CN114196629B - 一种高效培养nkt细胞的试剂及其应用和nkt细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫细胞治疗领域，特别是涉及一种高效培养NKT细胞的试剂及其应用和NKT细胞的培养方法。本发明提供的试剂包括包被液、诱导液、活化液和扩增液。上述成分分别作用于NKT细胞诱导、活化、扩增不同过程，特异性地针对诱导NKT细胞、活化NK细胞、扩增NKT细胞的三个不同过程，更加高效地诱导、活化、扩增NKT细胞，从而提高获得的高增殖量的NKT细胞，减少了三个过程中不必要因素的相互干扰，同时又高效地协同NKT细胞培养三个过程，将NKT细胞培养诱导、活化、扩增三个过程相结合，从而获得高增殖量的NKT细胞。

Description

一种高效培养NKT细胞的试剂及其应用和NKT细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及免疫细胞治疗领域，特别是涉及一种高效培养NKT细胞的试剂及其应用和NKT细胞的培养方法。

背景技术

NKT细胞(natural killer-like T cells)作为一类新型的免疫调节细胞，其主要特征为T细胞受体基因表达的恒定性、CDld的限制性以及细胞因子产生的迅速、高水平性。NKT细胞既能增强免疫反应又能抑制免疫反应，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要的作用。自然杀伤性T细胞(NKT)属于T淋巴细胞，但是其共同拥有传统T细胞和NK细胞的表面标志和功能特点。大多数NKT细胞表达一个半不变量T细胞受体，这个受体与抗原提呈细胞表面的MHC-I相关蛋白CD1d呈现的糖脂类抗原相互作用。NKT细胞在多种不同的感染和炎症反应中被激活，并迅速产生大量的免疫调节细胞因子。NKT细胞能够影响免疫系统中的其他多种细胞类型的活化状态和功能特性，因此，可以调节免疫反应对抗外来抗原、自身抗原、肿瘤、组织移植和过敏原NKT细胞的这些特性可被利用来干预治疗肿瘤、感染和自身免疫性疾病等。

目前，NKT在临床应用于治疗恶性肿瘤主要有以下特点：1、NKT细胞是人体内抗肿瘤活性最强的细胞，可直接识别、杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长及扩散；2、NKT细胞会通过其分泌的因子抑制肿瘤附近新血管的增生，限制肿瘤生长；3、NKT细胞可直接改善并调节患者的免疫力，间接提高患者的生活质量；4、NKT细胞会分泌多种细胞因子，减少患者疼痛，且治疗天然无副作用。

总的来说，NKT细胞是一种广泛应用的肿瘤免疫治疗手段。NKT细胞能通过体外诱导而扩增，目前NKT制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用α-Galcer诱导，再加入IL-2因子进行刺激，最后获得一定数量的NKT细胞。但最终获得的NKT细胞的增殖倍数和细胞表型都一般。同时，所用的培养液主要利用胎牛血清或小牛血清作为细胞培养的营养物，虽然有足够的供应量、价格便宜，但是有潜在传播传染病的风险，在临床治疗中也会存在伦理的影响以及异种蛋白可能会导致过敏反应。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效培养NKT细胞的试剂及其应用和NKT细胞的培养方法。本发明提供的试剂及培养方法能够提高所获得的NKT细胞的纯度、数量和安全性。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种高效培养NKT细胞的试剂，所述试剂包括包被液、诱导液、活化液和扩增液；

所述包被液包括以下组分：CD3、CD40和CD147；

所述诱导液包括以下组分：卡介苗、草分枝杆菌和IL-2；

所述活化液包括以下组分：CD150、神经苷酯、IL-2、IL-12和IL-18；

所述扩增液包括以下组分：甲泼尼龙、IL-2和IL-4。

优选的，所述包被液包括以下浓度的组分：CD3 2～20μg/mL、CD40 1～10μg/mL和CD147 1～10μg/mL；

所述诱导液包括以下组分：卡介苗1～50μg/mL、草分枝杆菌μg/mL和IL-2500～1000IU/mL；

所述活化液包括以下组分：CD150 1～10μg/mL、神经苷酯1～50μg/mL、IL-2500～1000IU/mL、IL-12 10～200IU/mL和IL-18 10～200IU/mL；

所述扩增液包括以下组分：甲泼尼龙1×10^-8～1×10^-5mol/L、IL-2 500～1000IU/mL和IL-4 50～1000IU/mL。

优选的，所述包被液的体积为1mL、诱导液的体积为1mL、活化液的体积为1mL和扩增液的体积为1mL。

本发明还提供了一种快速培养NKT细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。

本发明还提供了上述试剂或上述试剂盒在培养NKT细胞中的应用。

本发明提供了一种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)分离血浆和单个核细胞；

(2)将上述包被液与缓冲液混合得到混合包被液，室温条件下利用混合包被液包被器皿得到包被器皿；

(3)将上述诱导液与培养基混合得到INDM诱导培养基；将灭活的血浆与INDM诱导培养基混合得到混合诱导培养基；

将上述活化液与培养基混合得到ACTM活化培养基；将灭活的血浆与ACTM活化培养基混合得到混合活化培养基；

将上述扩增液与培养基混合得到EXPM扩增培养基；

(4)利用步骤(3)得到的混合诱导培养基悬浮单个核细胞得到悬浮细胞，将悬浮细胞置于步骤(2)得到的包被器皿中进行培养，记为Day 0；

所述悬浮细胞中单个核细胞的密度为1.0～1.5×10⁶个/mL；

(5)Day 3时，离心培养的细胞得到细胞沉淀，利用步骤(3)得到的混合活化培养基重悬细胞沉淀得到重悬细胞；

(6)Day 5和Day 7时，分别向重悬细胞中添加一次ACTM活化培养基；

所述ACTM活化培养基的添加体积比为1：2；

(7)Day 9、Day 11和Day 13时，分别向重悬细胞中添加一次EXPM扩增培养基；

所述EXPM扩增培养基的添加体积比为2：2：1；

(8)Day 15时收获细胞。

优选的，步骤(2)中，所述包被液和缓冲液的体积比为1：9。

优选的，步骤(3)中，所述诱导液与培养基的体积比为1：49；

所述活化液与培养基的体积比为1：1000；

所述扩增液与培养基的体积比为1：2000；

所述培养基为ALyS505N-0培养基。

优选的，所述灭活的血浆与INDM诱导培养基的体积比为1：9；

灭活的血浆与ACTM活化培养基的体积比为1：9。

优选的，步骤(5)、步骤(6)和步骤(7)中，所述重悬细胞的细胞密度为5～7×10⁵个/mL。

本发明提供了一种NKT细胞高效培养试剂，本发明提供的试剂中包括包被液、诱导液、活化液和扩增液。包被液由CD3、CD40、CD147组成，其中CD3分子的胞浆区均含有ITAM，具有传导TCR信号的功能，使T细胞活化，CD3分子与TCR以非共价键结合形成TCR-CD3复合物，把TCR与抗原结合后产生的活化信号传递到细胞内，诱导T细胞活化；CD1d(NKT细胞受体一般由恒定的TCRα链和半恒定的TCRβ链组成，识别由非经典MHC I类分子CD1d提呈的脂质抗原。CD1d是一种结合自身和外来糖脂类的抗原提呈分子。CD1d分子可识别提呈神经苷酯，促进NKT细胞分化成熟。)将抗原提呈给NKT细胞后，可诱导NKT细胞表达CD40L，CD40与CD40L相互作用，促进iNKT细胞分化成熟，分泌IL-12、INF-γ等细胞因子，进而发挥免疫调节的功能。大多数NKT细胞由CD4⁺CD8⁺双阳性T细胞(DP)偏离于主流T细胞的发育、分化途径而产生，CD147在T细胞发育过程中起关键作用，属于免疫球蛋白超家族成员，是一个淋巴细胞活化相关抗原，通过细胞脂筏结构的识别和聚集，进而改变T细胞激活相关下游分子，使得未成熟T细胞被重编程成innate样淋巴细胞，包括NKT-like细胞。

诱导液包括卡介苗、草分枝杆菌和IL-2。卡介苗(结核分枝杆菌)与草分枝杆菌细胞壁抗原可结合CD1d分子，是NKT细胞的强激动剂，诱导NKT分化。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。IL-2联合卡介苗、草分枝杆菌同时作用于PBMC，可活化NKT细胞，使诱导信号升高，进一步获得更多以及纯度更高的NKT细胞。

活化液包括CD150、神经苷酯、IL-2、IL-12和IL-18。LAM家族受体CD150与其相应配体的结合能够调控NKT细胞的阳性选择，阴性T细胞由DP阶段向NKT细胞系方向分化发育。

扩增液包括甲泼尼龙、IL-2和IL-4。甲泼尼属于糖皮质激素，具有促进免疫细胞增殖、提高免疫细胞杀伤功能的作用。NKT细胞体外增殖离不开IL-2环境，IL-2对NKT细胞的增殖分裂及正常生理功能的位置至关重要。IL-4通过特异性受体亚单位及IL4受体γc亚单位复合受体，促进NKT细胞的增殖，增强NKT细胞细胞毒性而不引起活化产生的细胞凋亡。Il-2与IL-4因子优化组合对促进NKT细胞的增殖及细胞毒活性有重要作用。

上述组分可以刺激NKT细胞的增殖、细胞因子的分泌、调节NKT细胞的活化以及分化，能够有效提高获得高增殖量、高纯度、高杀伤性NKT细胞；由于本发明采用不含动物源成分的无血清细胞培养基，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，提高了试剂的安全性。同时，本发明提供的试剂采用的成分均为临床治疗级别药物或因子，避免了外源性动物成分的带入，对细胞的培养时无毒副作用的。

本发明提供的NKT细胞培养方法，无需使用细胞分选等系统，能够减轻患者痛苦及医疗成本。同时该培养方法还有操作标准化，能够有效减少操作误差的优势，实用性高，操作便捷。

配合使用本发明提供的剂与培养方法培养NKT细胞，培养周期仅为15天即可获得高纯度、高数量、高杀伤力的NKT细胞，具有培养周期短的优势。

综上，本发明提供的NKT细胞培养试剂及其培养方法，能够提高所获得的NKT细胞的纯度、数量，简单高效，既降低了细胞培养成本，又提高了细胞培养的安全性，使NKT细胞的培养标准化、规范化。为细胞治疗临床广泛应用和研究提供了优质的培养方案，所获得的NKT细胞纯度高、杀瘤活性强。

附图说明

图1为应用例中实验组培养方法与常规培养方法培养获得的细胞的生长曲线图；

图2为应用例中实验组培养方法培养的细胞在Day15时利用流式分析检测的结果图；

图3为应用例中常规培养方法培养的细胞在Day15时利用流式分析检测的结果图；

图4应用例中本发明提供的培养方法与常规培养方法，将细胞培养到Day15时检测对MOLT-4细胞杀伤性试验图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂厂商购买得到的。

本发明需要提示说明的实验环境、实验材料和仪器设备如下：

1、实验环境：GMP环境下实验室内的超净工作台中操作。

2、试剂：恒温自动加热仪、台盼蓝染色液、DPBS(珠海贝索生物技术有限公司)、ALyS505N-0无血清培养液(株式会社细胞科学研究所CSTI)，IgG1-APC、IgG1-FITC、α24-APC、CD3-FITC(美国贝克曼公司)，MOLT-4细胞株(遵义医学院珠海校区研发中心提供)MTT试剂盒、二甲亚砜、胎牛血清，人淋巴细胞分离液、肝素钠溶液。

3、仪器与设备：离心机(THERMO，美国)、T75cm²悬浮培养瓶细胞培养袋(日本NIPRO株式会社)、CO₂培养箱(三洋，中国)、程控降温仪(THERMO，美国)、超净工作台(智净、中国)、50mL离心管(BD，美国)、96孔板、酶联免疫检测仪、移液管、血细胞计数盘(株式会社细胞科学研究所CSTI)、液氮罐。

实施例1

包被液：CD3的有效浓度为2μg/mL、CD40的有效浓度为1μg/mL、CD147的有效浓度为1μg/mL；

诱导液：卡介苗的有效浓度为20μg/mL、草分枝杆菌的有效浓度为20μg/mL、IL-2的有效浓度为1000IU/ML；

活化液：CD150的有效浓度为1μg/mL、神经苷酯的有效浓度为10μg/mL、IL-2的有效浓度为1000IU/mL、IL-12的有效浓度为100IU/mL、IL-18的有效浓度为100IU/mL；

扩增液：IL-2的有效浓度为500IU/mL、IL-4的有效浓度为500IU/mL。

实施例2

采集1名健康志愿者人外周血，分离外周血的单个核细胞和血浆，进行本发明提供的NKT细胞培养方法(简称实验组)与NKT细胞培养常规方法(简称常规组)同时进行细胞培养，观察两种方法在细胞增殖倍数、NKT细胞表型及杀瘤活性差异。

1、本发明提供的NKT细胞培养方法(实验组)包括以下步骤：

(1)制备PMBC(人外周血单个核细胞)：采集50mL外周血，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃30min灭活(本发明选择恒温加热仪灭活，能够减小污染风险)，冷却至室温后离心(离心力为2000xg，离心时间为5min，可以充分去除变性的补体蛋白等成分)取上清保存于4～8℃备用。

用磷酸缓释液(PBS，本发明选用的是CSTI生产的无钙、镁离子的PBS)按1：1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次得到单个核细胞待用，最后一次洗涤前需要进行计数。

(2)包被培养瓶：吸取1mL实施例1提供的包被液加入9mL(磷酸盐缓冲液)DPBS中制备成混合包被液，将上述混合包被液加入T75培养瓶内，铺平培养瓶底，室温包被1小时。

(3)制备INDM诱导培养基：吸取1mL实施例1提供的诱导液加入49mL ALyS505N-0培养基内配制成INDM诱导培养基；ALyS505N-0无血清细胞培养基在使用前需要回温处理，回温条件为35～37℃，30min；

将步骤(1)提供的单个核细胞用50mL含10％步骤(1)提供的自体灭活血浆的INDM诱导培养基吹打均匀，使单个核细胞的密度范围为1.0～1.5×10⁶个/mL，装入步骤(2)提供的培养瓶静置于37℃5％CO₂培养箱培养得到细胞培养悬液，记为Day 0。

(4)Day3将培养瓶内的细胞培养悬液转移至50mL离心管内，500xg离心，弃上清，得到细胞沉淀。

(5)制备ACTM活化培养基：吸取1mL活化液加入1L ALyS505N-0培养基内配制成ACTM活化培养基；ALyS505N-0培养基需要回温处理，步骤同上；

取100mL含10％步骤(1)提供的自体灭活血浆的ACTM培养基重悬细胞，使细胞密度维持5～7×10⁵个/mL。

(6)Day 5转到细胞培养袋补加300mL ACTM活化培养基，day 7补加600mLACTM活化培养基，使细胞密度维持5～7×10⁵个/mL。

(7)制备EXPM扩增培养基：吸取1mL扩增液加入2L ALyS505N-0内配制成EXPM；

Day 9、Day 11、Day 13分别补加EXPM扩增培养基800mL、800mL、400mL，使细胞密度维持5～7×10⁵个/mL，静置于37℃5％CO₂培养箱培养。

(8)细胞培养至Day15，离心洗涤收集细胞，进行细胞数量检测。加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪进行表型检测，检测CD3⁺α24⁺比例。同时还可以进行杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。

2、NKT细胞培养常规方法(常规组)，包括以下步骤：

(1)采集40mL外周血小心地将注入到分离液上层，缓升缓降离心细胞，将外周血进行离心，吸取上层血浆，装入无菌离心管置于56℃水浴锅内进行30min灭活，冷却至室温后离心取上清保存于4℃备用；

吸取单个核细胞层并用PBS离心洗涤三次得到单个核细胞备用，最后一次洗涤需要进行计数。

(2)将单个核细胞接种到培养瓶，加入含IL-2(1000IU/mL)、α-Galcer(100ng/mL)的ALyS505N-0无血清细胞培养液50mL，使单个核细胞密度大于1.0～1.5×10⁶个/mL，同时加入10％灭活自体血浆，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

Day 3补添加含IL-2(1000IU/mL)的ALyS505N-0无血清细胞培养液；

Day5将细胞转移到T225cm²培养瓶中补添加含IL-2(1000IU/mL)的ALyS505N-0无血清细胞培养液；

Day7将细胞转转入细胞培养袋中扩大培养，Day9、Day11、Day13都是补添加含IL-2(1000IU/ml)的ALyS505N-0无血清细胞培养液。

(3)细胞培养至Day15，离心洗涤收集细胞，进行细胞数量检测。加入流式细胞检测荧光抗体，通过流式细胞仪进行表型检测，检测CD3⁺α24⁺比例。同时还可以进行杀瘤活性、内毒素、真菌细菌、支原体检测。

应用例

收集上述实验组和常规组培养Day15细胞用于各项测试，从以下几个方面比较这两种制备方法获得细胞的差异。

1、细胞增殖倍数的测定

收获培养Day15细胞，用血球计数板计算细胞总数，统计结果见图1。

由图1可知，在培养过程中实验组细胞增殖数量与常规组表现出了明显差异，实验组细胞的增殖数量与最后收获细胞数量均远远高于常规组，完全能够满足临床应用。

2、CD3⁺α24⁺NKT细胞表型检测

收获培养Day15细胞，洗涤后的细胞重悬至密度为1×10⁷个/mL，实验组和常规组各取两个管分别加入100μl的细胞悬液，其中一管加10μl IgG1-APC及10μl IgG1-FITC作为同型对照，另一管加5μlα24-APC及10μl CD₃-FITC作为样品检测；共同避光孵育15min后进行检测，检测结果如图2和图3所示。由图2和图3可知，实验组及常规组有明显差异，常规组CD3⁺α24⁺即NKT细胞纯度仅为49.4％，实验组CD3⁺α24⁺即NKT细胞纯度可达86.7％，NKT细胞表型远远高于常规组，显示本发明试剂及培养方法NKT细胞在NKT细胞表型上的优势。

3、NKT细胞对MOLT-4细胞的杀伤效果

利用MTT法检测其细胞毒性，收集对数生长期的MOLT-4细胞离心计数并调整密度为1×10⁵个/mL。在试验孔中按5：1、10：1、20：1一一对应加入效应细胞(NKT细胞)及靶细胞(MOLT-4细胞)各100μl，37℃、5％CO₂培养箱共培养15h，然后每孔加入MTT 20μl(5mg/mL)继续培养4h，弃掉上清并每孔加入Formazan(甲)溶解液110μl/孔，置于摇床低速振荡10min，在酶联免疫检测仪490nm处检测吸光值。

计算公式为：细胞毒作用(％)＝[1-(实验组值-单独效应细胞值)/单独靶细胞值]×100％。

检测结果如图4所示，由图4可知实验组及常规组提供的NKT细胞对MOLT-4细胞杀伤效果有明显差异，三个实验组相同效靶比杀伤功能都比相应常规组高，说明本发明提供的NKT培养试剂及培养方法所得到的NKT细胞展现出较高杀瘤活性。

终上所述，采用本发明提供的NKT培养试剂及培养方法培养所获得得NKT细胞在细胞数量、细胞表型及杀伤功能的方面，与常规方法相比均表现出明显优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种高效培养NKT细胞的试剂，其特征在于，所述试剂包括包被液、诱导液、活化液和扩增液；

所述包被液包括以下组分：CD3、CD40和CD147；

所述诱导液包括以下组分：卡介苗、草分枝杆菌和IL-2；

所述活化液包括以下组分：CD150、神经苷酯、IL-2、IL-12和IL-18；

所述扩增液包括以下组分：甲泼尼龙、IL-2和IL-4；

所述包被液包括以下浓度的组分：CD3 2~20 μg/mL、CD40 1~10 μg/mL和CD147 1~10 μg/mL；

所述诱导液包括以下组分：卡介苗1~50 μg/mL、草分枝杆菌μg/mL和IL-2 500 ~1000IU/mL；

所述活化液包括以下组分：CD150 1~10 μg/mL、神经苷酯1~50 μg/mL、IL-2 500 ~1000IU/mL、IL-12 10 ~200 IU/mL和IL-18 10 ~200 IU/mL；

所述扩增液包括以下组分：甲泼尼龙1×10^-8 ~1×10^-5 mol/L、IL-2 500 ~1000 IU/mL和IL-4 50 ~1000 IU/mL；

所述包被液的体积为1 mL、诱导液的体积为1 mL、活化液的体积为1 mL和扩增液的体积为1 mL；

一种快速培养NKT细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述高效培养NKT细胞的试剂。

2.权利要求1所述的试剂或所述的试剂盒在培养NKT细胞中的应用。

3.一种NKT细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分离血浆和单个核细胞；

（2）将权利要求1所述的包被液与缓冲液混合得到混合包被液，室温条件下利用混合包被液包被器皿得到包被器皿；

（3）将权利要求1所述的诱导液与培养基混合得到INDM诱导培养基；将灭活的血浆与INDM诱导培养基混合得到混合诱导培养基；

将权利要求1所述的活化液与培养基混合得到ACTM活化培养基；将灭活的血浆与ACTM活化培养基混合得到混合活化培养基；

将权利要求1所述的扩增液与培养基混合得到EXPM扩增培养基；

（4）利用步骤（3）得到的混合诱导培养基悬浮单个核细胞得到悬浮细胞，将悬浮细胞置于步骤（2）得到的包被器皿中进行培养，记为Day 0；

所述悬浮细胞中单个核细胞的密度为1.0~1.5×10⁶个/mL；

（5）Day 3时，离心培养的细胞得到细胞沉淀，利用步骤（3）得到的混合活化培养基重悬细胞沉淀得到重悬细胞；

（6）Day 5和Day 7时，分别向重悬细胞中添加一次ACTM活化培养基；

所述ACTM活化培养基的添加体积比为1：2；

（7）Day 9、Day 11和Day 13时，分别向重悬细胞中添加一次EXPM扩增培养基；

所述EXPM扩增培养基的添加体积比为2：2：1；

（8）Day 15时收获细胞。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述包被液和缓冲液的体积比为1：9。

5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中，所述诱导液与培养基的体积比为1：49；

所述活化液与培养基的体积比为1：1000；

所述扩增液与培养基的体积比为1：2000；

所述培养基为ALyS505N-0培养基。

6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中，所述灭活的血浆与INDM诱导培养基的体积比为1：9；

灭活的血浆与ACTM活化培养基的体积比为1：9。

7.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤（5）、步骤（6）和步骤（7）中，所述重悬细胞的细胞密度为5~7×10⁵个/mL。