CN110305843A - 可以改善自身免疫性疾病的免疫细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可以改善自身免疫性疾病的免疫细胞及其制备方法与应用，所述免疫细胞的制备方法包括：体外分离并纯化外周血单个核细胞；用细胞激活因子I激活外周血单个核细胞；其中，细胞激活因子I含有IL‑2、IL‑1α、IFN‑γ、IL‑12，以生理盐水配置；用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增；其中，细胞激活因子II含有IL‑2、IFN‑γ、IL‑12，以生理盐水配置；收获免疫细胞。本发明的免疫细胞可通过将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2；能缓解诸如过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的症状。

Description

可以改善自身免疫性疾病的免疫细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明是关于一种可以改善自身免疫性疾病的免疫细胞及其制备方法与应用，具体地说，是关于一种激活并扩增外周血单个核细胞制备得到的免疫细胞AARI(Autoimmuneand Allergy Regulator Immune Cells)及其制备方法，以及在制备用于改善自身免疫性疾病的制剂中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
自身免疫性疾病(Autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。初始CD4+T淋巴细胞接受抗原刺激的信号，在共刺激信号以及共刺激分子的共同作用下活化，在不同条件下可分化成不同亚型的T淋巴细胞，包括Th1(T help1)型、Th2型、Th17型效应细胞，甚至分化为调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，执行不同的生物学功能。
Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，它主要介导细胞免疫应答。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等因子它主要介导体液免疫应答,辅助抗体生成，在过敏反应中起主导作用，使抗原特异的B细胞分泌Ig G1和Ig E抗体。Th1/Th2之间存在着互相调节的关系，即Th1/Th2功能平衡。但在疾病状态下，Th细胞受到特异抗原的刺激，一方面可能向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。当Th1细胞因子功能亢进时，将导致炎症的慢性迁移、器官特异性自身免疫病、急性排斥反应和接触性皮炎的发病或免疫病理损伤；当Th2细胞因子功能亢进时，将导致特异性过敏反应，参与高Ig E综合症和嗜酸性粒细胞增多症。由此可见Th1/Th2的平衡是维持机体处于健康状态的重要机制之一，一旦此平衡被打破，将可能引起异常的免疫应答，从而产生病理状态。
Th1/Th2与过敏性疾病的关系，过敏性疾病与抗原特异性Th2优势应答密切相关，由Th2分泌的细胞因子促进Ig E的产生和嗜酸性粒细胞的炎症反应。
目前对Th 1/Th 2平衡调节的进展包括以下几个方面：①诱导CD4+T细胞无反应性或凋亡；②逆转免疫偏离，形成分化平衡；③作用于B细胞，诱导Ig E向Ig G(主要是向IgG4)发生类型转换；④作用于抗原提呈细胞，形成“递呈偏离”；⑤抑制效应细胞产生直接的抗炎效应。抗原刺激B细胞活化和分泌Ig E需要T细胞辅助。阻断T细胞的活化，可改变Th0向Th1、Th2型淋巴细胞的分化，进而减少Th2细胞的细胞因子产生。上调Th1型细胞因子的表达，阻断Th2型细胞因子的表达。IL-12的产生在发病的各个环节都有一定的调节作用。它诱导Th0向Th1分化而抑制Th2细胞因子的产生。目前研究认为与变应性鼻炎有关的免疫球蛋白主要为Ig E和Ig G1。给予IFN-γ一方面抑制Th2细胞分泌IL-4，下调Ig E合成，另一方面促使免疫球蛋白发生类型转换，合成Ig G2a，间接抑制Ig E产生。IL-12也可促进B细胞Ig产生和I g类型转换，由Ig M转为Ig G，抑制IL-4促进B细胞合成Ig E。IL-4可直接诱导Ig M转换成Ig E，或经Ig G再转换为Ig E。
目前研究认为过敏性鼻炎是一系列细胞间相互作用的结果，开始于抗原呈递细胞(APC)对变应原的摄取和加工处理，而后将变应原肽传给Th细胞，使Th细胞的分化产生偏移，即由Th1反应偏向Th2反应，成为Th2﹥Th1反应，Th2细胞将诱导B细胞释放Ig E。有越来越多的证据表明，哮喘患者体内存在的Th1/Th2细胞因子间失衡是哮喘发病的关键机制；有研究表明，在哮喘发作期，患者外周血单个核细胞(PBMC)产生IL-4的水平明显增高，而IFN-γ水平明显下降，表现出Th2型细胞因子为主的免疫反应。研究表明，过敏性皮炎(AD)也是由于在相应变应原的刺激下，引起Th2为主的免疫应答，从而导致变态反应的发生；近年来研究表明Th1/Th2细胞亚群的不平衡在类风湿关节炎(RA)的发病机制中有着关键的作用，活动期RA患者外周血中Th1细胞降低，Th2细胞与血沉(ES R)、晨僵时间呈正相关，Th1/Th2比值与血沉呈负相关。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种改善自身免疫性疾病的免疫细胞。
本发明的另一目的在于提供上述的免疫细胞的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述的免疫细胞的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种改善自身免疫性疾病的免疫细胞的制备方法，从而得到一种免疫细胞，本发明中将所制备得到的免疫细胞称为AARI细胞(Autoimmune and Allergy Regulator Immune Cells，AARI)。AARI细胞能够通过将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2；能缓解诸如过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的症状。
具体地，一方面，本发明提供了一种免疫细胞的制备方法，该方法包括：
体外分离并纯化外周血单个核细胞；
用细胞激活因子I(本发明中亦称为AARI细胞激活因子I)激活外周血单个核细胞(激活后的细胞即成为AARI细胞)；其中，AARI细胞激活因子I含有IL-2、IL-1α、IFN-γ、IL-12，以生理盐水配置；
用细胞激活因子II(本发明中亦称为AARI细胞激活因子II)将激活后的细胞即AARI细胞进行扩增；其中，AARI细胞激活因子II含有IL-2、IFN-γ、IL-12，以生理盐水配置；
收获AARI细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞的制备方法中，体外分离并纯化外周血单个核细胞的过程包括：
将已加入肝素抗凝处理后的外周血分装至离心管中，离心，弃上清，向管中加入AIMV培养基，制成淋巴细胞悬液；
然后加入到预置有淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后将淋巴细胞层转移到另一离心管中，加入AIMV培养基后离心，弃上清，再加入AIMV培养基后离心，弃上清，获得外周血单个核细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的离心条件为1800rpm、5～15min。
向外周血单个核细胞中加完全培养基，制成淋巴细胞悬液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞的制备方法中，所述完全培养基是按照以下方法制备得到的：
全血离心，弃上清，4℃静置过夜，再离心，取上清作为向AIMV培养基中添加的血浆；在本发明的一些具体实施方案中，其中所述离心条件为1500g离心15～20分钟；
向AIMV培养基中加入上述血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v％自身血浆的完全培养基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备方法中，细胞激活因子I含有IL-2浓度2000-20000IU/mL、IL-1α浓度500-10000IU/mL、IFN-γ浓度500-1500IU/mL、IL-12浓度10-500IU/mL，以生理盐水配置；
用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增；其中，细胞激活因子II含有IL-2浓度2000-10000IU/mL、IFN-γ浓度500-10000IU/mL、IL-12浓度300-10000IU/mL，以生理盐水配置。
在本发明的一些具体的实施方案中，AARI细胞激活因子I含有IL-2浓度8000-15000IU/mL、IL-1α浓度6000-8000IU/mL、IFN-γ浓度800-1100IU/mL、IL-12浓度200-300IU/mL，以生理盐水配置。AARI细胞激活因子II含有IL-2浓度3500-5500IU/mL、IFN-γ浓度6000-8000IU/mL、IL-12浓度5000-7500IU/mL，以生理盐水配置。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞的制备方法中，用AARI细胞激活因子I激活外周血单个核细胞的过程包括：
向每20ml细胞悬液中加入AARI细胞激活因子I 0.5ml，于38.5℃、6.5％CO2的恒温培养箱中培养72小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞的制备方法中，用AARI细胞激活因子II将AARI细胞进行扩增的过程包括：
接种细胞72h后，将培养物转移至离心管中，离心(一些具体实施方案中的离心条件为1800rpm、5～15min)；弃上清，RPMI1640培养基混悬细胞，并调整细胞密度0.5×106-1×106个/ml，加入AARI细胞激活因子II；将细胞悬液加入到未包被的细胞培养瓶中，于38.5℃、6.5％CO2的恒温培养箱中继续培养72小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞的制备方法中，收获AARI细胞的过程包括：
将细胞培养产物离心(一些具体实施方案中的离心条件为1800rpm、5～15min)，弃上清，并用含白蛋白的生理盐水或RPMI1640培养基混悬细胞，冻存。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞的制备方法中，AARI细胞的冻存步骤包括：
将细胞培养产物离心(一些具体实施方案中的离心条件为1800rpm、5～15min)，弃上清，加入预冷过的冻存液A重悬，充分混匀后置冰上，缓慢加入预冷过的冻存液B，充分混匀后立即转入冻存管中，-80℃保存。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冻存液A为：向浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液每100mL中加入100mL pH7.0的PBS缓冲液；混匀后-20℃保存；
所述冻存液B为：pH7.0的PBS缓冲液与二甲基亚砜按照4：1体积比混匀即得。
其中AARI细胞的冻存步骤为：(1)将细胞培养产物离心(一些具体实施方案中的离心条件为1800rpm、5～15min)，弃上清，加入预冷过的冻存液A，混匀细胞，取少量置于无菌生理盐水，用于送检。(2)缓慢加入冻存液B，一边加入，一边晃动离心管，混匀后立即转入冻存管中。(3)放入泡沫盒中，并用棉花包裹，放入-80℃冰箱中。注意：①冻存液A、冻存液B需要提前配置，放入4℃冰箱中预冷，或者配制好后分装放入-20℃冰箱中冻存备用。冻存液在取出时需上下晃动混匀。②冻存管、冻存管架、泡沫盒均需提前放入-20℃冰箱中预冷30min左右。
另一方面，本发明还提供了一种免疫细胞，通过流式细胞仪检测所述免疫细胞表面白细胞分化抗原，其具有以下性能：
CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PerCP5鉴定：CD3+细胞≥90％，CD3+/CD4+细胞≥40％，CD3+/CD8+细胞≥40％；
CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PECy5鉴定：CD3+/CD56+细胞≥10％，CD3-/CD56+及CD3-/CD16+细胞≥5％；
FoxP3-FITC/CD25-PE/-CD4-PECy5鉴定：FoxP3+/CD25+/-CD4+细胞≥5％；
CD3-FITC/Intracelluler IFN-Gamma-PE/Intracelluler IL4-PerCP鉴定：CD3+/Intracelluler IFN-Gamma+细胞≥25％，CD3+/Intracelluler IL4+≦10％。
根据本发明的具体实施方案，本发明的免疫细胞，其是根据本发明所述的方法制备得到的。
本发明的免疫细胞，其他质量鉴定及合格标准：细胞培养终产品要求按照《中国生物制品》中的《生物制品无菌试验规程》进行实验，细胞终产品应经革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌培养结果为阴性；经真菌培养鉴定结果为阴性；经支原体检测结果为阴性；经梅毒检测结果为阴性；经乙肝抗原检测结果为阴性；内毒素检测结果为阴性。
另一方面，本发明还提供了所述的免疫细胞在制备用于改善自身免疫性疾病的制剂中的应用。
根据本发明的一些具体实施方案，所述用于改善自身免疫性疾病的制剂是通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述肿瘤内部或周围给药，给药剂量为每次50万-3000万免疫细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述用于改善自身免疫性疾病的制剂是通过将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2；能缓解诸如过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的症状。
根据本发明的具体实施方案，所述免疫细胞在具体应用时候，先经过复苏再回输。AARI细胞的复苏步骤为：将需复苏的细胞冷冻管于37℃恒温水浴中化冻，并迅速移入预置10ml细胞复苏液的离心管中，离心(一些具体实施方案中的离心条件为1800rpm、5～15min)，并用10ml生理盐水重悬，再离心。用2ml细胞复苏液重悬，准备回输。取样，进行台盼蓝染色，并计数、计算活率。其中复苏液的制备方法：95ml无菌生理盐水中加入浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液5ml，混匀后用0.22μm滤器过滤，即得。其中AARI细胞的回输步骤为：将复苏后的AARI细胞通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述肿瘤内部或周围给药，以每次注射50万-3000万细胞的剂量给药。回输前一定获得细菌鉴定及其他质检报告，以防培养过程所致的感染。
本发明的有益效果：
(1)在细胞体外激活阶段使用了IL-2、IL-1α、IFN-γ、IL-12的细胞因子组合共同作用下，快速激活外周血单个核细胞成为AARI细胞。
(2)在细胞扩增阶段使用了IL-2、IFN-γ、IL-12的细胞因子组合，使AARI细胞大量扩增，将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2。
(3)本方法采取特殊的刺激环境，可使细胞群中的单个核细胞在短时间内激活成AARI细胞，通过平衡Th1/Th2能减轻诸如过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的症状。
附图说明
图1为实施例2中AARI细胞增殖情况图。
图2为实施例5中AARI细胞抑制抗IgM抗体诱导的B增殖样本1的结果图。
图3为实施例5中AARI细胞抑制抗IgM抗体诱导的B增殖样本2的结果图。
图4为实施例5中AARI细胞抑制抗IgM抗体诱导的B增殖样本3的结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明技术方案的实施和所具有的有益效果，但不能认定为对本发明的可实施范围的任何限定。各实施例中未详细说明的方法和操作条件，按照所述领域的常规技术或是按照仪器制造商建议的操作进行。
实施例1.AARI细胞的制备
1.外周血淋巴细胞的分离
(1)一次抽血量：150ml，肝素抗凝。150ml全血正常情况下可得1.5-2×108个细胞，可种一个75cm2培养瓶；肝素抗凝处理后的外周血分装至离心管中，1800rpm，15min离心，弃上清；
(2)稀释血液：AIMV培养基等倍稀释血液，制成淋巴细胞悬液；
(3)25ml淋巴细胞悬液小心置于12.5ml淋巴细胞分离液上，1800rpm，15min离心，升降速调至最低；
(4)取上层部分血浆留用，4℃冰箱保存；
(5)取淋巴细胞层，置于50ml离心管中，加入AIMV培养基至总体积50ml，1800rpm，5min离心；
(6)弃上清，加入一定量AIMV培养基，混悬细胞，取少量计数。
(7)1800rpm，5min离心；
(8)弃上清，获得外周血单个核细胞；向外周血单个核细胞中加完全培养基，制成淋巴细胞悬液。
2.试剂及溶液配制培养基制备方法
全血于1500g离心20分钟，弃上清，4℃静置过夜，再于1500g离心15分钟，取上清作为向AIMV培养基中添加的血浆；向AIMV培养基中加入血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v％自身血浆的完全培养基。
3.细胞培养瓶处理
吸出包被液，并每瓶加入30ml生理盐水，轻轻晃动，吸出生理盐水即可。
4.AARI细胞激活
通过AARI细胞激活因子I的培养将AARI细胞激活的步骤为：细胞培养瓶处理后，立即加入20ml细胞悬液，加入AARI细胞激活因子I 0.5ml，于38.5℃，6.5％CO2的恒温培养箱中培养72小时。
其中AARI细胞激活因子I含有IL-2(11000IU)、IL-1α(7000IU、IFN-γ(900IU)、IL-12(200IU)，以生理盐水配置。
5.AARI细胞的扩增
(1)接种细胞72h后，将培养物转移至50ml离心管中，部分贴壁细胞无法吹下时，可加入15ml生理盐水，拍动瓶子或用细胞刮使其脱离瓶底，与原细胞悬液合并。1800rpm，5min离心；
(2)弃上清，RPMI1640培养基混悬细胞，计数；
(3)加入RPMI1640培养基，调整细胞密度0.5×106-1×106个/ml，加入AARI细胞激活因子II 0.5ml。
(4)将细胞悬液加入到新的75cm2细胞培养瓶中(未包被)，50ml左右/瓶。
(5)将培养瓶于38.5℃，6.5％CO2的恒温培养箱中继续培养72小时。
其中AARI细胞激活因子II含有IL-2(4000IU)、IFN-γ(7000IU)、IL-12(6000IU)，以生理盐水配置。
6.AARI细胞收获及冻存
将细胞培养产物1800rpm，5min离心，弃上清，并用含白蛋白的生理盐水或RPMI1640培养基混悬细胞，计数。根据细胞数量，确定冻存数量。
其中AARI细胞的冻存步骤为：
(1)将细胞培养产物1800rpm，5min离心，弃上清，加入预冷过的冻存液A4ml，混匀细胞，取少量置于无菌生理盐水，用于送检。
(2)缓慢加入冻存液B 4ml，一边加入，一边晃动离心管，混匀后立即转入冻存管中。
(3)放入泡沫盒中，并用棉花包裹，放入-80℃冰箱中。
所述冻存液A为：向浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液每100mL中加入100mLpH7.0的PBS缓冲液；混匀后-20℃保存；
所述冻存液B为：pH7.0的PBS缓冲液与二甲基亚砜按照4：1体积比混匀即得。
注意：①冻存液A、冻存液B需要提前配置，放入4℃冰箱中预冷，或者配制好后分装放入-20℃冰箱中冻存备用。冻存液在取出时需上下晃动混匀。②冻存管、冻存管架、泡沫盒均需提前放入-20℃冰箱中预冷30min左右。
上述送检步骤为：通过流式细胞仪检测成品细胞表面白细胞分化抗原，通常用于荧光染色的抗体包含一下几组：
(1)CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PECy5，鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+细胞≥90％，CD3+/CD4+细胞≥40％，CD3+/CD8+细胞≥40％；
(2)CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PECy5，鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+/CD56+细胞≥10％，CD3-/CD56+及CD3-/CD16+细胞≥5％；
(3)FoxP3-FITC/CD25-PE/-CD4-PECy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：FoxP3-FITC/CD25-PE/-CD4-PECy5鉴定：FoxP3+/CD25+/-CD4+细胞≥5％；
(4)CD3-FITC/Intracelluler IFN-Gamma-PE/Intracelluler IL4-PerCP鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+/Intracelluler IFN-Gamma+细胞≥25％，CD3+/Intracelluler IL4+≦10％。
其他质量鉴定及合格标准：细胞培养终产品要求按照《中国生物制品》中的《生物制品无菌试验规程》进行实验，细胞终产品应经革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌培养结果为阴性；经真菌培养鉴定结果为阴性；经支原体检测结果为阴性；经梅毒检测结果为阴性；经乙肝抗原检测结果为阴性；内毒素检测结果为阴性。
经检测，本实施例的成品细胞符合上述质检鉴定合格标准的要求。
7.AARI细胞复苏及回输
将需复苏的细胞冷冻管于37℃恒温水浴中化冻，并迅速移入预置10ml细胞复苏液的离心管中，1800rpm，5min离心，并用10ml生理盐水重悬，再离心。用2ml细胞复苏液重悬，准备回输。取样，进行台盼蓝染色，并计数、计算活率。
其中复苏液的制备方法：95ml无菌生理盐水中加入浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液5ml，混匀后用0.22μm滤器过滤，即得。
其中AARI细胞的回输步骤为：将复苏后的AARI细胞通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述肿瘤内部或周围给药，以每次注射50万-3000万细胞的剂量给药。回输前一定获得细菌鉴定及其他质检报告，以防培养过程所致的感染。
实施例2.AARI细胞扩增能力检测
采用实施例1的方法培养，并取培养时间为第0、3、5、7天的AARI细胞，检测细胞增殖情况，实验结果如图1所示。由图1可知：采用本发明方法培养的AARI细胞增殖情况较好。
实施例3.AARI细胞活力检测
采用实施例1的方法培养，并取培养12天的细胞100μl，加入100μl0.4％台盼蓝染色液，活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色，结果如表1所示。
表1
样品1 样品2 样品3
活细胞百分比 95.5％ 97.1％ 95.9％
由表1可知本发明制备的细胞活力大于95％，培养出的AARI细胞活力较好。
实施例4.AARI细胞流式表型检测
采用实施例1的方法培养3名供体外周血淋巴细胞，分别取培养7天培养成品细胞100μl，浓度约106/ml的细胞，分别加入检测用鼠抗人10μl，室温环境下，避光孵育30min。之后用PBS洗涤两次，进行流式细胞检测，结果如表2所示。
表2
检测内容 供体1 供体2 供体3
CD3+/CD19-/CD14-(T细胞) 90.5％ 92.9％ 90.7％
CD3+/CD8+/CD4-(T杀伤细胞) 42.3％ 43.9％ 48.7％
CD3+/CD4+/CD8-(T辅助细胞) 48.8％ 46.4％ 40.6％
CD3+/CD56+或CD16+(NKT细胞) 18.5％ 14.9％ 15.9％
CD3-/CD56+/CD16+(NK细胞) 6.4％ 5.9％ 7.8％
CD3+/CD4+/IFN-G+(Th1细胞) 30.3％ 32.6％ 30.7％
CD3+/CD4+/IL-4+(Th2细胞) 8.3％ 7.3％ 9.2％
CD4+/CD25+/FoxP3+(Treg细胞) 5.8％ 6.3％ 6.5％
由表2可以看出：AARI培养能够获得大量T细胞，同时使T辅助细胞极化为Th1细胞，将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2。从而减轻诸如过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的症状。具体地，本发明培养的细胞，CD3+/CD19-/CD14-(T细胞)在88.7％-92.9％，符合AARI细胞的性能≥90％；CD3+/CD4+/IFN-G+(Th1细胞)在30.3％-32.6％，符合AARI细胞的性能≥25％；CD3+/CD4+/IL-4+(Th2细胞)在7.3％-9.2％，符合AARI细胞的性能≤10％。
实施例5.AARI细胞可抑制抗IgM抗体诱导的B增殖
小鼠抗人IgM抗体(20ng/ml)加入2×105/100μl经小鼠抗人CD19微球纯化的人外周血B淋巴细胞中，用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率测定B细胞的增殖水平。细胞对照组加入未经激活的自体外周血PBMC 2×105/100μl，实验组加入经AARI方案激活7天的淋巴细胞2×105/100μl。阴性对照组加入100μl PBS。
SI＝(实验组CPM-本底CPM)/(阴性对照组CPM-本底CPM)
结果见图2、图3、图4所示。由图2、图3、图4的实验结果可知，加入AARI细胞的实验组B细胞的增值水平均低于对照组，且有统计学意义(图2的p＜0.001、图3的p＜0.001、图4的p＜0.0001)。由此可见，AARI细胞可通过降低B细胞的增殖从而改善自身免疫性疾病。

Claims (10)

1.一种免疫细胞的制备方法，该方法包括：
体外分离并纯化外周血单个核细胞；
用细胞激活因子I激活外周血单个核细胞；其中，细胞激活因子I含有IL-2、IL-1α、IFN-γ、IL-12，以生理盐水配置；
用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增；其中，细胞激活因子II含有IL-2、IFN-γ、IL-12，以生理盐水配置；
收获免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，体外分离并纯化外周血单个核细胞的过程包括：
将已加入肝素抗凝处理后的外周血分装至离心管中，离心，弃上清，向管中加入AIMV培养基，制成淋巴细胞悬液；
然后加入到预置有淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后将淋巴细胞层转移到另一离心管中，加入AIMV培养基后离心，弃上清，再加入AIMV培养基后离心，弃上清，获得外周血单个核细胞；
向外周血单个核细胞中加完全培养基，制成细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述完全培养基是按照以下方法进行操作的：
全血离心，弃上清，4℃静置过夜，再离心，取上清作为向AIMV培养基中添加的血浆；
向AIMV培养基中加入上述血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v％自身血浆的完全培养基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，细胞激活因子I含有IL-2浓度2000-20000IU/mL、IL-1α浓度500-10000IU/mL、IFN-γ浓度500-1500IU/mL、IL-12浓度10-500IU/mL，以生理盐水配置；
用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增；其中，细胞激活因子II含有IL-2浓度2000-10000IU/mL、IFN-γ浓度500-10000IU/mL、IL-12浓度300-10000IU/mL，以生理盐水配置。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，用细胞激活因子I激活外周血单个核细胞的过程包括：
向每20ml细胞悬液中加入细胞激活因子I0.5ml，于38.5℃、6.5％CO2的恒温培养箱中培养72小时；
用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增的过程包括：
接种细胞72h后，将培养物转移至离心管中，离心；弃上清，RPMI1640培养基混悬细胞，并调整细胞密度0.5×106-1×106个/ml，加入AARI细胞激活因子II；将细胞悬液加入到未包被的细胞培养瓶中，于38.5℃、6.5％CO2的恒温培养箱中继续培养72小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，收获免疫细胞的过程包括：
将细胞培养产物离心，弃上清，并用含白蛋白的生理盐水或RPMI1640培养基混悬细胞，冻存。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，免疫细胞的冻存步骤包括：
将细胞培养产物离心，弃上清，加入预冷过的冻存液A重悬，充分混匀后置冰上，缓慢加入预冷过的冻存液B，充分混匀后立即转入冻存管中，-80℃保存；
所述冻存液A为：向浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液每100mL中加入100mLpH7.0的PBS缓冲液；混匀后-20℃保存；
所述冻存液B为：pH7.0的PBS缓冲液与二甲基亚砜按照4：1体积比混匀即得。
8.一种免疫细胞，通过流式细胞仪检测所述免疫细胞表面白细胞分化抗原，其具有以下性能：
CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PerCP5鉴定：CD3+细胞≥90％，CD3+/CD4+细胞≥40％，CD3+/CD8+细胞≥40％；
CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PECy5鉴定：CD3+/CD56+细胞≥10％，CD3-/CD56+及CD3-/CD16+细胞≥5％；
FoxP3-FITC/CD25-PE/-CD4-PECy5鉴定：FoxP3+/CD25+/-CD4+细胞≥5％；
CD3-FITC/Intracelluler IFN-Gamma-PE/Intracelluler IL4-PerCP鉴定：CD3+/Intracelluler IFN-Gamma+细胞≥25％，CD3+/Intracelluler IL4+≦10％。
9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其是根据权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的。
10.权利要求8或9所述的免疫细胞在制备用于改善自身免疫性疾病的制剂中的应用；
优选地，所述用于改善自身免疫性疾病的制剂是通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述肿瘤内部或周围给药，给药剂量为每次50万-3000万免疫细胞；
优选地，所述用于改善自身免疫性疾病的制剂是通过将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2；缓解自身免疫性疾病的症状；所述自身免疫性疾病包括过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎。
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