CN109954139B - 苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用 - Google Patents

苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用。用苦参碱干预制备的胃癌树突状细胞疫苗可以促进树突状细胞的成熟，促进T细胞增殖，以及诱导增强体外抗胃癌效应。因此该佐剂的应用可增强胃癌树突状细胞疫苗的效价。该佐剂可以在制备胃癌树突状细胞疫苗中使用。本发明提供了一种将传统中药制剂苦参碱作为免疫佐剂促进DC疫苗效能的方案，为肿瘤的防治提供新途径。

Description

苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用。
背景技术
胃癌(Gastric cancer，GS)是全球癌症死亡的第三大原因，每年有超过78.3万人死于胃癌，在东亚发病率最高。值得注意的是，大多数确诊患者已处于晚期，预后较差，中位生存期为3-5个月。
随着FDA首次批准前列腺癌树突状细胞(Dendritic cells，DCs)疫苗，这项技术正在成为一种有希望的抗肿瘤的生物免疫治疗方法。然而，DC疫苗的局限性限制了临床试验的有效性。DC成熟度低是影响DC疫苗效能的主要因素之一，为了优化DC疫苗的抗肿瘤反应，克服肿瘤微环境的免疫抑制作用，在给药前DC应达到完全成熟和活化。因此，在外周血CD14+单核细胞或CD34+造血干细胞体外培养中，优化促进DC成熟的方案是最常用的方法。DCs可以通过多种方式促进其成熟。在实验室中，TLR激动剂如LPS(TLR4)、poly IC(TLR3)和resiquimod(TLR7)等常用作DC激活剂。这些TLR激动剂不仅影响DC的功能状态，而且在肿瘤微环境中产生具有负免疫调节作用的MDSCs和Tregs。在临床，常用的是促炎症细胞因子组合，即包含TNFα、IL-1β、PGE2的混合制剂。该制剂能够诱导CD40、CD80、CD86、CCR7和MHC I、II类分子上调，但未能有效诱导IL-12p70。另电穿孔亦可诱导DC成熟，在iDCs中表达TLR4、CD40L和CD70。然而，目前对诱导DC成熟的最佳方法仍然缺乏共识。
近年来，传统中药制剂在免疫治疗领域受到广泛关注。越来越多的证据表明，某些中药影响与免疫应答相关的免疫细胞，如DCs。此外，这些中药可能影响DCs的关键功能，包括分化、成熟、抗原表达和细胞因子的产生。苦参碱是从苦参根中分离得到的生物碱。虽然苦参碱的抗肿瘤作用已被广泛报道，但其对DC的作用尚无人报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用，苦参碱可以增强胃癌树突状细胞疫苗体外免疫治疗效果。本发明将苦参碱作为促进胃癌DC成熟、提高DC疫苗抗肿瘤作用的新策略。在DC促成熟阶段将苦参碱联合TLR激动剂LPS作用24小时接触可诱导DC成熟，促进T细胞增殖，并且可提高DC的抗原递呈能力，加强体外抗胃癌效能。从而提示在临床实践中加强自体DC疫苗效价在技术上是可行的。
本发明提供一种用于提高胃癌树突状细胞疫苗效价的免疫佐剂，所述免疫佐剂为苦参碱。
本发明提供苦参碱作为免疫佐剂在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用。
本发明提供上述免疫佐剂在提高树突状细胞成熟度中的应用。
本发明提供苦参碱作为免疫佐剂在诱导T细胞增殖中的应用。
本发明提供苦参碱作为免疫佐剂在增强体外针对胃癌的免疫治疗效能中的应用。
本发明提供胃癌树突状细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)在DC培养的第5天，将胃癌全抗原与DC细胞混合培养；
(2)在DC培养的第7天，加入100ng/ml LPS和60-240mg/ml苦参碱，恒温恒湿培养；
(3)药物干预24小时后即为制备成熟的胃癌树突状细胞疫苗。
作为优选，所述苦参碱的浓度为120-240mg/ml。
用苦参碱干预制备的胃癌树突状细胞疫苗可以促进树突状细胞的成熟，促进T细胞增殖，以及诱导增强体外抗胃癌效应。因此该佐剂的应用可增强胃癌树突状细胞疫苗的效价。该佐剂可以在制备胃癌树突状细胞疫苗中使用。本发明提供了一种将传统中药制剂苦参碱作为免疫佐剂促进DC疫苗效能的方案，为肿瘤的防治提供新途径。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为通过流式细胞术分析DC表面标志物的表达。
图2为IL-12p70的分泌水平检测。
图3为IFN-γ，TNF-αELISA检测结果。
图4为T细胞增殖结果。
图5为胃癌DC疫苗体外诱导肿瘤抗原特异性CTL的细胞毒性研究。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
一.MKN45胃癌细胞株复苏培养：
1.1取出放置于液氮罐中冻存的MKN45胃癌细胞，42℃水浴快速溶化；
1.2 1500rpm，5min离心沉淀冻存细胞，弃上清；
1.3 PBS离心洗涤细胞2次(1500rpm5min)；
1.4室温预温，含10％胎牛血清的DMEM培养基充分吹打重悬离心沉淀细胞，使成均匀细胞悬液；
1.5无菌细胞培养瓶中加入DMEM完全培养基各约10ml，分别加入huh7均匀细胞悬液，轻柔摇晃均匀；
1.6倒置显微镜观察，37℃，5％CO2相对饱和湿度培养箱中培养。
二.MKN45全抗原的制备
2.1将复苏培养的MKN45胃癌细胞，细胞密数量到1×109加入2ml冻存液，装入2mL冻存管中，程序降温4℃，30min，-20℃2小时，-80℃过夜，次日转液氮。
2.2液氮超低温冷冻细胞株，5min后取出，再迅速40-43℃水浴中解冻10min。震荡仪充分震荡反复三次。
2.3将肿瘤细胞裂解液加入离心管中，3000rpm，离心10min。
其中，肿瘤细胞裂解液即为2.1和2.2实验步骤中所得物。
2.4收集上清，0.22um微孔滤膜过滤除菌。
2.5-80℃保存备用。
三.外周血DC的分离培养：
3.1采集健康成年人外周全血60ml，肝素钠抗凝。
3.2将全血分装在三个50ml离心管中，每管约20ml。
3.3用PBS缓冲液按照体积比1:1稀释全血。
3.4取新的无菌50ml离心管，将淋巴细胞分离液(Ficoll)加入离心管中，每管约20ml。
3.5将3.3步骤稀释的全血按照每管20ml的量分别缓慢沿着管壁加入步骤3.4的离心管中。注意需动作轻柔，让血液平铺在淋巴细胞分离液上，不要浸入其中。
3.6离心1700rpm，20min，慢升慢降。
3.7用吸管小心旋转吸取中间的白膜层细胞至新的离心管中，上下可多吸0.5-1厘米，以免损失太多细胞。但切勿吸到红细胞。
3.8将吸取的白膜分装在50ml离心管中，加入PBS液至45ml。目的为去除杂质。
3.9离心1700rpm，10min。
3.10弃掉上清液，留下层沉淀，加入适量PBS洗涤细胞3次。
3.11离心1700rpm，离心10min。得到外周血单个核细胞(PBMC)。
3.12根据细胞量加一定量X-vivo20培养基混悬，血细胞计数仪测细胞密度，按照7×106/ml接种至25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2相对饱和湿度培养箱中培养4小时。
3.13 4小时取出培养瓶中的培养液及未贴壁细胞，得到贴壁细胞和未贴壁细胞。
3.14把得到的贴壁细胞每瓶加入10ml含GM-CSF 1000U/ml和IL-41000U/ml的X-VIVO20培养液诱导向DC分化。37℃，5％CO2相对饱和湿度培养箱中培养。
3.15第3天，半量换液一次补足GM-CSF 1000U/ml和IL-41000U/ml。
四.胃癌树突状细胞疫苗制备
4.1在DC培养的第5天，将步骤2.5中-80℃保存的胃癌细胞株裂解液提取的胃癌全抗原40-43℃水浴复苏，与DC细胞混合培养。DC：胃癌全抗原的体积比为＝1:20；
4.2在DC培养的第7天，加入LPS 100ng/ml诱导DC成熟，同时加入不同浓度苦参碱进行苦参碱干预分组。
4.3苦参碱干预分为四组，分别为：LPS，LPS+苦参碱60mg/ml，LPS+苦参碱120mg/ml，LPS+苦参碱240mg/ml。
苦参碱的购买厂家为百灵威科技有限公司，北京，中国。
4.4所有组均于37℃，5％CO2相对饱和湿度培养箱中培养。
4.5药物干预24小时后即为制备成熟的各组胃癌树突状细胞疫苗。
五.DC细胞、胃癌树突状细胞疫苗的表型流式检测：
5.1于DC培养第5天(未成熟DC)、7天(负载肿瘤抗原后48小时，半成熟DC)、10天(药物干预后第3天，成熟DC)、13天(药物干预后第6天，成熟DC)，分别取悬浮生长DC。
5.2 1700rpm5分钟离心沉淀，PBS洗涤细胞一次(1700rpm5分钟)。
5.3 PBS1.2ml吹打、重悬沉淀细胞，制备均匀单细胞悬液。
5.4分别加入6个小试管中并分别加入PE-CD80直标荧光单克隆抗体、PE-CD83直标荧光单克隆抗体、PE-HLA-DR直标荧光单克隆抗体及相应的对照。
5.5充分震荡均匀染色(4℃避光、30分钟)，染色结束后，再次充分震荡并行流式细胞仪细胞表型检测。
六.CTL细胞(细胞毒性T淋巴细胞)制备及LDH释放试验检测CTL杀伤效力。
6.1第3.13步骤获得的未贴壁细胞用于诱导培养T细胞。
6.2移液管吸取悬浮细胞，离心沉淀，计数，按2-5×106细胞数接种新的培养瓶，IL-21000U/ml+1640完全培养基+10％胎牛血清培养基10ml,37℃，5％CO2相对饱和湿度培养箱中培养，每三天半量换液。
6.3每7天以1:10的比例将不同苦参碱浓度干预处理的胃癌全抗原致敏的DCs疫苗加入T细胞。IL2+1640完全培养基2ml加入24孔板37℃，5％CO2相对饱和湿度培养箱中培养。
6.4 21天后收获CTL，收集上清液，评价CTL杀伤效果。将上述上清液分别以1:1、5:1、10:1、50:1、100:1的比例作为效应细胞加入目标MKN45细胞中，同样在DMEM培养基中培养。细胞共培养5h，收集上清液进行LDH释放试验，观察CTL杀伤效果。按照LDH释放试验试剂盒(Promega,Madison,USA)操作说明进行。
七.细胞因子分泌的ELISA检测
7.1 IL-12p70分泌的检测：
将第8天与苦参碱孵育24h后的成熟DC(mDC)培养上清液，离心收集，-80℃保存，检测IL-12的分泌情况。采用人IL-12p70高灵敏度ELISA试剂盒NeoBioscience(Shenzhen,China)，按照说明书操作步骤，检测上清液中IL-12p70的分泌水平。
7.2 IFN-γ和TNF-α分泌的检测：
在诱导CTL过程中，每组经苦参碱干预处理的胃癌DC疫苗与T细胞混合培养。检测时间点为诱导CTL的第17和21天。具体操作是按照ELISA试剂盒NeoBioscience(Shenzhen,China)步骤。
八.T细胞增殖实验。
采用CCK-8法检测T细胞增殖情况。各组经加入不同浓度苦参碱干预的DC疫苗，以1:10的比例与T细胞混合培养72h，采用CCK-8方法研究T细胞增殖情况，具体实验步骤按照说明书进行。
以下为实验结果：
一.苦参碱上调人单核细胞源性树突状细胞的成熟标记物和共刺激分子表达。
结果见图1和表1。
图1为通过流式细胞术分析DC表面标志物的表达。
由图1可知：单用LPS处理DC组的CD80，CD83双阳性为38.4％。在添加不同剂量苦参碱72h后的DC组中，CD80，CD83双阳性在DC上的表达分别为48.1％、56.6％和56.5％。
表1 DC表面标志物的表达
LPS+苦参碱120mg/mL组和240mg/mL组与单纯LPS组CD80表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。三组LPS+苦参碱组与单纯LPS组CD83表达差异有统计学意义(P<0.05)。报告的结果来源于三个独立的实验。
二.IL-12p70的分泌水平检测：
结果见图2。
图2为IL-12p70的分泌水平检测。
由图2可知，苦参碱干预组IL-12p70的分泌水平均明显高于单纯LPS组(P<0.05)。此外，IL12p70的表达随着苦参碱用量的增加而增加。但当剂量达到240mg/mL时，表达量下降，最佳剂量为120mg/mL。
三.IFN-γ，TNF-αELISA结果:
结果见图3。
图3为IFN-γ，TNF-αELISA检测结果。
在诱导CTL过程中，每组经苦参碱干预处理的胃癌DC疫苗与T细胞混合培养。检测时间点为诱导CTL的第17和21天。*表示各组间差异有统计学意义(P<0.05)。数据代表三个独立实验的平均值。
四.苦参碱能增强DC诱导T细胞增殖的能力:
结果见图4。
图4为T细胞增殖结果。
图4为各组经加入不同浓度苦参碱干预的DC疫苗，以1:10的比例与T细胞混合培养72h的结果。*表示各组间差异有统计学意义(P<0.05)。数据代表三个独立实验的平均值。
五.胃癌DC疫苗诱导肿瘤抗原特异性CTL的细胞毒性研究：
结果见图5。
图5为胃癌DC疫苗体外诱导肿瘤抗原特异性CTL的细胞毒性研究。将人胃癌MKN45细胞与CTL按E/T比值共孵育，以检测抗原提呈效率。*在E/T 100:1时，LPS加苦参碱120mg/mL和240mg/mL组与单独LPS组比较，P<0.05。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.苦参碱在制备胃癌树突状细胞疫苗中的应用，其特征在于：所述苦参碱作为树突状细胞疫苗体外成熟促进剂，所述苦参碱的浓度为60-240mg/mL。
2.苦参碱在制备提高胃癌树突状细胞成熟度的体外制剂中的应用，其特征在于：所述苦参碱的浓度为60-240mg/mL。
3.苦参碱在制备树突状细胞诱导T细胞增殖的制剂中的应用，其特征在于：所述苦参碱作为树突状细胞体外成熟促进剂，所述苦参碱的浓度为60-240mg/mL。
4.苦参碱在制备增强体外针对胃癌树突状细胞疫苗的免疫治疗效能的制剂中的应用，其特征在于：所述苦参碱作为树突状细胞疫苗体外成熟促进剂，所述苦参碱的浓度为60-240mg/mL。
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