量新鲜NK细胞活化培养液清洗上室残留的细胞，避免浪费，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养。下室间充质干细胞弃掉。
步骤2.10：视生长情况，适量的补充新鲜的NK增殖培养液进行培养。
步骤2.11：NK细胞收集：培养15天后，收集NK细胞悬液，2000rpm×10min离心后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。
在一个实施方式中，Transwell上室细胞与Transwell下室细胞1：1混合培养24小时。
在一个实施方式中，本发明提供一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备试剂盒，所述试剂盒包括Transwell培养体系。
进一步地，所述试剂盒包括对活化前的NK细胞进行孵育驯化的间充质干细胞。
进一步地，所述试剂盒包括NK细胞活化培养液和NK细胞增殖培养液。
进一步地，所述NK细胞活化培养液包括基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、OK432、IL-2、IL-21和IL-15及5ml灭活的血浆。
进一步地，所述NK细胞增殖培养液包括基础无血清培养基1000ml加入IL-2、烟酰胺及5ml灭活的血浆。
在一个实施方式中，本发明提供一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞，其根据上述方法制备或采用上述试剂盒制备。
有益效果
本发明取得的有益效果如下：
1.本发明采用Transwell培养体系将间充质干细胞与NK细胞共培养，驯化了NK细胞的免疫调节能力。
2.本发明利用CD16单抗联合IFN-γ、OK432、IL-2、IL-21和IL-15活化培养，IL-2和烟酰胺扩增培养，增强了NK细胞的增殖能力，增强了NK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤活性。
附图说明
图1是根据本发明的实施例1，培养15天后，收集前通过显微镜观察到的NK细胞的示意图。
图2是根据本发明实施例1的NK细胞生长曲线图。
图3是根据本发明实施例1的NK细胞活化受体表达示意图，其中系列1为培养前细胞活化受体的表达率，系列2为培养后细胞活化受体的表达率。
图4是根据本发明实施例1的NK细胞免疫表型CD3-CD56+的表达示意图。
图5是根据本发明实施例1的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性示意图。
图6是根据本发明的实施例2，培养21天后，收集前通过显微镜观察到的NK细胞的示意图。
图7是根据本发明实施例2的NK细胞生长曲线图。
图8是根据本发明实施例2的NK细胞活化受体表达示意图，其中系列1为培养前细胞活化受体的表达率，系列2为培养后细胞活化受体的表达率。
图9是根据本发明实施例2的NK细胞免疫表型CD3-CD56+的表达示意图。
图10是根据本发明实施例2的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性示意图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
实验组
实验操作可以包括以下步骤：
步骤1：NK细胞培养瓶预处理：将CD16单抗溶于DPBS中，转移至T75培养瓶中，37℃避光放置3小时，或4℃放置过夜。
步骤2：PBMC分离
子步骤2.1：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。
子步骤2.2：将30ml新鲜的肝素抗凝的患者外周血倒入50ml离心管内，配平，700g/min离心20min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用。
子步骤2.3：上述外周血离心后的下层加入DPBS混匀，定容50ml。各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
子步骤2.4：收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
步骤2.5：NK细胞活化培养液的配制：基础无血清培养基100ml加入IFN-γ(1000IU/ml)、OK432(100ng/ml)、IL-2(1000IU/ml)、IL-21(50ng/ml)和IL-15(50ng/ml)及5ml上述灭活的血浆。
NK细胞增殖培养液的配制：基础无血清培养基1000ml加入IL-2(1000IU/ml)、烟酰胺5mM及5ml上述灭活的血浆。
步骤2.6：NK细胞培养：将步骤2.4得到的细胞用NK细胞活化培养液重悬，转移Transwell上室中，每孔接种1×105个细胞。
步骤2.7：MSCs培养液配置：基础培养基加入3％的血清替代物。
步骤2.8：MSCs培养：从细胞库取出P3-P5代细胞，复苏，用配置的MSCs培养液重悬细胞，转移Transwell下室中，每孔接种1×105个细胞。将Transwell培养体系置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养24小时。
步骤2.9：培养24小时后，取出预处理的T75培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤2.6Transwell上室的细胞转移至T75培养瓶中，用少量新鲜NK细胞活化培养液清洗上室残留的细胞，避免浪费，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中继续培养。下室MSCs细胞弃掉。
步骤2.10：视生长情况，适量的补充新鲜的NK增殖培养液进行培养。
步骤2.11：NK细胞收集：培养15天后，收集NK细胞悬液，2000rpm×10min离心后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。
结果
1、NK细胞数量、细胞活率、免疫表型及活化受体表达的检测
培养15天后，收集前通过显微镜观察到的NK细胞的示意图，参见图1。
采用血球计数板法计算细胞数量，NK细胞数量为1.25×1010。NK细胞生长曲线图，参见图2。
取培养15天，100μl浓度为106/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4％的台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活率可达到99％。
将细胞与适当浓度的荧光染料偶联的抗体与CD3、CD56、CD69+、NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46混合，通过流式细胞仪上机测试以上抗体的组合来测定NK细胞免疫表型、活化受体和抑制受体的表达。NK细胞免疫表型CD3-CD56+比例为98.7％，且NK细胞免疫表型CD3-CD56+的表达情况参见图4。NK细胞活化受体表达情况参见图3。
2、NK细胞与相对应的肿瘤细胞特异性杀伤作用的检测
NK细胞按不同效靶比与相对应的肿瘤细胞接种在培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5％CO2的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。
按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的NK细胞与相对应的肿瘤细胞效靶比5：1时，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性为96％。本实施例制备的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性参见图5。
实施例2
对照组
实验操作可以包括以下步骤：
步骤1：NK细胞培养瓶预处理：将CD16单抗溶于20ml DPBS中，转移至T75培养瓶中，37℃避光放置3小时，或4℃放置过夜。
步骤2：PBMC分离。
子步骤2.1：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。
子步骤2.2：将100ml新鲜的肝素抗凝的患者外周血倒入50ml离心管内，配平，700g/min离心20min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用。
子步骤2.3：上述外周血离心后的下层加入DPBS混匀，定容50ml。各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
子步骤2.4：收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
步骤2.5：NK细胞培养液的配制：基础无血清培养基1000ml加入IFN-γ(1000IU/ml)、OK432(100ng/ml)、IL-2(1000IU/ml)、IL-21(50ng/ml)和IL-15(50ng/ml)及5ml上述灭活的血浆。
步骤2.6：NK细胞培养：取出预处理的T75培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤2.4得到的细胞用NK细胞培养液重悬，转移至T75培养瓶中，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养。
步骤2.7：视生长情况，适量的补充新鲜的NK培养液进行培养。
步骤2.8：NK细胞收集：培养21天后，收集NK细胞悬液，2000rpm×10min离心后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。
结果
1、NK细胞数量、细胞活率、免疫表型及活化受体表达的检测
培养21天后，收集前通过显微镜观察NK细胞的示意图，参见图6。
采用血球计数板法计算细胞数量，NK细胞数量为1.11×1010。NK细胞生长曲线图参见图7。
取培养21天100μl浓度为106/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4％台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活率可达到85％。
将细胞与适当浓度的荧光染料偶联的抗体与CD3、CD56、NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46混合，通过流式细胞仪上机测试以上抗体的组合来测定NK细胞免疫表型和活化受体的表达。NK细胞免疫表型CD3-CD56+比例为96.2％，且NK细胞免疫表型CD3-CD56+的表达情况参见图9。NK细胞活化受体表达情况参见图8。
2、NK细胞与相对应的肿瘤细胞特异性杀伤作用的检测
NK细胞按不同效靶比与相对应的肿瘤细胞接种在培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT 20μl，置于37℃、体积百分数为5％CO2的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO 150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。
按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的NK细胞与相对应的肿瘤细胞效靶比5：1时，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性为89％。
以上二组实验数据显示，实验组仅需采集外周血30毫升，而对照组需采集外周血不得少于100毫升；实验组培养15天NK细胞扩增数量均可达到120亿以上，对照组培养21天NK细胞扩增数量可达到110亿以上；实验组NK细胞活率高达99％，对照组细胞活率为85％；两组细胞表型CD3-CD56+比例无明显差异；效应细胞与靶细胞5：1时，实验组杀伤率为96％，对照组杀伤率为89％；培养后的细胞活化受体实验组均高于对照组。此方法培养的NK细胞，增殖能力强，纯度高，提高了NK细胞的杀伤活性与免疫调节能力，为提高NK细胞临床应用的疗效提供了可行性方案。

Claims (10)

1.一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法采用Transwell培养体系进行培养。
2.根据权利要求1所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法使用间充质干细胞对活化前的NK细胞进行孵育驯化。
3.根据权利要求2所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法包括配制NK细胞活化培养液和NK细胞增殖培养液。
4.根据权利要求3所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，其进一步包括所述NK细胞活化培养液的配制方法为基础无血清培养基100ml加入IFN-γ、OK432、IL-2、IL-21和IL-15及5ml灭活的血浆。
5.根据权利要求3所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，其进一步NK细胞增殖培养液的配制方法为基础无血清培养基1000ml加入IL-2、烟酰胺及5ml灭活的血浆。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，包括在Transwell上室中加入用活化培养液重悬的分离的PBMC，在Transwell下室中加入间充质干细胞和间充质干细胞培养液，PBMC与间充质干细胞的数量比为1：1或2：1。
7.一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法，所述方法可以包括：
采用Transwell培养体系使用间充质干细胞对活化前的NK细胞进行孵育驯化；
基于新鲜的肝素抗凝的患者外周血对PBMC进行分离处理；
将分离得到的细胞用配置的活化培养基进行重悬，转移至预处理后的Transwell上室中；
向Transwell下室加入与上室1：1或2：1数量的间充质干细胞，并加入间充质干细胞培养液，将Transwell培养体系置于恒温培养箱中培养12-72小时；
12-72小时后，弃掉下室间充质干细胞，将上室NK细胞转移至CD16单抗预处理的T75培养瓶中，基于设定时长和/或细胞生长情况，向培养瓶中补加活化培养基，随后继续补加增殖培养基；培养预设天数后，收集增殖的NK细胞。
8.一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备试剂盒，所述试剂盒包括Transwell培养体系。
9.根据权利要求8所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备试剂盒，所述试剂盒还包括对活化前的NK细胞进行孵育驯化的间充质干细胞。
10.根据权利要求1的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备方法或采用根据权利要求8所述的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞的制备试剂盒制备的强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞。
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