CN116445406A - 一种脐带血来源nk细胞的体外简易培养体系和培养方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系和培养方法。所述体外简易培养体系包括激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2；所述激活培养液为包含140~180ug/mL抗‑Her2‑单克隆抗体、0.5~0.8ug/mL抗‑CD16‑单克隆抗体、10~30ug/mL层粘连蛋白和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液；所述活化培养液为包含30~80ng/mL IL‑15、5~15ng/mL IL‑21、10~50ng/mL IL‑18、5~15ng/mL IL‑1α、800~1200IU/mL IL‑2、30~80ng/mL PHA和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液。利用所述简易培养体系对脐带血来源NK细胞进行培养时，无需滋养层细胞且无需对培养瓶进行提前包被，简化了培养流程、提高了培养效率，同时获得的NK细胞具有较高的流式表达指标。

Description

一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系和培养方法
技术领域
本申请涉及免疫细胞治疗技术领域，尤其是涉及一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系和培养方法。
背景技术
NK细胞能直接杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞和受损细胞，且不受主要组织相容性复合体(MHC)限制，同时具有分泌多种细胞因子参与调节适应性免疫反应的能力。因此，NK细胞被认为是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能。同时NK细胞在肿瘤免疫中具有的重要作用，使得NK细胞过继免疫疗法成为一种治疗肿瘤的新策略。
但是NK细胞的临床应用同时受到其数量的限制，NK细胞在外周血中仅占淋巴细胞的10-15％，在脐带血中NK细胞的含量更低，只有5％左右，远远不能满足临床治疗的需要。因此用于肿瘤免疫治疗的NK细胞主要通过对成人外周血单个核细胞和新生儿脐带血单个核细胞进行体外诱导扩增技术获得。目前人NK细胞诱导扩增方法，主要是基于IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21等细胞因子组合的培养体系诱导成人外周血单个核细胞进行扩增，并且培养过程中需要用到滋养层细胞或者需要提前对培养瓶进行包被。然而在培养过程中采用滋养层细胞不仅会导致培养过程复杂、培养效率低，而且选用的饲养层细胞为肿瘤细胞，尽管从理论上讲，经过相应处理的肿瘤细胞已经不再具备增殖的可能性，但其潜在风险难以证明可以完全排除，而且将正常细胞与肿瘤细胞共培养，然后将培养后的NK细胞回输体内，确实存在难以克服的临床伦理障碍。对培养瓶进行提前包被虽然不存在临床理论障碍，但是包被过程均需提前一天晚上进行，不能对紧急样品进行立即检测，培养过程同样复杂培养效率也低。
因此，需要提供一种培养过程中不需要提前对培养瓶进行包被的NK细胞的体外简易培养方法。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系，利用所述体外简易培养体系对脐带血来源NK细胞进行培养时，无需滋养层细胞且无需对培养瓶进行提前包被，简化了培养流程、降低了成本且极大地提高了培养效率，同时获得的NK细胞具有较高的流式表达指标，不仅可以满足临床需要，而且为细胞治疗的产业化奠定了基础。
为此，本申请第一方面提供了一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系，所述体外简易培养体系包括激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2；
所述激活培养液为包含140～180ug/mL抗-Her2-单克隆抗体、0.5～0.8ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、10～30ug/mL层粘连蛋白和1～5v/v％人血小板裂解物的基础培养液；
所述活化培养液为包含30～80ng/mL IL-15、5～15ng/mL IL-21、10～50ng/mLIL-18、5～15ng/mL IL-1α、800～1200IU/mL IL-2、30～80ng/mL PHA和1～5v/v％人血小板裂解物的基础培养液。
本申请所述激活培养液中的抗-CD16-单克隆抗体能够结合NK细胞表面的CD16位点，增强细胞因子(如IL-2、IL-15和IL-21)对NK细胞的刺激，以及ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用，进而诱导NK细胞活化，提高NK细胞的扩增效率，并获得更高纯度的NK细胞。抗-Her2-单克隆抗体能够特异性识别Her2蛋白受体，抑制其介导的信号转导，是ADCC的潜在介质，在NK细胞增殖和功能调节中具有重要作用，能够有效刺激NK细胞使细胞激活。层粘连蛋白分子量为805kD，由一个400kD的α链和两条200kD左右的β链组成，是细胞外间质中的一种非胶原性结构蛋白，为细胞黏着于基质的介质。本申请人的发明人创造性的发现，层粘连蛋白能够提升抗-Her2-单克隆抗体对NK细胞的体外激活作用，提高抗-Her2-单克隆抗体的诱导活性，二者协同使用能够显著提升诱导效果并提升细胞的增殖能力。人血小板裂解物含有细胞生长所需的所有生长因子和蛋白质，能够为细胞的生长提供营养物质，进而提高细胞的增殖能力。
本申请所述活化培养液中的细胞因子(IL-15、IL-21、IL-18、IL-1α、IL-2)能够刺激NK细胞使其大量扩增，促进NK细胞的大量增殖，并且提高其细胞的杀伤活性。PHA(植物血凝素)是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞，刺激机体产生IL-2和干扰素，进而有效刺激NK细胞的增殖。同时人血小板裂解物同样用于为NK细胞的生长提供营养物质，进而提高细胞的增殖能力。
本申请通过采用上述组成的激活培养液，在不需要对培养瓶进行提前包被的情况下，能够有效对接种的脐带血单个核细胞进行刺激和激活，使其快速适应体外培养坏境，进而提高NK细胞的增殖能力。同时上述组成的激活培养液与在上述组成的活化培养液存在协同复合效果，通过在细胞的不同培养阶段添加所述激活培养液和活化培养液，在二者的共同配合下，提升了对NK细胞的诱导效果，促进NK细胞的大量增殖，培养产物中流式指标的纯度高，并且提高其细胞的杀伤活性。
本申请中的人血小板裂解物为市售产品，本领域技术人员可根据需要采购使用。
在一些优选的实施方式中，所述激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体的含量为150～170ug/mL，抗-CD16-单克隆抗体的含量为0.6～0.7ug/mL，层粘连蛋白的含量为15～25ug/mL，人血小板裂解物的含量为2～3v/v％。
本申请通过进一步将激活培养液中的各组分的含量控制在上述范围内，能够使所述激活培养液的效果更佳，进而进一步提高了NK细胞的增殖能力和细胞杀伤活性。
在一些实施方式中，所述激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为(5～10):1。在一些优选的实施方式中，所述激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为8:1。
本申请通过将激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的用量关系控制在上述范围内，能够更好地发挥二者之间的协同作用，进一步提升NK细胞的诱导效果并提升NK细胞的增殖能力。
在一些实施方式中，所述活化培养液中还包含20～50ng/mL的维生素C磷酸酯钠。
本申请中，维生素C磷酸酯钠是一种维生素C衍生物，有抗氧化活性，可以促进细胞的生长、增殖，提高细胞存活率。本申请的发明人通过研究发现，当在活化培养液中进一步添加维生素C磷酸酯钠后，维生素C磷酸酯钠与PHA之间存在协同作用，进而使NK细胞的增殖能力更佳。
在一些实施方式中，所述活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为(1～3):1。在一些优选的实施方式中，所述活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为2:1。
本申请通过将活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的用量关系控制在上述范围内，能够更好地发挥二者之间的协同作用，进一步提升NK细胞的增殖能力和细胞杀伤活性。
在一些实施方式中，所述扩增培养液1为包含800～1200IU/mL IL-2和1～5v/v％人血小板裂解物的基础培养液；所述扩增培养液2为包含800～1200IU/mL IL-2的基础培养液。
本申请所述扩增培养液1和扩增培养液2中均含有对NK细胞刺激作用的IL-2，通过采用上述组成的扩增培养液1和扩增培养液2能够有效对NK细胞进行增殖，实现细胞的大量体外增殖。
本申请对所述激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2中的基础培养基没有明确限定，本领域中细胞培养时采用的常规基础培养基均可以使用，成本低廉。例如，所述基础培养基可以为IMDM培养基、EMDM培养基、DMDM培养基、RPMI1640培养基、KBM581培养基或KBM 551培养基等。值得注意的是，本申请中采用的基础培养基中均不含有动物源血清，有效降低了临床使用风险。
本申请第二方面提供了一种采用如本申请第一方面所述的体外简易培养体系对脐带血来源NK细胞进行培养的方法，所述方法包括如下步骤：
S1，将分离的脐带血单个核细胞与所述激活培养液混合后的细胞混合液接种于未经包被的培养瓶中，培养2～3天，获得第一培养物；
S2，将所述第一培养物与所述活化培养液混合后培养2～3天，获得第二培养物；
S3，将所述第二培养物与所述扩增培养液1混合后培养4～6天，获得第三培养物；
S4，将所述第三培养物与所述扩增培养液2混合后培养8～10天，获得第四培养物；
S5，收集第四培养物中的NK细胞。
本申请所述方法通过在细胞培养的不同阶段添加所述体外简易培养体系中相应的培养液，能够有效对NK细胞进行诱导和增殖，培养过程简单、细胞培养效率高且扩增倍数高，同时NK细胞培养产物中流式指标的纯度高，且NK细胞的细胞杀伤活性优异。将细胞产品赋予了“off the shelf”的特点，为临床上细胞申请和应用的简化了步骤、缩短了时间，为细胞治疗产品化和产业化提供了可行性的条件
本申请中，所述培养过程的培养条件为细胞培养的常规条件，例如所述培养条件为：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
本申请步骤S1中，所述脐带血单个核细胞的分离方式例如可以为密度梯度离心法。在一些具体实施方式中，所述脐带血单个核细胞的分离方法包括：
转移脐带血标本：血袋塑料管用碘伏擦拭，使用经灭菌消毒的剪刀在消毒处剪断塑料管，把血袋中的脐带血倾倒入离心管中，将脐带血袋移至热合机中封口后丢弃；
离心分离：将离心管配平，1363g离心10min，升速设为8降速设为5，将离心后血浆废弃；单个核细胞的分离：用氯化钠注射液按1:2比例稀释脐带血有形成分，混匀；将30mL稀释的血标本缓慢加入盛有室温的15mL人淋巴细胞分离液(Ficoll)的50mL无菌离心管中(方法如下：用10mL的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5cm处，让第一滴血沿管壁缓慢自然滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后缓慢匀速转动离心管，同时匀速缓慢加入血样)，配平后800g离心20min，升速设为4降速设为4；离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、CBMC层(白膜层)和血浆氯化钠注射液层；吸取血浆层弃之，直至距白膜层5mm处，小心将粒细胞层之上的所有液体转移至50mL(或250mL)无菌离心管中，补充等体积的氯化钠注射液，混匀；
洗涤：800g离心10min，升速设为8降速设为6，弃上清，用30mL氯化钠注射液重悬细胞，混匀；
细胞计数：吸取0.5mL细胞悬液加入EP管中，混匀后细胞计数，补充氯化钠注射液至45mL，300g离心10min，升速设为8降速设为6，离心后弃去上清。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述细胞混合液中的脐带血单个核细胞的细胞密度为(1～5)×106个/mL。
本申请根据分离的单个核细胞的计数结果配制细胞混合液，使细胞混合液中的脐带血单个核细胞的细胞密度为(1～5)×106个/mL。通过将细胞混合液中脐带血单个核细胞的细胞密度控制在上述范围内，更利于NK细胞的激活和增殖。
在一些实施方式中，所述激活培养液、活化培养液、扩增培养液1与扩增培养液2的体积比为1:(0.5～1.5):(5～10):(60～80)。在一些具体实施方式中，所述激活培养液、活化培养液、扩增培养液1与扩增培养液2的体积比为1:1:8:70。
本申请在培养过程的不同阶段添加上述用量的各培养液，使得NK细胞充分吸收所述的培养液中的养分并接受信号分子的刺激，提高扩增的细胞收率以及细胞活性。细胞开始培养后可以定期观察不同视野下的细胞，主要观察其形态轮廓、数目及增殖情况、细胞碎片及杂质情况、是否有细胞富集现象等，以进行培养参数相应的调整。
本申请步骤S5中收集后的NK细胞可以直接使用，也可以与冻存液混合后在低温(-200℃)下进行储存。
本申请第三方面提供了一种如本申请第二方面所述方法培养的NK细胞在制备用于预防和/或治疗免疫性疾病和/或肿瘤的药物中的应用。
本申请所述方法在NK细胞培养过程中无需滋养层细胞、无需提前包被培养瓶，无需使用动物源血清，有效降低了临床使用风险，同时收获的NK细胞具有较高的流式表达指标，较强的细胞的杀伤活性，可以满足临床需要，进而较好地应用在制备预防和/或治疗免疫性疾病和/或肿瘤的药物中，应用前景良好。
综上所述，本申请的有益技术效果为：本申请提供的脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系中的激活培养液中含有特定含量的抗-CD16-单克隆抗体、抗-Her2-单克隆抗体、层粘连蛋白和人血小板裂解物，采用上述组成的激活培养液，在不需要对培养瓶进行提前包被和使用滋养层细胞的情况下，能够有效对接种的脐带血单个核细胞进行刺激和激活，使其快速适应体外培养坏境，进而提高NK细胞的增殖能力；同时在活化培养液的配合下，提升了对NK细胞的诱导效果，促进NK细胞的大量增殖，培养产物中流式指标的纯度高，并且提高其细胞的杀伤活性。培养的NK细胞可在深低温长期保存，在使用时进行复温即可，将细胞产品赋予了“off the shelf”的特点，为临床上细胞申请和应用简化了步骤、缩短了时间，为细胞治疗产品化和产业化提供了可行性的条件。
附图说明
图1实施例1中Day0时细胞混合液中流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果图。
图2实施例1中Day20时NK细胞培养物中流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果图。
图3对比例3中Day20时NK细胞培养物中流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果图。
图4实施例5中Day0时细胞混合液中流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果图。
图5实施例5中Day20时NK细胞培养物中流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果图。
图6对比例4中Day20时NK细胞培养物中流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：脐带血来源NK细胞的培养
1.1Day0：将一份120mL的脐血从血袋中转移至50mL离心管中，5个离心管配平，1363g离心10min，升速8降速5；将离心后血浆分别取1.5mL于冻存管中，-20℃保存留样；2～3mL于采血管中进行传染病委托检测，剩余血浆废弃。用氯化钠注射液按1:2比例稀释离心后的细胞沉淀，将30mL稀释的细胞悬液缓慢加入到盛有室温的15mL Ficoll的50mL离心管中。5个离心管配平后800g离心20min，升速4降速4；离心完毕后，弃去血浆层，将CBMC(脐带血单个核细胞)转移到新的50mL离心管中，加入氯化钠注射液，混匀，800g离心10min；离心后弃上清，用30mL的氯化钠注射液重悬细胞，混匀，取样计数；计数结果：白细胞数(也即CBMC数)：总数36.9×107个；淋巴细胞数(LYM)：总数17.4×107个；红细胞数(RBC)：总数0.6×109个；血小板(PLT)：总数45.3×109个；补充氯化钠注射液至45mL，300g离心10min(分离的CBMC用于本申请实施例1-5和对比例1-3的培养)。
根据细胞计数结果，用50mL激活培养液重悬细胞，然后将细胞混合液接种到未经包被的T175培养瓶(接种瓶数：1瓶)中；CBMC的接种密度为：3.7×106个/mL。其中，激活培养液为包含160ug/mL抗-Her2-单克隆抗体、0.67ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、20ug/mL层粘连蛋白和2.5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为8:1)。从培养瓶中取样进行流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果见表2和图1。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.2Day 3：从培养箱取出培养瓶，每瓶添加50mL活化培养液，活化培养液为包含50ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、30ng/mL IL-18、10ng/mL IL-1α、1000IU/mL IL-2、50ng/mL PHA和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.3Day 6：从培养箱取出培养瓶，每瓶添加150mL扩增培养液1，扩增培养液1为包含1000IU/mL IL-2和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱继续培养2天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.4Day 8：从培养箱取出培养瓶，每瓶再次添加250mL扩增培养液1，此时总体积为500mL；分2瓶培养。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.5Day 11：从培养箱取出培养瓶，将每瓶培养瓶中的细胞混匀，并分别转移至细胞培养袋中，再向每瓶培养瓶中加入250mL扩增培养液2，将培养瓶中残留细胞转移至细胞培养袋中，总体积为1000mL；其中，扩增培养液2为包含1000IU/mL IL-2的KBM 581基础培养液。将培养袋放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.6Day 14：从培养箱取出培养袋，每袋再次添加500mL扩增培养液2，总体积达2000mL。将培养袋放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.7Day 17：从培养箱取出培养袋，每袋再次添加1000mL扩增培养液2，总体积达4000mL。将培养袋放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.8Day 20：从培养箱取出2袋培养袋，反复轻轻按压培养袋以混匀培养液中的细胞，从培养袋中取4000mL细胞悬液至250mL离心管中，配平300g离心10min；离心完成后，弃上清，用150mL的氯化钠注射液重悬细胞，混匀，制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2和图2。
根据计数结果按照体积比DMSO:人血白蛋白:NK培养液＝1:3:6配制200mL冻存液，预冷40min；细胞离心去上清后，用100mL冻存液重悬细胞，分装至10个50mL离心管中，补加冻存液总体积至20mL/个，最后一支取0.5mL混悬液做无菌检测(血平皿)，离心管标注细胞编码、冻存日期。
实施例2：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例1，不同之处在于，采用的激活培养液为包含140ug/mL抗-Her2-单克隆抗体0.5ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、10ug/mL层粘连蛋白和1v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为14:1)。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例3：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例1，不同之处在于，采用的激活培养液为包含180ug/mL抗-Her2-单克隆抗体0.8ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、30ug/mL层粘连蛋白和5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为6:1)。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例4：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例1，不同之处在于，采用的激活培养液为包含160ug/mL抗-Her2-单克隆抗体、0.67ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、16ug/mL层粘连蛋白和2.5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为10:1)。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例5：脐带血来源NK细胞的培养
1.1Day0：将一份105mL的脐血从血袋中转移至50mL离心管中，4个离心管配平，1363g离心10min，升速8降速5；将离心后血浆分别取1.5mL于冻存管中，-20℃保存留样；2～3mL于采血管中进行传染病委托检测，剩余血浆废弃。用氯化钠注射液按1:2比例稀释离心后的细胞沉淀，将30mL稀释的细胞悬液缓慢加入到盛有室温的15mL Ficoll的50mL离心管中。4个离心管配平后800g离心20min，升速4降速4；离心完毕后，弃去血浆层，将CBMC(脐带血单个核细胞)转移到新的50mL离心管中，加入氯化钠注射液，混匀，800g离心10min；离心后弃上清，用30mL的氯化钠注射液重悬细胞，混匀，取样计数；计数结果：白细胞数(也即CBMC数)：总数21.0×107个；淋巴细胞数(LYM)：总数13.2×107个；红细胞数(RBC)：总数0.3×109个；血小板(PLT)：总数7.8×109个；补充氯化钠注射液至45mL，300g离心10min(分离的CBMC用于本申请实施例5-10和对比例4的培养)。
根据细胞计数结果，用50mL激活培养液重悬细胞，然后将细胞混合液接种到未经包被的T175培养瓶(接种瓶数：1瓶)中；CBMC的接种密度为：2.1×106个/mL。其中，激活培养液为包含160ug/mL抗-Her2-单克隆抗体、0.67ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、20ug/mL层粘连蛋白和2.5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为8:1)。从培养瓶中取样进行流式细胞表型检测(CD3-CD56+)检测结果见表2和图4。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.2Day 3：从培养箱取出培养瓶，每瓶添加50mL活化培养液，活化培养液为包含50ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、30ng/mL IL-18、10ng/mL IL-1α、1000IU/mL IL-2、50ng/mL PHA和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.3Day 6：从培养箱取出培养瓶，每瓶添加150mL扩增培养液1，扩增培养液1为包含1000IU/mL IL-2和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱继续培养2天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.4Day 8：从培养箱取出培养瓶，每瓶再次添加250mL扩增培养液1，此时总体积为500mL；分2瓶培养。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.5Day 11：从培养箱取出培养瓶，将每瓶培养瓶中的细胞混匀，并分别转移至细胞培养袋中，再向每瓶培养瓶中加入250mL扩增培养液2，将培养瓶中残留细胞转移至细胞培养袋中，总体积为1000mL；其中，扩增培养液2为包含1000IU/mL IL-2的KBM 581基础培养液。将培养袋放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.6Day 14：从培养箱取出培养袋，每袋再次添加500mL扩增培养液2，总体积达2000mL。将培养袋放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.7Day 17：从培养箱取出培养袋，每袋再次添加1000mL扩增培养液2，总体积达4000mL。将培养袋放置于二氧化碳培养箱继续培养3天，培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
1.8Day 20：从培养箱取出2袋培养袋，反复轻轻按压培养袋以混匀培养液中的细胞，从培养袋中取4000mL细胞悬液至250mL离心管中，配平300g离心10min；离心完成后，弃上清，用150mL的氯化钠注射液重悬细胞，混匀，制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2和图5。
根据计数结果按照体积比DMSO:人血白蛋白:NK培养液＝1:3:6配制200mL冻存液，预冷40min；细胞离心去上清后，用100mL冻存液重悬细胞，分装至10个50mL离心管中，补加冻存液总体积至20mL/个，最后一支取0.5mL混悬液做无菌检测(血平皿)，离心管标注细胞编码、冻存日期。
实施例6：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例5，不同之处在于，采用的活化培养液为包含80ng/mL IL-15、15ng/mL IL-21、50ng/mL IL-18、15ng/mL IL-1α、1200IU/mL IL-2、80ng/mL PHA和5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例7：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例5，不同之处在于，采用的活化培养液为包含30ng/mL IL-15、5ng/mL IL-21、10ng/mL IL-18、5ng/mL IL-1α、800IU/mL IL-2、30ng/mL PHA和1v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例8：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例5，不同之处在于，采用的活化培养液为包含50ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、30ng/mL IL-18、10ng/mL IL-1α、1000IU/mL IL-2、50ng/mL PHA、25ng/mL维生素C磷酸酯钠和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为2:1)。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例9：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例5，不同之处在于，采用的活化培养液为包含50ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、30ng/mL IL-18、10ng/mL IL-1α、1000IU/mL IL-2、50ng/mL PHA、50ng/mL维生素C磷酸酯钠和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为1:1)。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
实施例10：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例5，不同之处在于，采用的活化培养液为包含50ng/mL IL-15、10ng/mL IL-21、30ng/mL IL-18、10ng/mL IL-1α、1000IU/mL IL-2、50ng/mL PHA、20ng/mL维生素C磷酸酯钠和2v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液(活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为2.5:1)。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
对比例1：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例1，不同之处在于，采用的激活培养液为包含180ug/mL抗-Her2-单克隆抗体、0.67ug/mL抗-CD16-单克隆抗体和2.5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
对比例2：脐带血来源NK细胞的培养
培养过程基本同实施例1，不同之处在于，采用的激活培养液为包含0.67ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、180ug/mL层粘连蛋白和2.5v/v％人血小板裂解物的KBM 581基础培养液。
细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2。
对比例3：脐带血来源NK细胞的培养
使用市售商品化的培养体系，按说明书进行培养瓶包被及按流程进行细胞培养。细胞培养时CBMC的初始接种密度为：3.7×106个/mL，与实施例1一致。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2和图3。
对比例4：脐带血来源NK细胞的培养
使用市售商品化的培养体系，按说明书进行培养瓶包被及按流程进行细胞培养。细胞培养时CBMC的初始接种密度为：2.1×106个/mL，与实施例5一致。
培养结束后制得NK细胞培养物，取样进行细胞计数和流式细胞表型检测(CD3-CD56+)，细胞计数结果见表1，流式细胞表型检测结果见表2和图6。
表1
表2
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从表1、表2和图1-3中实施例1和对比例3的检测结果可知，相较于对培养瓶进行提前包被的培养方式，采用本申请的培养体系对接种的脐带血单个核细胞进行培养时，在不需要对培养瓶进行提前包被的情况下，能使NK细胞增殖能力更佳，且制得的NK细胞培养物中流式指标(CD3-CD56+细胞)的纯度更高。说明本申请中的激活培养液能够有效对接种的脐带血单个核细胞进行刺激和激活，促进NK细胞的大量增殖，并提高培养产物中流式指标的纯度。从表1和表2中实施例1-4和对比例1-2的检测结果可知，当激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体的含量为150～170ug/mL，抗-CD16-单克隆抗体的含量为0.6～0.7ug/mL，层粘连蛋白的含量为15～25ug/mL，人血小板裂解物的含量为2～3v/v％，且抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为(7～9):1时，更有利于提升激活培养液的效果。
从表1、表2和图4-6中实施例5和对比例4的检测结果可知，相较于对培养瓶进行提前包被的培养方式，采用本申请的培养体系对接种的脐带血单个核细胞进行培养时，在不需要对培养瓶进行提前包被的情况下，能使NK细胞增殖能力更佳，且制得的NK细胞培养物中流式指标(CD3-CD56+细胞)的纯度更高。从表1和表2中实施例6-10的检测结果可知，当在活化培养液中进一步添加20～50ng/mL的维生素C磷酸酯钠后，维生素C磷酸酯钠与PHA之间存在协同作用，使得NK细胞的增殖能力更强，并使培养产物中流式指标的(CD3-CD56+细胞)的纯度更高，且当活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为2:1时，能够更好地发挥二者之间的协同作用，更有利于提升活化培养液的效果。
测试例1：细胞杀伤毒性检测
取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，将效应细胞(实施例1、5、8和对比例1-3培养的NK细胞)和靶细胞各0.1mL(E/T＝100:1)加入40孔细胞培养板的孔中，每份标本设3复孔，取平均值。同时设靶细胞自然释放对照组(0.1mL靶细胞+0.1mL培养液)和最大释放对照组(0.1mL靶细胞+0.1mL1％NP-40液)，低速离心1000r/min，2min后，置37℃、5％CO2温箱中孵育2h。
2h后取出培养物，吸取各孔上清0.1mL加于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的LDH底物溶液0.1mL，室温避光反应15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μL，以终止酶促反应。用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算杀伤细胞活性，结果如表3所示。
杀伤活性(％)＝[(实验组OD值-自然释放OD值)/(最大释放OD值-自然释放OD值)]×100％。
表3
OD值(A450nm) 杀伤活性(％)
自然释放 0.103 -
最大释放 0.446 -
实施例1 0.206 29.7
实施例5 0.247 42.0
实施例8 0.265 47.2
对比例1 0.179 22.1
对比例2 0.154 14.9
对比例3 0.192 26.0
从表3中实施例1和对比例1-3的检测结果可知，相较于对培养瓶进行提前包被的培养方式，采用本申请的培养体系对接种的脐带血单个核细胞进行培养时，在不需要对培养瓶进行提前包被的情况下，能使NK细胞培养物的细胞杀伤毒性更强，且当激活培养液中同时含有抗-Her2-单克隆抗体和层粘连蛋白时，二者之间存在协同作用，进一步提升NK细胞培养物的细胞杀伤毒性。从实施例5和8的检测结果可知，当在活化培养液中添加维生素C磷酸酯钠后，维生素C磷酸酯钠与PHA之间存在协同作用，有助于提升NK细胞培养物的细胞杀伤毒性。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系，其特征在于，所述体外简易培养体系包括激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2；
所述激活培养液为包含140~180ug/mL抗-Her2-单克隆抗体、0.5~0.8ug/mL抗-CD16-单克隆抗体、10~30ug/mL层粘连蛋白和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液；
所述活化培养液为包含30~80ng/mL IL-15、5~15ng/mL IL-21、10~50ng/mL IL-18、5~15ng/mL IL-1α、800~1200IU/mL IL-2、30~80ng/mL PHA和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液。
2.根据权利要求1所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体的含量为150~170ug/mL，抗-CD16-单克隆抗体的含量为0.6~0.7ug/mL，层粘连蛋白的含量为15~25ug/mL，人血小板裂解物的含量为2~3v/v%。
3.根据权利要求2所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述激活培养液中抗-Her2-单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为（5~10）:1。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述活化培养液中还包含20~50ng/mL的维生素C磷酸酯钠。
5.根据权利要求4所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为（1~3）:1。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述扩增培养液1为包含800~1200IU/mL IL-2和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液；所述扩增培养液2为包含800~1200IU/mL IL-2的基础培养液。
7.一种采用如权利要求1-6中任意一项所述的体外简易培养体系对脐带血来源NK细胞进行培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1，将分离的脐带血单个核细胞与所述激活培养液混合后的细胞混合液接种于未经包被的培养瓶中，培养2~3天，获得第一培养物；
S2，将所述第一培养物与所述活化培养液混合后培养2~3天，获得第二培养物；
S3，将所述第二培养物与所述扩增培养液1混合后培养4~6天，获得第三培养物；
S4，将所述第三培养物与所述扩增培养液2混合后培养8~10天，获得第四培养物；
S5，收集第四培养物中的NK细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞混合液中的脐带血单个核细胞的细胞密度为（1~5）×106个/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述激活培养液、活化培养液、扩增培养液1与扩增培养液2的体积比为1:（0.5~1.5）: （5~10）: （60~80）。
10.一种如权利要求7-9中任意一项所述方法培养的NK细胞在制备用于预防和/或治疗免疫性疾病和/或肿瘤的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113811315A (zh) * 2019-01-18 2021-12-17 育世博生物科技股份有限公司 一种新颖的cd16阳性自然杀手细胞及一种培养cd16阳性自然杀手细胞的方法
CN116179488A (zh) * 2023-03-09 2023-05-30 广东唯泰生物科技有限公司 外周血自然杀伤细胞的体外扩增方法

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