CN113811315A - 一种新颖的cd16阳性自然杀手细胞及一种培养cd16阳性自然杀手细胞的方法 - Google Patents

一种新颖的cd16阳性自然杀手细胞及一种培养cd16阳性自然杀手细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人类CD16阳性自然杀手细胞系。所述人类CD16阳性自然杀手细胞系不包含合成的、基因改造的或特意提供的编码CD16受体多核苷酸，同时为一非致瘤性细胞系。因此，所述人类CD16阳性自然杀手细胞系在用于疾病治疗时可提供可观的长期安全性。

Description

一种新颖的CD16阳性自然杀手细胞及一种培养CD16阳性自然 杀手细胞的方法
【技术领域】
本发明是关于一种CD16阳性自然杀手细胞和一种培养CD16阳性自然杀手细胞的方法；特别是关于一种非转基因且没有致癌性的CD16阳性自然杀手细胞系，和一种能大量增殖CD16阳性自然杀手细胞并维持CD16表达的培养方法。
【先前技术】
自然杀手(NK)细胞是淋巴细胞，为先天免疫系统(innate immune system)中的一个重要组成，其最广为人知的功能为对病毒感染的先天防御(innate defense)及对肿瘤细胞的免疫监测(surveillance)。在人体中，自然杀手细胞常透过没有T细胞受体复合物(Tcell receptor complex；CD3阴性)，但有神经元黏附分子(neural cell adhesionmolecule；CD56阳性)而被正统地识别。在人体周边血液中，自然杀手细胞主要有两大亚群，其中大多数(超过90％)的周边血液自然杀手细胞为CD3阴性CD56低表达CD16阳性自然杀手细胞，而少部分(10％)的周边血液自然杀手细胞为CD3阴性CD56高表达CD16阴性自然杀手细胞(Orange JS,2013)。
CD16受体(FcγRIII，是一种IgGFc区的受体，可结合于IgG抗体上的Fc部分)是人类自然杀手细胞在执行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cellcytotoxicity；ADCC)作用时所必须的。在人体中，编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的1q23.3位点(1q23.3)。表达CD16受体的人类自然杀手细胞可透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用杀死多种目标细胞，例如癌细胞、肿瘤细胞和被人类免疫缺乏病毒(HIV)所感染的细胞(Rezvani K and Rouce RH,2015；Littwitz-Salomon et al,2016；Eileen Scully and Galit Alter,2016)。举肿瘤细胞为例，表达肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens；例如人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2，称为HER2)的肿瘤细胞能与内源性IgG抗体(endogenous IgG antibodies)或经临床核准且靶向肿瘤相关抗原的治疗性IgG抗体(clinically approved therapeuticIgG antibodies targetingthe tumor-associated antigens；如贺癌平(trastuzumab)、莫须瘤(rituximab)、或西妥昔单抗(cetuximab))结合。一旦一自然杀手细胞所表达的CD16受体(IgGFc的受体，FcγRIII)与内源性IgG抗体或经临床核准的治疗性IgG抗体的Fc区域结合，将诱发自然杀手细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用，且该自然杀手细胞将进而释放细胞毒性因子(cytotoxic factors)导致肿瘤细胞死亡(Rezvani K andRouce RH,2015)。
使用CD16阳性自然杀手细胞治疗癌症的方法主要有两种。第一种方法包含以下步骤：(a)取得自体或异体血液；(b)从自体或异体血液中分离出自体或异体的原代CD16阳性自然杀手细胞(primary CD16+natural killer cells；原代CD16阳性NK细胞)；(c)体外增殖自体或异体的原代CD16阳性自然杀手细胞；然后(d)将增殖的自体或异体原代CD16阳性自然杀手细胞注射回一癌症病患的静脉，使病患体内将有足够的CD16阳性自然杀手细胞，以释放细胞毒性因子(cytotoxic factors)，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用导致癌细胞死亡。然而，由于经过几周的短期培养后，原代CD16阳性自然杀手细胞即会老化甚至凋亡的事实，为了长期治疗，必须不断从自体或异体血液中取得原代CD16阳性自然杀手细胞。除此之外，已有研究指出，用现存的方法培养高纯度的CD16阳性自然杀手细胞族群(亦即，CD16阳性自然杀手细胞数量等于或高于99％)四天之后所取得的所有培养的细胞中，只有10％的细胞还表达CD16。换句话说，现存的CD16阳性自然杀手细胞体外培养方法，无法让增殖后的自然杀手细胞稳定表达CD16。因此，上述方法不仅在维持CD16阳性自然杀手细胞供应源上存在着困难，同时也缺乏能在体外稳定增殖CD16阳性自然杀手细胞的方法。这些问题往往使癌症病人在取得足够量的CD16阳性自然杀手细胞上产生困难，同时也很难让癌症治疗每次都能顺利地进行。除此之外，上述方法也需要面临着因为个体细胞差异而使疗效难以控制的问题。
第二种方法涉及一种NK-92细胞系(保藏编号ATCCCRL-2407)。NK-92细胞系是从一名患有恶性非霍奇金式淋巴瘤(malignant non-Hodgkin’s lymphoma)的50岁高加索男子的血液中分离出来的一种CD16阴性自然杀手细胞系。NK-92细胞系可以被持续地继代培养而没有老化跟死亡的问题，同时该NK-92细胞系对免疫力不全的小鼠(immune compromisedmice)没有致癌性(tumorigenic)。在经过γ射线照射过后，NK-92细胞系对同种异体(allogeneic)的人类个体也没有致癌性(carcinogenic)，因此有某种程度上的可利用性。然而，因为NK-92细胞系未表达CD16受体，所以它无法透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用来摧毁癌细胞。因此，为了取得一种能表达CD16受体且可行使抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的转基因CD16NK-92细胞系，上述的第二种方法需要透过转基因的技术将CD16受体转基因到NK-92细胞系中。然后，将转染了CD16的NK-92细胞系注射到癌症病患的静脉；因此，癌症病患体内将有足够的CD16阳性自然杀手细胞，以释放细胞毒性因子(cytotoxicfactors)而透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用导致癌细胞死亡。可惜的是，医学界和一般民众对转基因的免疫细胞在人体循环系统中的长期安全性有所疑虑。因此，上述方法的开发受到了相当大程度的限制。
因此，仍急需一种可以被持续地继代培养，非转基因、没有致癌性的细胞系和一种可以大量增殖CD16阳性自然杀手细胞并维持CD16表达的培养方法。
【发明内容】
本发明提供一种可以被持续地继代培养且没有老化和死亡问题的自然杀手细胞系。
本发明的第二目的为提供一种在经过至少三个月的增殖后仍能稳定地表达CD16阳性受体的自然杀手细胞。
本发明的另一目的为提供一种非转基因的CD16阳性自然杀手细胞系。
本发明的另一目的为提供一种对免疫力不全的小鼠不具致癌性的CD16阳性自然杀手细胞系。
本发明的另一目的为提供一种在经过γ射线照射后，对同种异体的人类个体没有致癌性的CD16阳性自然杀手细胞系。
本发明的另一目的为提供一种可以大量增殖CD16阳性自然杀手细胞系的培养方法。
本发明的另一目的为提供一种可以使CD16阳性自然杀手细胞在增殖后稳定表达CD16受体的培养方法。
本发明的另一个目的为提供一种实质上富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，其中该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中的总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％；该人类CD16阳性自然杀手细胞具有以下特征：在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力。
本发明提供了一种具有下列特征的人类自然杀手细胞：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)包含一被表达的编码CD16受体的多核苷酸序列，其中该被表达的编码CD16受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
较佳者，该人类自然杀手细胞在经过至少一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月或十一个月的继代培养后仍能增殖。
较佳者，该人类自然杀手细胞在经过至少一年、两年或三年的继代培养后仍能增殖。
较佳者，该人类自然杀手细胞对一免疫能力低下的小鼠不具致癌性。
较佳者，该免疫力不全的小鼠为一SCID/Beige鼠、一NOD/SCID鼠、一NSG鼠、或一裸鼠。
本发明更提供一种实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，其中该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中的总细胞数为100％时，该人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％；该人类CD16阳性自然杀手细胞具有以下特征：
i)表达一CD16受体，
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力，以及
iii)包含一被表达中的编码CD16受体的多核苷酸序列，其中该编码CD16受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
较佳者，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数为5×105～5×109个。
较佳者，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数为1×106、1.1×106、5×106、5.1×106、1×107、1.1×107、5×107、5.1×107、1×108、1.1×108、5×108、5.1×108、1×109、1.1×109、或5×109个。
较佳者，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的总量为5％～100％。
较佳者，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％、7％、9％、10％、12％、15％、19％、20％、22％、25％、29％、30％、32％、35％、39％、40％、42％、45％、49％、50％、52％、55％、59％、60％、62％、65％、69％、70％、72％、75％、79％、80％、82％、85％、89％、或95％。
较佳者，该CD16受体为一CD16a受体或一CD16b受体。
较佳者，所述被表达的编码CD16a受体或CD16b受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
一种取得一实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞组合物的方法；该方法包含：
(a)取得一群保藏编号为ATCC CRL-2047的人类周边血液自然杀手细胞；
(b)将该群人类周边血液自然杀手细胞与一种对一CD16受体具有特异性的抗体接触；以及
(c)将被抗体特异性地结合的细胞分离，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物；
其中，该人类CD16阳性自然杀手细胞包含一被表达的编码一CD16受体的多核苷酸，且该被表达的编码CD16受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少三个月的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、或十一个月的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少一年、两年、或三年的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
较佳者，该被表达的编码CD16受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
较佳者，该组合物中，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于80％。
较佳者，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
较佳者，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于50％。
较佳者，溶解于培养基中的葡萄糖的浓度大于1500mg/L。
较佳者，该培养基是充分通气的，溶解于培养基中的氧气的浓度维持在一个稳定的范围，或是溶解于培养基中的葡萄糖的浓度为1500～5000mg/L。
较佳者，溶解于该培养基中的葡萄糖的浓度为2500、2501、3500、3501、4000、或4500mg/L。
较佳者，组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
较佳者，组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数为5×105～5×109个。
较佳者，组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数为1×106、1.1×106、5×106、1×107、1.1×107、5×107、5.1×107、1×108、1.1×108、5×108、5.1×108、1×109、1.1×109、5×109、1×1010、1.1×1010、5×1010、1×1011、1.1×1011、5×1011、5.1×1011、1×1012、1.1×1012、5×1012、5.1×1012、1×1013、1.1×1014、5×1014、1×1015、1.1×1015、5×1015、1×1016、1.1×1016、5×1016、5.1×1016、1×1017、1.1×1017、5×1017、5.1×1017、1×1018、1.1×1018、5×1018、1×1019、1.1×1019、5×1019、1×1020、1.1×1020、5×1020、5.1×1020、1×1021、1.1×1021、5×1021、5.1×1021、1×1022、1.1×1022、5×1022、1×1023、1.1×1023、5×1023、1×1024、1.1×1024、5×1024、5.1×1024、1×1025、1.1×1025、5×1025、5.1×1025、1×1026、1.1×1026、5×1026、1×1027、1.1×1027、5×1027、1×1028、1.1×1028、5×1028、5.1×1028、1×1029、1.1×1029、5×1029、5.1×1029、1×1030、1.1×1030、5×1030、1×1031、1.1×1031、5×1031、1×1032、1.1×1032、5×1032、5.1×1032、1×1033、1.1×1033、5×1033、5.1×1033、1×1034、1.1×1034、5×1034、1×1035、1.1×1035、5×1035、1×1036、1.1×1036、5×1036、5.1×1036、1×1037、1.1×1037、5×1037、5.1×1037、1×1038、1.1×1038、5×1038、1×1039、1.1×1039、5×1039、5.1×1039、1×1040、1.1×1040、5×1040个。较佳者，组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数为1×106～1×1041个。
较佳者，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的总数为5％～100％。
较佳者，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％、7％、9％、10％、12％、15％、19％、20％、22％、25％、29％、30％、32％、35％、39％、40％、42％、45％、49％、50％、52％、55％、59％、60％、62％、65％、69％、70％、72％、75％、79％、80％、82％、85％、89％、或95％。
本发明还提供一种培养和扩增人类CD16阳性自然杀手细胞的方法；该方法包含
(x)在一容器中，将人类CD16阳性自然杀手细胞与一包含人类血小板裂解物(human platelet lysate)和白介素-2(IL-2)的培养基接触；以及
(y)培养细胞数日；
其中该人类CD16阳性自然杀手细胞包含一被表达的编码一CD16受体的多核苷酸，同时该被表达的编码CD16受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
较佳者，溶解于培养基中的葡萄糖的浓度大于1500mg/L。
较佳者，步骤(y)包含以下子步骤：
(y1)培养该细胞至少一天；以及
(y2)继代培养该细胞至少三个月。
较佳者，其中步骤(y2)为继代培养该细胞至少一周、两周、三周，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、或十一个月。
较佳者，其中步骤(y2)为继代培养该细胞至少一年、两年、或三年。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少三个月的继代培养后仍能保持其增殖能力。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、或十一个月的继代培养后仍能保持其增殖能力。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少一年、两年、或三年的继代培养后仍能保持其增殖能力。
较佳者，该被表达的编码CD16受体的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或非不是被意送进细胞内的。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞表达CD2分子(CD2阳性)。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞表达NKp44、NKp46、NKG2D、或CD107a。
本发明提供一种具有以下特征的人类自然杀手细胞：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖能力；以及
iii)包含一被表达的编码CD16受体的CD16A基因，其中该被表达的CD16A基因位于一号染色体的q臂。
较佳者，该被表达的CD16A基因位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
本发明提供一种具有以下特征的人类自然杀手细胞：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)包含一被表达的编码CD16受体的CD16A基因，其中该被表达的CD16A基因的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送进细胞内的。
较佳者，该被表达的CD16A基因的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被造特意送进细胞内的。
本发明提供一种人类自然杀手细胞，其为
(A)保藏在NPMD(日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心)且具有保藏序号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析细胞的基因组脱氧核糖核酸(genomic DNA)，被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子(DNA molecule)与被CD16F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子(DNA molecule)的比例等于或大于1，其中CD16F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
较佳者，该CD16受体为一CD16a受体或一CD16b受体。
较佳者，一被表达的编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
较佳者，该细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性(non-tumorigenic)。
较佳者，在经过γ射线照射过后，该细胞对一同种异体的个体不具致癌性(non-tumorigenic)。
较佳者，一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:19核苷酸序列。
较佳者，该CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
较佳者，该细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因(inactive tumorsuppressorgene)或一经突变且高度表达的致癌基因(highly expressed oncogene)。
较佳者，该细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应，且该细胞为一雄性细胞。
较佳者，该细胞还包含至少一复合于该细胞的外源性靶向单元(exogenoustargeting unit)，其中该外源性靶向单元包含一靶向部分(targeting moiety)，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记展现特异性结合(binding)；
(b)它不是一种核酸(nucleic acid)；以及
(c)它不是由该细胞产生。
较佳者，该外源性靶向单元是透过共轭(conjugated)于该靶向部分的一第一接头(first linker)和共轭于该细胞的一第二接头(second linker)之间的一种相互作用(interaction)，复合于该细胞。
较佳者，该第一接头是一第一多核苷酸，或该第二接头是一第二多核苷酸。
较佳者，该靶向部分包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)。
较佳者，该第一多核苷酸包含一段单链区域(single-stranded region)。
较佳者，该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
较佳者，该第一接头和该第二接头是选自下列组群：一DNA结合结构域(DNAbinding domain)和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型(leucine zipper)和一目标DNA、生物素(biotin)和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和链霉抗生物素蛋白(streptavidin)、携钙素结合蛋白(calmodulin binding protein)和携钙素(calmodulin)、一荷尔蒙(hormone)和一荷尔蒙受体(hormone receptor)、凝集素(lectin)和一种碳水化合物(carbohydrate)、一细胞膜受体和一受体配体(receptor ligand)、一酶(enzyme)和一底物(substrate)、一抗原和一抗体、一激动剂(agonist)和一拮抗剂(antagonist)、能杂交的多核苷酸序列分子(polynucleotide hybridizing sequences)、一核酸适体(aptamer)及一目标分子、一锌指蛋白(zinc finger)和一目标DNA。
较佳者，该第一接头包含一第一反应基团(first reactive group)，且该第二接头包含一第二反应基团(second reactive group)，且其中该细胞藉由第二反应基团和第一反应基团间的一种反应(reaction)所形成的一共价键(covalent bond)复合于(complexed to)该靶向部分(targeting moiety)。
较佳者，该靶向部分包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)。
较佳者，该第二接头包含一聚乙二醇区域(PEG region)。
较佳者，该靶向部分和该细胞间的间隔长度为1nm到400nm，或该靶向部分和该细胞间的间隔长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、60、70、80、90、100、130、170、200、230、270、300、330、或370nm。
较佳者，该外源性靶向单元包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)，该抗原结合单元与癌症抗原(cancer antigen)、糖脂(glycolipid)、糖蛋白(glycoprotein)、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛(cluster of differentiation antigen presenton cells of a hematopoietic lineage)、γ-谷氨酸转肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白(adhesion protein)、荷尔蒙、生长因子(growthfactor)、细胞激素、配体受体(ligand receptor)、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链(membrane-bound form of an immunoglobulinμ)、甲型胎儿蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反应蛋白(C-reactive protein)、嗜铬血液细胞分泌素A(chromogranin A)、上皮黏蛋白抗原(epithelial mucin antigen)、人类上皮细胞特异抗原(human epithelium specificantigen)、路易斯(a)(Lewis(a))抗原、多重抗药性相关蛋白(multidrug resistancerelated protein)、Neu致癌基因蛋白(Neu oncogene protein)、神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase)、P型糖蛋白(P-glycoprotein)、多重抗药性相关抗原、p170、多重抗药性相关抗原(multidrug-resistance-related antigen)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen)、神经细胞黏附分子(NCAM)、神经节苷脂分子(gangliosidemolecule)、MART-1、热休克蛋白(heat shock protein)、唾液酸多糖(sialylTn)、酪氨酸酶(tyrosinase)、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成长因子受体(EGF-R)、血管内皮生长因子(VEGF)、或黑色素瘤相关抗原(MAGE)结合。
较佳者，该抗原结合单元(antigen-binding unit)是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(HER3)(ERBB3)、上皮成长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基质金属蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(间皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、CD3、巨噬细胞移行抑制因子(MIF)、叶酸受体α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、运铁蛋白受体(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(白介素-2受体(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受体(CSF1R))、白介素1B(IL1B)、CD105(内皮糖蛋白(Endoglin))、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、白介素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生长素2(angiopoietin 2)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(a killer-cellimmunoglobulin-likereceptors；KIRs)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白(aTNFreceptor protein)、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体(acytokinereceptor)、一种整合素(integrin)、激活自然杀手细胞的受体(activating NK cell receptors)及其组合。
较佳者，该靶向部分是藉由一耦合基团(coupling group)共轭于(conjugatedto)该第一多核苷酸，其中所述耦合基团为一NHS酯(NHS ester)、其他活化后的酯(ester)、一烷基或酰基卤(alkyl or acyl halide)、一双功能化的交联剂(bifunctionalcrosslinker)或顺丁烯二酰亚胺基团(maleimide group)。
较佳者，该第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一从下列选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20个核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7(23-mer SEQ ID NO:7)、和SEQ ID NO:10。
较佳者，该靶向部分对该生物标记(biological marker)的结合亲和力(bindingaffinity)小于250nM，或该靶向部分对该生物标记的结合亲和力为5nM、10nM、40nM、90nM、130nM、或170nM。
较佳者，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt到500nt。较佳者，该第一多核苷酸的长度或第二多核苷酸的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、160、220、300、400、或480nt。
较佳者，第一接头和第二接头的结合亲和力小于250nM。较佳者，第一接头和第二接头的结合亲和力为5nM、10nM、40nM、90nM、130nM、或170nM。
较佳者，该第一接头或该第二接头共轭(conjugated)在该靶向单元的一原生功能基团(native functional group)或该细胞的一表面上，其中该原生功能基团为一氨基酸、一糖基(sugar)或一氨基(amine)。
较佳者，该靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体(aptamer)。
本发明提供一种实质上富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，其中、该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％；该人类CD16阳性自然杀手细胞为
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析细胞的基因组脱氧核糖核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子(DNA molecule)与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子(DNA molecule)的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
较佳者，该CD16受体为一CD16a受体或一CD16b受体。
较佳者，一编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
较佳者，在经过γ射线照射过后，该人类CD16阳性自然杀手细胞对一同种异体的个体没有致癌性。
较佳者，一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:19核苷酸序列。
较佳者，该CD16受体包含一为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因(inactivetumorsuppressor gene)或一突变过且高度表达的致癌基因(oncogene)。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应(ADCC)，且该细胞为一雄性细胞(male cell)。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞更包含至少一复合于(complexed to)该人类CD16阳性自然杀手细胞的外源性靶向单元(exogenous targeting unit)，其中所述外源性靶向单元包含一靶向部分(targeting moiety)，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记(biological marker)展现特异性结合(binding)；
(b)它不是一种核酸(nucleic acid)；以及
(c)它不是由该人类CD16阳性自然杀手细胞产生。
较佳者，该外源性靶向单元是透过共轭(conjugated)于靶向部分的一第一接头(first linker)和共轭于该人类CD16阳性自然杀手细胞的一第二接头(second linker)之间的一种相互作用(interaction)，复合于该人类CD16阳性自然杀手细胞。
较佳者，该第一接头是一第一多核苷酸，或该第二接头是一第二多核苷酸。
较佳者，所述靶向部分包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)。
较佳者，所述第一多核苷酸包含一段单链区域(single-stranded region)。
较佳者，该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
较佳者，该第一接头和该第二接头是选自下列组群：一DNA结合结构域(DNAbinding domain)和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型(leucine zipper)和一目标DNA、生物素(biotin)和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和链霉抗生物素蛋白(streptavidin)、携钙素结合蛋白(calmodulin binding protein)和携钙素(calmodulin)、一荷尔蒙和一荷尔蒙受体、凝集素(lectin)和一种碳水化合物(carbohydrate)、一细胞膜受体和一受体配体(receptor ligand)、一酶和一底物(substrate)、一抗原和一抗体、一激动剂(agonist)和一拮抗剂(antagonist)、多个能杂交的多核苷酸序列分子(polynucleotide hybridizingsequences)、一核酸适体(aptamer)及一目标分子、一锌指蛋白(zinc finger)和一目标DNA。
较佳者，该第一接头包含一第一反应基团(first reactive group)，且该第二接头包含一第二反应基团(second reactive group)，其中该人类CD16阳性自然杀手细胞藉由第二反应基团和第一反应基团间的一种反应(reaction)所形成的一共价键(covalentbond)复合于(complexed to)该靶向部分(targeting moiety)。
较佳者，该靶向部分包含一抗原结合区(antigen-binding unit)。
较佳者，该第二接头包含一聚乙二醇(PEG)区域。
较佳者，该靶向部分和该人类CD16阳性自然杀手细胞间的间隔长度为1nm到400nm。
较佳者，该外源性靶向单元包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)，该抗原结合单元与癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ-谷氨酸转肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)(Lewis(a))抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶(enolase)、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、多重抗药性相关抗原、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子(NCAM)、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖(sialylTn)、酪氨酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成长因子受体(EGF-R)、血管内皮生长因子(VEGF)、或黑色素瘤相关抗原(MAGE)结合。
较佳者，该抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(HER3)(ERBB3)、上皮成长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基质金属蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(间皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、CD3、巨噬细胞移行抑制因子(MIF)、叶酸受体α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、运铁蛋白受体(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(白介素-2受体(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受体(CSF1R))、白介素1B(IL1B)、CD105(内皮糖蛋白(Endoglin))、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、白介素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生长素2(angiopoietin 2)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-likereceptors；KIRs)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白(TNF receptor protein)、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素(integrin)、激活自然杀手细胞的受体(activating NK cellreceptors)及其组合。
较佳者，该靶向部分是藉由一耦合基团(coupling group)共轭于(conjugatedto)该第一多核苷酸，其中所述耦合基团为一NHS酯(NHS ester)、其他活化后的酯(ester)、一烷基或酰基卤(alkyl or acyl halide)、一双功能化的交联剂(bifunctionalcrosslinker)或顺丁烯二酰亚胺基团(maleimide group)。
较佳者，该第一多核苷酸或第二多核苷酸的序列包含一从下列选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20个核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:10。
较佳者，该靶向部分对该生物标记(biological marker)的结合亲和力(bindingaffinity)小于250nM。
较佳者，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt～500nt。
较佳者，该第一接头(first linker)和该第二接头(second linker)的结合亲和力(binding affinity)小于250nM。
较佳者，该第一接头或该第二接头共轭(conjugated)在靶向单元的一原生功能基团(native functional group)或人类CD16阳性自然杀手细胞的一表面上，其中所述原生功能基团为一氨基酸、一糖基(sugar)或一氨基(amine)。
较佳者，该靶向部分为一肽、蛋白质或核酸适体(aptamer)。
本发明提供一种取得一实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物的方法；该方法包含：
(a)取得一群保藏编号为ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞；
(b)将该群人类周边血液自然杀手细胞与一种对一CD16受体具特异性的抗体接触；以及
(c)将被抗体特异性地结合的细胞分离，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物；
其中该人类CD16阳性自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏序号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析细胞的基因组脱氧核糖核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子(DNA molecule)与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子(DNA molecule)的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
较佳者，该抗体至少对一CD16a受体或一CD16b受体其中之一具有特异性。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少一周的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
较佳者，一被表达的编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
较佳者，在经过γ射线照射过后，该人类CD16阳性自然杀手细胞对一同种异体的个体不具致癌性。
较佳者，一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:19核苷酸序列。
较佳者，该CD16受体包含一为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因(inactivetumorsuppressor)或一突变过且高度表达的致癌基因(oncogene)。
较佳者，在该组合物中，基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应(ADCC)，且该人类CD16阳性自然杀手细胞为雄性细胞。
较佳者，步骤(c)包含下列子步骤：
(c1)将被抗体特异性地结合的细胞分离出来；
(c2)在一容器中，让被抗体特异性地结合的细胞与一含有人类血小板裂解物(human platelet lysate)和白介素-2(IL-2)的培养基接触；以及
(c3)培养细胞多日，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物。
较佳者，该容器为高速细胞培养扩增装置(G-Rexculture devices)。
较佳者，该容器包含一可透气(air-permeable)且不透水(water-impermeable)的用于接种细胞的底面(bottom)。
较佳者，溶于培养基中的葡萄糖的浓度为1500～5000mg/L。
较佳者，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
本发明提供一种培养和扩增人类CD16阳性自然杀手细胞的方法；该方法包含：
(x)在一容器中，让人类CD16阳性自然杀手细胞和一包含0.5～10vol％的人类血小板裂解物(human platelet lysate)及100～3000IU/mL白介素-2(IL-2)的培养基接触；以及
(y)培养细胞多日。
较佳者，该培养基含有1vol％、2vol％、3vol％、4vol％、5vol％、6vol％、7vol％、8vol％、9vol％、10vol％、11vol％、12vol％、13vol％、14vol％、或15vol％的人类血小板裂解物(human platelet lysate)。较佳者，该培养基含有0.5～20vol％的人类血小板裂解物。较佳者，该培养基含有100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、或3000IU/mL的白介素-2(IL-2)。
较佳者，该容器为高速细胞培养扩增装置(G-Rexculture devices)。
较佳者，该容器包含一可透气(air-permeable)且不透水(water-impermeable)的用于接种细胞的底面(bottom)。
较佳者，溶于培养基中的葡萄糖的浓度为1500～5000mg/L。
较佳者，步骤(y)包含下列子步骤：
(y1)培养细胞至少一天；以及
(y2)继代培养细胞至少一个月。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少三个月的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；以及
ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
较佳者，在经过γ射线照射过后，该人类CD16阳性自然杀手细胞对一同种异体的个体没有致癌性。
较佳者，一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:19核苷酸序列。
较佳者，该CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
较佳者，该人类CD16阳性自然杀手细胞更含有一失活的肿瘤抑制基因(inactivetumorsuppressor)或一突变过且高度表达的致癌基因(oncogene)。
本发明提供一种治疗癌症、自体免疫疾病、神经疾病、人类免疫不全病毒(HIV)感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、病原性疾病、病毒感染、细菌感染的方法，包含给一有需要的个体施用一种含有一有效剂量的一人类自然杀手细胞的组合物；所述人类自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力，以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析该人类自然杀手细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
较佳者，该人类自然杀手细胞更包含至少一外源性靶向单元(exogenoustargeting unit)复合于(complexed to)该人类自然杀手细胞，其中该外源性靶向单元包含一靶向部分(targeting moiety)，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记(biological marker)展现特异性结合(binding)；
(b)它不是一种核酸(nucleic acid)；以及
(c)它不是由该人类自然杀手细胞产生。
较佳者，该外源性靶向单元是透过共轭于靶向部分的一第一接头，和共轭于人类自然杀手细胞上的一第二接头之间的一种相互作用，复合于人类自然杀手细胞上。
较佳者，该第一接头(first linker)是一第一多核苷酸(firstpolynucleotide)，或该第二接头(second linker)是一第二多核苷酸(secondpolynucleotide)。
较佳者，该靶向部分包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)。
较佳者，该第一多核苷酸包含一段单链区域(single-stranded region)。
较佳者，该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
较佳者，该第一接头和该第二接头是选自下列群组：一DNA结合结构域(DNAbinding domain)和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型和一目标DNA、生物素和抗生物素蛋白、生物素和链霉抗生物素蛋白、携钙素结合蛋白和携钙素、一荷尔蒙和一荷尔蒙受体、凝集素和一种碳水化合物、一细胞膜受体和一受体配体、一酶和一底物、一抗原和一抗体、一激动剂和一拮抗剂、多个能杂交的多核苷酸序列分子、一核酸适体及一目标分子、一锌指蛋白和一目标DNA。
较佳者，所述第一接头包含一第一反应基团(first reactive group)，且第二接头包含一第二反应基团(second reactive group)，其中人类自然杀手细胞藉由第二反应基团和第一反应基团的一种反应(reaction)所形成的一共价键(covalent bond)复合于(complexed to)靶向部分。
较佳者，该靶向部分包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)。
较佳者，该第二接头含有一聚乙二醇(PEG)区域。
较佳者，该靶向部分和该人类自然杀手细胞间的间隔长度为1nm到400nm。
较佳者，该外源性靶向单元包含一抗原结合单元(antigen-binding unit)，所述抗原结合单元与癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ-谷氨酸转肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)(Lewis(a))抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶(enolase)、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、多重抗药性相关抗原、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子(NCAM)、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖(sialylTn)、酪氨酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成长因子受体(EGF-R)、血管内皮生长因子(VEGF)、或黑色素瘤相关抗原(MAGE)结合。
较佳者，该抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(HER3)(ERBB3)、上皮成长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基质金属蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(间皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、CD3、巨噬细胞移行抑制因子(MIF)、叶酸受体α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、运铁蛋白受体(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(白介素-2受体(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受体(CSF1R))、白介素1B(IL1B)、CD105(内皮糖蛋白(Endoglin))、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、白介素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生长素2(angiopoietin 2)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-likereceptors；KIRs)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白(TNF receptor protein)、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素(integrin)、激活自然杀手细胞的受体(activating NK cellreceptors)、及其组合。
较佳者，该靶向部分是藉由一耦合基团(coupling group)共轭于(conjugatedto)该第一多核苷酸，其中所述耦合基团为一NHS酯(NHS ester)、其他活化后的酯(ester)、一烷基或酰基卤(alkyl or acyl halide)、一双功能化的交联剂(bifunctionalcrosslinker)或顺丁烯二酰亚胺基团(maleimide group)。
较佳者，该第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一从下列选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20个核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:10。
较佳者，该靶向部分(targeting moiety)对该生物标记(biological marker)的结合亲和力(binding affinity)小于250nM。较佳者，该靶向部分对该生物标记的结合亲和力为5nM、10nM、40nM、90nM、130nM、或170nM。
较佳者，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt～500nt。较佳者，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、160、220、300、400、或480nt。
较佳者，该第一接头(first linker)和该第二接头(second linker)的结合亲和力(binding affinity)小于250nM。较佳者，第一接头和第二接头的结合亲和力为2、10、25、50、62、70、85、100、102、110、125、150、162、170、185、200、202、210、225、或250nM。
较佳者，该第一接头或该第二接头共轭(conjugated)在该靶向单元(targetingunit)的一原生功能基团(native functional group)或该细胞的一表面，其中该原生功能基团为一氨基酸、一糖基(sugar)或一氨基(amine)。
较佳者，该靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体(aptamer)。
较佳者，该CD16受体是一CD16a受体或一CD16b受体。
较佳者，一被表达的编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
较佳者，该细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性(non-tumorigenic)。
较佳者，在经过γ射线照射过后，该细胞对一同种异体的个体不具致癌性(non-tumorigenic)。
较佳者，一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:19核苷酸序列。
较佳者，该CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
较佳者，该人类自然杀手细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因(inactivetumorsuppressor gene)或一经突变且高度表达的致癌基因(oncogene)。
较佳者，该人类自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应，且该人类自然杀手细胞为一雄性细胞。
较佳者，该组合物中的人类自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于该组合物中的总细胞数为100％时，人类自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
较佳者，该个体为一人体。
较佳者，该方法是用于治疗选自下列的癌症：棘皮瘤(Acanthoma)、腺细胞癌(Acinic cell carcinoma)、听神经瘤(Acoustic neuroma)、肢端小痣性黑色素瘤(Acrallentiginous melanoma)、汗腺顶端汗腺瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸性粒细胞白血病(Acute eosinophilic leukemia)、急性淋巴母细胞白血病(Acute lymphoblasticleukemia)、急性巨核母细胞白血病(Acute megakaryoblastic leukemia)、急性单核细胞白血病(Acute monocytic leukemia)、急性成熟骨髓芽球性白血病(Acute myeloblasticleukemia with maturation)、急性髓源型树突状细胞白血病(Acute myeloid dendriticcell leukemia)、急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia)、急性前髓细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia)、牙釉母细胞瘤(Adamantinoma)、腺癌(Adenocarcinoma)、腺样囊状癌(Adenoid cystic carcinoma)、腺瘤(Adenoma)、牙源性腺瘤样肿瘤(Adenomatoid odontogenic tumor)、肾上腺皮质癌(Adrenocorticalcarcinoma)、成人型T细胞白血病(Adult T-cell leukemia)、侵略性NK细胞白血病(Aggressive NK-cell leukemia)、艾滋病相关癌症(AIDS-Related Cancers)、艾滋病相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、肺泡状软组织肉瘤(Alveolar soft part sarcoma)、造釉细胞性纤维瘤(Ameloblastic fibroma)、肛门癌(Anal cancer)、间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma)、甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer)、血管免疫芽细胞性T细胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma)、血管平滑肌脂肪瘤(Angiomyolipoma)、血管肉瘤(Angiosarcoma)、阑尾癌(Appendix cancer)、星细胞瘤(Astrocytoma)、非典型畸胎/类横纹肌细胞瘤(Atypical teratoidrhabdoid tumor)、基底细胞癌(Basal cell carcinoma)、类基底细胞癌(Basal-like carcinoma)、B细胞白血病(B-cell leukemia)、B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、Bellini集合管癌(Bellini ductcarcinoma)、胆道癌(Biliary tract cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、胚细胞瘤(Blastoma)、骨癌(Bone Cancer)、骨肿瘤(Bone tumor)、脑干胶质瘤(Brain StemGlioma)、脑瘤(Brain Tumor)、乳癌(Breast Cancer)、布伦内罗氏瘤(Brenner tumor)、支气管肿瘤(Bronchial Tumor)、支气管肺泡腺癌(Bronchioloalveolar carcinoma)、棕色瘤(Brown tumor)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、原发部位不明的癌(Cancer ofUnknown Primary Site)、类癌瘤(Carcinoid Tumor)、上皮细胞癌(Carcinoma)、原位癌(Carcinoma in situ)、阴茎癌(Carcinoma of the penis)、原发部位不明转移癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤(Carcinosarcoma)、Castleman氏病(Castleman's Disease)、中枢神经系统胚胎性肿瘤(Central Nervous System EmbryonalTumor)、小脑星状细胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、大脑星状细胞瘤(CerebralAstrocytoma)、子宫颈癌(Cervical Cancer)、胆管癌(Cholangiocarcinoma)、软骨癌(Chondroma)、软骨肉瘤(Chondrosarcoma)、脊索瘤(Chordoma)、绒毛膜癌(Choriocarcinoma)、脉络丛乳头状瘤(Choroid plexus papilloma)、慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia)、慢性单核细胞白血病(Chronic monocyticleukemia)、慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增生性疾病(Chronic Myeloproliferative Disorder)、慢性嗜中性白血病(Chronic neutrophilicleukemia)、透明细胞肿瘤(Clear-cell tumor)、大肠癌(Colon Cancer)、大肠直肠癌(Colorectal cancer)、颅咽管瘤(Craniopharyngioma)、皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)、Degos氏病(Degos disease)、隆突性皮肤纤维肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、皮样囊肿(Dermoid cyst)、发育不良的小圆细胞瘤(Desmoplastic small round cell tumor)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large Bcell lymphoma)、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(Dysembryoplastic neuroepithelialtumor)、胚胎性癌(Embryonal carcinoma)、内胚窦瘤(Endodermal sinus tumor)、子宫内膜癌(Endometrial cancer)、子宫内膜癌(Endometrial Uterine Cancer)、子宫内膜样瘤(Endometrioid tumor)、肠道T细胞淋巴瘤(Enteropathy-associated T-cell lymphoma)、室管膜母细胞瘤(Ependymoblastoma)、室管膜瘤(Ependymoma)、上皮样肉瘤(Epithelioidsarcoma)、红血球性白血病(Erythroleukemia)、食道癌(Esophageal cancer)、敏感性神经胚细胞瘤(Esthesioneuroblastoma)、Ewing氏家族肿瘤(Ewing Family of Tumor)、Ewing氏家族肉瘤(Ewing Family Sarcoma)、Ewing氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、生殖细胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外生殖细胞瘤(Extragonadal Germ CellTumor)、肝外胆管癌(Extrahepatic Bile Duct Cancer)、乳房外Paget氏病(ExtramammaryPaget's disease)、输卵管癌(Fallopian tube cancer)、胎内胎(Fetus in fetu)、纤维瘤(Fibroma)、纤维肉瘤(Fibrosarcoma)、滤泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma)、滤泡性甲状腺癌(Follicular thyroid cancer)、胆癌(Gallbladder Cancer)、胆癌(Gallbladdercancer)、神经节胶质细胞瘤(Ganglioglioma)、神经节细胞瘤(Ganglioneuroma)、胃癌(Gastric Cancer)、胃淋巴癌(Gastric lymphoma)、肠胃道癌(Gastrointestinalcancer)、胃肠道类癌肿瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃肠道基质肿瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor)、胃肠道基质肿瘤(Gastrointestinal stromaltumor)、生殖细胞瘤(Germ cell tumor)、胚细胞瘤(Germinoma)、妊娠绒毛膜癌(Gestational choriocarcinoma)、妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational TrophoblasticTumor)、骨巨细胞瘤(Giant cell tumor of bone)、多形性神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme)、神经胶质瘤(Glioma)、大脑神经胶瘤病(Gliomatosiscerebri)、球状血管瘤(Glomus 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PrimitiveNeuroectodermal Tumor)、表面上皮间质肿瘤(Surface epithelial-stromal tumor)、滑膜肉瘤(Synovial sarcoma)、T细胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblasticleukemia)、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-cell large granular lymphocyteleukemia)、T细胞白血病(T-cell leukemia)、T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T幼淋巴细胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、畸胎瘤(Teratoma)、末期淋巴癌(Terminallymphatic cancer)、睪丸癌(Testicular cancer)、鞘细胞瘤(Thecoma)、咽喉癌(ThroatCancer)、胸腺癌(Thymic Carcinoma)、胸腺癌(Thymoma)、甲状腺癌(Thyroid cancer)、肾盂、输尿管和过度上皮细胞癌(Transitional Cell Cancer of Renal Pelvis andUreter)、移形上皮细胞癌(Transitional cell carcinoma)、脐尿管癌(Urachal cancer)、尿道癌(Urethral cancer)、泌尿生殖器肿瘤(Urogenital neoplasm)、子宫肉瘤(Uterinesarcoma)、葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma)、阴道癌(Vaginal Cancer)、瓦-马二氏症(Verner Morrison syndrome)、疣状癌(Verrucous carcinoma)、视觉通路神经胶质瘤(Visual Pathway Glioma)、外阴肿瘤(Vulvar Cancer)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、华生氏肿瘤(Warthin's tumor)、威尔母氏肿瘤(Wilms'tumor)、其他癌症、及其组合。
较佳者，所述生物标记选自糖(carbohydrates)、糖脂(glycolipids)、糖蛋白(glycoproteins)、呈现在一造血群系细胞上的CD(分化簇)抗原，例如CD2、CD4、CD8、CD21等、γ-谷氨酸转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase)、一种黏附蛋白(adhesion protein；例如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、细胞间黏附分子-2(ICAM-2)、内皮细胞白血球黏附分子-1(ELAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1))、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、和其他配体受体、离子通道、及膜结合形式的一免疫球蛋白μ链(the membrane-bound form of animmunoglobulinμ.Chain)。
较佳者，所述呈现在一造血群系细胞上的CD(分化簇)抗原为CD2、CD4、CD8、CD21或其他CD(分化簇)抗原。
较佳者，所述黏附蛋白为细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、细胞间黏附分子-2(ICAM-2)、内皮细胞白血球黏附分子-1(ELAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、或其他黏附蛋白。
较佳者，该细胞更包含一合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberatelydelivered)的编码嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含一靶向结合单链可变片段(target-binding single-chain variablefragment；scFv)抗一种抗原(against an antigen)选自：CD2、CD3δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3epsilon)、CD3γ(CD3gamma)、CD4、CD7、CD8a、CD8、CD11a(整合素αL(ITGAL))、CD11b(整合素αM(ITGAM))、CD11c(整合素αX(ITGAX))、CD11d(整合素αD(ITGAD))、CD18(整合素β2(ITGB2))、CD19(B4)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD28、CD29(整合素β1(ITGB1))、CD30(肿瘤坏死因子受体超家族8(TNFRSF8))、CD40(肿瘤坏死因子受体超家族5(TNFRSF5))、CD48(信号淋巴细胞激活分子家族成员2(SLAMF2))、CD49a(整合素α1(ITGA1))、CD49d(整合素α4(ITGA4))、CD49f(整合素α6(ITGA6))、CD66a(癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAMl))、CD66b(癌胚抗原相关细胞黏附分子8(CEACAM8))、CD66c(癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6))、CD66d(癌胚抗原相关细胞黏附分子3(CEACAM3))、CD66e(癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5))、CD69(C型凝集素结构域家族2(CLEC2))、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关α链(B-cell antigen receptor complex-associated alphachain))、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关β链(B-cell antigen receptor complex-associated beta chain))、CD84(信号淋巴细胞激活分子家族成员5(SLAMF5))、CD96(Tactile)、CD100(脑信号蛋白4D(SEMA4D))、CD103(整合素αE(ITGAE))、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(信号淋巴细胞激活分子家族成员1(SLAMF1))、CD158A(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1))、CD158B1(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2))、CD158B2(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3))、CD158C(杀手细胞免疫球蛋白样受体3DP1(KIR3DP1))、CD158D(杀手细胞免疫球蛋白样受体DL4(KIRDL4))、CD158F1(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL5A(KIR2DL5A))、CD158F2(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL5B(KIR2DL5B))、CD158K(杀手细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2))、CD160(BY55)、CD162(P选择素糖蛋白配体(SELPLG))、CD226(DNAX辅助分子1(DNAM1))、CD229(信号淋巴细胞激活分子家族成员3(SLAMF3))、CD244(信号淋巴细胞激活分子家族成员4(SLAMF4))、CD247(CD3-ξ；CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(B细胞活化因子受体(BAFFR))、CD270(肿瘤坏死因子受体超家族14(TNFSF14))、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(计划性死亡-1(PD-1))、CD314(NKG2D)、CD319(信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7))、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(信号淋巴细胞激活分子家族成员6(SLAMF6))、CD353(信号淋巴细胞激活分子家族成员8(SLAMF8))、CD355(细胞毒性及调节T细胞分子(CRTAM))、CD357(肿瘤坏死因子受体超家族18(TNFRSF18))、可诱导T细胞共刺激分子(inducible T cell co-stimulator；ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、NKp80(杀手细胞凝集素样受体基因家族成员1(KLRF1))、白介素-2Rβ(IL-2R beta)、白介素-2Rγ(IL-2R gamma)、白介素-7Rα(IL-7R alpha)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、T细胞活化衔接因子(LAT)、GADS(GrpL)、SLP-76(淋巴细胞胞浆蛋白2(LCP2))、PAG1/CBP、一CD83配体(CD83 ligand)、Fcγ受体(Fc gamma receptor)、MHC1类分子(MHCclass 1molecule)、MHC2类分子(MHC class 2molecule)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白(TNF receptor protein)、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体(cytokine receptor)、一种整合素(integrin)、活化自然杀手细胞受体(activating NK cell receptors)、一种类铎受体(Toll-like receptor)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、计划性死亡-配体1(PD-L1)、及其组合。
较佳者，该细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应。
本发明提供一种治疗癌症、自体免疫疾病、神经疾病、人类免疫不全病毒(HIV)感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、病原性疾病、病毒感染、或细菌感染的方法，包含将一种含有一有效剂量的一人类自然杀手细胞的组合物施用于一有需要的个体；该人类自然杀手细胞包含一合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)的多核苷酸，该嵌合抗原受体包含一靶向结合单链可变片段(target-binding single-chain variable fragment；scFv)抗一种抗原(against an antigen)选自：CD2、CD3δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3 epsilon)、CD3γ(CD3gamma)、CD4、CD7、CD8a、CD8、CD11a(整合素αL(ITGAL))、CD11b(整合素αM(ITGAM))、CD11c(整合素αX(ITGAX))、CD11d(整合素αD(ITGAD))、CD18(整合素β2(ITGB2))、CD19(B4)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD28、CD29(整合素β1(ITGB1))、CD30(肿瘤坏死因子受体超家族8(TNFRSF8))、CD40(肿瘤坏死因子受体超家族5(TNFRSF5))、CD48(信号淋巴细胞激活分子家族成员2(SLAMF2))、CD49a(整合素α1(ITGA1))、CD49d(整合素α4(ITGA4))、CD49f(整合素α6(ITGA6))、CD66a(癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAMl))、CD66b(癌胚抗原相关细胞黏附分子8(CEACAM8))、CD66c(癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6))、CD66d(癌胚抗原相关细胞黏附分子3(CEACAM3))、CD66e(癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5))、CD69(C型凝集素结构域家族2(CLEC2))、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关α链(B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain))、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关β链(B-cell antigen receptor complex-associated beta chain))、CD84(信号淋巴细胞激活分子家族成员5(SLAMF5))、CD96(Tactile)、CD100(脑信号蛋白4D(SEMA4D))、CD103(整合素αE(ITGAE))、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(信号淋巴细胞激活分子家族成员1(SLAMF1))、CD158A(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1))、CD158B1(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2))、CD158B2(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3))、CD158C(杀手细胞免疫球蛋白样受体3DP1(KIR3DP1))、CD158D(杀手细胞免疫球蛋白样受体DL4(KIRDL4))、CD158F1(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL5A(KIR2DL5A))、CD158F2(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL5B(KIR2DL5B))、CD158K(杀手细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2))、CD160(BY55)、CD162(P选择素糖蛋白配体(SELPLG))、CD226(DNAX辅助分子1(DNAM1))、CD229(信号淋巴细胞激活分子家族成员3(SLAMF3))、CD244(信号淋巴细胞激活分子家族成员4(SLAMF4))、CD247(CD3-ξ；CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(B细胞活化因子受体(BAFFR))、CD270(肿瘤坏死因子受体超家族14(TNFSF14))、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(计划性死亡-1(PD-1))、CD314(NKG2D)、CD319(信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7))、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(信号淋巴细胞激活分子家族成员6(SLAMF6))、CD353(信号淋巴细胞激活分子家族成员8(SLAMF8))、CD355(细胞毒性及调节T细胞分子(CRTAM))、CD357(肿瘤坏死因子受体超家族18(TNFRSF18))、可诱导T细胞共刺激分子(inducible T cell co-stimulator；ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、NKp80(杀手细胞凝集素样受体基因家族成员1(KLRF1))、白介素-2Rβ(IL-2R beta)、白介素-2Rγ(IL-2R gamma)、白介素-7Rα(IL-7R alpha)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、T细胞活化衔接因子(LAT)、GADS(GrpL)、SLP-76(淋巴细胞胞浆蛋白2(LCP2))、PAG1/CBP、一CD83配体(CD83ligand)、Fcγ受体(Fc gamma receptor)、MHC1类分子(MHC class 1molecule)、MHC2类分子(MHC class 2molecule)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白(TNF receptor protein)、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体(cytokine receptor)、一种整合素(integrin)、活化自然杀手细胞受体(activating NK cell receptors)、一种类铎受体(Toll-likereceptor)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、计划性死亡-配体1(PD-L1)及其组合，且该人类自然杀手细胞是：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少3个月的继代培养后仍保持其增殖的能力，以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析该人类自然杀手细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
较佳者，该组合物中的人类自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于该组合物中的总细胞数为100％时，人类自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
较佳者，该个体为一人体。
较佳者，该方法用于治疗选自下列的癌症：棘皮瘤(Acanthoma)、腺细胞癌(Aciniccell carcinoma)、听神经瘤(Acoustic neuroma)、肢端小痣性黑色素瘤(Acrallentiginous melanoma)、汗腺顶端汗腺瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸性粒细胞白血病(Acute eosinophilic leukemia)、急性淋巴母细胞白血病(Acute lymphoblasticleukemia)、急性巨核母细胞白血病(Acute megakaryoblastic leukemia)、急性单核细胞白血病(Acute monocytic leukemia)、急性成熟骨髓芽球性白血病(Acute myeloblasticleukemia with maturation)、急性髓源型树突状细胞白血病(Acute myeloid dendriticcell leukemia)、急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia)、急性前髓细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia)、牙釉母细胞瘤(Adamantinoma)、腺癌(Adenocarcinoma)、腺样囊状癌(Adenoid cystic carcinoma)、腺瘤(Adenoma)、牙源性腺瘤样肿瘤(Adenomatoid odontogenic tumor)、肾上腺皮质癌(Adrenocorticalcarcinoma)、成人型T细胞白血病(Adult T-cell leukemia)、侵略性NK细胞白血病(Aggressive NK-cell leukemia)、艾滋病相关癌症(AIDS-Related Cancers)、艾滋病相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、肺泡状软组织肉瘤(Alveolar soft part sarcoma)、造釉细胞性纤维瘤(Ameloblastic fibroma)、肛门癌(Anal cancer)、间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma)、甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer)、血管免疫芽细胞性T细胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma)、血管平滑肌脂肪瘤(Angiomyolipoma)、血管肉瘤(Angiosarcoma)、阑尾癌(Appendix cancer)、星细胞瘤(Astrocytoma)、非典型畸胎/类横纹肌细胞瘤(Atypical teratoidrhabdoid tumor)、基底细胞癌(Basal cell carcinoma)、类基底细胞癌(Basal-like carcinoma)、B细胞白血病(B-cell leukemia)、B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、Bellini集合管癌(Bellini ductcarcinoma)、胆道癌(Biliary tract cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、胚细胞瘤(Blastoma)、骨癌(Bone Cancer)、骨肿瘤(Bone tumor)、脑干胶质瘤(Brain StemGlioma)、脑瘤(Brain Tumor)、乳癌(Breast Cancer)、布伦内罗氏瘤(Brenner tumor)、支气管肿瘤(Bronchial Tumor)、支气管肺泡腺癌(Bronchioloalveolar carcinoma)、棕色瘤(Brown tumor)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、原发部位不明的癌(Cancer ofUnknown Primary Site)、类癌瘤(Carcinoid Tumor)、上皮细胞癌(Carcinoma)、原位癌(Carcinoma in situ)、阴茎癌(Carcinoma of the penis)、原发部位不明转移癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤(Carcinosarcoma)、Castleman氏病(Castleman's Disease)、中枢神经系统胚胎性肿瘤(Central Nervous System EmbryonalTumor)、小脑星状细胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、大脑星状细胞瘤(CerebralAstrocytoma)、子宫颈癌(Cervical Cancer)、胆管癌(Cholangiocarcinoma)、软骨癌(Chondroma)、软骨肉瘤(Chondrosarcoma)、脊索瘤(Chordoma)、绒毛膜癌(Choriocarcinoma)、脉络丛乳头状瘤(Choroid plexus papilloma)、慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia)、慢性单核细胞白血病(Chronic monocyticleukemia)、慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增生性疾病(Chronic Myeloproliferative Disorder)、慢性嗜中性白血病(Chronic neutrophilicleukemia)、透明细胞肿瘤(Clear-cell tumor)、大肠癌(Colon Cancer)、大肠直肠癌(Colorectal cancer)、颅咽管瘤(Craniopharyngioma)、皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)、Degos氏病(Degos disease)、隆突性皮肤纤维肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、皮样囊肿(Dermoid cyst)、发育不良的小圆细胞瘤(Desmoplastic small round cell tumor)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large Bcell lymphoma)、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(Dysembryoplastic neuroepithelialtumor)、胚胎性癌(Embryonal carcinoma)、内胚窦瘤(Endodermal sinus tumor)、子宫内膜癌(Endometrial cancer)、子宫内膜癌(Endometrial Uterine Cancer)、子宫内膜样瘤(Endometrioid tumor)、肠道T细胞淋巴瘤(Enteropathy-associated T-cell lymphoma)、室管膜母细胞瘤(Ependymoblastoma)、室管膜瘤(Ependymoma)、上皮样肉瘤(Epithelioidsarcoma)、红血球性白血病(Erythroleukemia)、食道癌(Esophageal cancer)、敏感性神经胚细胞瘤(Esthesioneuroblastoma)、Ewing氏家族肿瘤(Ewing Family of Tumor)、Ewing氏家族肉瘤(Ewing Family Sarcoma)、Ewing氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、生殖细胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外生殖细胞瘤(Extragonadal Germ CellTumor)、肝外胆管癌(Extrahepatic Bile Duct Cancer)、乳房外Paget氏病(ExtramammaryPaget's disease)、输卵管癌(Fallopian tube cancer)、胎内胎(Fetus in fetu)、纤维瘤(Fibroma)、纤维肉瘤(Fibrosarcoma)、滤泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma)、滤泡性甲状腺癌(Follicular thyroid cancer)、胆癌(Gallbladder Cancer)、胆癌(Gallbladdercancer)、神经节胶质细胞瘤(Ganglioglioma)、神经节细胞瘤(Ganglioneuroma)、胃癌(Gastric Cancer)、胃淋巴癌(Gastric lymphoma)、肠胃道癌(Gastrointestinalcancer)、胃肠道类癌肿瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃肠道基质肿瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor)、胃肠道基质肿瘤(Gastrointestinal stromaltumor)、生殖细胞瘤(Germ cell tumor)、胚细胞瘤(Germinoma)、妊娠绒毛膜癌(Gestational choriocarcinoma)、妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational TrophoblasticTumor)、骨巨细胞瘤(Giant cell tumor of bone)、多形性神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme)、神经胶质瘤(Glioma)、大脑神经胶瘤病(Gliomatosiscerebri)、球状血管瘤(Glomus tumor)、升糖素瘤(Glucagonoma)、性腺胚瘤(Gonadoblastoma)、粒层细胞瘤(Granulosa cell tumor)、毛细胞白血病(Hairy CellLeukemia)、毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)、头颈癌(Head and Neck Cancer)、头颈癌(Head and neck cancer)、心脏癌(Heart cancer)、血管母细胞瘤(Hemangioblastoma)、血管外皮细胞瘤(Hemangiopericytoma)、血管肉瘤(Hemangiosarcoma)、血液恶性肿瘤(Hematological malignancy)、肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)、肝脾T细胞淋巴癌(Hepatosplenic T-cell lymphoma)、遗传性乳癌与卵巢癌症候群(Hereditary breast-ovarian cancer syndrome)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)、下咽癌(Hypopharyngeal Cancer)、下视丘脑神经胶质瘤(Hypothalamic Glioma)、延性乳腺癌(Inflammatory breast cancer)、眼内黑色素瘤(Intraocular Melanoma)、胰岛细胞癌(Islet cell carcinoma)、胰岛细胞瘤(Islet CellTumor)、少年性骨髓单核球白血病(Juvenile myelomonocytic leukemia)、卡波西氏肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、肾癌(Kidney Cancer)、肝门部胆管癌(Klatskin tumor)、Krukenberg氏瘤(Krukenberg tumor)、喉癌(Laryngeal Cancer)、喉癌(Laryngeal cancer)、恶性雀斑样黑色素瘤(Lentigo maligna melanoma)、白血病(Leukemia)、嘴唇及口腔癌症(Lip and Oral Cavity Cancer)、脂肪肉瘤(Liposarcoma)、肺癌(Lung cancer)、黄体瘤(Luteoma)、淋巴管瘤(Lymphangioma)、淋巴管肉瘤(Lymphangiosarcoma)、淋巴上皮瘤(Lymphoepithelioma)、淋巴细胞性白血病(Lymphoidleukemia)、淋巴瘤(Lymphoma)、巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)、恶性纤维组织细胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma)、恶性纤维组织细胞瘤(Malignant fibroushistiocytoma)、恶性骨纤维组织细胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)、恶性神经胶瘤(Malignant Glioma)、恶性间皮瘤(Malignant Mesothelioma)、恶性周边神经鞘瘤(Malignant peripheral nerve sheath tumor)、恶性横纹肌瘤(Malignant rhabdoidtumor)、恶性蝾螈瘤(Malignant triton tumor)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALTlymphoma)、被套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)、肥胖细胞白血病(Mast cellleukemia)、纵隔腔生殖细胞瘤(Mediastinal germ cell tumor)、纵隔腔肿瘤(Mediastinal tumor)、甲状腺髓样癌(Medullary thyroid cancer)、神经管胚细胞癌(Medulloblastoma)、神经管胚细胞癌(Medulloblastoma)、髓上皮瘤(Medulloepithelioma)、黑色素瘤(Melanoma)、黑色素瘤(Melanoma)、脑脊髓膜瘤(Meningioma)、Merkel氏细胞瘤(Merkel Cell Carcinoma)、间皮瘤(Mesothelioma)、间皮瘤(Mesothelioma)、原发不明鳞状细胞癌之颈部转移(Metastatic Squamous Neck Cancerwith Occult Primary)、转移性尿路上皮癌(Metastatic urothelial carcinoma)、混合米勒氏肿瘤(Mixed Mullerian tumor)、单核球白血病(Monocytic 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Cancer)、卵巢生殖细胞肿瘤(Ovarian GermCell Tumor)、卵巢低恶性瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、乳腺博德氏Paget疾病(Paget's disease of the breast)、肺上沟癌(Pancoast tumor)、胰脏癌(Pancreatic Cancer)、胰脏癌(Pancreatic cancer)、乳头状甲状腺癌(Papillarythyroid cancer)、乳突瘤病(Papillomatosis)、副神经节瘤(Paraganglioma)、鼻窦癌(Paranasal Sinus Cancer)、甲状旁腺腺瘤(Parathyroid Cancer)、阴茎癌(PenileCancer)、血管周围上皮样细胞瘤(Perivascular epithelioid cell tumor)、咽癌(Pharyngeal Cancer)、嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma)、中分化松果体实质肿瘤(PinealParenchymal Tumor of Intermediate Differentiation)、松果体母细胞瘤(Pineoblastoma)、垂体细胞瘤(Pituicytoma)、垂体腺瘤(Pituitary adenoma)、脑下垂体瘤(Pituitary tumor)、浆细胞肿瘤(Plasma Cell Neoplasm)、胸膜肺母细胞瘤(Pleuropulmonary blastoma)、多胚瘤(Polyembryoma)、T淋巴母细胞淋巴瘤(PrecursorT-lymphoblastic lymphoma)、原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary central nervoussystem lymphoma)、原发性体液淋巴瘤(Primary effusion lymphoma)、原发性肝细胞癌(Primary Hepatocellular Cancer)、原发性肝癌(Primary Liver Cancer)、原发性腹膜癌(Primary peritoneal cancer)、原始神经外胚层肿瘤(Primitive neuroectodermaltumor)、前列腺癌(Prostate cancer)、腹膜假黏液瘤(Pseudomyxoma peritonei)、直肠癌(Rectal Cancer)、肾细胞癌(Renal cell carcinoma)、与在第15号染色体上NUT基因相关的呼吸道癌(Respiratory Tract Carcinoma Involving the NUT Gene on Chromosome15)、视网膜胚细胞瘤(Retinoblastoma)、横纹肌瘤(Rhabdomyoma)、横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、Richter转化(Richter'stransformation)、荐椎尾骨畸胎瘤(Sacrococcygeal teratoma)、唾液腺肿瘤(Salivary Gland Cancer)、肉瘤(Sarcoma)、神经鞘瘤(Schwannomatosis)、皮脂腺癌(Sebaceous gland carcinoma)、继发性肿瘤(Secondary neoplasm)、精原细胞瘤(Seminoma)、浆液性肿瘤(Serous tumor)、支持间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索间质肿瘤(Sex cord-stromal tumor)、Sezary症候群(Sezary Syndrome)、印戒细胞癌(Signet ring cell carcinoma)、皮肤癌(SkinCancer)、小蓝圆细胞肿瘤(Small blue round cell tumor)、小细胞癌(Small cellcarcinoma)、小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、小细胞淋巴癌(Small celllymphoma)、小肠癌(Small intestine cancer)、软组织肉瘤(Soft tissue sarcoma)、体抑素瘤(Somatostatinoma)、煤烟疣(Soot wart)、脊髓肿瘤(Spinal Cord Tumor)、脊髓肿瘤(Spinal tumor)、脾脏缘带淋巴癌(Splenic marginal zone lymphoma)、鳞状上皮细胞瘤(Squamous cell carcinoma)、胃癌(Stomach cancer)、表浅散播型黑色素瘤(Superficialspreading melanoma)、小脑幕上神经外胚层母细胞瘤(Supratentorial PrimitiveNeuroectodermal Tumor)、表面上皮间质肿瘤(Surface epithelial-stromal tumor)、滑膜肉瘤(Synovial sarcoma)、T细胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblasticleukemia)、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-cell large granular lymphocyteleukemia)、T细胞白血病(T-cell leukemia)、T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T幼淋巴细胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、畸胎瘤(Teratoma)、末期淋巴癌(Terminallymphatic cancer)、睪丸癌(Testicular cancer)、鞘细胞瘤(Thecoma)、咽喉癌(ThroatCancer)、胸腺癌(Thymic Carcinoma)、胸腺癌(Thymoma)、甲状腺癌(Thyroid cancer)、肾盂、输尿管和过度上皮细胞癌(Transitional Cell Cancer of Renal Pelvis andUreter)、移形上皮细胞癌(Transitional cell carcinoma)、脐尿管癌(Urachal cancer)、尿道癌(Urethral cancer)、泌尿生殖器肿瘤(Urogenital neoplasm)、子宫肉瘤(Uterinesarcoma)、葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma)、阴道癌(Vaginal Cancer)、瓦-马二氏症(Verner Morrison syndrome)、疣状癌(Verrucous carcinoma)、视觉通路神经胶质瘤(Visual Pathway Glioma)、外阴肿瘤(Vulvar Cancer)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、华生氏肿瘤(Warthin's tumor)、威尔母氏肿瘤(Wilms'tumor)、其他癌症、及其组合。
“oNK”一词代表(a)从具有保藏编号ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞群衍生出来的非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞系；(b)利用揭露于实施例2.1中的培养方法，培养(a)所述的细胞多日后所取得的非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞系；(c)保藏在NPMD且具有保藏序号NITE BP-03017的细胞；或(d)一具有以下特征的人类自然杀手细胞：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；和
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送(deliberately delivered)的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16 F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
【附图简单说明】
图1：取得一非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的流程图。
图2A：未经CD16荧光标记抗体(CD16 fluorescent labeled antibody)标定的人类周边血液自然杀手细胞群的二维位图，其中该人类周边血液自然杀手细胞群是衍生自保藏编号为ATCC CRL-2407的细胞群。
图2B：经CD16荧光标记抗体标定的人类周边血液自然杀手细胞群的二维位图，其中该人类周边血液自然杀手细胞群是衍生自保藏编号为ATCC CRL-2407的细胞群。
图2C：将表达CD16受体的细胞自经利用CD16荧光标记抗体标定的人类周边血液自然杀手细胞群中分离后的二维位图。
图3：培养人类CD16阳性自然杀手细胞之流程图。
图4：非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系于培养不同天数后的细胞存活率(cell viability)之折线图。
图5：比较经培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和NK-92细胞系，对癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。
图6A：比较不同数量的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系，对癌细胞的细胞毒杀活性之柱状图。
图6B：比较不同数量的HER2抗体复合的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenic human CD16+natural killer cellline)，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用对癌细胞的细胞毒杀活性之柱状图。
图7：比较HER2抗体复合的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(anti-HER2antibody-conjugated non-transgenic human CD16+natural killer cell line)和与HER2抗体共培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(anti-HER2 antibody co-cultured non-transgenic human CD16+natural killer cell line)，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用对癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。
图8：比较非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和转基因CD16的NK-92细胞系，其基因型(genotype)之柱状图。
图9A-9E：说明应用一标记一颜色的CD16a受体基因特异性测试探针和一标记另一颜色的参考探针的双色FISH分析来检测测人类自然杀手细胞中，转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16a受体的DNA序列的原理。
图10：非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。
图11A：比较非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和转基因CD16的NK-92细胞系，在不同作用细胞(E)和目标细胞(T)比例时，杀死癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。
图11B：比较非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和转基因CD16的NK-92细胞系，在不同作用细胞(E)和目标细胞(T)比例时，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。
图12A：人类血小板裂解物对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的总细胞数的影响之折线图。
图12B：人类血小板裂解物对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的细胞存活率的影响之折线图。
图12C：人类血小板裂解物对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的维持CD16表达量的影响之折线图。
图13A：低浓度的白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的总细胞数的影响之折线图。
图13B：高浓度的白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的总细胞数的影响之折线图。
图13C：低浓度的白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的细胞存活率的影响之折线图。
图13D：高浓度的白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的细胞存活率的影响之折线图。
图13E：低浓度的白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的维持CD16表达量的影响之折线图。
图13F：高浓度的白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的维持CD16表达量的影响之折线图。
图14A：透气容器对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的总细胞数的影响之折线图。
图14B：透气容器对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的细胞存活率的影响之折线图。
图14C：透气容器对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同的培养天数后的维持CD16表达量的影响之折线图。
【实施方式】
下述为使用本发明的实施例和本发明的技术和特点对本发明的一详细描述；然而，这些实施例并非用以限制本发明，因此凡其他未脱离本发明的精神和目标下，任何经熟悉此技术的人所做的更动或润饰，均应包含在本发明的范围内。
实施例一：取得非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞系。
请参照图1。图1为取得一种非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的流程图。本发明中用以取得一种非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的方法至少包含以下步骤：
步骤S11：取得一群人类周边血液自然杀手细胞，其系衍生自一保藏编号为ATCCCRL-2407的细胞群；
步骤S12：让该人类周边血液自然杀手细胞群与一种对一CD16受体有特异性的抗体接触；
步骤S13：将被抗体特异性地结合的细胞分离出来，从而取得非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
较佳者，在步骤S12中，CD16受体为一CD16a受体。
较佳者，在步骤S13中，系用流式细胞技术、磁珠(beads)、或任何含抗体修饰表面(antibody-modified surface)的材料来分离被抗体特异性地结合的细胞。
较佳者，『非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞系』一词指的是非基因改造的人类CD16阳性自然杀手细胞系且/或没有合成的或外源性多核苷酸序列的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
以下提供较佳实施例的详细描述。
实施例1.1标记(label)并分选(sorting)非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
本实施例由一实验组和一对照组组成。将具有保藏编号ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞群用100～1000xg的转速离心3～5分钟。移除上清液后，用一缓冲液重新悬浮人类周边血液自然杀手细胞群。将该人类周边血液自然杀手细胞群均匀分配到对照组和实验组的细胞培养皿中。将实验组的人类周边血液自然杀手细胞群培养在该细胞培养皿中，然后与CD16荧光标记抗体(CD16-PE-Cy7，一种抗CD16a受体和CD16b受体的抗体)混合，以标定人类周边血液自然杀手细胞群中表达CD16受体的细胞；同时将对照组的人类周边血液自然杀手细胞群与一等体积的缓冲液混合。将实验组和对照组内的细胞分别离心，去除上清液后，加入一分选缓冲液(sorting buffer)，使细胞浓度调整成每毫升1×107个细胞。最后，用一细胞分选仪(cell sorter)分析实验组和对照组的细胞群。
其中，所述缓冲液为分选前缓冲液(Pre-Sort buffer)、流式细胞技术样品制备缓冲液(Flow cytometry sample preparation buffers)或Dulbecco氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco’s phosphate buffer saline；DPBS)。所述分选缓冲液为添加了胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)的分选前缓冲液、流式细胞技术样品制备缓冲液或Dulbecco氏磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)。所述细胞分选仪为，例如一台型号为Becton Dickinson-FACSAria IIIu的流式细胞仪。
较佳者，该分选缓冲液包含0.1～10％(体积百分比，vol％，v/v)的胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)。
较佳者，分选时间为1小时，分选速度为50～70000events/second。
利用细胞分选仪的前向散射光(FSC)和侧向散色光(SSC)分别分析对照组和实验组中的10,000个粒子后，在对照组的10,000个粒子中有6771个粒子为细胞(当粒子数为100％时，细胞数占67.7％)，而在实验组的10,000粒子中有6944个粒子为细胞(当粒子数为100％时，细胞数占69.4％)。
图2A显示对照组细胞的荧光分析结果，图2A为未经CD16荧光标记抗体(CD16fluorescent labeled antibody)标定的人类周边血液自然杀手细胞群的二维位图，其中该人类周边血液自然杀手细胞群是衍生自保藏编号为ATCC CRL-2407的细胞群。图2B显示实验组细胞的荧光分析结果，图2B为经CD16荧光标记抗体标定的人类周边血液自然杀手细胞群的二维位图，其中该人类周边血液自然血液自然杀手细胞群是衍生自保藏编号为ATCCCRL-2407的细胞群。
图2A和图2B中，横坐标为PE-CY7荧光强度的相对数值(用于该实验中的CD16荧光标记抗体会发射PE-Cy7荧光)，纵坐标为前向散色光(FSC)强度的相对数值。
图2A的结果显示，对照组中，6771个被分析的细胞皆不发射PE-Cy7荧光(0个细胞在长方型的区域内)。因此，在没有CD16-PE-Cy7荧光标记抗体标定时，没有其他与PE-Cy7荧光染料(fluorescent dye)相似波长的辐射光会干扰对照组细胞的实验结果。
图2B的结果显示，实验组内，6966个被分析的细胞，大多数都没有PE-Cy7荧光，只有少数细胞有PE-Cy7荧光(只有174个细胞在长方形区域内)。因此，可以得知，实验组内在10,000个粒子中有6944个为细胞，其中有174个细胞表现CD16受体，亦即，只有1.7％的粒子是表达CD16受体的细胞(174÷10000＝1.7％)，并且只有2.5％～2.6％的细胞是表达CD16受体的细胞(174÷6944≒2.6％)。在实验组中，以细胞浓度每毫升1×107个细胞的条件为依据，每毫升实验组的细胞溶液中包含大约2.6×105个表达CD16受体的细胞。
为了取得高纯度的CD16阳性细胞(在下文称为『纯化的CD16阳性细胞群』、『分离的oNK』或『分离的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系』)，从实验组的细胞中分选出表达CD16受体的细胞。
请参阅图2C，图2C为将表达CD16受体的细胞自经利用CD16荧光标记抗体标定的人类周边血液自然杀手细胞群中分离后的二维位图。图2C的结果显示，在纯化的CD16阳性细胞群中，大多数的细胞发射PE-Cy7荧光，且表达CD16受体的细胞的纯度高达99％。
前述纯化的CD16阳性细胞群中的CD16受体表达细胞是非转基因细胞；经过分析，所有前述纯化的CD16阳性细胞群中的CD16受体表达细胞皆有CD3阴性CD56阳性的特征，它们可以被持续地继代培养且没有致癌性；因此，前述纯化的CD16阳性细胞群中的CD16受体表达细胞是一种新颖的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
实施例二：培养人类CD16阳性自然杀手细胞。
请参阅图3。图3是培养人类CD16阳性自然杀手细胞的流程图。培养人类CD16阳性自然杀手细胞的方法至少包含以下步骤：
步骤S21：取得人类CD16阳性自然杀手细胞；
步骤S22：在容器中，让人类CD16阳性自然杀手细胞与一含有人类血小板裂解物和白介素-2(IL-2)的培养基接触；以及
步骤S23：培养人类CD16阳性自然杀手细胞数日以增殖人类CD16阳性自然杀手细胞。
下面阐述本发明的一培养一种非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的具体实施例，但是本发明的应用并非局限于此，亦即本发明也可被用于培养其他人类CD16阳性自然杀手细胞。例如，从自体或异体血液中分离出的原代人类CD16阳性自然杀手细胞、转基因CD16的NK-92细胞系或其他人类CD16阳性自然杀手细胞。
实施例2.1培养非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
步骤S21’：将从实施例一中分选出的纯化的CD16阳性细胞群(表达CD16受体的细胞比例高达99％)离心，移除上清液。
步骤S22’：用1mL的细胞培养基重新悬浮细胞后，将该细胞悬浮液置入一第一容器中，使第一容器内的40mL细胞培养基中包含6.54×105个非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞；所述细胞培养基包含：
0.5％～30％(体积百分比，vol％，v/v)的人类血小板裂解物；
100～3000IU/mL的白介素2(IL-2)；以及
DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、α-MEM培养基(alphamodification of Eagle's minimum essential medium)、或XVIVO 10培养基。
步骤S23’：经过数日培养后，取得一种富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，在该富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物中，非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的数量至少为5×105个；所述的数日为例如一天到三年。
较佳者，所述的数日为一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、两年、或三年。
较佳者，该细胞培养基包含0.5％、1％、1.5％、1.6％、2％、2.5％、2.6％、3％、3.5％、3.6％、4％、4.5％、4.6％、5.0％、5.1％、5.5％、5.6％、6％、6.1％、6.5％、6.6％、7％、7.1％、7.5％、7.6％、8％、8.1％、8.5％、8.6％、9％、9.1％、9.5％、9.6％、或10％(体积百分比，vol％，v/v)的人类血小板裂解物。
较佳者，该细胞培养基包含100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、或3000IU/mL的白介素2(IL-2)。
较佳者，步骤S23’更包含子步骤：
步骤S231’：经过数日培养后，细胞培养基中的细胞数达到第一细胞数，该第一细胞数为1.25×106～5×106；
步骤S232’：将细胞悬浮液置入一第二容器中，使第二容器中的细胞数为第一细胞数；经过数日培养后，细胞数达到第二细胞数，该第二细胞数为5×107～1×109；以及
步骤S233’：为了取得一富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，将细胞悬浮液置入一第三容器中，使第三容器中的细胞数为第二细胞数；经过数日培养后，细胞数达到第三细胞数，该第三细胞数为例如5×109或1×1040。
其中，第一容器为例如一T25细胞培养瓶(T25 flask)或G-Rex六孔细胞培养板。第二和第三容器含有一可透气但不透水的薄膜或所述第二和第三容器可以让溶氧浓度充分通气，或是使溶解于培养基中的葡萄糖浓度维持在1500～5000mg/L。较佳者，该第二容器为例如G-Rex 100M透气性悬浮细胞培养瓶(商品号81100，WILSON WOLF，美国)，该第三容器为例如G-Rex-500M透气性悬浮细胞培养瓶(商品号85500S，WILSON WOLF，美国)。请参照这些容器的商品说明书的指示来使用G-Rex 6M 6孔细胞培养板、G-Rex 100M透气性悬浮细胞培养瓶、和G-Rex-500M透气性悬浮细胞培养瓶。
在步骤S23’和S231’～S233’中，培养细胞时，一培养基中添加了0.5％～30％(体积百分比，vol％，v/v)的人类血小板裂解物和100～3000IU/mL的白介素2(IL-2)。同时该培养基为例如DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、α-MEM培养基(alphamodification of Eagle's minimum essential medium)、XVIVO 10培养基、或XVIVO 10无血清造血干细胞培养基。
在步骤S23’和S231’～S233’中，细胞系被培养在37℃和5％二氧化碳的条件下。
实施例2.2检测从实施例2.1中取得的经培养的细胞的细胞存活率(cellviability)。
将利用公开在实施例2.1的培养方法于培养不同天数后取得的每个细胞悬浮样品与一等体积的台盼蓝(Trypan blue)混合，观察细胞数及细胞存活率。
实验结果显示，经培养7、16、21、28、37、42、49、65、92、97、103、134、166、184和202天后，细胞数分别达到1.61×106、1.01×109、2.53×109、5.06×109、1.01×1010、1.62×1010、3.24×1010、1.13×1011、1.81×1015、3.25×1016、6.50×1017、1.35×1022、3.24×1027、1.30×1033和1.04×1039。请参阅图4。图4显示，非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系经培养7、16、21、28、37、42、49、65、92、97、103、134、166、184和202天后，细胞存活率维持在84～97％。因此，利用本发明的培养方法培养非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系，可使细胞数扩增至少1.59×1033倍[(1.04×1039)÷(6.54×105)≒1.59×1033]，同时在增殖后能有效地维持细胞存活率。
实施例三：检测细胞状态和细胞表面标志。
实施例3.1利用本发明的培养方法长期培养非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系
本实施例中有两个实验。第一批纯化的CD16阳性细胞群和第二批纯化的CD16阳性细胞群(两批细胞中表达CD16受体细胞的比例皆高达99％)为利用实施例1.1的方法分选出来的，然后将第一批纯化的CD16阳性细胞群和第二批纯化的CD16阳性细胞群分别用实施例2.1的培养方法培养，以取得第一个实验的细胞悬浮液和第二个实验的细胞悬浮液。第一批纯化的CD16阳性细胞群的总培养时间为35天，而第二批纯化的CD16阳性细胞群被长期培养到至少第202天。
实施例3.2检测经培养的细胞的状态
将从实施例3.1中不同时间点取得的每个细胞悬浮液样品离心；移除上清液，将细胞重新悬浮至缓冲液中，然后与1μL的碘化丙啶(propidium iodide)混合。用细胞分选仪或流式细胞仪检测细胞是否被碘化丙啶染色，以决定正在凋亡或已经死亡的细胞的百分比。
实施例3.3检测经培养的细胞的CD56、CD3和CD2表面标志。
将从实施例3.1中不同时间点取得的每个细胞悬浮液样品离心；移除上清液，将细胞重新悬浮至缓冲液中后，然后与1μL的CD56荧光标记抗体(商品号318304，Biolegend，美国)、1μL的CD3荧光标记抗体(商品号300410，Biolegend，美国)、及1μL的CD2荧光标记抗体(商品号300222，Biolegend，美国)混合，以同时标定表达CD56分子、CD3分子、且/或CD2分子的细胞。最后，用细胞分选仪或流式细胞仪分析细胞是否表现CD56分子、CD3分子、且/或CD2分子，并计算具有不同细胞表面标记的细胞的百分比。
实施例3.4检测经培养的细胞的CD16表面标志。
将从实施例3.1中不同时间点取得的每个细胞悬浮液样品离心；移除上清液，将细胞重新悬浮至缓冲液后，与1μL的CD16荧光标记抗体(商品号302016，Biolegend，美国)混合，以标定表达CD16受体的细胞。最后用细胞分选仪分析细胞是否表现CD16受体，并计算有CD16受体的细胞的百分比。
实施例3.5检测经培养的细胞的细胞毒性功能。
本实施例使用xCELLigence实时细胞分析系统(xCELLigence Real Time CellAnalysis System；xCELLigenceRTCA系统，ACEA Biosciences Inc.，美国)检测经培养的细胞对目标细胞的细胞毒杀能力。本实施例包含一用来进行细胞毒性测试的96孔xCELLigence E-板(xCELLigence E-Plate)，将xCELLigence E-板上的孔分成对照孔、实验孔、和最大化裂解目标细胞的对照孔。本实施例中使用的作用细胞(effector cells)是从实施例3.1中培养不同时间点取得的细胞悬浮液，目标细胞(target cells)为SK-OV-3细胞系(HTB-77，购自ATCC)，SK-OV-3细胞系是一贴壁式卵巢癌细胞系。将SK-OV-3细胞种于对照孔、实验孔、和最大化裂解目标细胞的对照孔中，每孔含有20000个SK-OV-3细胞，然后使其静置30分钟。
将从实施例3.1中取得的一细胞悬浮液样品加入实验孔中，作用细胞数和SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为2、5和10；将与细胞悬浮液样品十分之一等体积(tenth equalvolume)的裂解缓冲液(lysis buffer)加入最大化裂解目标细胞的对照孔；对照组中不加任何样品或裂解缓冲液。将该xCELLigence E-板放入xCELLigence实时细胞分析系统，以检测细胞在37℃和5％二氧化碳条件下的实时细胞指数(cell index(CI))变化。
其中，附着于xCELLigence E-板底部的目标细胞数越多，xCELLigence实时细胞分析系统检测到的细胞指数就越高。因此，细胞指数可以换算出实验孔中被裂解的目标细胞(target cells that are lysed)的百分比。将实验孔的细胞指数转换成被裂解的目标细胞的百分比的公式为：
被裂解的目标细胞的百分比(％)＝1-[(实验孔的细胞指数-最大化裂解目标细胞对照孔的细胞指数)÷(对照孔的细胞指数-最大化裂解目标细胞对照孔的细胞指数)]×100％
请参照表一和表二。表一显示从第一个实验取得的细胞悬浮液的结果，表二显示从第二个实验取得的细胞悬浮液的结果。
在表一中，第一列的「天」代表培养天数；第二列的「PI+」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，正在凋亡或已死亡的细胞的百分比；因为自然杀手细胞、CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞都为CD56阳性(Pernick，N，2018)，所以第三列的「CD56+」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞、CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的总细胞数的百分比；因为T细胞都为CD3阳性(Pernick,N,2018)，所以第四列的「CD3-」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，T细胞以外的细胞的百分比；因为自然杀手细胞、周边血液T细胞和大多数的胸腺细胞都为CD2阳性(Pernick,N,2018)，且实施例三所测试的细胞是源自于(derived)周边血液，所以第五列的「CD2+」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞和T细胞的总细胞数的百分比；第六列的「CD56+CD3-」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞的百分比；第七列的「CD56+CD2+」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞和T细胞总数的百分比；因为自然杀手细胞和巨噬细胞都表现CD16阳性(Pernick,N,2018)，且CD16参与了抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀(ADCC)作用，所以第八列的「CD16+」代表以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，有抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀功能的自然杀手细胞和巨噬细胞的总数量的百分比；第九列「CD56+CD16+」代表以自然杀手细胞(亦即，CD56阳性CD3阴性细胞)总数为100％时，有抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀功能的自然杀手细胞的百分比。
表二中一到八列所代表的意思与表一中相同；当第九列「毒杀测试」被标上「√」标记时，代表该细胞悬浮液中的细胞之细胞毒杀功能在某个时间点被同步测试且确认了该些细胞具有细胞毒杀功能。
表一显示：(1)第一批纯化的CD16阳性细胞群(其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例高达99％)被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，正在凋亡或已死亡的细胞百分比为5.65％～7.34％，因此，在培养期间，存活的细胞的百分比为92.66％～94.35％；(2)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞、CD4阳性的T细胞和CD8阳性的T细胞的总数的百分比为99.08％～99.56％；(3)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，T细胞以外的细胞的百分比为99.88～100％；(4)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞和T细胞总数的百分比为98.08～99.22％；(5)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞的百分比为98.21～98.76％；(6)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞和T细胞的总数的百分比为98.78～99.33％；(7)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，有抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀功能的自然杀手细胞和巨噬细胞的总数的百分比为90.17～92.36％；(8)第一批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～35天后所取得的细胞悬浮液中，以自然杀手细胞(亦即，CD56阳性CD3阴性细胞)的总数为100％时，有抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀功能的自然杀手细胞的百分比为88.79～92.11％。
表一培养第一批纯化的CD16阳性细胞群后所取得的细胞悬浮液的细胞状态和细胞表面标志测试结果
Figure GDA0003261113020000741
Figure GDA0003261113020000751
表二显示：(1)第二批纯化的CD16阳性细胞群(其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例达99％)被培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，正在凋亡或已死亡的细胞的百分比为2.7％～10.5％，因此，在培养期间，存活的细胞的百分比为89.5％～97.3％；(2)第二批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞、CD4阳性的T细胞和CD8阳性的T细胞的总数的百分比为98.85％～99.65％；(3)第二批纯化的CD16阳性细胞群培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，T细胞以外的细胞的百分比为99.82～100％；(4)第二批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞和T细胞的总数的百分比为94.5～99.68％；(5)第二批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞的百分比为97.65％～99.05％；(6)第二批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，自然杀手细胞和T细胞的总数的百分比为97.83％～99.61％；(7)第二批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～202天后所取得的细胞悬浮液中，以细胞悬浮液中的总细胞数为100％时，有抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀功能的自然杀手细胞和巨噬细胞的总数的百分比为83.88～94.04％；(8)第二批纯化的CD16阳性细胞群被培养7～202天后，所取得的细胞悬浮液确实具有细胞毒杀功能。
以揭露于实施例2.1的培养方法培养28天后所取得的细胞悬浮液，已经被保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017。本发明所揭露的结果显示oNK细胞系在经过至少三个月的继代培养后，仍能保持其增殖能力，因此，该细胞系可能含有失调的负责控制细胞生长的基因(deregulated genes responsible for cell growth control；例如，该oNK细胞系可能含有一失活的肿瘤抑制基因或一经突变且高度表达的致癌基因)。
表二培养第二批纯化的CD16阳性细胞群所取得的细胞悬浮液的细胞状态、细胞表面标志、和细胞毒性测试结果
Figure GDA0003261113020000761
Figure GDA0003261113020000771
实施例四：非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系没有致癌性。
本实施例使用六到八周大的雌性BALB/c裸鼠(购买自The Jackson Laboratory或BioLasco，中国台湾)。三十只小鼠被任意的指派成六组，为一SK-OV-3组、Raji组、Daudi组、oNK组、γ射线照射过的ACE-oNK组、和DPBS组。
本实施例使用：一人类卵巢癌细胞系「SK-OV-3」(购买自ATCC；保藏编号为ATCCHTB-77)、人类B淋巴球母细胞系「Raji」(购买自ATCC；保藏编号为ATCC CCL-86)和「Daudi」(购买自ATCC；保藏编号为ATCC CCL-213)、以揭露于实施例2.1中的培养方法培养88天后所取得的一细胞悬浮液(本发明的经过88天培养的oNK悬浮液，称为经88天培养的oNK悬浮液)、及一经γ射线照射过的ACE-oNK细胞悬浮液。下面描述制备γ射线照射过的ACE-oNK细胞悬浮液的方法。
γ射线照射过的ACE-oNK细胞悬浮液：揭露于实施例2.1的培养方法培养84天后所得的细胞悬浮液(本发明的经过84天培养的oNK悬浮液，称为经84天培养的oNK悬浮液)，利用剂量为10Gy的γ射线照射。使用互补的一细胞接头(cell linker)和一贺癌平(Trastuzumab)接头(Trastuzumab linker)，使贺癌平(Trastuzumab)与经γ射线照射后的经84天培养的oNK悬浮液中的细胞(cells in theγ-ray irradiated 84-day culturedoNK suspension)结合，即取得γ射线照射过的ACE-oNK细胞悬浮液(γ-ray irradiatedACE-oNK cell suspension)。
使贺癌平(Trastuzumab)与细胞(例如：自然杀手细胞、经60天培养的oNK悬浮液中的细胞、经γ射线照射后的经60天培养的oNK悬浮液中的细胞)结合(binding)的程序如下：
(A)制备细胞接头(cell linker)并使细胞接头与细胞结合，以制备一单链DNA共轭的细胞(cell-ssDNA conjugate)的步骤；
(B)，制备贺癌平(Trastuzumab)接头并使贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)结合，以制备单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab-ssDNAconjugate)的步骤；
(C)混合单链DNA共轭的细胞和单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)，使单链DNA共轭的细胞和单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)透过细胞接头与其位于贺癌平(Trastuzumab)接头上的互补序列相结合，以制备贺癌平共轭的细胞(Trastuzumab-conjugated cells)。
其中步骤(A)的制备细胞接头并使细胞接头与细胞结合，包含下列步骤(a1)～(a4)：
步骤(a1)取得一第一单链DNA(first single strand DNA)，其中该第一单链DNA的序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7。
步骤(a2)第一单链DNA的5’端被改造成5’端为硫醇基的第一单链DNA(5’endthiol-modified first single strand DNA)，以获得细胞接头贮备物(cell linkerstock)。该细胞接头贮备物也可从Integrated DNA Technologies商业上取得。对本领域技术人员而言，实际的改造方法是已知或显而易见的(Zimmermann,J,2010)。
步骤(a3)将10～500μL的细胞接头贮备物和0.1～10μL的N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺(NHS-Maleimide)(可从Fisher Scientific商业上取得)混合并反应1～60分钟。
步骤(a4)将从步骤(a3)取得的混合物与1×106～1×108个细胞混合并反应1～60分钟，以取得单链DNA共轭的细胞。
步骤(B)的制备贺癌平(Trastuzumab)接头并使贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)结合，包含下列步骤(b1)～(b4)：
步骤(b1)取得一第二单链DNA(second single strand DNA)，其中该第二单链DNA的序列为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10，且该第二单链DNA的序列是第一单链DNA的互补链(complementary strand)。
步骤(b2)第二单链DNA的5’端被改造成5’端为硫醇基的第二单链DNA(5’endthiol-modified second single strand DNA)，以获得一贺癌平(Trastuzumab)接头贮备物(Trastuzumab linker stock)。此贺癌平(Trastuzumab)接头贮备物也可从IntegratedDNA Technologies商业上取得。对本领域技术人员而言，实际的改造方法是已知或显而易见的(Zimmermann,J,2010)。
步骤(b3)将10～500μL的贺癌平(Trastuzumab)接头贮备物和0.1～10μL的N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺(NHS-Maleimide)(可从Fisher Scientific商业上取得)混合并反应1～60分钟。
步骤(b4)将从步骤(b3)取得的混合物与10～100μL的贺癌平(Trastuzumab)贮备物(Trastuzumabstock)(可从Roche商业上取得)混合并反应10分钟到3小时，以取得单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)。
混合单链DNA共轭的细胞和单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)，以取得贺癌平(Trastuzumab)共轭的细胞，例如经γ射线照射过的ACE-oNK悬浮液中的细胞。
1×107个SK-OV-3细胞、1×107个Raji细胞、1×107个Daudi细胞、1×107个经60天培养的oNK悬浮液中的细胞、和1×107个经γ射线照射过的ACE-oNK悬浮液中的细胞，分别被悬浮于100μL的Dulbecco氏磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)中，以取得不同的细胞悬浮液。这些细胞悬浮液和100μL的Dulbecco氏磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)在第0天时，分别皮下植入(subcutaneously implanted)至SK-OV-3组、Raji组、Daudi组、oNK组、经γ射线照射过的ACE-oNK组、和DPBS组的雌性BALB/c裸鼠中。在第14天、第21天、第24天、第42天和第59天观察每只小鼠中的肿瘤生长情形，并在第59天让小鼠安乐死。
请参阅表三。表三显示异种移植不同细胞系的裸鼠中，肿瘤生成的结果。
表三显示在整个实验过程中，DPBS组(阴性对照组)的小鼠没有肿瘤生成(0/5，0％)，然而，在SK-OV-3组(阳性对照组)中，五只小鼠皆有肿瘤生成(5/5，100％)。对异种移植淋巴细胞系Daudi的小鼠，在Daudi组的五只小鼠中有四只产生肿瘤(4/5，80％)，且肿瘤维持到实验结束时(第59天)。对异种移植淋巴细胞系Raji的小鼠，在Raji组的五只小鼠中有一只在第42天前带有可以检测到的肿瘤，但在实验结束时回到无法测量的大小。
对异种移植本发明的oNK细胞或经γ射线照射过的ACE-oNK细胞的小鼠，在oNK组和γ射线照射过的ACE-oNK组的小鼠中，整个实验过程皆没有肿瘤形成(0/5，0％)。这些实验结果提供证据证明未经γ射线照射的oNK细胞(non-irradiated oNK cells)及贺癌平(Trastuzumab)共轭的经γ射线照射过的ACE-oNK细胞(Trastuzumab-conjugatedirradiated ACE-oNK cells)不具致癌性且可以安全地用于未来的临床应用和疾病治疗。
表三异种移植不同细胞系的裸鼠的肿瘤生成结果。
Figure GDA0003261113020000811
实施例五：经培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和NK-92细胞系间细胞毒性之比较
本实施例的实验方法和实施例3.5的方法大致相同，除了(1)本实施例中所使用的作用细胞(effector cell)为①用公开在实施例2.1中的培养方法培养33天后所取得的细胞悬浮液(本发明的培养33天后的oNK细胞悬浮液，称为经33天培养的oNK细胞悬浮液，其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例为91.74％)，或②保藏序号为ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞群(称为NK-92悬浮液，其中如图2B所示，NK-92细胞系的比例至少为98％，且该NK-92细胞系为一CD16阴性自然杀手细胞系)；以及(2)作用细胞数(经33天培养的oNK细胞悬浮液中的细胞总数或NK-92悬浮液中的细胞总数)和SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为2：1(ET2)。
请参照图5。图5为比较经培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和NK-92细胞系，对癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。图5显示NK-92细胞系(一CD16阴性自然杀手细胞系，所以不能藉由抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用摧毁癌细胞)只毒杀2.40±5.52％的癌细胞，然而oNK细胞(非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞，该细胞没有与靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体连接或共培养，因此，未被活化而无法诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应)毒杀49.68±1.19％的癌细胞。
因此，此实验结果显示：与NK-92细胞(NK-92为一CD16阴性自然杀手细胞系，因此不能透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用来摧毁癌细胞)相比，未经活化诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应的oNK细胞能使细胞毒杀效果提升大约21倍(49.68÷2.4＝21)。这是一无法预期的结果。
此外，根据此结果，申请人相信，如将人类CD16阳性自然杀手细胞系从经33天培养的oNK悬浮液(经培养的oNK)中分离出，并将CD16阴性自然杀手细胞系(NK-92)从NK-92悬浮液中分离出后，可观察到相似的无法预期的结果。
实施例六：不同数量的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系间细胞毒性之比较
本实施例的实验方法与实施例3.5的实验方法大致相同，除了(1)本实施例中所使用的作用细胞为①用公开在实施例2.1中的培养方法培养X天后所取得的细胞悬浮液(本发明的培养X天的oNK悬浮液，其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例为8.91％，称为小量oNK细胞悬浮液)，②用公开在实施例2.1中的培养方法培养Y天后所取得的细胞悬浮液(本发明的培养Y天的oNK，其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例为64.15％，称为中量oNK细胞悬浮液)，③用公开在实施例2.1中的培养方法培养Z天后所取得的细胞悬浮液(本发明的培养Z天的oNK，其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例为91.74％，称为大量oNK细胞悬浮液)，④保藏编号为ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞群(称为NK-92悬浮液，其中如图2B所示，NK-92细胞系的比例至少为98％，且该NK-92细胞系为一CD16阴性自然杀手细胞系)，⑤含有小量ACE-oNK-HER2细胞的悬浮液，⑥含有中量ACE-oNK-HER2细胞的悬浮液，或⑦含有大量ACE-oNK-HER2细胞的悬浮液；以及(2)作用细胞数(少量oNK细胞悬浮液，中量oNK细胞悬浮液，大量oNK细胞悬浮液，NK-92悬浮液，小量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，中量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，或大量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液中的总细胞数)与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为2：1(ET2)。
兹描述制备小量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，中量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，和大量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液的方法于下。
小量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液：将「小量oNK细胞悬浮液」中的所有细胞，利用互补的一细胞接头和一贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)连接，进而取得小量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，其中ACE-oNK-HER2细胞的比例大约为8.91％。
中量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液：将「中量oNK细胞悬浮液」中的所有细胞，利用互补的一细胞接头和一贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)连接，进而取得中量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，其中ACE-oNK-HER2细胞的比例大约为64.15％。
大量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液：将「大量oNK细胞悬浮液」中的所有细胞，利用互补的一细胞接头和一贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)连接，进而取得大量ACE-oNK-HER2细胞悬浮液，其中ACE-oNK-HER2细胞的比例大约为91.74％。
将贺癌平(Trastuzumab)与细胞(少量oNK细胞悬浮液，中量oNK细胞悬浮液，或大量oNK细胞悬浮液中的细胞)结合的方法如同实施例四的方法。
请参照图6A和6B。图6A为比较不同数量的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系，对癌细胞的细胞毒杀活性之柱状图。图6B为比较不同数量的HER2抗体复合的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenichuman CD16+natural killer cell line)，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用对癌细胞的细胞毒杀活性之柱状图。
图6A显示NK-92细胞系(一CD16阴性自然杀手细胞系，因此无法透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用摧毁癌细胞)只毒杀2.40±5.52％的癌细胞；小量oNK细胞(非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞，该细胞没有与靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体连接或共培养，因此，未经活化而无法诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应)毒杀25.00±3.60％的癌细胞；中量oNK细胞(非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞，该细胞没有与靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体连接或共培养，因此，未经活化而无法诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应)毒杀47.60±6.80％的癌细胞；大量oNK细胞(非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞，该细胞没有与靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体连接或共培养，因此，未经活化而无法诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应)毒杀49.68±1.19％的癌细胞。
因此，此结果显示：和NK-92细胞(NK-92为一CD16阴性自然杀手细胞系，因此不能藉由抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用摧毁癌细胞)相比，小量oNK细胞悬浮液(其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例为8.91％)足以使细胞毒杀效果提升10倍(25.00÷2.4＝10)。这是一无法预期的结果。因此，该结果代表当以悬浮液中的总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞系的数量等于或超过5％即足以杀死癌细胞。根据此结果，申请人相信在临床实验中能观察到相似的无法预期的结果。
该结果也显示了中量或大量oNK细胞悬浮液(其中人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例为64.15％或91.74％)可以使细胞毒杀效果提升大约20～21倍(47.60÷2.4＝20；49.68÷2.4＝21)。因此，该结果代表越多人类CD16阳性自然杀手细胞系即能杀死越多癌细胞，且于人类CD16阳性细胞系的量大约为60％～65％时达到一平台(plateau)，此系以悬浮液中的总细胞数作为100％。根据此结果，申请人相信在临床实验中能观察到相似的结果。
图6B显示小量oNK细胞毒杀25.00±3.60％的癌细胞；中量oNK细胞毒杀47.60±6.80％的癌细胞；大量oNK细胞毒杀49.68±1.19％的癌细胞；小量ACE-oNK-HER2细胞毒杀63.70±5.00％的癌细胞；中量ACE-oNK-HER2细胞毒杀62.00±4.00％的癌细胞；大量ACE-oNK-HER2细胞毒杀73.9±11.80％的癌细胞。
因此，此结果显示：当本发明培养所得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系，透过互补的一细胞接头和一抗体接头(例如贺癌平(Trastuzumab)接头)与靶向肿瘤相关抗原(例如贺癌平(Trastuzumab))的抗体连结，因此能被活化而诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应时，细胞毒杀效果显著增加14.4％～38.7％(62.00％-47.60％＝14.4％；63.70％-25.00％＝38.7％)。
该结果同时显示，外源性靶向单元复合的oNK细胞(exogeneous targeting unitcomplexed-oNK cell；例如与抗HER2抗体共轭的oNK细胞)的量等于或超过5％时即足以透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死癌细胞；该结果也指出，越多外源性靶向单元复合的oNK细胞，即能透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死越多癌细胞，且当外源性靶向单元复合的oNK细胞量为大约5％～10％时，会达到一第一平台(first plateau)，此系以悬浮液中的总细胞数作为100％。根据此结果，申请人相信能在临床测试中观察到相似的结果。
实施例七：与HER2抗体共轭的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和与HER2抗体共培养的非转基因人类CD16阳性自然杀手细胞系间细胞毒杀活性之比较
本实施例的实验方法和实施例3.5的方法大致相同，除了(1)本实施例中所使用的作用细胞为①用公开在实施例2.1中的培养方法培养55天后所取得的细胞悬浮液(称为经55天培养的oNK悬浮液)，或②含有ACE-oNK-HER2细胞的细胞悬浮液(如实施例四中所描述，将「经55天培养的oNK悬浮液」中的所有细胞，利用互补的一细胞接头和一贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)连接)；(2)作用细胞数(经55天培养的oNK悬浮液中的所有细胞或含有ACE-oNK-HER2细胞的细胞悬浮液中的所有细胞)与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为1：1(ET1)、2：1(ET2)、5：1(ET5)；和(3)在用于测试经55天培养的oNK悬浮液的实验孔中，加入与「含有ACE-oNK-HER2细胞的细胞悬浮液中，连接在细胞上的贺癌平(Trastuzumab)」总量相等的贺癌平(Trastuzumab)(在E：T比例为1时(0.55ng)，E：T比例为2时(1.10ng)，及E：T比例为5时(2.75ng))。详细步骤描述于下。
将xCELLigence E-板中的孔分成对照孔、ACE-oNK-HER2ET1实验孔、ACE-oNK-HER2ET2实验孔、ACE-oNK-HER2 ET5实验孔、oNK和贺癌平(Herceptin)ET1实验孔、oNK和贺癌平(Herceptin)ET2实验孔、oNK和贺癌平(Herceptin)ET5实验孔、以及最大化裂解目标细胞对照孔。将SK-OV-3细胞种于对照孔、ACE-oNK-HER2 ET1实验孔、ACE-oNK-HER2ET2实验孔、ACE-oNK-HER2 ET5实验孔、oNK和贺癌平(Herceptin)ET1实验孔、oNK和贺癌平(Herceptin)ET2实验孔、oNK和贺癌平(Herceptin)ET5实验孔、以及最大化裂解目标细胞对照孔中，每孔含有20000个SK-OV-3细胞，然后使其静置30分钟。
将含有ACE-oNK-HER2细胞的细胞悬浮液中的20000、40000、100000个细胞分别加入ACE-oNK-HER2 ET1实验孔、ACE-oNK-HER2 ET2实验孔、及ACE-oNK-HER2 ET5实验孔；因此，作用细胞数(含有ACE-oNK-HER2细胞的细胞悬浮液中的细胞总数)与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为1、2和5。
将经55天培养的oNK悬浮液中的20000、40000、或100000个细胞和0.55、1.10、或2.75ng的贺癌平(Trastuzumab)(一种HER2蛋白的抗体，商品名称为Herceptin，购自Roche，瑞士)分别加入「oNK和贺癌平(Herceptin)ET1实验孔」、「oNK和贺癌平(Herceptin)ET2实验孔」、及「oNK和贺癌平(Herceptin)ET5实验孔」中。因此，作用细胞数(经55天培养的oNK悬浮液中的细胞总数)与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为1、2和5；在「oNK和贺癌平(Herceptin)ET1实验孔」、「oNK和贺癌平(Herceptin)ET2实验孔」、或「oNK和贺癌平(Herceptin)ET5实验孔」中的贺癌平(Trastuzumab)量分别与在Ace-oNK-HER2 ET1实验孔、Ace-oNK-HER2 ET2实验孔、及Ace-oNK-HER2 ET5实验孔中，连接在细胞上的贺癌平(Trastuzumab)总量相同。
请参照图7。图7为比较HER2抗体复合的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenic human CD16+natural killer cellline)和与HER2抗体共培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(anti-HER2antibody co-cultured non-transgenic human CD16+natural killer cell line)，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用对癌细胞的细胞毒杀活性能力之柱状图。图7显示与靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体共培养的oNK细胞(因此，被活化诱导了抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应)，在E：T的比例为1、2或5时，分别只毒杀0.00±2.10％、7.30±1.40％、或71.8±2.10％的癌细胞，然而，连接(共轭)了靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体的ACE-oNK-HER2细胞(因此，被活化诱导了抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应)，在E：T的比例为1、2、或5时，分别毒杀31.40±1.10％、65.60±1.00％、或99.10±1.30％的癌细胞。
因此，此结果显示：对比于与靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体共培养的oNK细胞，连接(共轭)靶向肿瘤相关抗原的IgG抗体的ACE-oNK-HER2细胞在低剂量时，能造成9～∞倍的细胞毒性增加量(ET1含有0.55ng贺癌平(Trastuzumab)或ET2含有1.10ng贺癌平(Trastuzumab)；65.60÷7.30＝9；31.40÷0.00＝∞；∞是一代表一无限大数值的符号)。亦即，「将CD16阳性自然杀手细胞与肿瘤抗原之抗体连结」(例如连结经培养的oNK细胞和贺癌平(Trastuzumab))会造成一无法预期的结果，而且「将CD16阳性自然杀手细胞与肿瘤抗原之抗体连结」创造出有效且更安全的治疗方法，使得低剂量的治疗方法得以实现。
除此之外，根据此结果，申请人相信将人类CD16阳性自然杀手细胞系从经55天培养的oNK悬浮液(培养的oNK)分离出来后、以及将与贺癌平(Trastuzumab)连接的CD16阳性自然杀手细胞(ACE-oNK-HER2细胞)从含有ACE-oNK-HER2细胞的细胞悬浮液中分离出来后，可观察到相似的无法预期的结果。
实施例八：检测非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的基因组DNA
实施例8.1使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)检测编码CD16受体的DNA序列。
本实施例中使用微滴式数字核酸侦测系统(ddPCR)来检测本发明经培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(oNK)或转基因CD16的NK-92细胞系(yNK)中，编码CD16受体的DNA序列。
本实施例使用揭露于实施例2.1中的培养方法培养M天后取得的细胞悬浮液(称为经M天培养的oNK悬浮液)和转基因CD16的NK-92细胞系(购自ATCC，具有保藏编号ATCC PTA-6967；称为yNK)。用Blood&Cell Culture DNA Mini Kit试剂盒(购自Qiagen)分离yNK和经M天培养的oNK悬浮液中的细胞的基因组DNA(Genomic DNA)。
yNK样品或oNK样品：将从yNK或经M天培养的oNK悬浮液中分离出的50ng基因组DNA与10μL的ddPCR Supermix for Probes(2倍浓度溶液(2X))(商品货号：1863026；购自Bio-Rad)、1μLBstXI限制酶(商品名BstXI；商品货号R0013S；购自BioLabs)、及1μL的CD16 F176F水解探针和CD16 F176V水解探针混合物(试验ID：C_C_25815666_10；购自ThermoFisher；内容序列[VIC/FAM]：
TCTGAAGACACATTTTTACTCCCAA[C/A]AAGCCCCCTGCAGAAGTAGGAGCCG(SEQ ID NO:41)；
https://www.thermofisher.com/order/genome-database/details/ genotyping/C_25815666_10？CID＝&ICID＝&subtype＝)混合，使总体积达20μL。
无模板的对照样品：将水、10μL的ddPCR Supermix for Probes(2倍浓度溶液(2X))、1μLBstXI限制酶、及1μL的CD16 F176F水解探针和CD16 F176V水解探针混合物混合，使总体积达20μL。
用QX100/QX200微滴式数字PCR(ddPCR)系统(购自Bio-Rad)进行ddPCR实验。首先，将样品放入一QX100或QX200微滴产生器(QX100/QX200微滴式数字PCR系统中的一台机器)中，将每个样品分隔成(partition)15000～20000颗微滴(纳升大小的微滴，nanoliter-sized droplet)。
第二，将96孔板(商品名：DG8 cartidge；购自Bio-Rad)中的孔分成无模板对照孔、yNK孔、及oNK孔，这些孔分别用于测试无模板对照组(NTC组)、yNK组、及oNK组。将纳米化的无模板对照样品、yNK样品、及oNK样品各自转移到无模板对照孔、yNK孔、及oNK孔中。
第三，PCR扩增的方法中，热循环的条件为95℃作用10分钟、45个循环的95℃作用15秒、及60℃作用1分钟，接着98℃作用10分钟，然后保持在4℃。每个步骤中的升降温速率(ramp rate for each step)设定为2℃/s。
CD16 F176F水解探针(CD16 F176F hydrolysis probe)是一标记有FAM受体荧光团(FAM receptor fluorophore)的探针，而CD16 F176V水解探针(CD16 F176V hydrolysisprobe)是一标记有VIC受体荧光团的探针。PCR扩增方法中的主要步骤为变性(denaturation)、退火(annealing)、及延伸(extension)。在退火时，水解探针(例如CD16F176F水解探针或CD16 F176V水解探针)与目标序列结合；然后在延伸时，标记在探针5’端的受体被切除然后获释的受体发射荧光。CD16 F176F水解探针的序列为SEQ ID NO:11，因此预期可以检测位于一号染色体q臂第1q23.3位点的编码CD16受体的DNA序列；CD16 F176V水解探针的序列为SEQ ID NO:12，预期能检测yNK中的合成的DNA序列。
请注意，oNK中位于一号染色体q臂第1q23.3位点的编码CD16受体的DNA序列会被转录成CD16 F176F信息RNA(CD16 F176FmRNA)，然后翻译成CD16 F176F蛋白(CD16 F176Fprotein)，其中oNK内位于一号染色体q臂第1q23.3位点的编码CD16受体的DNA序列包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:19；CD16 F176F信息RNA的序列包含SEQ ID NO:13；CD16 F176F蛋白的序列包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20。yNK中编码CD16受体的合成的DNA序列会被转录成CD16 F176V信息RNA(CD16 F176V mRNA)，然后翻译成CD16F176V蛋白(CD16 F176V protein)，CD16 F176V信息RNA的序列为SEQ IDNO:15；CD16 F176V蛋白的序列为SEQ ID NO:16。
第四，微滴读取的过程(droplet reading process)中，用一QX100/QX200微滴读取仪(QX100/QX200微滴数字PCR分析系统中的一台机器)读取微滴，其中每个微滴被各自隔开以读取荧光，因此每个微滴都被一双色检测系统个别地(individually)分析(设定为检测FAM和VIC)。对比于阴性微滴(negative droplets)，具有至少一个目标DNA分子拷贝(onecopy of the target DNA molecule)(例如CD16 F176F水解探针检测的DNA分子或CD16F176V水解探针检测的分子)的阳性微滴(positive droplet)展现增强的荧光量。
请参照图8。图8为比较非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和转基因CD16的NK-92细胞系，其基因型(genotype)柱状图。
NTC组中，在14568个总收集微滴(事件)中，只有一个含有能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子的阳性微滴和四个含有能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子的阳性微滴。yNK组中，在14230个总收集微滴(事件)中，有6737个含有能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子的阳性微滴和8152个含有能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子的阳性微滴。oNK组中，在14230个总收集微滴(事件)中，有7637个含有能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子的阳性微滴和5333个含有能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子的阳性微滴。
因此，此结果显示使用微滴数字PCR分析系统分析yNK细胞的基因组DNA时，能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子和能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子的比例为0.83(6737÷8152＝0.83)，而用微滴数字PCR分析系统分析oNK细胞的基因组DNA时，能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子和能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子的比例为1.43(7637÷5333＝1.43)。
亦即，透过使用微滴数字PCR分析系统分析本发明的人类CD16阳性自然杀手细胞系(oNK)的基因组DNA时，能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子和能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子的比例等于或大于一(能被CD16 F176F水解探针检测到的DNA分子数÷能被CD16 F176V水解探针检测到的DNA分子数≧1)。
此外，基于此结果，申请人相信将人类CD16阳性自然杀手细胞系从经M天培养的oNK悬浮物(经培养的oNK)中分离出来后，可观察到相似的结果。
根据申请人的经验，具有序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的另一水解探针可以检测在其他转基因CD16的NK细胞(other CD16-transgenic NK cells)中的编码CD16受体的DNA序列。
实施例8.2利用荧光原位杂交实验(FISH)检测编码CD16受体的DNA序列。
本实施例中，使用双色(two-color)荧光原位杂交实验(Fluorescence in situhybridizaton，FISH)来检测人类自然杀手细胞中，转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16a受体的DNA序列。
这里将用本发明经培养的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(oNK)作为一例来展示没有转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16受体的DNA序列的人类细胞的结果，而用转基因CD16的NK-92细胞系(yNK)为一例来展示有转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16受体的DNA序列的人类细胞的结果。
详言之，本实施例使用从揭露于实施例2.1的培养方法培养N天后取得的细胞悬浮液中分离出的CD16阳性NK细胞(oNK细胞)(称为经N天培养的oNK悬浮液)、以及转基因CD16的NK-92细胞系(购自ATCC，具有保藏编号ATCC PTA-6967；称为yNK)。
Kallioniemi在1996年公开了双色荧光原位杂交实验(FISH)方法的细节，兹呈现一简短摘录如下。
第一，依DNA流式细胞技术(DNA flow cytometry)的使用指南，从1×107个yNK细胞或从经N天培养的oNK悬浮液中分离出的oNK细胞(CD16阳性NK细胞)中制备细胞核(nuclei)(Kallioniemi et al.,1996；Vindelov et al.,1983)。详言之，将细胞团块(cellpellet)培养(incubated)于一低张的界面活性剂溶液(hypotonic detergent solution)中并稍微用胰蛋白酶分解。
第二，将细胞核(nuclei)滴在显微镜玻片(microscope slides)上，风干并固定于甲醇乙酸液(methanol acetic acid)中。
第三，在杂交反应(hybridization)前，用蛋白酶K(proteinase K)或其他蛋白水解酶处理目标细胞以提升探针的穿透力(probe penetration)。
第四，通常透过将玻片浸没在一变性溶液(70％甲酰胺(formamide)，两倍浓度的SSC缓冲液)中，于70℃条件下作用2～4分钟，然后用乙醇固定(fixation)和脱水(dehydration)，来达成目标细胞的变性(denaturation)。变性反应的时间和温度需要根据目标细胞的特性做优化。
第五，在杂交反应前，将20～60ng的第一荧光染剂标记的FCGR3A FISH探针(一可以检测所有编码CD16a受体的人类DNA序列的实验探针；购自Empire Genomics)、20～60ng的第二荧光染剂标记的一号染色体对照探针(一参考探针；购自Empire Genomics)、以及遮蔽DNA(blocking DNA；没有标记的Cot-1或胎盘DNA)加入一以甲酰胺为基底的杂交反应缓冲液(formamide-based hybridization buffer)。当探针含有会与基因组上多个位置杂交(hybridize)的重复序列(repetitive sequences)时，必须使用遮蔽DNA。将杂交反应混合物加热达70℃，反应5分钟使探针片段(probe fragments)变性，然后放置到目标玻片(target slide)上；盖上一盖玻片，封上橡胶胶合剂(rubber cement)。杂交反应是在37℃条件下的一潮湿反应槽(moist chamber)中执行过夜(overnight)。
第六，将未结合的探针洗掉。
第七，用一DNA染料复染(counterstained)目标细胞核(target nuclei)，该染料通常为碘化丙啶(propidium iodide)或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
使用一一般的高分辨率落射荧光显微镜(high-quality epifluorescencemicroscope)来评估杂交反应。几乎任何主要的制造商(Zeiss,Leitz,Olympus,and Nikon)近期的显微镜型号都适合用来作基因特异性的FISH分析；60X Plan Apos或其他经过仔细色差校正过的物镜较佳。评估至少100个从整个玻片上任意挑选的细胞核的实验和参考探针的信号数。只计算形态完整且没有重叠的细胞核。因为细胞核是三维立体的，所以必须在细胞核的深度区间上下移动焦距以取得正确的信号计数。
一般可用几种格式来报告基因特异性FISH实验的结果，例如：(1)每个细胞的实验探针信号数；(2)每个细胞的测试探针信号数除以参考探针的信号数；或(3)测试探针的信号数比参考探针的拷贝数(copy number)高或低的细胞的百分比。
请参照图9A-9E。图9A-9E说明应用一标记一颜色的CD16a受体基因特异性测试探针和一标记另一颜色的参考探针的双色FISH分析来检测测人类自然杀手细胞中，转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16a受体的DNA序列的原理。
根据申请人的经验，每个oNK细胞的FCGR3A FISH探针(一种可以检测所有编码CD16a的人类DNA序列的实验探针)信号值为2(每个细胞的实际基因拷贝数；the actualgene copy number per cell)，oNK的双色FISH形态看起来将会像图9A(代表一不具有转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16a受体的DNA序列的人类细胞的结果的常态图样(normal pattern))。每个yNK细胞的一号染色体对照探针(一参考探针；购自EmpireGenomics)的信号数可能大于2，yNK的双色FISH形态看起来将会像图9B～9E(代表一具有转基因的、合成的、基因改造的、或特意递送的编码CD16a受体的DNA序列的人类细胞的结果的CD16转基因图样(CD16-transgenic pattern))。
实施例九：冷冻解冻对非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系存活率的影响。
利用实施例1.1的方法分选出纯化的CD16阳性细胞群(表达CD16受体的细胞比例高达99％)，然后利用实施例2.1的培养方法培养该纯化的CD16阳性细胞群21天(纯化的CD16阳性细胞群被继代培养了八次)。将细胞液样品与一等体积的台盼蓝混合，进行细胞计数后得知细胞存活率为95％。取一足够量的细胞液，使其含有2×107个活细胞，然后实施以下的冷冻和解冻方法。
冷冻方法：将含有2×107个活细胞的细胞液离心，去除上清液，然后用1mL的冷冻缓冲液(
Figure GDA0003261113020000981
CS10 Freeze Media，含有10vol％的DMSO，BioLife Solutions，美国)重新悬浮细胞。将该细胞悬浮液放入一冷冻管后，将该冷冻管置入CoolCell细胞冷冻盒(Corning，USA)，然后将该CoolCell细胞冷冻盒存放入一-80℃冰箱过夜(每分钟温度下降1℃)。将该冷冻管移出并存放在液氮中17天。
解冻方法：将冷冻管放入一37℃水浴以快速地解冻细胞悬浮液，将1mL的细胞悬浮液与9mL实施例2.1中所述的细胞培养基混合。在将一细胞混合液样品与一等体积的台盼蓝混合后，观察细胞数与细胞存活率。
实验结果显示，解冻后有1.95×107个细胞存活，回收率(Recovery Rate)高达97.5％[(1.95×107)÷(2×107)×100％＝97.5％]，细胞存活率为96％，与冷冻前的存活率(95％)没有显著的差异。
实施例十：非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的细胞毒杀活性
本实施例的实验方法和实施例3.5的方法大致相同，除了(1)本实施例中所使用的作用细胞为Ctrl oNK细胞、Ctrl yNK细胞、ACE-oNK细胞或ACE-yNK细胞；以及(2)作用细胞数与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为2：1(ET2)或5：1(ET5)。
Ctrl oNK细胞：Ctrl oNK细胞为将纯化的CD16阳性细胞群(其中非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的比例高达99％)用实施例2.1的培养方法培养26天后所得的经培养的细胞群。
Ctrl yNK细胞：Ctrl yNK细胞为转基因CD16的NK-92细胞系(购自ATCC；保藏编号为ATCC PTA-6967)；
ACE-oNK细胞：ACE-oNK细胞为使用互补的一细胞接头和一贺癌平(Trastuzumab)接头，使贺癌平(Trastuzumab)与Ctrl oNK细胞结合后，所取得的细胞。
ACE-yNK细胞：ACE-oNK细胞为使用互补的一细胞接头和一贺癌平(Trastuzumab)接头，使贺癌平(Trastuzumab)(一种HER2蛋白抗体，商品名为Herceptin，购自Roche，瑞士)与Ctrl yNK细胞结合后，所取得的细胞。
使贺癌平(Trastuzumab)与自然杀手细胞(例如Ctrl oNK细胞或Ctrl yNK细胞)结合的方法如下：
(A)制备细胞接头(Cell linker)并使细胞接头与自然杀手细胞结合，以制备一单链DNA共轭的NK细胞(NK-ssDNA conjugate)的步骤；
(B)制备贺癌平接头(Trastuzumablinker)并使贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)结合，以制备单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab-ssDNA conjugate)的步骤；
(C)混合单链DNA共轭的NK细胞和单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)，使单链DNA共轭的NK细胞和单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)透过细胞接头与其位于贺癌平(Trastuzumab)接头上的互补序列相结合，以制备贺癌平共轭的自然杀手细胞(Trastuzumab-conjugated natural killer cells)(例如：ACE-oNK细胞或ACE-yNK细胞)。
其中步骤(A)的制备细胞接头并使细胞接头与自然杀手细胞结合，包含下列步骤(a1)～(a4)：
步骤(a1)取得一第一单链DNA(first single strand DNA)，其中该第一单链DNA的序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7。
步骤(a2)第一单链DNA的5’端被改造成5’端为硫醇基的第一单链DNA(5’endthiol-modified first single strand DNA)，以获得细胞接头贮备物(cell linkerstock)。该细胞接头贮备物也可从Integrated DNA Technologies商业上取得。对本领域技术人员而言，实际的改造方法是已知或显而易见的(Zimmermann,J,2010)。
步骤(a3)将10～500μL的细胞接头贮备物和0.1～10μL的N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺(NHS-Maleimide)(可从Fisher Scientific商业上取得)混合并反应1～60分钟。
步骤(a4)将从步骤(a3)取得的混合物与1×106～1×108个自然杀手细胞混合并反应1～60分钟，以取得单链DNA共轭的NK细胞。
步骤(B)的制备贺癌平(Trastuzumab)接头并使贺癌平(Trastuzumab)接头与贺癌平(Trastuzumab)结合，包含下列步骤(b1)～(b4)：
步骤(b1)取得一第二单链DNA(second single strand DNA)，其中该第二单链DNA的序列为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10，且该第二单链DNA的序列是第一单链DNA的互补链(complementary strand)。
步骤(b2)第二单链DNA的5’端被改造成5’端为硫醇基的第二单链DNA(5’endthiol-modified second single strand DNA)，以获得贺癌平接头贮备物(Trastuzumablinker stock)。该贺癌平(Trastuzumab)接头贮备物也可从Integrated DNATechnologies商业上取得。对本领域技术人员而言，实际的修饰方法是已知或显而易见的(Zimmermann,J,2010)。
步骤(b3)将10～500μL的贺癌平(Trastuzumab)接头贮备物和0.1～10μL的N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺(NHS-Maleimide)(可从Fisher Scientific商业上取得)混合并反应1～60分钟。
步骤(b4)将从步骤(b3)取得的混合物与10～100μL的贺癌平贮备物(Trastuzumabstock)(可从Roche商业上取得)混合并反应10分钟到3小时，以取得单链DNA共轭的贺癌平(Trastuzumab)。
请参阅图10。图10为表达非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。图10显示不论作用细胞数与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为2：1(ET2)或5：1(ET5)，未经贺癌平(Trastuzumab)活化的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(Ctrl oNK细胞)毒杀60％～65％的癌细胞，而经贺癌平(Trastuzumab)活化的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(ACE-oNK细胞)毒杀95％～100％的癌细胞。因此，本发明培养所取得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系确实有毒杀癌细胞的细胞毒杀功能，且当本发明培养所取得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系经活化诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应后，细胞毒杀作用显著地提高了至少30％(95％-65％＝30％；p<0.05)。
请参阅图11A和图11B。图11A为比较非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和转基因CD16的NK-92细胞系，在不同作用细胞(E)和目标细胞(T)比例时，杀死癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图；图11B为比较非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系和转基因CD16的NK-92细胞系，在不同作用细胞(E)和目标细胞(T)比例时，透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死癌细胞的细胞毒杀功能之柱状图。
图11A的结果显示，当作用细胞数与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为5：1(ET5)且未经贺癌平(Trastuzumab)活化时，非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(Ctrl oNK细胞)毒杀70％的癌细胞，而转基因CD16的NK-92细胞系(Ctrl yNK)毒杀72％的癌细胞，两组间并没有显著差别(p>0.05)。因此，当作用细胞数与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为5：1(ET5)时，本发明培养取得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系的细胞毒杀功能没有比转基因CD16的NK-92细胞系差。换句话说，与转基因CD16的NK-92细胞系相比，利用本发明的方法所取得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系不只安全，同时具有相同的细胞毒杀效果。
图11B的结果显示，不论作用细胞数与SK-OV-3细胞(目标细胞)数的比例为2：1(ET2)或5：1(ET5)，经贺癌平(Trastuzumab)活化的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系(ACE-oNK细胞)毒杀95％的癌细胞，而经贺癌平(Trastuzumab)活化的转基因CD16的NK-92细胞系(ACE-yNK)毒杀95％的癌细胞，两组间没有显著差异(p>0.05)。因此，利用本发明的培养方法所取得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用的细胞毒杀功能没有比转基因CD16的NK-92细胞系差。换句话说，与转基因CD16的NK-92细胞系相比，利用本发明的方法所取得的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系不只安全，且在透过抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死癌细胞方面上有相同的细胞毒杀效果。
实施例十一：用不同浓度的人类血小板裂解物培养非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
本实施例的实验方法和实施例2.1的方法大致相同，除了(1)在步骤S22’中，本实施例系培养「利用公开在实施例2.1的培养方法培养9天后取得的细胞悬浮液(称为9天培养的oNK悬浮液)中的所有细胞」，且步骤S22’中的第一容器内的细胞数为5×106；以及(2)细胞培养基包含500IU/mL的白介素-2(IL-2)和①2.5％的人类血小板裂解物，②5.0％的人类血小板裂解物，③10.0％的人类血小板裂解物，或④5.0％的人类血清(不包含人类血小板裂解物)。
本实施例中，检测经培养的细胞的细胞数、细胞存活率、和CD16表面标志的实验方法都与实施例2.2和3.4的方法相同。
请参阅图12A～12C。图12A～12C为人类血小板裂解物对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同培养天数后的总细胞数、细胞存活率或维持CD16表达量各自的影响之折线图。
图12A显示，经培养14天后，培养在不含人类血小板裂解物(但包含5.0％的人类血清)、包含2.5％人类血小板裂解物、包含5.0％人类血小板裂解物、和包含10.0％人类血小板裂解物的细胞培养基中的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞数分别为4.7×108、6.49×108、1.01×109、和1.74×109。因此，此结果显示：当跟不包含人类血小板裂解物(但包含5.0％的人类血清)的细胞培养基相比，人类血小板裂解物可以造成3.7倍的增加量(17.4÷4.7＝3.7)。亦即，人类血小板裂解物造成了一无法预期的结果，人类血小板裂解物使非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞大量地扩增。另外，这些结果暗示对于人类CD16阳性自然杀手细胞的扩增而言，配方3(包含10.0％人类血小板裂解物)比其余的配方好。
图12B显示，经培养7天后，培养在不含人类血小板裂解物(但包含5.0％的人类血清)、包含2.5％人类血小板裂解物、包含5.0％人类血小板裂解物、和包含10.0％人类血小板裂解物的细胞培养基中的非转基因的人类CD16阳性自然杀手的细胞的存活率分别维持在92％、88％、92％、和92％。经培养14天后，培养在不含人类血小板裂解物(但包含5.0％的人类血清)、包含2.5％人类血小板裂解物、包含5.0％人类血小板裂解物、和包含10.0％人类血小板裂解物的细胞培养基中的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞的细胞存活率分别维持在94％、90％、92％、和93％。因此，此结果显示：未经人类血小板裂解物作用的人类CD16阳性自然杀手细胞和以2.5％～10.0％人类血小板裂解物作用的人类CD16阳性自然杀手细胞有相似的细胞存活率。
图12C显示，在不包含人类血小板裂解物(但包含5.0％的人类血清)、包含2.5％人类血小板裂解物、包含5.0％人类血小板裂解物、和包含10.0％人类血小板裂解物的细胞培养基中培养7天后，CD16阳性细胞的百分比分别维持在83.55％、84.15％、82.81％、和83.95％。在不包含人类血小板裂解物(但包含5.0％的人类血清)、包含2.5％人类血小板裂解物、包含5.0％人类血小板裂解物、和包含10.0％人类血小板裂解物的细胞培养基中培养14天后，CD16阳性细胞的百分比分别维持在80.72％、80.74％、78.07％、和80.76％。因此，此结果显示：2.5％～10.0％的人类血小板裂解物跟没有人类血小板裂解物(包含5.0％的人类血清)维持相似的CD16阳性细胞群。
此外，根据此结果，申请人相信将人类CD16阳性自然杀手细胞系从经9天培养的oNK悬浮液(经培养的oNK)中分离出来后，可观察到相似的结果。
实施例十二：用不同浓度的白介素-2(IL-2)培养非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
本实施例的实验方法和实施例2.1的方法大致相同，除了(1)在步骤S22’中，本实施例系培养「利用公开在实施例2.1中的培养方法培养9天后所取得的细胞悬浮液(称为9天培养的oNK悬浮液)中的所有细胞」，且在步骤S22’中第一容器内的细胞数为5×106；以及(2)细胞培养基包含5.0％的人类血小板裂解物和①100IU/mL的白介素-2(IL-2)、②200IU/mL的白介素-2(IL-2)、③500IU/mL的白介素-2(IL-2)、④750IU/mL的白介素-2(IL-2)、或⑤1000IU/mL的白介素-2(IL-2)。
请注意扩增人类CD16阳性自然杀手细胞同时需要白介素-2(IL-2)和人类血小板裂解物。本实施例中，1.8×107IU/mL的白介素(IL-2)等同于1.1mg/mL的白介素(IL-2)。因此，
100IU/mL的白介素(IL-2)等同于0.0612μg/mL的白介素(IL-2)；
200IU/mL的白介素(IL-2)等同于0.1224μg/mL的白介素(IL-2)；
500IU/mL的白介素(IL-2)等同于0.306μg/mL的白介素(IL-2)；
750IU/mL的白介素(IL-2)等同于0.459μg/mL的白介素(IL-2)；以及
1000IU/mL的白介素(IL-2)等同于0.612μg/mL的白介素(IL-2)。
本实施例中，检测经培养的细胞的细胞数、细胞存活率、和CD16表面标志的实验方法都与实施例2.2和3.4的方法相同。
请参照图13A～13F。图13A～13F为白介素-2(IL-2)对人类CD16阳性自然杀手细胞系经过不同培养天数后的总细胞数、细胞存活率、或维持CD16表达量各自的影响之折线图。
图13A～13B显示白介素-2(IL-2)的量不影响非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞的扩增。请注意在第7天时细胞系被重新接种然后继续扩增到第11天；该扩增流程每11天重复一次。
图13C～13D显示白介素-2(IL-2)的量不影响非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞的细胞存活率。
图13E～13F显示在包含100～200IU/mL白介素-2(IL-2)的细胞培养基中培养40天后，CD16阳性细胞的百分比下降至小于20％。反之，在包含500～1000IU/mL白介素-2(IL-2)的细胞培养基中培养40天后，CD16阳性细胞的百分比增加到80％。亦即，500～1000IU/mL的白介素-2(IL-2)造成一无法预期的结果，且500～1000IU/mL的白介素-2(IL-2)使CD16阳性细胞群大量地维持。
此外，根据此结果，申请人相信将人类CD16阳性自然杀手细胞系从经9天培养的oNK悬浮液(经培养的oNK)中分离出来后，可观察到相似的结果。
实施例十三：在不同的容器中培养非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞系。
本实施例的实验方法和实施例2.1的方法大致相同，除了(1)在步骤S22’中，本实施例系培养「利用公开在实施例2.1中的培养方法培养9天后所取得的细胞悬浮液(称为9天培养的oNK悬浮液)中的所有细胞」，且在步骤S22’中第一容器内的细胞数为5×106；(2)细胞培养基包含500IU/mL的白介素-2(IL-2)和5.0％的人类血小板裂解物；以及(3)本实施例中使用的容器为①透气容器例如高速细胞培养扩增系统(G-Rex)六孔培养板或②不透气容器例如T25细胞培养瓶。
本实施例中，检测经培养的细胞的细胞数、细胞存活率、和CD16表面标志的实验方法都与实施例2.2和3.4的方法相同。
请参照图14A～14C。图14A～14C为透气容器对人类CD16阳性自然杀手细胞经过不同培养天数后对，总细胞数、细胞存活率、或维持CD16表达量各自的影响之折线图。
图14A显示在培养14天后，培养在不透气容器和透气容器中的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞数分别为3.1×108和1.01×109。因此，此结果显示：当与培养在不透气的容器中的细胞相比，透气容器可以造成3.26倍的增加量(10.1÷3.1＝3.26)。亦即，透气容器造成了一无法预期的结果，透气容器使非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞大量地扩增。
图14B显示经培养7天后，培养在不透气容器和透气容器中的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞的细胞存活率分别维持在87％和92％。经培养14天后，培养在不透气容器和透气容器中的非转基因的人类CD16阳性自然杀手细胞的细胞存活率分别维持在88％和92％。因此，此结果显示：对比于培养在不透气容器中的人类CD16阳性自然杀手细胞，培养在透气容器中的人类CD16阳性自然杀手细胞的细胞存活率较佳。
图14C显示在不透气容器和透气容器中培养7天后，CD16阳性细胞的百分比分别维持在82.63％和82.81％。在不透气容器和透气容器中培养14天后，CD16阳性细胞的百分比分别维持在83.79％和88.07％。因此，此结果显示：透气容器跟不透气容器维持相似量的CD16阳性细胞群。
此外，根据此结果，申请人相信将人类CD16阳性自然杀手细胞系从经9天培养的oNK悬浮液(经培养的oNK)中分离出来后，可观察到相似的结果。
实施例十四：制备外源性靶向单元复合的oNK细胞(exogenous targeting unitcomplexed-oNK cells)
本实施例中，申请人制备了一种至少复合(complexed)了一外源性靶向单元(exogenous targeting unit)的外源性靶向单元复合的oNK细胞。所述外源性靶向单元包含与一目标细胞上的一生物标记呈现特异性结合的一靶向部分(targeting moiety)，该靶向部分能与一生物标记(biological marker)结合，且该生物标记选自癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ-谷氨酸转肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体的受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)(Lewis(a))抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶(enolase)、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、多重抗药性相关抗原、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子(NCAM)、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖(sialylTn)、酪氨酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成长因子受体(EGF-R)、血管内皮生长因子(VEGF)、或黑色素瘤相关抗原(MAGE)。该靶向部分不是一氨基酸，也不是由该外源性靶向单元复合的oNK细胞产生。
使一靶向部分(例如HER2蛋白的抗体贺癌平(Trastuzumab))与oNK细胞结合(bind)的方法如下：
(A)制备细胞接头(cell linker)并使细胞接头与自然杀手细胞结合，以制备一单链DNA共轭的NK细胞(NK-ssDNA conjugate)的步骤；
(B)制备靶向部分接头(targeting moiety linker)(例如贺癌平(Trastuzumab)接头)并使靶向部分接头与靶向部分结合，以制备单链DNA共轭的靶向部分(moiety-ssDNAconjugate)的步骤；
(C)混合单链DNA共轭的NK细胞和单链DNA共轭的靶向部分，使单链DNA共轭的NK细胞和单链DNA共轭的靶向部分透过细胞接头与其位于靶向部分接头上的互补序列相结合，以制备外源性靶向单元共轭的自然杀手细胞(exogenous targeting unit complexed-conjugated natural killer cells)(例如ACE-oNK细胞或ACE-yNK细胞)。
其中步骤(A)的制备细胞接头并使细胞接头与自然杀手细胞结合，包含以下步骤(a1)～(a4)：
步骤(a1)取得一第一单链DNA(first single strand DNA)，其中该第一单链DNA的序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7。
步骤(a2)第一单链DNA的5’端被改造成5’端为硫醇基的第一单链DNA(5’endthiol-modified first single strand DNA)，以获得细胞接头贮备物(cell linkerstock)，该细胞接头贮备物也可从Integrated DNA Technologies商业上取得。对本领域技术人员而言，实际的改造方法是已知或显而易见的(Zimmermann,J,2010)。
步骤(a3)将10～500μL的细胞接头贮备物和0.1～10μL的N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺(NHS-Maleimide)(可从Fisher Scientific商业上取得)混合并反应1～60分钟。
步骤(a4)将从步骤(a3)取得的混合物与1×106～1×108个自然杀手细胞混合并反应1～60分钟，以取得单链DNA共轭的NK细胞。
步骤(B)的制备靶向部分接头并使靶向部分接头与靶向部分结合，包含以下步骤(b1)～(b4)：
步骤(b1)取得一第二单链DNA(second single strand DNA)，其中该第二单链DNA的序列为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10，且该第二单链DNA的序列是第一单链DNA的互补链(complementary strand)。
步骤(b2)第二单链DNA的5’端被改造成5’端为硫醇基的第二单链DNA(5’endthiol-modified second single strand DNA)，以获得靶向部分接头贮备物(targetingmoiety linker stock)。该靶向部分接头贮备物也可从Integrated DNATechnologies商业上取得。对本领域技术人员而言，实际的改造方法是已知或显而易见的(Zimmermann,J,2010)。
步骤(b3)将10～500μL的靶向部分接头贮备物和0.1～10μL的N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺(NHS-Maleimide)(可从Fisher Scientific商业上取得)混合并反应1～60分钟。
步骤(b4)将从步骤(b3)取得的混合物与10～100μL的靶向部分贮备物(targetingmoiety stock)(可从Roche商业上取得)混合并反应10分钟到3小时，以取得单链DNA共轭的靶向部分。
该靶向部分可以为一肽、蛋白质、或核酸适体(aptamer)，其中所述蛋白质可为一种抗一癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(HER3)(ERBB3)、上皮成长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基质金属蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(间皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、CD3、巨噬细胞移行抑制因子(MIF)、叶酸受体α(Folate receptor alpha，FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、运铁蛋白受体(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(白介素-2受体(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受体(CSF1R))、白介素1B(IL1B)、CD105(内皮糖蛋白(Endoglin))、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、白介素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生长素2(angiopoietin 2)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素(integrin)、激活自然杀手细胞的受体(activating NK cellreceptors)、及其组合。
实施例十五：制备表达嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)的oNK细胞
本实施例公开了制备包含一合成的、基因改造的且/或特意递送的编码一嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor；CAR)的多核苷酸之oNK细胞的方法，该嵌合抗原受体包含一抗靶向抗原的靶向结合单链可变片段(scFv)(target-binding single-chainvariable fragment against target antigen)，其中所述嵌合抗原受体选自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8a、CD8、CD11a(整合素αL(ITGAL))、CD11b(整合素αM(ITGAM))、CD11c(整合素αX(ITGAX))、CD11d(整合素αD(ITGAD))、CD18(整合素β2(ITGB2))、CD19(B4)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD28、CD29(整合素β1(ITGB1))、CD30(肿瘤坏死因子受体超家族8(TNFRSF8))、CD40(肿瘤坏死因子受体超家族5(TNFRSF5))、CD48(信号淋巴细胞激活分子家族成员2(SLAMF2))、CD49a(整合素α1(ITGA1))、CD49d(整合素α4(ITGA4))、CD49f(整合素α6(ITGA6))、CD66a(癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAMl))、CD66b(癌胚抗原相关细胞黏附分子8(CEACAM8))、CD66c(癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6))、CD66d(癌胚抗原相关细胞黏附分子3(CEACAM3))、CD66e(癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5))、CD69(C型凝集素结构域家族2(CLEC2))、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关α链(B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain))、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关β链(B-cell antigen receptor complex-associated betachain))、CD84(信号淋巴细胞激活分子家族成员5(SLAMF5))、CD96(Tactile)、CD100(脑信号蛋白4D(SEMA4D))、CD103(整合素αE(ITGAE))、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(信号淋巴细胞激活分子家族成员1(SLAMF1))、CD158A(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1))、CD158B1(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2))、CD158B2(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3))、CD158C(杀手细胞免疫球蛋白样受体3DP1(KIR3DP1))、CD158D(杀手细胞免疫球蛋白样受体DL4(KIRDL4))、CD158F1(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL5A(KIR2DL5A))、CD158F2(杀手细胞免疫球蛋白样受体2DL5B(KIR2DL5B))、CD158K(杀手细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2))、CD160(BY55)、CD162(P选择素糖蛋白配体(SELPLG))、CD226(DNAX辅助分子1(DNAM1))、CD229(信号淋巴细胞激活分子家族成员3(SLAMF3))、CD244(信号淋巴细胞激活分子家族成员4(SLAMF4))、CD247(CD3-ξ)、CD258(LIGHT)、CD268(B细胞活化因子受体(BAFFR))、CD270(肿瘤坏死因子受体超家族14(TNFSF14))、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(计划性死亡-1(PD-1))、CD314(NKG2D)、CD319(信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7))、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(信号淋巴细胞激活分子家族成员6(SLAMF6))、CD353(信号淋巴细胞激活分子家族成员8(SLAMF8))、CD355(细胞毒性及调节T细胞分子(CRTAM))、CD357(肿瘤坏死因子受体超家族18(TNFRSF18))、可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、NKp80(杀手细胞凝集素样受体基因家族成员1(KLRF1))、白介素-2Rβ(IL-2R beta)、白介素-2Rγ(IL-2Rgamma)、白介素-7Rα(IL-7R alpha)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、T细胞活化衔接因子(LAT)、GADS(GrpL)、SLP-76(淋巴细胞胞浆蛋白2(LCP2))、PAG1/CBP、一CD83配体、Fcγ受体、MHC1类分子(MHC class 1molecule)、MHC2类分子(MHC class 2molecule)、一种肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素、活化自然杀手细胞受体(activating NK cell receptors)、一种类铎受体(Toll-like receptor)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、计划性死亡-配体1(PD-L1)、及其组合。
下面以CD19为例来解释制备包含一合成的、基因改造的、且/或特意递送的编码一嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸之oNK的方法，该嵌合抗原受体包含一抗CD19的靶向结合单链可变片段(scFv)。收集oNK细胞，用6μM的5Z-7-Oxozeaenol(TAK1抑制剂)处理30分钟。将5Z-7-Oxozeaenol处理过的细胞用Trasdux(转导促进剂)处理后，用慢病毒颗粒(lentivirus particle)感染细胞，病毒感染剂量为9(at m.o.i.of 9)，其中该慢病毒颗粒是带有CD19单链可变片段(scFv)嵌合抗原受体(CAR)的建构物的CD810A-1载体(CD810A-1vector)所制成的。用1000xg的转速将细胞离心70分钟后，在37℃条件下反应4小时。将细胞以200xg转速再次离心5分钟，移除上清液。将感染过的细胞用新鲜的生长培养基(freshgrowth media)重新悬浮后，在37℃条件下于高速细胞培养扩增系统(G-Rex)细胞板中培养。
将细胞以400xg转速离心5分钟，并用MACS缓冲液清洗以浓缩表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群。接着将细胞用Myc-Ab-APC抗体和碘化丙啶或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。用Dulbecco氏磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)清洗后，以细胞分选仪分选出APC阳性碘化丙啶或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)阴性(APC+DAPI-)的细胞，然后在新鲜的生长培养基和高速细胞培养扩增系统(G-Rex)中扩增细胞。
本发明的实施例显示，利用本发明的方法所取得的非转基因的CD16阳性人类自然杀手细胞系、本发明的外源性靶向单元复合自然杀手细胞、和本发明的嵌合抗原受体(CAR)表达oNK细胞都确实可以透过类似抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用杀死目标细胞(例如癌细胞)。因此，利用本发明的培养方法所取得的非转基因的CD16阳性人类自然杀手细胞系的应用范围包含但不仅限于癌症治疗、自体免疫疾病治疗、神经疾病治疗、消灭人类免疫不全病毒(HIV)、造血细胞相关疾病治疗、代谢症候群治疗、病原性疾病治疗、病毒感染治疗、和细菌感染治疗。
参考数据一
Eileen Scully and Galit Alter,2016.NK cells in HIV disease.Curr HIV/ AIDS Rep.13(2):85-94.
参考数据二
Jordan S.Orange,2013.Natural killer celldeficiency.J Allergy Clin Immunol.132(3):515-525.
参考数据三
Kallioniemi A,Visakorpi T,Karhu R,Pinkel D,and Kallioniemi OP,1996.Gene Copy number analysisby fluorescence in situ hybridizationandcomparative genomic hybridization.Methods.9(1):113-121.
参考数据四
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参考数据五
Pernick,N,2018.
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参考数据六
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参考数据七
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L.L.,Christensen,I.J.,and Nissen,N.I.,1983.A Detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNAanalysis.Cytometry.3(5),323–327.
参考数据八
Zimmermann,J,Nicolaus,T,Neuert,G.and Blank,K.2010.Thiol-based,site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-moleculeexperiments.Nat.Protoc.5(6):975-985.
以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明之申请专利范围，因此凡其它未脱离本发明所揭示之精神下所完成之各种更动或润饰等，均应包含于本案之申请专利范围内。
序列表
<110> 育世博生物科技股份有限公司
<120> 一种新型CD16阳性自然杀手细胞和CD16阳性自然杀手细胞的培养方法
<130> 5586/0104PWO2
<150> US 62/794,193
<151> 2019-01-18
<160> 40
<170>
<210> 1
<211> 2137
<212> DNA
<213> 现代人种(人类)
<400> 1
cttgtccact ccagtgtggc atcatgtggc agctgctcct cccaactgct ctgctacttc 60
tagtttcagc tggcatgcgg actgaagatc tcccaaaggc tgtggtgttc ctggagcctc 120
aatggtacag ggtgctcgag aaggacagtg tgactctgaa gtgccaggga gcctactccc 180
ctgaggacaa ttccacacag tggtttcaca atgagagcct catctcaagc caggcctcga 240
gctacttcat tgacgctgcc acagttgacg acagtggaga gtacaggtgc cagacaaacc 300
tctccaccct cagtgacccg gtgcagctag aagtccatat cggctggctg ttgctccagg 360
cccctcggtg ggtgttcaag gaggaagacc ctattcacct gaggtgtcac agctggaaga 420
acactgctct gcataaggtc acatatttac agaatggcaa aggcaggaag tattttcatc 480
ataattctga cttctacatt ccaaaagcca cactcaaaga cagcggctcc tacttctgca 540
gggggcttgt tgggagtaaa aatgtgtctt cagagactgt gaacatcacc atcactcaag 600
gtttgtcagt gtcaaccatc tcatcattct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct 660
tggtgatggt actccttttt gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca 720
ttcgaagctc aacaagagac tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag 780
acaaatgacc cccatcccat gggggtaata agagcagtag cagcagcatc tctgaacatt 840
tctctggatt tgcaacccca tcatcctcag gcctctctac aagcagcagg aaacatagaa 900
ctcagagcca gatcccttat ccaactctcg acttttcctt ggtctccagt ggaagggaaa 960
agcccatgat cttcaagcag ggaagcccca gtgagtagct gcattcctag aaattgaagt 1020
ttcagagcta cacaaacact ttttctgtcc caaccgttcc ctcacagcaa agcaacaata 1080
caggctaggg atggtaatcc tttaaacata caaaaattgc tcgtgttata aattacccag 1140
tttagagggg aaaaaaaaac aattattcct aaataaatgg ataagtagaa ttaatggttg 1200
aggcaggacc atacagagtg tgggaactgc tggggatcta gggaattcag tgggaccaat 1260
gaaagcatgg ctgagaaata gcaggtagtc caggatagtc taagggaggt gttcccatct 1320
gagcccagag ataagggtgt cttcctagaa cattagccgt agtggaatta acaggaaatc 1380
atgagggtga cgtagaattg agtcttccag gggactctat cagaactgga ccatctccaa 1440
gtatataacg atgagtcctc ttaatgctag gagtagaaaa tggtcctagg aaggggactg 1500
aggattgcgg tggggggtgg ggtggaaaag aaagtacaga acaaaccctg tgtcactgtc 1560
ccaagttgct aagtgaacag aactatctca gcatcagaat gagaaagcct gagaagaaag 1620
aaccaaccac aagcacacag gaaggaaagc gcaggaggtg aaaatgcttt cttggccagg 1680
gtagtaagaa ttagaggtta atgcagggac tgtaaaacca ccttttctgc ttcaatatct 1740
aattcctgtg tagctttgtt cattgcattt attaaacaaa tgttgtataa ccaatactaa 1800
atgtactact gagcttcgct gagttaagtt atgaaacttt caaatccttc atcatgtcag 1860
ttccaatgag gtggggatgg agaagacaat tgttgcttat gaaagaaagc tttagctgtc 1920
tctgttttgt aagctttaag cgcaacattt cttggttcca ataaagcatt ttacaagatc 1980
ttgcatgcta ctcttagata gaagatggga aaaccatggt aataaaatat gaatgataaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2137
<210> 2
<211> 820
<212> DNA
<213> 现代人种(人类)
<400> 2
cactccagtg tggcatcatg tggcagctgc tcctcccaac tgctctgcta cttctagttt 60
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acagcgtgct tgagaaggac agtgtgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg 180
acaattccac acagtggttt cacaatgaga gcctcatctc aagccaggcc tcgagctact 240
tcattgacgc tgccacagtc aacgacagtg gagagtacag gtgccagaca aacctctcca 300
ccctcagtga cccggtgcag ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc 360
ggtgggtgtt caaggaggaa gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg 420
ctctgcataa ggtcacatat ttacagaatg gcaaagacag gaagtatttt catcataatt 480
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ttgttgggag taaaaatgtg tcttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgg 600
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gacccccatc ccatgggagt aataagagca gtggcagcag 820
<210> 3
<211> 254
<212> PRT
<213> 现代人种(人类)
<400> 3
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 4
<211> 233
<212> PRT
<213> 现代人种(人类)
<400> 4
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Ser Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asn Glu Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Arg
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225 230
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
cacacacaca cacacacaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
tcatacgact cactctaggg 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
agttaccatg acgtcaattt cag 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
ccctagagtg agtcgtatga 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
ctgaaattga cgtcatggta act 23
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
tctgaagaca catttttact cccaaaaagc cccctgcaga agtaggagcc g 51
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
tctgaagaca catttttact cccaacaagc cccctgcaga agtaggagcc g 51
<210> 13
<211> 765
<212> RNA
<213> 现代人种(人类)
<400>13
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
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tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
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aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 14
<211> 254
<212> PRT
<213> 现代人种(人类)
<400> 14
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
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Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
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<211> 765
<212> RNA
<213> 现代人种(人类)
<400> 15
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gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cotttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 16
<211> 254
<212> PRT
<213> 现代人种(人类)
<400> 16
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
tccttcacaa tttctgcagc cactctgtgg ccaccgtcac cttattcctg a 51
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
tccttcacaa tttctgcagc cactccgtgg ccaccgtcac cttattcctg a 51
<210> 19
<211> 765
<212> DNA
<213> 现代人种(人类)
<400> 19
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggctttttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cotttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 20
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<212> PRT
<213> 现代人种(人类)
<400> 20
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
1 5 10 15
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
20 25 30
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
35 40 45
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
50 55 60
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
65 70 75 80
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
tttttttttt tttttttttt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
actgactgac tgactgactg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
cagtcagtca gtcagtcagt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gtaacgatcc agctgtcact 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
agtgacagct ggatcgttac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
actgatggta atctgcacct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
aggtgcagat taccatcagt 20
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
actgactgac tgactgactg actgactgac tgactgactg 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
cagtcagtca gtcagtcagt cagtcagtca gtcagtcagt 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
gtaacgatcc agctgtcact gtaacgatcc agctgtcact 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
agtgacagct ggatcgttac agtgacagct ggatcgttac 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
tcatacgact cactctaggg tcatacgact cactctaggg 40
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<212> DNA
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<223> 合成的
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ccctagagtg agtcgtatga ccctagagtg agtcgtatga 40
<210> 39
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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actgatggta atctgcacct actgatggta atctgcacct 40
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
aggtgcagat taccatcagt aggtgcagat taccatcagt 40
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种源自于一带有癌症的个体的人类自然杀手细胞，具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16
F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V
探针的序列为SEQ ID NO:12。
2.如权利要求第1项所述之细胞，其中所述CD16受体是一CD16a受体或一CD16b受体。
3.如权利要求第1项所述之细胞，其中一被表达的编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
4.如权利要求第1项所述之细胞，该细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
5.如权利要求第1项所述之细胞，在经过γ射线照射过后，该细胞对一同种异体的个体不具致癌性。
6.如权利要求第1项所述之细胞，其中一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:19核苷酸序列。
7.如权利要求第1项所述之细胞，其中CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
8.如权利要求第1项所述之细胞，该细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因或一经突变且高度表达的致癌基因。
9.如权利要求第1项所述之细胞，其中该细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应，且该细胞为一雄性细胞。
10.如权利要求第1项所述之细胞，其中该细胞更包含至少一复合于该细胞上的外源性靶向单元，其中外源性靶向单元包含一靶向部分，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记展现特异性结合；
(b)它不是一种核酸；以及
(c)它不是由该细胞产生。
11.如权利要求第10项所述之细胞，其中外源性靶向单元是透过共轭于该靶向部分的一第一接头和共轭于该细胞的一第二接头之间的一种相互作用，复合于该细胞。
12.如权利要求第11项所述之细胞，其中第一接头是一第一多核苷酸，或第二接头是一第二多核苷酸。
13.如权利要求第10项所述之细胞，其中靶向部分包含一抗原结合单元。
14.如权利要求第12项所述之细胞，其中第一多核苷酸包含一段单链区域。
15.如权利要求第11项所述之细胞，其中该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
16.如权利要求第11项所述之细胞，其中该第一接头和该第二接头选自下列组群：一DNA结合结构域和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型和一目标DNA、生物素和抗生物素蛋白、生物素和链霉抗生物素蛋白、携钙素结合蛋白和携钙素、一荷尔蒙和一荷尔蒙受体、凝集素和一种碳水化合物、一细胞膜受体和一受体配体、一酶和一底物、一抗原和一抗体、一激动剂和一拮抗剂、多个能杂交的多核苷酸序列分子、一核酸适体和一目标分子、一锌指蛋白和一目标DNA。
17.如权利要求第11项所述之细胞，其中第一接头包含一第一反应基团，且第二接头包含一第二反应基团，且其中该细胞藉由第二反应基团和第一反应基团间的一种反应所形成的一共价键复合于该靶向部分。
18.如权利要求第15项所述之细胞，其中该靶向部分包含一抗原结合单元。
19.如权利要求第11项所述之细胞，其中该第二接头包含一聚乙二醇区域。
20.如权利要求第10项所述之细胞，其中该靶向部分和该细胞间的间隔长度为1nm到400nm。
21.如权利要求第10项所述之细胞，其中该外源性靶向单元包含一抗原结合单元，该抗原结合单元能与癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ–谷氨酸转肽酶、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、多重抗药性相关抗原、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖、酪氨酸酶、黏蛋白-1、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原、p53、RAS、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、或黑色素瘤相关抗原结合。
22.如权利要求第21项所述之细胞，其中抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(ERBB3)、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子)、CA-125(黏蛋白16)、基质金属蛋白酶9、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1)、癌胚抗原、MSLN(间皮素)、糖抗原19-9、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体、CD3、巨噬细胞移行抑制因子、叶酸受体α(FOLR1)、聚落刺激因子1、OX-40、CD137、运铁蛋白受体、黏蛋白1、CD25(白介素-2受体)、CD115(聚落刺激因子1受体)、白介素1B、CD105(内皮糖蛋白)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、CD47、癌胚抗原、白介素-17A、DLL4、CD51、血管生长素2、神经纤毛蛋白-1、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3)、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7)、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、一种肿瘤坏死因子受体蛋白、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素、激活自然杀手细胞的受体及其组合。
23.如权利要求第12项所述之细胞，其中靶向部分是藉由一耦合基团共轭于该第一多核苷酸，其中所述耦合基团为一NHS酯、其他活化后的酯、一烷基或酰基卤、一双功能化的交联剂或顺丁烯二酰亚胺基团。
24.如权利要求第12项所述之细胞，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一从下列所选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA、20个核苷酸的多聚GGTT、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:10。
25.如权利要求第10项所述之细胞，该靶向部分对该生物标记的结合亲和力小于250nM。
26.如权利要求第12项所述之细胞，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt到500nt。
27.如权利要求第11项所述之细胞，第一接头和第二接头的结合亲和力小于250nM。
28.如权利要求第11项所述之细胞，该第一接头或该第二接头共轭在该靶向单元的一原生功能基团或该细胞的一表面上，其中该原生功能基团为一氨基酸、一糖基、或一氨基(amine)。
29.如权利要求第10项所述之细胞，靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体。
30.一种实质上富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，其中，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞的数量至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％；该人类CD16阳性自然杀手细胞是源自于一带有癌症的个体且
具有以下特征：
i)表达一CD16受体，
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
31.如权利要求第30项所述之组合物，其中该CD16受体是一CD16a受体或一CD16b受体。
32.如权利要求第30项所述之组合物，其中一编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
33.如权利要求第30项所述之组合物，其中所述人类CD16阳性自然杀手细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
34.如权利要求第30项所述之组合物，其中在经过γ射线照射过后，所述人类CD16阳性自然杀手细胞对一同种异体的个体没有致癌性。
35.如权利要求第30项所述之组合物，其中一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:19核苷酸序列。
36.如权利要求第30项所述之组合物，其中CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
37.如权利要求第30项所述之组合物，其中该人类CD16阳性自然杀手细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因或一经突变且高度表达的致癌基因。
38.如权利要求第30项所述之组合物，其中人类CD16阳性自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(ADCC)，且该细胞为一雄性细胞。
39.如权利要求第30项所述之组合物，其中人类CD16阳性自然杀手细胞更包含至少一复合于该人类CD16阳性自然杀手细胞的外源性靶向单元，其中该外源性靶向单元包含一靶向部分，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记展现特异性结合；
(b)它不是一种核酸；以及
(c)它不是由该人类CD16阳性自然杀手细胞产生。
40.如权利要求第39项所述之组合物，其中外源性靶向单元是透过共轭于靶向部分的一第一接头和共轭于该人类CD16阳性自然杀手细胞的一第二接头之间的一种相互作用，复合于该人类CD16阳性自然杀手细胞。
41.如权利要求第40项所述之组合物，其中第一接头是一第一多核苷酸，或第二接头是一第二多核苷酸。
42.如权利要求第39项所述之组合物，其中该靶向部分包含一抗原结合单元。
43.如权利要求第41项所述之组合物，其中第一多核苷酸包含一段单链区域。
44.如权利要求第40项所述之组合物，其中该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
45.如权利要求第40项所述之组合物，其中该第一接头和该第二接头系选自下列群组：一DNA结合结构域和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型和一目标DNA、生物素和抗生物素蛋白、生物素和链霉抗生物素蛋白、携钙素结合蛋白和携钙素、一荷尔蒙和一荷尔蒙受体、凝集素和一种碳水化合物、一细胞膜受体和一受体配体、一酶和一底物、一抗原和一抗体、一激动剂和一拮抗剂、多个能杂交的多核苷酸序列分子、一核酸适体及一目标分子、一锌指蛋白和一目标DNA。
46.如权利要求第40项所述之组合物，其中第一接头包含一第一反应基团，而第二接头包含一第二反应基团，且其中人类CD16阳性自然杀手细胞，藉由第二反应基团和第一反应基团间的一种反应所形成的一共价键复合于该靶向部分。
47.如权利要求第44项所述之组合物，其中靶向部分包含一抗原结合单元。
48.如权利要求第40项所述之组合物，其中该第二接头包含一聚乙二醇区域。
49.如权利要求第39项所述之组合物，其中该靶向部分和该人类CD16阳性自然杀手细胞间的间隔长度为1nm到400nm。
50.如权利要求第39项所述之组合物，其中外源性靶向单元包含一抗原结合单元，该抗原结合单元能与癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ-谷氨酸转肽酶、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖、酪氨酸酶、黏蛋白-1、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原、p53、RAS、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、或黑色素瘤相关抗原结合。
51.如权利要求第50项所述之组合物，其中该抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(ERBB3)、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子)、CA-125(黏蛋白16)、基质金属蛋白酶9、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1)、癌胚抗原、MSLN(间皮素)、糖抗原19-9、CD73、CD205、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体、CD3、巨噬细胞移行抑制因子、叶酸受体α(FOLR1)、聚落刺激因子1、OX-40、CD137、运铁蛋白受体、黏蛋白1、CD25(白介素-2受体)、CD115(聚落刺激因子1受体)、白介素1B、CD105(内皮糖蛋白)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、CD47、癌胚抗原、白介素-17A、DLL4、CD51、血管生长素2、神经纤毛蛋白-1、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3)、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7)、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、一种肿瘤坏死因子受体蛋白、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素、激活自然杀手细胞的受体及其组合。
52.如权利要求第41项所述之组合物，其中该靶向部分是藉由一耦合基团共轭于该第一多核苷酸，所述耦合基团为一NHS酯、其他活化后的酯、一烷基或酰基卤、一双功能化的交联剂或顺丁烯二酰亚胺基团。
53.如权利要求第41项所述之组合物，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸的序列包含一由下列选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA、20个核苷酸的多聚GGTT、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:10。
54.如权利要求第39项所述之组合物，该靶向部分对该生物标记的结合亲和力小于250nM。
55.如权利要求第41项所述之组合物，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt～500nt。
56.如权利要求第40项所述之组合物，该第一接头和该第二接头的结合亲和力小于250nM。
57.如权利要求第40项所述之组合物，该第一接头或该第二接头共轭在靶向单元的一原生功能基团或人类CD16阳性自然杀手细胞的一表面上，其中该原生功能基团为一氨基酸、一糖基或一氨基(amine)。
58.如权利要求第39项所述之组合物，靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体。
59.一种取得一实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物的方法；该方法包含：
(a)取得一群保藏编号为ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞；
(b)将该群人类周边血液自然杀手细胞与一种对一CD16受体具特异性的抗体接触；以及
(c)将被抗体特异性地结合的细胞分离，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物；其中所述人类CD16阳性自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；以及
ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
60.如权利要求第59项所述之方法，其中步骤(c)包含下列子步骤：
(c1)将被抗体特异性地结合的细胞分离出来；
(c2)在一容器中，让被抗体特异性地结合的细胞与一含有人类血小板裂解物和白介素-2的培养基接触；
(c3)培养细胞多日，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物。
61.如权利要求第60项所述之方法，其中该容器包含一可透气且不透水的用于接种细胞的底面。
62.如权利要求第60项所述之方法，其中溶于培养基中的葡萄糖的浓度为1500～5000mg/L。
63.如权利要求第60项所述之方法，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞的数量至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
64.一种培养和扩增人类CD16阳性自然杀手细胞的方法；该方法包含：
(x)在一容器中，让人类CD16阳性自然杀手细胞和一包含0.5～10vol％的人类血小板裂解物和100～3000IU/mL的白介素-2的培养基接触；
(y)培养细胞多日。
65.如权利要求第64项所述之方法，其中该容器包含一可透气且不透水的用于接种细胞的底面。
66.如权利要求第64项所述之方法，其中步骤(y)包含下列子步骤：
(y1)培养细胞至少一天；以及
(y2)继代培养细胞至少一个月。
67.如权利要求第64项所述之方法，其中人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少三个月的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
68.如权利要求第64项所述之方法，其中人类CD16阳性自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；以及
ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
69.一种治疗癌症、自体免疫疾病、神经疾病、人类免疫不全病毒(HIV)感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、病原性疾病、病毒感染、或细菌感染的方法，包含将含有一有效剂量的如权利要求第1项或权利要求第10项所述之人类自然杀手细胞的一组合物施用于一有需要的个体。
70.如权利要求第69项所述之方法，其中外源性靶向单元是透过共轭于靶向部分的一第一接头，和共轭于人类自然杀手细胞的一第二接头之间的一种相互作用，复合于人类自然杀手细胞。
71.如权利要求第69项所述之方法，其中该靶向部分包含一抗原结合单元。
72.如权利要求第71项所述之方法，其中抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体。
73.如权利要求第69项所述之方法，其中靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体。
74.如权利要求第69项所述之方法，其中人类自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应，且该人类自然杀手细胞为一雄性细胞。
75.如权利要求第69项所述之方法，其中该方法用来治疗癌症。
76.如权利要求第1项所述之细胞，其中该细胞还具有一合成的、基因改造的、且/或被特意递送的多核苷酸，其编码一种抗抗原的靶向结合单链可变片段(scFv)。
77.如权利要求第76项所述之细胞，其中该细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应。
78.一种治疗癌症、自体免疫疾病、神经疾病、人类免疫不全病毒(HIV)感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、病原性疾病、病毒感染、或细菌感染的方法，包含将一种含有有一效剂量的如权利要求第76项所述之人类自然杀手细胞施用于一有需要的个体。
79.如权利要求第78项所述之方法，其中组合物中的人类自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中的总细胞数为100％时，细胞的数量为等于或大于5％。
80.如权利要求第78项所述之方法，其中该方法是用于治疗癌症。
81.一种保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017的人类自然杀手细胞。
82.一种实质上富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，其中，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞的数量至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD 16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％；该人类CD16阳性自然杀手细胞是保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017。

Claims (80)

1.一种人类自然杀手细胞，其为
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
2.如权利要求第1项所述之细胞，其中所述CD16受体是一CD16a受体或一CD16b受体。
3.如权利要求第1项所述之细胞，其中一被表达的编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
4.如权利要求第1项所述之细胞，该细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
5.如权利要求第1项所述之细胞，在经过γ射线照射过后，该细胞对一同种异体的个体不具致癌性。
6.如权利要求第1项所述之细胞，其中一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:19核苷酸序列。
7.如权利要求第1项所述之细胞，其中CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
8.如权利要求第1项所述之细胞，该细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因或一经突变且高度表达的致癌基因。
9.如权利要求第1项所述之细胞，其中该细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应，且该细胞为一雄性细胞。
10.如权利要求第1项所述之细胞，其中该细胞更包含至少一复合于该细胞上的外源性靶向单元，其中外源性靶向单元包含一靶向部分，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记展现特异性结合；
(b)它不是一种核酸；以及
(c)它不是由该细胞产生。
11.如权利要求第10项所述之细胞，其中外源性靶向单元是透过共轭于该靶向部分的一第一接头和共轭于该细胞的一第二接头之间的一种相互作用，复合于该细胞。
12.如权利要求第11项所述之细胞，其中第一接头是一第一多核苷酸，或第二接头是一第二多核苷酸。
13.如权利要求第10项所述之细胞，其中靶向部分包含一抗原结合单元。
14.如权利要求第12项所述之细胞，其中第一多核苷酸包含一段单链区域。
15.如权利要求第11项所述之细胞，其中该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
16.如权利要求第11项所述之细胞，其中该第一接头和该第二接头选自下列组群：一DNA结合结构域和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型和一目标DNA、生物素和抗生物素蛋白、生物素和链霉抗生物素蛋白、携钙素结合蛋白和携钙素、一荷尔蒙和一荷尔蒙受体、凝集素和一种碳水化合物、一细胞膜受体和一受体配体、一酶和一底物、一抗原和一抗体、一激动剂和一拮抗剂、多个能杂交的多核苷酸序列分子、一核酸适体和一目标分子、一锌指蛋白和一目标DNA。
17.如权利要求第11项所述之细胞，其中第一接头包含一第一反应基团，且第二接头包含一第二反应基团，且其中该细胞藉由第二反应基团和第一反应基团间的一种反应所形成的一共价键复合于该靶向部分。
18.如权利要求第15项所述之细胞，其中该靶向部分包含一抗原结合单元。
19.如权利要求第11项所述之细胞，其中该第二接头包含一聚乙二醇区域。
20.如权利要求第10项所述之细胞，其中该靶向部分和该细胞间的间隔长度为1nm到400nm。
21.如权利要求第10项所述之细胞，其中该外源性靶向单元包含一抗原结合单元，该抗原结合单元能与癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ–谷氨酸转肽酶、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、多重抗药性相关抗原、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖、酪氨酸酶、黏蛋白-1、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原、p53、RAS、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、或黑色素瘤相关抗原结合。
22.如权利要求第21项所述之细胞，其中抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(ERBB3)、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子)、CA-125(黏蛋白16)、基质金属蛋白酶9、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1)、癌胚抗原、MSLN(间皮素)、糖抗原19-9、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体、CD3、巨噬细胞移行抑制因子、叶酸受体α(FOLR1)、聚落刺激因子1、OX-40、CD137、运铁蛋白受体、黏蛋白1、CD25(白介素-2受体)、CD115(聚落刺激因子1受体)、白介素1B、CD105(内皮糖蛋白)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、CD47、癌胚抗原、白介素-17A、DLL4、CD51、血管生长素2、神经纤毛蛋白-1、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3)、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7)、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、一种肿瘤坏死因子受体蛋白、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素、激活自然杀手细胞的受体及其组合。
23.如权利要求第12项所述之细胞，其中靶向部分是藉由一耦合基团共轭于该第一多核苷酸，其中所述耦合基团为一NHS酯、其他活化后的酯、一烷基或酰基卤、一双功能化的交联剂或顺丁烯二酰亚胺基团。
24.如权利要求第12项所述之细胞，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一从下列所选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA、20个核苷酸的多聚GGTT、SEQ IDNO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:10。
25.如权利要求第10项所述之细胞，该靶向部分对该生物标记的结合亲和力小于250nM。
26.如权利要求第12项所述之细胞，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt到500nt。
27.如权利要求第11项所述之细胞，第一接头和第二接头的结合亲和力小于250nM。
28.如权利要求第11项所述之细胞，该第一接头或该第二接头共轭在该靶向单元的一原生功能基团或该细胞的一表面上，其中该原生功能基团为一氨基酸、一糖基、或一氨基(amine)。
29.如权利要求第10项所述之细胞，靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体。
30.一种实质上富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物，其中，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞的数量至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％；该人类CD16阳性自然杀手细胞是
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体，
ii)在经过至少三个月的继代培养后仍保持其增殖的能力；以及
iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16 F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
31.如权利要求第30项所述之组合物，其中该CD16受体是一CD16a受体或一CD16b受体。
32.如权利要求第30项所述之组合物，其中一编码CD16受体的多核苷酸位于一号染色体q臂的第1q23.3位点。
33.如权利要求第30项所述之组合物，其中所述人类CD16阳性自然杀手细胞对一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
34.如权利要求第30项所述之组合物，其中在经过γ射线照射过后，所述人类CD16阳性自然杀手细胞对一同种异体的个体没有致癌性。
35.如权利要求第30项所述之组合物，其中一编码CD16受体的多核苷酸包含一SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:19核苷酸序列。
36.如权利要求第30项所述之组合物，其中CD16受体包含一SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:20氨基酸序列。
37.如权利要求第30项所述之组合物，其中该人类CD16阳性自然杀手细胞更包含一失活的肿瘤抑制基因或一经突变且高度表达的致癌基因。
38.如权利要求第30项所述之组合物，其中人类CD16阳性自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(ADCC)，且该细胞为一雄性细胞。
39.如权利要求第30项所述之组合物，其中人类CD16阳性自然杀手细胞更包含至少一复合于该人类CD16阳性自然杀手细胞的外源性靶向单元，其中该外源性靶向单元包含一靶向部分，该靶向部分的特征在于：
(a)它对一目标细胞上的一生物标记展现特异性结合；
(b)它不是一种核酸；以及
(c)它不是由该人类CD16阳性自然杀手细胞产生。
40.如权利要求第39项所述之组合物，其中外源性靶向单元是透过共轭于靶向部分的一第一接头和共轭于该人类CD16阳性自然杀手细胞的一第二接头之间的一种相互作用，复合于该人类CD16阳性自然杀手细胞。
41.如权利要求第40项所述之组合物，其中第一接头是一第一多核苷酸，或第二接头是一第二多核苷酸。
42.如权利要求第39项所述之组合物，其中该靶向部分包含一抗原结合单元。
43.如权利要求第41项所述之组合物，其中第一多核苷酸包含一段单链区域。
44.如权利要求第40项所述之组合物，其中该第一接头是一第一多核苷酸，且该第二接头是一第二多核苷酸。
45.如权利要求第40项所述之组合物，其中该第一接头和该第二接头系选自下列群组：一DNA结合结构域和一目标DNA、一亮氨酸拉链型构型和一目标DNA、生物素和抗生物素蛋白、生物素和链霉抗生物素蛋白、携钙素结合蛋白和携钙素、一荷尔蒙和一荷尔蒙受体、凝集素和一种碳水化合物、一细胞膜受体和一受体配体、一酶和一底物、一抗原和一抗体、一激动剂和一拮抗剂、多个能杂交的多核苷酸序列分子、一核酸适体及一目标分子、一锌指蛋白和一目标DNA。
46.如权利要求第40项所述之组合物，其中第一接头包含一第一反应基团，而第二接头包含一第二反应基团，且其中人类CD16阳性自然杀手细胞，藉由第二反应基团和第一反应基团间的一种反应所形成的一共价键复合于该靶向部分。
47.如权利要求第44项所述之组合物，其中靶向部分包含一抗原结合单元。
48.如权利要求第40项所述之组合物，其中该第二接头包含一聚乙二醇区域。
49.如权利要求第39项所述之组合物，其中该靶向部分和该人类CD16阳性自然杀手细胞间的间隔长度为1nm到400nm。
50.如权利要求第39项所述之组合物，其中外源性靶向单元包含一抗原结合单元，该抗原结合单元能与癌症抗原、糖脂、糖蛋白、呈现于一造血群系细胞上的分化抗原丛、γ-谷氨酸转肽酶、黏附蛋白、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、膜结合形式的一免疫球蛋白μ链、甲型胎儿蛋白、C-反应蛋白、嗜铬血液细胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异抗原、路易斯(a)抗原、多重抗药性相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异性烯醇酶、P型糖蛋白、多重抗药性相关抗原、p170、前列腺特异性抗原、神经细胞黏附分子、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多糖、酪氨酸酶、黏蛋白-1、HER-2/neu、KSA、前列腺特异性膜抗原、p53、RAS、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、或黑色素瘤相关抗原结合。
51.如权利要求第50项所述之组合物，其中该抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体，且该癌症抗原选自HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(ERBB3)、上皮成长因子受体、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、GD2、细胞毒性T细胞抗原-4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞黏附分子)、CA-125(黏蛋白16)、基质金属蛋白酶9、DLL3、CD274(计划性死亡-配体1)、癌胚抗原、MSLN(间皮素)、糖抗原19-9、CD73、CD205、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰岛素样生长因子-1受体、CD3、巨噬细胞移行抑制因子、叶酸受体α(FOLR1)、聚落刺激因子1、OX-40、CD137、运铁蛋白受体、黏蛋白1、CD25(白介素-2受体)、CD115(聚落刺激因子1受体)、白介素1B、CD105(内皮糖蛋白)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、CD47、癌胚抗原、白介素-17A、DLL4、CD51、血管生长素2、神经纤毛蛋白-1、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3)、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7)、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(CLDN1)、前列腺特异性膜抗原、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3、一种杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、一种肿瘤坏死因子受体蛋白、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体、一种整合素、激活自然杀手细胞的受体及其组合。
52.如权利要求第41项所述之组合物，其中该靶向部分是藉由一耦合基团共轭于该第一多核苷酸，所述耦合基团为一NHS酯、其他活化后的酯、一烷基或酰基卤、一双功能化的交联剂或顺丁烯二酰亚胺基团。
53.如权利要求第41项所述之组合物，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸的序列包含一由下列选出的序列：20个核苷酸单元的多聚CA、20个核苷酸的多聚GGTT、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、23个核苷酸单元的序列SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:10。
54.如权利要求第39项所述之组合物，该靶向部分对该生物标记的结合亲和力小于250nM。
55.如权利要求第41项所述之组合物，该第一多核苷酸的长度或该第二多核苷酸的长度为4nt～500nt。
56.如权利要求第40项所述之组合物，该第一接头和该第二接头的结合亲和力小于250nM。
57.如权利要求第40项所述之组合物，该第一接头或该第二接头共轭在靶向单元的一原生功能基团或人类CD16阳性自然杀手细胞的一表面上，其中该原生功能基团为一氨基酸、一糖基或一氨基(amine)。
58.如权利要求第39项所述之组合物，靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体。
59.一种取得一实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物的方法；该方法包含：
(a)取得一群保藏编号为ATCC CRL-2407的人类周边血液自然杀手细胞；
(b)将该群人类周边血液自然杀手细胞与一种对一CD16受体具特异性的抗体接触；以及
(c)将被抗体特异性地结合的细胞分离，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物；其中所述人类CD16阳性自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；以及
ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
60.如权利要求第59项所述之方法，其中步骤(c)包含下列子步骤：
(c1)将被抗体特异性地结合的细胞分离出来；
(c2)在一容器中，让被抗体特异性地结合的细胞与一含有人类血小板裂解物和白介素-2的培养基接触；
(c3)培养细胞多日，从而取得该实质富含人类CD16阳性自然杀手细胞的组合物。
61.如权利要求第60项所述之方法，其中该容器包含一可透气且不透水的用于接种细胞的底面。
62.如权利要求第60项所述之方法，其中溶于培养基中的葡萄糖的浓度为1500～5000mg/L。
63.如权利要求第60项所述之方法，该组合物中的人类CD16阳性自然杀手细胞的数量至少为5×105个，且基于组合物中总细胞数为100％时，人类CD16阳性自然杀手细胞的数量为等于或大于5％。
64.一种培养和扩增人类CD16阳性自然杀手细胞的方法；该方法包含：
(x)在一容器中，让人类CD16阳性自然杀手细胞和一包含0.5～10vol％的人类血小板裂解物和100～3000IU/mL的白介素-2的培养基接触；
(y)培养细胞多日。
65.如权利要求第64项所述之方法，其中该容器包含一可透气且不透水的用于接种细胞的底面。
66.如权利要求第64项所述之方法，其中步骤(y)包含下列子步骤：
(y1)培养细胞至少一天；以及
(y2)继代培养细胞至少一个月。
67.如权利要求第64项所述之方法，其中人类CD16阳性自然杀手细胞在经过至少三个月的继代培养后仍能保持其增殖的能力。
68.如权利要求第64项所述之方法，其中人类CD16阳性自然杀手细胞为：
(A)保藏在NPMD且具有保藏编号NITE BP-03017；或
(B)具有以下特征：
i)表达一CD16受体；以及
ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意递送的编码CD16受体的多核苷酸，或
y)通过使用微滴式数字核酸侦测系统分析细胞的基因组脱氧核糖核酸，能被CD16F176F探针检测到的脱氧核糖核酸分子与能被CD16 F176V探针检测到的脱氧核糖核酸分子的比例等于或大于1，其中CD16F176F探针的序列为SEQ ID NO:11，且CD16 F176V探针的序列为SEQ ID NO:12。
69.一种治疗癌症、自体免疫疾病、神经疾病、人类免疫不全病毒(HIV)感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、病原性疾病、病毒感染、或细菌感染的方法，包含将含有一有效剂量的如权利要求第1项或权利要求第10项所述之人类自然杀手细胞的一组合物施用于一有需要的个体。
70.如权利要求第69项所述之方法，其中外源性靶向单元是透过共轭于靶向部分的一第一接头，和共轭于人类自然杀手细胞的一第二接头之间的一种相互作用，复合于人类自然杀手细胞。
71.如权利要求第69项所述之方法，其中该靶向部分包含一抗原结合单元。
72.如权利要求第71项所述之方法，其中抗原结合单元是一种抗癌症抗原的抗体。
73.如权利要求第69项所述之方法，其中靶向部分为一肽、蛋白质、或核酸适体。
74.如权利要求第69项所述之方法，其中人类自然杀手细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应，且该人类自然杀手细胞为一雄性细胞。
75.如权利要求第69项所述之方法，其中该方法用来治疗癌症。
76.如权利要求第1项所述之细胞，其中该细胞还具有一合成的、基因改造的、且/或被特意递送的多核苷酸，其编码一种抗抗原的靶向结合单链可变片段(scFv)。
77.如权利要求第76项所述之细胞，其中该细胞能介导一抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀反应。
78.一种治疗癌症、自体免疫疾病、神经疾病、人类免疫不全病毒(HIV)感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、病原性疾病、病毒感染、或细菌感染的方法，包含将一种含有有一效剂量的如权利要求第76项所述之人类自然杀手细胞施用于一有需要的个体。
79.如权利要求第78项所述之方法，其中组合物中的人类自然杀手细胞数至少为5×105个，且基于组合物中的总细胞数为100％时，细胞的数量为等于或大于5％。
80.如权利要求第78项所述之方法，其中该方法是用于治疗癌症。
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