CN107988155B - 一种cik细胞的制备方法 - Google Patents

一种cik细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107988155B
CN107988155B CN201711272620.0A CN201711272620A CN107988155B CN 107988155 B CN107988155 B CN 107988155B CN 201711272620 A CN201711272620 A CN 201711272620A CN 107988155 B CN107988155 B CN 107988155B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
added
culture
plasma
final concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711272620.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107988155A (zh
Inventor
吴琨
陈汉森
徐丽婉
徐家科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jisai International Regenerative Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
Cum Regenerative Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cum Regenerative Medical Science And Technology Co Ltd filed Critical Cum Regenerative Medical Science And Technology Co Ltd
Priority to CN201711272620.0A priority Critical patent/CN107988155B/zh
Publication of CN107988155A publication Critical patent/CN107988155A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107988155B publication Critical patent/CN107988155B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及免疫细胞的体外培养，更具体涉及一种CIK细胞的体外诱导培养。本发明所述制备方法包括：纤连蛋白和CD3单抗包被细胞培养瓶；制备自体血浆；获取外周血单个核细胞PBMC；IL‑2、IFN‑γ和自体血浆诱导PBMC；扩增培养。本发明制备得到的CIK细胞，CIK细胞数量多、细胞活率高、CD3+CD56+效应细胞比例高、细胞毒活性强，均可达到临床要求，抗肿瘤能力强。

Description

一种CIK细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞的体外培养，更具体涉及一种CIK细胞的体外诱导培养。
背景技术
CIK(cytokine induced killer)细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子共同培养刺激后所获得的一类以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，同时表达NK细胞(自然杀伤细胞)表面标志(CD56分子)和T细胞表面标志(CD3分子)，故又称为NKT细胞(自然杀伤T细胞)；兼具T细胞强大的抗瘤活性，以及NK细胞非MHC(主要组织相容性抗原)限制性杀瘤的特点。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，目前已成为临床上肿瘤过继免疫治疗的重要方案。
CD3+CD56+双阳性细胞在正常人体外周血组分中含量极少，体外在含多种细胞因子的培养基中扩增，可使CD3+CD56+双阳性细胞数量成百倍扩增。
细胞因子是一类由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长分化、调节免疫功能和生理活性并参与病理反应的小分子蛋白质。在CIK细胞的诱导中，常用的细胞因子种类有：
白细胞介素(Interleukin，IL)：介导白细胞间相互作用的细胞因子。
IL-1：又叫淋巴细胞刺激因子，主要由活化的单核-巨噬细胞产生，可与IL-2或干扰素协同作用增强NK细胞活性，有IL-1α和IL-1β两种存在形式。
IL-2：又称T细胞生长因子，主要由T细胞产生，以自分泌和旁分泌方式发挥效应。能够活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。
IL-21：与IL-2、IL-4、IL-15空间结构同源，促进骨髓NK细胞的增殖与分化，与抗CD40抗体协同刺激B细胞的增殖，与抗CD3抗体协同刺激T细胞的增殖。
IL-15：分子结构与IL-2相似，可利用IL-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性，可诱导B细胞增殖和分化，是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子；能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ(γ干扰素)。
IL-12：主要由B细胞和巨噬细胞产生，主要作用于T细胞和NK细胞，可刺激活化型T细胞增殖，诱导CIK细胞的细胞毒活性。
干扰素(Interferon，IFN)：抵抗病毒感染，干扰病毒复制的细胞因子，包括：IFN-α、IFN-β(I型)；IFN-γ(II型)。CIK细胞诱导中常用IFN-γ。
目前CIK细胞的制备方法是将分离得到的外周血单个核细胞用IFN-γ刺激24小时后，再用CD3单抗、IL-1α、IL-2等因子进行刺激。但是诱导产生的CIK细胞细胞活力和肿瘤杀伤能力低，对肿瘤的治疗效果十分有限。此外，还有少数供血者的单个核细胞对CD3单抗和一些细胞因子的诱导不敏感，细胞增殖速度缓慢，因此本领域技术人员仍致力于开发一种诱导产生的CIK细胞数量多、细胞毒活性强的CIK细胞制备技术。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种制备得到的CIK细胞数量多、活率高、CD3+CD56+效应细胞比例高、细胞毒活性强的CIK细胞的制备方法。
本发明提供一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)准备阶段：包被细胞培养瓶；
(2)外周血单核细胞诱导培养：
①采血；②制备自体血浆；③获得外周血单核细胞，并配置细胞悬液；
④接种细胞：将上述配制的细胞悬液加入到包被过的细胞培养瓶中，加入无血清细胞培养基，添加IL-2、IFN-γ、及上述制备的自体血浆；⑤将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，补加培养基，同时补加IL-2、IFN-γ及CD3单抗；
②培养12-16天后，收获细胞。
优选地，步骤(1)中所述的包被细胞培养瓶所用的包被液的成分包括：纤连蛋白5-50μg/mL，CD3单抗2-20μg/mL。
更优选地，步骤(1)中所述的包被细胞培养瓶所用的包被液的成分包括：纤连蛋白12.5μg/mL，CD3单抗5μg/mL。
优选地，配制上述的包被液所用的缓冲液为D-PBS缓冲液；
优选地，步骤(1)中所述的细胞培养瓶可以为T25、T75、T175细胞培养瓶；
优选地，步骤(1)中所述的包被细胞培养瓶的方法为：将配制好的包被液加入细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜。
优选地，步骤(2)-②中制备自体血浆时需灭活补体：56℃恒温水浴30min。
优选地，步骤(2)-③中获得外周血单核细胞的方法为采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞得到。
优选地，步骤(2)-④中所述的添加的IL-2的终浓度为800-1200单位/mL。
更优选地，步骤(2)-④中所述的添加的IL-2的终浓度为1000单位/mL。
优选地，步骤(2)-④中所述的添加的IFN-γ的终浓度为800-1200单位/mL。
更优选地，步骤(2)-④中所述的添加的IFN-γ的终浓度为1000单位/mL。
优选地，步骤(2)-④中所述的添加的上述制备的自体血浆的终浓度为1％-3％。
更优选地，步骤(2)-④中所述的添加的上述制备的自体血浆的终浓度为2％。
优选地，步骤(3)-①中所述的补加IL-2、IFN-γ及CD3单抗的终浓度分别为：100-300单位/mL、100-300单位/mL、20-60ng/mL。
优选地，步骤(3)中所述的扩增培养为：培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，根据细胞的生产状况，补加培养基。
优选地，步骤(3)-②中培养14天后，收获细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、由于个体化差异，少数供血者的单个核细胞对一些细胞因子的诱导不敏感，细胞增殖速度缓慢，细胞数量难以达到临床要求，而本发明采用CD3单抗、IL-2、IFN-γ和自体血清共同诱导、且细胞因子采用特定配比的方法，同时会在培养第四天补加CD3单抗、IL-2、IFN-γ，很好地解决了该问题，可诱导这类不敏感细胞的增殖。
2、本发明使用纤连蛋白和CD3单抗包被细胞培养瓶，使得培养瓶更加适合细胞生长。
3、本发明的方法制备的CIK细胞，细胞数量多，增殖速度快，培养14天可收获100亿左右的高效能CIK细胞，且细胞存活率高。
4、本发明的方法制备的CIK细胞，纯度和均一性均达到临床应用水平。
5、本发明的方法制备的CIK细胞，其表达细胞表面抗原CD3+和CD56+的水平高，可达60％以上。
6、本发明的方法制备的CIK细胞，细胞毒活性强，杀伤力大。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种CIK细胞的培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1
一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)准备阶段：
①配包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白(购至TAKARA)400μL(终浓度20μg/mL)，鼠源CD3单抗(商品名：爱欧山)200μL(终浓度10μg/mL)；
②包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
(2)外周血单核细胞(PBMC)诱导培养：
①采血：采集外周血50mL；
②制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；
轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；
灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液(商品名：Ficoll)，室温下800g离心20min；
离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mLPBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；
④配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mLGT-T551培养基重悬，混匀；
⑤清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mLGT-T551培养基洗一次；
⑥接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGT-T551培养基，添加终浓度为800单位/mL的IL-2和终浓度为1200单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为1％的上述制备的自体血浆；
将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为100单位/mL的IL-2、100单位/mL的IFN-γ、20ng/mL的CD3单抗；
②培养14天后，收获细胞。
实施例2
一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)准备阶段：
①配包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白(购至TAKARA)100μL(终浓度5μg/mL)，鼠源CD3单抗(商品名：爱欧山)400μL(终浓度20μg/mL)；
②包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
(2)外周血单核细胞(PBMC)诱导培养：
①采血：采集外周血50mL；
②制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；
轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；
灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液(商品名：Ficoll)，室温下800g离心20min；
离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mLPBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；
④配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mLGT-T551培养基重悬，混匀；
⑤清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mLGT-T551培养基洗一次；
⑥接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGT-T551培养基，添加终浓度为1200单位/mL的IL-2和终浓度为800单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为3％的上述制备的自体血浆；
将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为300单位/mL的IL-2、300单位/mL的IFN-γ、60ng/mL的CD3单抗；
②培养14天后，收获细胞。
实施例3
一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)准备阶段：
①配包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白(购至TAKARA)250μL(终浓度12.5μg/mL)，鼠源CD3单抗(商品名：爱欧山)100μL(终浓度5μg/mL)；
②包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
(2)外周血单核细胞(PBMC)诱导培养：
①采血：采集外周血50mL；
②制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；
轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；
灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液(商品名：Ficoll)，室温下800g离心20min；
离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mLPBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；
④配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mLGT-T551培养基重悬，混匀；
⑤清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mLGT-T551培养基洗一次；
⑥接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGT-T551培养基，添加终浓度为1000单位/mL的IL-2和终浓度为1000单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为1％的上述制备的自体血浆；
将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为200单位/mL的IL-2、200单位/mL的IFN-γ、50ng/mL的CD3单抗；
②培养14天后，收获细胞。
对比例1
一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)外周血单核细胞(PBMC)诱导培养：
①采血：采集外周血50mL；
②制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；
轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；
灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液(商品名：Ficoll)，室温下800g离心20min；
离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mLPBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；
④配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mLGT-T551培养基重悬，混匀；
⑤清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mLGT-T551培养基洗一次；
⑥接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGT-T551培养基，添加终浓度为1000单位/mL的IL-2和终浓度为1000单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为2％的上述制备的自体血浆；
将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为200单位/mL的IL-2、200单位/mL的IFN-γ、50ng/mL的CD3单抗；
②培养14天后，收获细胞。
对比例2
一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)准备阶段：
①配包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白(购至TAKARA)250μL(终浓度12.5μg/mL)，鼠源CD3单抗(商品名：爱欧山)100μL(终浓度5μg/mL)；
②包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
(2)外周血单核细胞(PBMC)诱导培养：
①采血：采集外周血50mL；
②制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；
轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；
灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液(商品名：Ficoll)，室温下800g离心20min；
离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mLPBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；
④配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mLGT-T551培养基重悬，混匀；
⑤清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mLGT-T551培养基洗一次；
⑥接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGT-T551培养基，添加终浓度为1500单位/mL的IL-2和终浓度为1500单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为2％的上述制备的自体血浆；
将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为200单位/mL的IL-2、200单位/mL的IFN-γ、50ng/mL的CD3单抗；
②培养14天后，收获细胞。
对比例3
一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)准备阶段：
①配包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白(购至TAKARA)250μL(终浓度12.5μg/mL)，鼠源CD3单抗(商品名：爱欧山)100μL(终浓度5μg/mL)；
②包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
(2)外周血单核细胞(PBMC)诱导培养：
①采血：采集外周血50mL；
②制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；
轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；
灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液(商品名：Ficoll)，室温下800g离心20min；
离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mLPBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；
④配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mLGT-T551培养基重悬，混匀；
⑤清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mLGT-T551培养基洗一次；
⑥接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGT-T551培养基，添加终浓度为1000单位/mL的IL-2和终浓度为1000单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为1％的上述制备的自体血浆；
将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
(3)扩增培养：
①培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，但不补加IL-2、IFN-γ和CD3单抗；
②培养14天后，收获细胞。
对比例4
(1)采外周血60mL，将采血袋中抗凝血转移至无菌离心管中，2000rpm水平离心20min；
(2)吸取上层血浆至新离心管，置于56℃恒温水浴中30min灭活补体，灭活后的血浆于4℃下3000rpm离心30分钟，收集上清。密封，4℃保存，作为细胞培养添加剂备用。
(3)将下层沉淀细胞以生理盐水稀释至原体积，充分混匀后将稀释的外周血沿离心管管壁缓慢滴加于等体积的人淋巴细胞分离液上，保持界面清晰，室温下800g离心15min。
(4)收集白色雾层细胞即PBMC，以生理盐水重悬，室温下2000rpm离心10min。
(5)弃上清，收集细胞沉淀，以生理盐水重悬，取样0.5mL计数，其余细胞室温下2000rpm离心10min，重复2次。
(6)将末次收集的细胞沉淀以含2％灭活血浆的GT-T551无血清培养基重悬，调整细胞密度至1-2.5×106/mL，补加终浓度为1000IU/mL的INF-γ。
(7)将细胞悬液转移至175cm2组织培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中。
(8)细胞培养24h后，补充终浓度为100ng/mL的CD3εMab和CD28Mab，以及终浓度为1000IU/mL的IL-2继续培养；此后每2-3天以含2％灭活血浆、1000IU/mL IL-2的培养基扩增培养；
细胞培养至第14、15、16天收获。
实验例1细胞数量
实施例1-3以及对比例1-3中所述的取样0.5mL计数，计数方法为：台盼蓝染色法，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率；
此外，培养14天后，同样用台盼蓝染色法计算细胞数和细胞活率，结果见表1：
表1
实验例2细胞表面抗原检测(CD3+、CD56+)
实施例1-3以及对比例1-3中，细胞培养至14天时，取样以流式细胞术检定细胞免疫表型，调整培养细胞密度至1×106/mL，100μL/管分装至流式测试管中，分别以同型对照、anti-CD3Mab-PerCP、anti-CD56Mab-PE孵育标记，以流式细胞仪检测细胞表型，确定CIK细胞中CD3+CD56+细胞的比例，结果见表2：
表2
实验例3细胞杀伤活性测定
取对数生长期的K562肿瘤细胞株，重悬细胞浓度为1×105/ml，5×104/ml，2.5×104/ml，每孔100μL铺于96孔平底板中，置于37℃，CO2浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时待用；
将实施例1-3及对比例1-3中培养14天的CIK细胞重悬为1×106/ml，加入前述96孔板中，使效靶比为10∶1、20∶1以及40∶1，每个浓度各设4个复孔，并设未与肿瘤细胞反应的为效应细胞空白对照组，共培养48小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μL，继续培养4小时后，离心弃上清，每孔加入DMSO 100μL，于570nm处测定吸光度数值，计算杀伤率，结果见表3。
杀伤率的公式如下：[1-(效靶细胞组OD值-效应细胞OD值)/靶细胞OD值-空白对照组OD值]×100％；
表3

Claims (1)

1. 一种CIK细胞的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：(1)准备阶段：
① 配包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白250μL，终浓度12.5μg/mL，鼠源CD3单抗100μL，终浓度5μg/mL；
② 包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
(2)外周血单核细胞诱导培养：
① 采血：采集外周血50mL；
② 制备自体血浆：将上述采集的外周血室温下700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；灭活后的血浆于4℃静置15min后，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血浆备用；
③ 分离淋巴细胞：将步骤(2)-②中的下层液体中加入PBS缓冲液至50mL，混匀后缓慢加入已经添加20mL淋巴分离液，室温下800g离心20min；离心后中间的白色雾层细胞即为PBMC，用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，在新的50mL离心管中加入30mL左右PBS清洗，1500rpm离心8min，弃上清；再次用30mL PBS清洗，1200 rpm清洗6min，弃上清；30mL培养基重悬，混匀，取样0 .5mL计数，1000 rpm离心6min，弃上清；
④ 配制细胞悬液：将末次洗涤时收集的细胞沉淀用40mL GT-T551培养基重悬，混匀；
⑤ 清洗细胞培养瓶：取出步骤(1)-②中包被过的T175细胞培养瓶，弃包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL GT-T551培养基洗一次；
⑥ 接种细胞：将上述配制的40mL细胞悬液加入T175细胞培养瓶中，再加入40mLGTT551培养基，添加终浓度为1000单位/mL的IL-2和终浓度为1000单位/mL的IFN-γ，以及终浓度为1％的上述制备的自体血浆；将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱，在37℃，5％CO2的条件中培养；
(3)扩增培养：
① 培养第4天，将接种于培养瓶的细胞装袋培养，补加培养基，同时补加终浓度分别为200单位/mL的IL-2、200单位/mL的IFN-γ、50ng/mL的CD3单抗；
② 培养14天后，收获细胞。
CN201711272620.0A 2017-12-06 2017-12-06 一种cik细胞的制备方法 Active CN107988155B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711272620.0A CN107988155B (zh) 2017-12-06 2017-12-06 一种cik细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711272620.0A CN107988155B (zh) 2017-12-06 2017-12-06 一种cik细胞的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107988155A CN107988155A (zh) 2018-05-04
CN107988155B true CN107988155B (zh) 2019-01-11

Family

ID=62036167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711272620.0A Active CN107988155B (zh) 2017-12-06 2017-12-06 一种cik细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107988155B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117959A (zh) * 2020-01-08 2020-05-08 山东龙辰生物技术有限公司 Dc-cik细胞培养基、dc-cik细胞的培养方法及应用
CN112359015B (zh) * 2020-11-06 2023-01-24 上海映天生物科技有限公司 一种nk nk-t细胞的诱导扩增方法
CN112410294A (zh) * 2020-11-11 2021-02-26 海南优尼科尔生物科技有限公司 一种外周血cik细胞的扩增培养方法
CN112746056A (zh) * 2021-03-17 2021-05-04 辽宁盛京干细胞科技有限公司 一种增强nk细胞毒作用的培养液及其制备方法
CN114432395A (zh) * 2022-02-14 2022-05-06 南宁摩米生物科技有限公司 一种用于女性阴道清洁护理凝胶的制备方法
CN115558641B (zh) * 2022-11-14 2023-05-12 四川新生命干细胞科技股份有限公司 高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142245A (zh) * 2017-05-31 2017-09-08 东莞市保莱生物科技有限公司 一种cik细胞培养方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103865874A (zh) * 2012-12-14 2014-06-18 联亘生物科技（上海）有限公司 Cik细胞及其制备方法和应用
CN103642754A (zh) * 2013-12-04 2014-03-19 深圳市合一康生物科技有限公司 一种高毒性、高增值能力的人d-cik细胞的制备方法
CN106676067A (zh) * 2015-11-10 2017-05-17 成都嘉泰美康生物科技有限公司 高效特异i-DC/CIK细胞培养方法
CN106987558B (zh) * 2017-05-31 2019-12-20 东莞市保莱生物科技有限公司 一种cik细胞培养基

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142245A (zh) * 2017-05-31 2017-09-08 东莞市保莱生物科技有限公司 一种cik细胞培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
包被抗人CD3单克隆抗体对CIK细胞生长影响的研究;王岩等;《检验医学与临床》;20120229;第9卷(第4期);413-415

Also Published As

Publication number Publication date
CN107988155A (zh) 2018-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107988155B (zh) 一种cik细胞的制备方法
CN107326008B (zh) 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
KR101643165B1 (ko) 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법
CN107475196B (zh) 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
EP3444332A1 (en) Medium addition kit for culturing nk cells and nk cell culturing method using kit
CN109609584A (zh) 间充质干细胞免疫调节能力的检测方法
CN106222140A (zh) 一种nk细胞无血清培养基及其配制方法
KR20100012586A (ko) 자연살해세포의 증식방법
CN105925527A (zh) 一种用于制备nk细胞的试剂盒及其应用方法
CN105274053B (zh) 一种高细胞毒活性的cik细胞的制备方法
CN107488631A (zh) 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN101314764A (zh) 一种体外扩增自然杀伤细胞的方法
JP4275680B2 (ja) リンパ球の活性・増殖に係る培養方法
CN109825473A (zh) 一种采用tlr7激动剂刺激的自体外周血淋巴细胞的培养方法
CN106190976A (zh) 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法
CN106085958A (zh) 一种nk细胞的制备方法
CN1237170C (zh) 自然杀伤细胞的增殖方法
CN105112371A (zh) 脐带血单个核细胞来源的dc-cik细胞制取方法及制剂
CN109234232A (zh) 兔外周血b细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用
CN109402055A (zh) 一种dc-cik细胞培养试剂盒及其培养方法
CN105106237B (zh) 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂
CN110272871B (zh) 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用
US20110256611A1 (en) Interferon beta production promoter and a method for producing thereof
CN104818249B (zh) 一种增强型cik细胞制剂及其制备方法
CN110305843A (zh) 可以改善自身免疫性疾病的免疫细胞及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 510000 room d2-101, building 28, No.61 Dalingshan Road, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province

Patentee after: Jisai international Regenerative Medicine Technology Co.,Ltd.

Address before: 510000 room d2-101, building 28, No.61 Dalingshan Road, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province

Patentee before: GCH REGENERATIVE MEDICINE TECHNOLOGY CO.,LTD.