CN117377479A - 富含γδT细胞的新颖组合物、其制备方法、及其用途 - Google Patents

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CN117377479A CN202280028427.5A CN202280028427A CN117377479A CN 117377479 A CN117377479 A CN 117377479A CN 202280028427 A CN202280028427 A CN 202280028427A CN 117377479 A CN117377479 A CN 117377479A
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李皓刚
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Abstract

本文提供具有高治疗潜力的富含gdT细胞的新颖组合物。还提供生产此类组合物的方法及其在过继免疫疗法中的使用方法。

Description

富含γδT细胞的新颖组合物、其制备方法、及其用途
【技术领域】
本申请案主张2021年4月16日申请之美国临时申请案第63/175,689号和2021年10月7日申请之美国临时申请案第63/253,323号之优先权，所述系以全文引用之方式并入本文中。
本发明涉及了分子生物学、细胞生物学、和免疫学。本文提供富含具有类NK(NK-like)特性的γδT(gdT)细胞的新颖组合物、其制备方法、及其使用方法。
【先前技术】
因同时具有先天免疫和类似后天免疫的特性，gdT细胞具有广泛的抗原特异性和类NK细胞毒性。此外，gdT细胞可以浸润到不同的肿瘤中并杀死多种肿瘤细胞。因此，在例如癌症免疫疗法的免疫疗法中使用gdT细胞已被多方尝试，但仅取得的有限的成果，主要是因为仍然缺乏能有选择性且有效扩增具有治疗潜力的gdT细胞的方法。因此，急需取得富含具有治疗潜力的gdT细胞的细胞群的方法。本公开说明书满足了这种需求并提供了相关的优点。
【发明内容】
本文提供制造富含gdT细胞的细胞群的方法，包含在添加有(i)一磷酸抗原(phosphoantigen)、(ii)一细胞激素、和(iii)人类血小板裂解物(human plateletlysate，「HPL」)的培养基中培养一包含gdT细胞的来源细胞群(source cell population)。
在本文提供的方法的一些实施例中，细胞群在培养期间不与滋养细胞或肿瘤细胞接触。在一些实施例中，本文提供的方法不包含对gdT细胞进行正向选汰。
在本文提供的方法的一些实施例中，培养细胞群3至40天、4至40天、5至40天、6至40天、7至40天、10至40天、10至30天、6至20天、12至20天、或14至18天。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包含去除αβT(abT)细胞。在一些实施例中，于培养周期约一半时去除abT细胞。在一些实施例中，培养细胞14至18天，在第4天和第10天间去除abT细胞。
在本文提供的方法的一些实施例中，于培养期间补充细胞激素。在一些实施例中，细胞激素每周补充一次、每周补充两次、每周补充三次、每隔一天补充一次、或每天补充。
在本文提供的方法的一些实施例中，所述细胞激素为间白素-2(IL-2)、间白素-4(IL-4)、间白素-6(IL-6)、间白素-7(IL-7)、间白素-8(IL-8)、间白素-9(IL-9)、间白素-12(IL-12)、间白素-15(IL-15)、间白素-18(IL-18)、间白素-21(IL-21)、间白素-33(IL-33)、或其任合组合。在一些实施例中，细胞激素为IL-2。
在本文提供的方法的一些实施例中，细胞激素的添加浓度为200-3000IU/mL。
在本文提供的方法的一些实施例中，在培养期间不补充磷酸抗原。
在本文提供的方法的一些实施例中，磷酸抗原是双磷酸盐(bisphosphonate)选自由氯磷酸盐(clodranate)、依替磷酸盐(etidronate)、阿仑磷酸盐(alendronate)、帕米磷酸盐(pamidronate)、唑来磷酸盐(zoledronate(唑来磷酸(zoledronic acid))、奈立磷酸盐(neridronate)、伊班磷酸盐(ibandronate)、和帕米磷酸盐(pamidronate)所组成的群组。在一些实施例中，磷酸抗原是唑来磷酸盐(zoledronate)。在本文提供的方法的一些实施例中，磷酸抗原选自由焦磷酸溴代醇(bromohydrin pyrophosphate，BrHPP)、4-羟基-丁-2-烯基焦磷酸(4-hydroxy-but-2-enyl pyrophosphate，HMBPP)、异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)、和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallylpyrophosphate，DMAPP)所组成的群组。
在本文提供的方法的一些实施例中，磷酸抗原的添加浓度为0.1-20μM。
在本文提供的方法的一些实施例中，HPL的添加浓度为1-20vol％。
在本文提供的方法的一些实施例中，培养基包含浓度为600-5000mg/L的葡萄糖。在一些实施例中，培养基为无血清的培养基。
在本文提供的方法的一些实施例中，细胞群培养在含有透气性表面的装置里。在一些实施例中，该装置是一G-Rex装置。
在本文提供的方法的一些实施例中，来源细胞群包含周边血单核细胞(PBMC)、骨髓、脐带血、或其组合。在一些实施例中，来源细胞群包含PBMC。在一些实施例中，本文提供的方法还包含从周边血液中取得PBMC。
在本文提供的方法的一些实施例中，在培养期间来源细胞群中的gdT细胞至少扩增了1,000倍。在一些实施例中，产生的细胞群中至少75％是gdT细胞。
在一些实施例中，本文提供的方法还包含将靶向部分添加到产生的细胞群的细胞表面。在一些实施例中，靶向部分藉由与靶向部分接合的第一连结子(linker)和与细胞表面接合的第二连结子之间的相互作用复合于细胞表面。在一些实施例中，靶向部分由产生的细胞群外源性地表达。
在一些实施例中，本文提供的方法还包含在培养后冷冻保存细胞群。
本文还提供通过本文所述方法获得的细胞群。
在一些实施例中，本文提供包含至少70％gdT细胞的细胞群，其中(1)平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子；(2)至少30％的gdT细胞为CD69+；或(1)和(2)两者。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少500个、至少1000个、至少2000个、或至少3000个DNAM-1分子。在一些实施例中，至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的gdT细胞为CD69+。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的gdT细胞为终端分化的(terminally differentiated)效应(TDEM)细胞。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少1×106个、至少5×106个、至少1×107个、至少5×107个、至少1×108个、至少5×108个、至少1×109个、至少5×109个、至少1×1010个、至少5×1010个或至少1×1011个gdT细胞。
在一些实施例中，本文提供的细胞群没有对gdT细胞进行正向选汰。
在一些实施例中，本文提供的细胞群自从来自单一供体的来源细胞群起经20天或较短时间的培养，所述细胞群源自或取自来源细胞群。
在一些实施例中，本文提供的细胞群中的gdT细胞表达(1)平均每个细胞至少400个CD56分子；(2)平均每个细胞至少400个CD16分子；(3)平均每个细胞至少400个NKG2D分子；(4)平均每个细胞至少400个CD107a分子；(5)平均每个细胞最多2800个PD-1分子；(6)平均每个细胞至少5000个DNAM-1分子；(7)平均每个细胞至少400个CD69分子；(8)平均每个细胞至少100个颗粒酶B(Granzyme B)分子；或其任合组合。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少30％的gdT细胞是Vδ2T细胞。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少10％的gdT细胞包含一复合于细胞表面的靶向部分。
在一些实施例中，靶向部分不是核酸。在一些实施例中，靶向部分是与目标细胞上的生物标志物特异性地结合的抗体或抗原结合单元。在一些实施例中，生物标志物是一肿瘤抗原。
在一些实施例中，gdT细胞表达包含抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)或T细胞受体(TCR)。
在一些实施例中，靶向部分不是由gdT细胞产生的。在一些实施例中，靶向部分藉由与靶向部分接合的第一连结子和与细胞表面接合的第二连结子之间的相互作用复合于细胞表面。在一些实施例中，第一连结子是一第一多核苷酸，且第二连结子是一第二多核苷酸。在一些实施例中，(1)第一多核苷酸具有4到500个核苷酸，(2)第二多核苷酸具有4到500个核苷酸，或(1)和(2)两者。
在一些实施例中，本文提供的细胞群是冷冻保存的。
在一些实施例中，本文提供的是包含本文提供的细胞群和一药学上可接受载剂的医药组合物。
在一些实施例中，本文提供的细胞群或本文提供的医药组合物储存在0℃或0℃以下至少一周、至少两周、至少1个月、至少3个月、或至少6个月后可以维持其疗效。
本文还提供本文所提供的细胞群或医药组合物在过继免疫疗法(adoptiveimmunotherapy)中的用途。
本文还提供本文所提供的细胞群或医药组合物在治疗疾病或病症时的用途。
本文还提供了为有需要的个体治疗疾病或病症的方法，其包含对个体施用本文提供的细胞群或医药组合物。
在一些实施例中，所述疾病或病症为肿瘤或癌症。在一些实施例中，疾病或病症是自身免疫疾病、神经元疾病、造血细胞相关疾病、代谢综合症、致病性疾病、HIV或其他病毒感染、真菌感染、原虫感染、或细菌感染。在一些实施例中，个体为人类。
【图式简单说明】
图1A和1B分别提供了示范制备富含gdT细胞细胞群方法的流程图。
图2提供显示在不同培养天数时细胞群的细胞数量和葡萄糖摄取量的折线图。
图3A-3C提供分析根据本文所述方法制备的细胞群(在第16天时)的流式细胞术结果。如图所示，经染色的分子包含：TCRab、TCRvd2、CD16、CD3和CD25(图3A)；CD38、CD56、CD69、CD107a、和NKG2D(图3B)；和PD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色(图3C)。
图4A-4C提供分析第16天产生的细胞群中PI-TCRVδ2+圈选内细胞群(第16天的Vδ2T细胞)的流式细胞术结果。如图所示，经染色的分子包含：TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1(图4A)；CD36、CD69、PD-1、CD103、和CCR7(图4B)；和TNFα、INFγ、颗粒酶B、和CD107a(图4C)。
图5A-5Q提供萤光染料接合的小鼠抗体的标准曲线(QuantumTMSimply试剂盒)。图5A：抗人类CD56；图5B：抗人类CD16；图5C：抗人类NKG2D；图5D：抗人类NKp44；图5E：抗人类NKp46；图5F：抗人类IFNγ；图5G：抗人类DNAM-1；图5H：抗人类颗粒酶B；图5I：抗人类TIGIT；图5J：抗人类TNFα；图5K：抗人类CD18；图5L：抗人类TCRVd2；图5M：抗人类NKp30；图5N：抗人类PD1；图5O：抗人类CD69；图5P：抗人类CD107a；图5Q：抗人类CCR7。
图6是显示从第16天产生的细胞群中分离出的记忆类型的Vδ2T细胞(第16天Vδ2T细胞)的二维点阵图。
图7A-7C提供分析Control-gdT细胞和ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的流式细胞术结果。如图所示，经染色的分子包含：TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、和CD25(图3A)；CD38、CD56、CD69、CD107a、和NKG2D(图7B)；和PD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色(图7C)。
图8A-8C提供分析Control-gdT细胞和ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞中PI-TCRVδ2+-圈选内的细胞群的流式细胞术结果。如图所示，经染色的分子包含：TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1(图8A)；CD36、CD69、PD-1、CD103、和CCR7(图8B)；和TNFα、INFγ、颗粒酶B、和CD107a(图8C)。
图9是显示PI-TCRVδ2+-圈选内的细胞群中记忆类型的Control-gdT细胞和ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的二维点阵图。
图10A-10B提供针对人类卵巢癌细胞系SK-OV-3的细胞毒性检定结果。图10A显示比较Control-gdT细胞在曲妥珠单抗(trastuzumab)存在时的细胞毒性和曲妥珠单抗(trastuzumab)本身的细胞毒性的结果。图10B显示比较ACE-gdT细胞-HER2(曲妥珠单抗，trastuzumab)细胞的细胞毒性和Control-gdT细胞的细胞毒性的结果。
图11A-11C提供针对三种癌细胞系的细胞毒性检定结果：CD20阳性的人类淋巴瘤细胞系Raji细胞(图11A)；CD20阳性人类淋巴瘤细胞系Daudi(图11B)；和人类淋巴瘤细胞系K562(图11C)。每张图提供比较ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的细胞毒性和Control-gdT细胞的细胞毒性的结果。
图12A-12C提供针对Raji细胞的细胞毒性检定结果。每张分图提供比较ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的细胞毒性和Control-gdT细胞的细胞毒性的结果。测试了来自三个不同供体的新鲜PBMC的细胞群：图12A：供体1；图12B：供体2；和图12C：供体3。
图13A-13C提供针对Daudi细胞的细胞毒性检定结果。每张分图提供比较ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的细胞毒性和Control-gdT细胞的细胞毒性的结果。测试了来自三个不同供体的新鲜PBMC的细胞群：图13A：供体1；图13B：供体2；和图13C：供体3。
图14A-14C提供针对Raji细胞的细胞毒性检定结果。每张分图提供比较ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的细胞毒性和Control-gdT细胞的细胞毒性的结果。测试了来自三个不同供体的经冷冻保存的PBMC的细胞群：图14A：供体1；图14B：供体2；和图14C：供体3。
图15A-15C提供针对Daudi细胞的细胞毒性检定结果。每张分图提供比较ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)细胞的细胞毒性和Control-gdT细胞的细胞毒性的结果。测试了来自三个不同供体的经冷冻保存的PBMC的细胞群：图15A：供体1；图15B：供体2；和图15C：供体3。
图16A-16B显示细胞群在不同培养天数时的总细胞数。图16A：第1批次；图16B：第2批次。
图17A-17B提供针对Raji细胞的细胞毒性检定结果。每张分图提供比较在5vol％HPL或20vol％HPL中培养的细胞群的细胞毒性的结果。图17A：Control-gdT细胞；图17B：ACE-gdT细胞-CD20(利妥昔单抗，rituximab)。
图18A-18B是显示在G-Rex(透气性)或T-培养瓶(不透气性)中培养的细胞群的细胞总数(图18A)和细胞活性(图18B)的折线图。
图19A-19C提供小鼠模型研究的结果，其证明Control-gdT细胞和ACE-gdT细胞-CD20的抗肿瘤活性。图19A提供小鼠体内肿瘤细胞的萤光图像。图19B提供统计分析。图19C提供存活率曲线。
备注：「ET」、「ET比」、「E：T」、和「E：T比」等效地用来表示效应细胞(「E」)与目标细胞(「T」)的比例。
【实施方式】
如本领域内所理解的，T淋巴细胞或T细胞是在细胞介导的免疫中起核心作用的免疫细胞。T细胞在细胞表面表达CD3和T细胞受体(TCR)，并且可以通过其不同的TCR表面表达分为不同的亚型。
「Alpha beta T细胞」、「abT细胞」、或「αβT细胞」为同义词，代表同时表达TCR-α链和TCR-β链的T细胞亚群。「Gamma delta T细胞」、「gdT细胞」、或「γδT细胞」为同义词，代表在细胞表面同时表达TCR-γ链(例如：Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、或Vγ11)和TCR-δ链(例如：Vδ1、Vδ2、Vδ3、或Vδ5)的T细胞亚群(请见Pistoia等人，2018，Front Immunol.9：984.；WO2020117862A1)。abT细胞的活化是MHC/HLA依赖性的；而gdT细胞与先天免疫细胞相似并且可以以不依赖MHC的方式，在不需要抗原加工的情况下被活化。
每条TCR链包含一可变(V)区、一恒定(C)区、一跨膜区和一细胞质尾端。V区包含一个抗原结合位点。人类gdT细胞有两种主要的亚型：一种在周边血液中占多数，其主要表达delta可变2链(delta variable 2chain，Vδ2)，而另一种在非造血组织中占多数，其主要表达delta可变1(delta variable 1，Vδ1)链。Vδ2gdT细胞通常会共表达Vγ9且占周边gdT细胞的50-95％。
GdT细胞可以浸润到肿瘤中并杀死多种肿瘤细胞，包含固态肿瘤和造血组织肿瘤(hematopoietic tumors)。已经在如皮肤癌、B细胞淋巴瘤、前列腺癌、黑色素瘤、和间质性神经胶质母细胞瘤等不同肿瘤中观察到gdT细胞的抗肿瘤功能。已在各个方面观察到gdT细胞的抗肿瘤活性。一方面，已知gdT细胞为压力感应器，其识别非常规性的抗原，包含由恶性细胞所表达的应激分子和非胜肽类的代谢物。例如，gdT细胞可以表达自然杀手第2群成员D(natural killer group 2member D，NKG2D)，同时因为转化是一种诱导NKG2D配体表达的细胞压力，gdT细胞上的NKG2D与NKG2D配体(例如MHC I类多肽相关序列A(MICA))之间的结合，会引起对转化细胞的靶向特异性杀伤。除了NKG2D以外，一些其他NK受体的表达也被证明会参与肿瘤识别并活化gdT细胞的抗癌功能，包含CD226(DNAM-1)、自然细胞毒性触发受体3(natural cytotoxicity-triggering receptor 3，NCR3；NKp30)、和NCR2(NKp44)。
除此之外，人类gdT细胞表达CD16并参与诱导抗体依赖性细胞毒杀作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。gdT细胞上表达如TNF-相关雕亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)和Fas配体(FASL)等的肿瘤坏死因子(TNF)受体也可以杀死肿瘤细胞。gdT细胞的抗肿瘤活性也反映于细胞激素的产生。gdT细胞产生的促炎性细胞激素(Proinflammatory cytokines)，如IFNγ和TNFα，可以通过诱导位于肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合物(MHC)分子或影响其他免疫细胞进一步活化抗肿瘤免疫。细胞毒性分子如颗粒酶(granzymes)(例如颗粒酶B(granzyme B))和穿孔蛋白(perforin)的上调可以直接杀死肿瘤细胞。gdT细胞可以促进B细胞产生具有抗肿瘤功效的IgE。因此，gdT细胞，特别是具有类NK(NK-like)特性的gdT细胞，在癌症免疫疗法中有很大的前景。
人类gdT细胞正常来说仅占循环T淋巴细胞的1-5％。尽管人们的兴趣增加，但以gdT细胞为基础的癌症免疫疗法在仅取得的有限的临床成功(Yazdanifar等人，2020，Cells.9(5)：1305；Kabelitz等人，2020.Cell Mol Immunol.17(9)：925-939；Wu等人，Int JBiol Sci.10(2)：119-35)。其中的一个限制因素为目前可用来扩增gdT细胞的方法要么太耗时，要么无法有效地取得具有足够数量、纯度和/或效力的gdT细胞。因此，需要用来选择性扩增具有有效抗肿瘤活性的特定gdT细胞亚群的方法。
本文提供能有效生产富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群或医药组合物的方法。本文提供的细胞群中的gdT细胞具有高细胞毒性活性并在治疗某些疾病和病症，如癌症、传染病和自身免疫性疾病中有巨大的治疗潜力。
在进一步描述本公开之前，应当理解的是本公开不限于本文中阐述的特定实施例，同时还应当理解的是本文中使用的术语是为了描述特定实施例，而非意图进行限制。
除非本文中另外进行定义，本公开中使用的科学和技术术语应具有本领域中具有通常知识者一般理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，且复数术语应包含单数。一般而言，本文中描述涉及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学和杂交结合时所使用的专业术语和技术是本领域熟知的且常用的那些。
5.1生产方法
本文提供制造富含gdT细胞的细胞群的方法，包含在添加有(i)一磷酸抗原(phosphoantigen)、(ii)一细胞激素和(iii)人类血小板裂解物(human plateletlysate，「HPL」)的培养基中培养一来源细胞群(source cell population)。在一些实施例中，所述培养在足以活化和扩增gdT细胞的条件下进行。在一些实施例中，所述培养于离体(ex vivo)进行。在一些实施例中，所述培养在体外(in vitro)进行。
如本文所用，「来源细胞群(source cell population)」一词是指通过直接从合适的来源分离所获得的多个细胞。所述来源可以是天然来源。例如，所述来源细胞群可以是人类周边血液或非造血组织(non-hematopoietic issue)。随后可以离体培养所述来源细胞群以制备所需细胞群。例如，可以通过各种培养技术和/或针对特定细胞类型的负向或正向选汰将一来源细胞群纯化至同质(homogeneity)、大体上同质、或去除一种或多种细胞类型(例如，abT细胞)。还可以培养一来源细胞群以富集特定的亚群。如本文所用，「富含gdT细胞」的细胞群具有比该细胞群分离源头的来源细胞群更高百分比的gdT细胞。在一些实施例中，富含gdT细胞的细胞群能具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的gdT细胞。富含gdT细胞的细胞群也可以具有少于50％的gdT细胞，只要gdT细胞的百分比比该细胞群分离源头的来源细胞群高。
本文提供的方法包含在条件下培养来源细胞群达足够的时间以产生富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群。在本文提供的方法的一些实施例中，培养细胞群至少4天，例如至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少18天、至少21天、至少28天、或更长，例如约30天、约35天、约40天、约45天，或约50天。在一些实施例中，所述方法包含培养细胞群至少7天，例如至少10天、至少11天、至少14天、或至少16天。在本文提供的方法的一些实施例中，培养细胞群4到40天、7到35天、7到28天、或7到21天、7到18天、10到30天、12到20天、或14到18天。在一些实施例中，培养细胞群4到25天。在一些实施例中，培养细胞群1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40天。在一些实施例中，培养细胞群4、7、10、12、14、17、22、或25天。在一些实施例中，细胞群可以培养12天。细胞群可以培养13天。细胞群可以培养14天。细胞群可以培养15天。细胞群可以培养16天。细胞群可以培养17天。细胞群可以培养18天。细胞群可以培养19天。细胞群可以培养20天。细胞群可以培养约25天。细胞群可以培养约30天。细胞群可以培养约35天。细胞群可以培养约40天。细胞群可以培养约45天。细胞群可以培养约50天。
已知TCRα/βT细胞或abT细胞在过继细胞疗法中会导致移植物抗宿主反应。从移植细胞群中排除abT细胞可减少或防止在过继细胞治疗中产生移植物抗宿主反应(GvHD)。在一些实施例中，本文提供的方法还包含去除abT细胞。可以在培养过程中的不同时间点去除abT细胞。在一些实施例中，在培养开始时去除abT细胞。在一些实施例中，在培养结束时去除abT细胞。在一些实施例中，在培养的前半段去除abT细胞。在一些实施例中，在培养的后半段去除abT细胞。在来源细胞群具有相对较少的T细胞的情况下，去除abT细胞前让所有细胞先扩增几天可能是有益的。在一些实施例中，在第2天或之后、第3天或之后、第4天或之后、第5天或之后、或第6天或之后去除abT细胞。此外，在abT细胞的百分比达到某个阈值之前去除abT细胞可以帮助gdT细胞达到最有效的扩增。因此，在一些实施例中，在abT细胞达到细胞群的30％、25％、20％、15％、12％、10％、9％、或8％前去除abT细胞。申请人发现一般来说，如果不去除，abT细胞的百分比会在培养的前20天增加。因此，在一些实施例中，在培养的第14天前、第12天前、第10天前、第9天前、第8天前、或第4天前去除abT细胞。在一些实施例中，在培养时间约一半时去除abT细胞。例如，在一些实施例中，培养细胞30到40天且在第18天和第25天之间去除abT细胞。在一些实施例中，培养细胞14到18天且在第4天和第10天之间去除abT细胞。在一些实施例中，培养细胞约14到18天，在第6天或第7天去除abT细胞。在一些实施例中，在第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18天时去除abT细胞。在一些实施例中，在第7、8、9、10、12、14、或16天时去除abT细胞。在一些实施例中，在第4、5、6、7、或8天时去除abT细胞。在一些实施例中，在第6天去除abT细胞。在一些实施例中，在第7天去除abT细胞。在一些实施例中，在第8天去除abT细胞。在一些实施例中，细胞群在去除了abT细胞后又培养了3-25天。在一些实施例中，去除abT细胞后，细胞群又培养了3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25天。
用于本文所述方法的培养基可以添加(i)一磷酸抗原。如本领域所理解的，「磷酸抗原」是T细胞的促效剂，更具体地来说是gdT细胞的促效剂，其活性取决于磷酸部分(phosphate moiety)的存在。本领域也知道某些磷酸抗原可以特异性地活化gdT细胞。(Espinosa等人，Microbes and Infections 2001；Belmant等人，Drug discovery today2005；US20100189681A1)。在一些实施例中，磷酸抗原是双磷酸盐(bisphosphonate)。在一些实施例中，本文所述方法中使用的双磷酸盐(bisphosphonate)是选自由氯磷酸盐(clodranate)、依替磷酸盐(etidronate)、阿仑磷酸盐(alendronate)、帕米磷酸盐(pamidronate)、唑来磷酸盐(zoledronate(唑来磷酸(zoledronic acid))、奈立磷酸盐(neridronate)、伊班磷酸盐(ibandronate)、和帕米磷酸盐(pamidronate)所组成的群组。在一些实施例中，本文所述方法中使用的双磷酸盐是唑来磷酸盐(zoledronate)。
在一些实施例中，用于本文所述方法中的磷酸抗原选自由焦磷酸溴代醇(bromohydrin pyrophosphate，BrHPP)、4-羟基-丁-2-烯基焦磷酸(4-hydroxy-but-2-enylpyrophosphate，HMBPP)、异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)、和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)所组成的群组。
磷酸抗原以0.1-20μM的浓度添加到培养基中。在一些实施例中，磷酸抗原以约0.1、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、11.5、12、13、13.5、14、15、16、17、18、或19μM的浓度添加。在一些实施例中，添加约0.1μM的磷酸抗原。可添加约0.5μM的磷酸抗原。可添加约1μM的磷酸抗原。可添加约1.5μM的磷酸抗原。可添加约2μM的磷酸抗原。可添加约3μM的磷酸抗原。可添加约4μM的磷酸抗原。可添加约5μM的磷酸抗原。可添加约6μM的磷酸抗原。可添加约7μM的磷酸抗原。可添加约8μM的磷酸抗原。可添加约9μM的磷酸抗原。可添加约10μM的磷酸抗原。可添加约12μM的磷酸抗原。可添加约15μM的磷酸抗原。可添加约18μM的磷酸抗原。可添加约20μM的磷酸抗原。磷酸抗原可以是本文公开的或其他本领域已知的任何磷酸抗原。
在一些实施例中，本文所述方法中使用的磷酸抗原是唑来磷酸盐(zoledronate)，其以0.1-20μM的浓度添加于培养基中。在一些实施例中，唑来磷酸盐(zoledronate)以约0.1、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、11.5、12、13、13.5、14、15、16、17、18、或19μM的浓度添加。在一些实施例中，添加约0.1μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约0.5μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约1μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约1.5μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约2μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约3μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约4μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约5μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约6μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约7μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约8μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约9μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约10μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约12μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约15μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约18μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。可以添加约20μM的唑来磷酸盐(zoledronate)。
用于本文所述方法的培养基可以添加(ii)一细胞激素。细胞激素包括间白素、淋巴激素、干扰素、群落刺激因子和趋化因子。在一个实施例中，细胞激素选自由间白素-2(IL-2)、间白素-4(IL-4)、间白素-6(IL-6)、间白素-7(IL-7)、间白素-8(IL-8)、间白素-9(IL-9)、间白素-12(IL-12)、间白素-15(IL-15)、间白素-18(IL-18)、间白素-21(IL-21)、间白素-33(IL-33)、类胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、间白素-1b(IL-1b)、干扰素-γ(IFN-g)和基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)。在对培养中的gdT细胞促进类似的生理作用的能力方面，与细胞激素具有相同活性的化合物也可以用于本文公开的方法中，包括例如细胞激素的模拟物(cytokinemimetics)。
在一些实施例中，细胞激素可以是IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-33、或其任合组合。在一些实施例中，细胞激素是IL-2。
在一些实施例中，可以使用不只一种细胞激素。可以同时添加多种细胞激素到培养基里或在不同时间点添加。在本文公开的方法的一些实施例中，在培养过程中可以将至少含有两种不同细胞激素的组合物添加到培养基里。在本文公开的方法的一些实施例中，培养基可以在开始培养时添加第一细胞激素然后在培养期间的稍后时间点添加第二细胞激素。第一和第二细胞激素可以各自独立地选自由间白素、淋巴激素、干扰素、群落刺激因子和趋化因子所组成的群组。在一些实施例中，第一和第二细胞激素可以各自独立地选自由IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、和IL-33所组成的群组。
用于本文所述方法的细胞激素可以是人或动物来源的。在一些实施例中，细胞激素是人源的。它可以是野生型蛋白质，或能维持野生型蛋白质活性之任何生物活性片段或变体，其能对培养中的gdT细胞促进类似的生理作用。细胞激素可以是可溶形式，融合或复合于另一分子，例如胜肽、多肽或生物活性蛋白质。在一些实施例中，使用人类重组细胞激素。
在一些实施例中，本文公开的方法包含使用添加了浓度在1-10000U/ml范围间的细胞激素的培养基。在一些实施例中，细胞激素浓度可以介于100-1000U/ml。在一些实施例中，培养基中添加的细胞激素浓度为100-2500IU/mL。在一些实施例中，培养基中添加的细胞激素浓度为200-3000IU/mL。在一些实施例中，细胞激素的添加浓度为约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、或约3000IU/mL。在一些实施例中，细胞激素的添加浓度约为100IU/mL。可以添加浓度约为200IU/mL的细胞激素。可以添加浓度约为350IU/mL的细胞激素。可以添加浓度约为500IU/mL的细胞激素。可以添加浓度约为700IU/mL的细胞激素。可以添加浓度约为1000IU/mL的细胞激素。可以添加浓度约为1500IU/mL的细胞激素。可以添加浓度约为2000IU/mL的细胞激素。
本领域中具有通常知识者应当理解，可以使用不同的单位来表征培养基里细胞激素的浓度。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为0.0612-1.53μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为0.05-5μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，添加浓度为约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9μg、约2.0μg、约2.2、约2.4、约2.6、约2.8、约3.0、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.2、约4.4、约4.6、约4.8、或约5.0μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，添加约0.1μg/mL的细胞激素。可以添加约0.2μg/mL的细胞激素。可以添加约0.3μg/mL的细胞激素。可以添加约0.4μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，添加约0.5μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，添加约1.0μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，添加约1.5μg/mL的细胞激素。在一些实施例中，添加约2μg/mL的细胞激素。
细胞激素可以是本文公开的或其他本领域已知的任何细胞激素。当使用至少两种细胞激素时，细胞激素以约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、或约3000IU/mL的总浓度添加到培养基内。在一些实施例中，细胞激素于培养基内添加的总浓度为约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9μg、约2.0μg、约2.2、约2.4、约2.6、约2.8、约3.0、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.2、约4.4、约4.6、约4.8、或约5.0μg/mL。
在一些实施例中，使用IL-2，并且本文公开的方法包含使用添加有浓度范围在1-10000U/ml之间的IL-2的培养基。在一些实施例中，IL-2的浓度范围可为100-1000U/ml。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为100-2500IU/mL的IL-2。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为200-3000IU/mL的IL-2。在一些实施例中，IL-2的添加浓度为约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、或约3000IU/mL。在一些实施例中，IL-2的添加浓度为约100IU/mL。可以添加浓度约为200IU/mL的IL-2。可以添加浓度约为350IU/mL的IL-2。可以添加浓度约为500IU/mL的IL-2。可以添加浓度约为700IU/mL的IL-2。可以添加浓度约为1000IU/mL的IL-2。可以添加浓度约为1500IU/mL的IL-2。可以添加浓度约为2000IU/mL的IL-2。
本领域中具有通常知识者应当理解，可以使用不同的单位来表征培养基中IL-2的浓度。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为0.0612-1.53μg/mL的IL-2。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为0.05–5μg/mL的IL-2。在一些实施例中，添加浓度为约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9μg、约2.0μg、约2.2、约2.4、约2.6、约2.8、约3.0、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.2、约4.4、约4.6、约4.8、或约5.0μg/mL的IL-2。在一些实施例中，添加约0.1μg/mL的IL-2。可以添加约为0.2μg/mL的IL-2。可以添加约为0.3μg/mL的IL-2。可以添加约为0.4μg/mL的IL-2。在一些实施例中，添加约0.5μg/mL的IL-2。在一些实施例中，添加约1.0μg/mL的IL-2。在一些实施例中，添加约1.5μg/mL的IL-2。在一些实施例中，添加约2μg/mL的IL-2。
在本文所述的方法中使用的培养基可以添加(iii)HPL。HPL可购自StemCellTechnologies、Sigma Aldrich、Millipore等处。HPL可以0.5-30vol％的浓度添加到培养基内。在一些实施例中，HPL的添加浓度为1-20vol％。在一些实施例中，HPL的添加浓度为5-20vol％。在一些实施例中，HPL的添加浓度为5-15vol％。在一些实施例中，在培养基中添加浓度为约0.5％、约1％、约1.5％、约1.6％、约2％、约2.5％、约2.6％、约3％、约3.5％、约3.6％、约4％、约4.5％、约4.6％、约5.0％、约5.1％、约5.5％、约5.6％、约6％、约6.1％、约6.5％、约6.6％、约7％、约7.1％、约7.5％、约7.6％、约8％、约8.1％、约8.5％、约8.6％、约9％、约9.1％、约9.5％、约9.6％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、或约30％(体积百分比、vol％、或％(v/v))的HPL。在一些实施例中，HPL以约5％的浓度添加到培养基中。HPL的浓度可为约2％。HPL的浓度可为约3％。HPL的浓度可为约4％。HPL的浓度可为约6％。HPL的浓度可为约7％。HPL的浓度可为约8％。HPL的浓度可为约9％。HPL的浓度可以约为10％。HPL的浓度可为约12％。HPL的浓度可为约15％。HPL的浓度可为约18％。HPL的浓度可为约20％。HPL的浓度可为约25％。HPL的浓度可为约30％。
在一些实施例中，用于本文所述方法的培养基可以不含血清(serum-free)。在一些实施例中，培养基可为血清替代培养基(serum replacement medium)，例如化学成分确定的培养基，其可避免人或动物来源血清的使用。在不含血清的培养基中培养的样品具有避免了过滤、沉淀、污染和血清供应等问题的优势。
有许多适用于gdT细胞增殖的基础培养基，例如Iscoves培养基和RPMI-1640(可购自Gibco、Sigma Aldrich、Biological Industries、STEMCELL Technologies、LifeTechnologies等处)、AIM-V、X-VIVO 10、X-VIVO 15或X-VIVO 20(Lonza)。培养基可以添加如本文定义的其他培养基因子。本文所述方法中使用的培养基可以进一步包含对gdT细胞的扩增和/或活性有用的其他成分。可以添加的其他成分的例子包含但不限于经纯化的蛋白质如白蛋白、脂质来源如低密度脂蛋白(LDL)、维生素、氨基酸、类固醇和任何其他支持或促进细胞生长和/或存活的添加物。
在一些实施例中，用于本文所述方法的培养基包含浓度为600-5000mg/L的葡萄糖。培养基可具有约500mg/L至约1000mg/L、约500mg/L至约1500mg/L、约500mg/L至约2000mg/L、约750mg/L至约1000mg/L、约750mg/L至约1500mg/L、约750mg/L至约2000mg/L、约1000mg/L至约1500mg/L、约1000mg/L至约2000mg/L、1000mg/L至3000mg/L、或1000mg/L至4000mg/L的葡萄糖含量。在一些实施例中，细胞可以维持在葡萄糖含量约为1250mg/L的培养基中。在一些情况下，例如在维持高细胞密度培养物的情况下，细胞可以维持在具有葡萄糖含量为约1000mg/L至约5000mg/L、约1000mg/L至约4000mg/L、约2000mg/L至约5000mg/L、或约2000mg/L至约4000mg/L的培养基中。在一些实施例中，培养基包含浓度为700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、或4900mg/L的葡萄糖。
在本文所述的方法的一些实施例中，在培养过程中可以更换培养基。如本领域已知的，更换培养基是指移除培养装置中老旧培养基并添加新鲜培养基的过程。可以半量更换培养基。也可以将培养基全部更换。培养基可以每周更换一次、每周两次、每周三次、每隔一天或每天。在一些实施例中，可以每两天或每三天更换一次培养基。
在一些实施例中，在培养期间用新鲜培养基重新接种细胞。一般来说，重新接种的细胞为经稀释或调整到能支持进一步扩增的密度。在培养过程中可以重新接种细胞一次或数次。在一些实施例中，可以每周一次、每周两次、每周三次、每隔一天、或每天重新接种细胞。在一些实施例中，培养过程中细胞可以重新接种至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、或至少五次。在一些实施例中，每两天或每三天重新接种细胞。整个培养周期可以包含在某些日子更换培养基以及在不同的日子重新接种细胞。在一些实施例中，将细胞密度调整到约0.5×106至约1×106个细胞/mL、约0.5×106至约1.5×106个细胞/mL、约0.5×106至约2×106个细胞/mL、约0.75×106至约1×106个细胞/mL、约0.75×106至约1.5×106个细胞/mL、约0.75×106至约2×106个细胞/mL、约1×106至约2×106个细胞/mL、或约1×106至约1.5×106个细胞/mL、约1×106至约2×106个细胞/mL、约1×106至约3×106个细胞/mL、约1×106至约4×106个细胞/mL、约1×106至约5×106个细胞/mL、约1×106至约10×106个细胞/mL、约1×106至约15×106个细胞/mL、约1×106至约20×106个细胞/mL、或约1×106至约30×106个细胞/mL的范围。作为常规实践，本领域中具有通常知识者能够优化培养基的更换程序(频率、时间、更换的量等)。
一般来说，在更换培养基或重新接种时，新鲜培养基中添加了与开始培养时所使用培养基的相同的成分，包含磷酸抗原(例如唑来磷酸盐(zoledronate))、细胞激素(例如IL-2)和HPL。在本文所述方法的一些实施例中，用于培养基更换或重新接种的新鲜培养基不添加唑来磷酸盐(zoledronate)。在本文所述方法的一些实施例中，磷酸抗原(例如，唑来磷酸盐(zoledronate))仅于培养起始时使用的培养基中添加。在本文所述方法的一些实施例中，在接近培养结束时使用的培养基中不添加磷酸抗原(例如，唑来磷酸盐(zoledronate))。例如，在一些实施例中，在培养周期的最后一天、最后两天、最后三天、最后四分之一、最后三分之一或后一半所使用的培养基中不添加磷酸抗原(例如唑来磷酸盐(zoledronate))。在本文所述方法的一些实施例中，该实施例包含去除abT细胞时，abT去除之前使用添加有磷酸抗原(例如唑来磷酸盐(zoledronate))的培养基，但在abT去除之后不添加。
在本文所述方法的一些实施例中，在培养过程中补充细胞激素(例如，IL-2)。可以在非更换培养基或重新接种的日子补充细胞激素(例如，IL-2)。在一些实施例中，细胞激素(例如，IL-2)可以每周补充一次、每周两次、每周三次、每隔一天或每天补充。
在一些实施例中，在培养期间，细胞培养在37℃含有5％CO 2的潮湿环境里的合适的培养基中。
出于说明目的，本文所述方法包含培养细胞16天并包含以下程序：
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如说明，在示范性的16天培养程序中，在第6天去除abT细胞。完全培养基添加有细胞激素(例如350或700IU/mL的IL-2)、磷酸抗原(例如1μM的唑来磷酸盐(zoledronate))、和HPL(例如5vol％)。细胞激素大约每天或每隔一天藉由直接补充、培养基更换或重新接种来添加，而磷酸抗原(例如，1μM的唑来磷酸盐(zoledronate))仅添加于abT去除前的培养基。作为常规实践，本领域中具有通常知识者应当理解，所阐述的程序可以修改和进一步优化。
包含gdT细胞的来源细胞群可以从多种样品中取得。在一些实施例中，样品为造血组织样品或其部分(即，来源细胞群由造血组织样品或其部分获得)。造血组织样品包含血液(例如周边血液或脐带血)、骨髓、淋巴组织、淋巴结组织、胸腺组织、及其部分或经富集的部分。在一些实施例中，样品是血液样品。在一些实施例中，来源细胞群可以从脐带血或其部分获得。在一些实施例中，来源细胞群可以从周边血液或其部分获得。在一些实施例中，来源细胞群可以从周边血液的部分获得，例如肤色血球层细胞、白细胞分离术(leukapheresis)产物、周边血单核细胞(PBMC)和低密度单核细胞(LDMC)。在一些实施例中，来源细胞群包含PBMC。在一些实施例中，样品是人类血液或其部分。可以使用本领域已知的技术例如密度梯度离心从血液样品中获得细胞。PBMC可以由个体身上采集，例如，使用血液成份分离机(apheresis machine)，例如Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare)系统。
在一些实施例中，来源细胞群可以从非造血组织样品中获得。非造血组织是血液、骨髓、淋巴组织、淋巴结组织、或胸腺组织以外的组织。在一些实施例中，来源细胞群不是从特定类型的生物液体样品，例如血液或滑液获得。非造血组织包含但不限于来自肠胃道(例如结肠或肠道)、乳腺、肺、前列腺、肝脏、脾脏、胰腺、子宫、阴道和其他皮肤、黏膜或浆膜的组织。从非造血组织样品中获得来源细胞群的方法是本领域已知的。例如，可以通过在合成支架上培养非造血组织样品来从非造血组织样品中获得来源细胞群，所述合成支架经配置能促进细胞从非造血组织样品中排出。
GdT细胞也可以存在于癌症组织样品中。在一些实施例中，来源细胞群可从人类癌症组织样品(例如，血液癌症组织或固态肿瘤组织)中获得。癌症组织样品可以是例如乳腺或前列腺的肿瘤。在其他实施例中，来源细胞群可以来自人类癌症组织以外的样品(例如，不含有大量肿瘤细胞的组织)。例如，来源细胞群可以来自与附近或邻近的癌症组织分开的健康组织区域。
来源细胞群可以从人类或非人类的动物组织中获得。在一些实施例中，本文所述的方法进一步包含从人类或非人类的动物组织中获得来源细胞群。在一些实施例中，样品从人类获得。在一些实施例中，样品从非人类的动物个体中获得。
在一些实施例中，根据本文公开的方法制备的细胞群用于移植。因此，在一些实施例中，本文所述的方法还包含从供体中获得来源细胞群。在一些实施例中，供体是人类。供体可以是健康的人类。供体可以是患病的人类。在一些实施例中，移植的接受者是人类。移植可以是自体移植。移植可以是异体移植。如本领域理解的，「自体」一词当用于指材料时意味着该材料源自其稍后将被重新导入的同一个体；而「异体」一词当用于指材料时是指该材料是源自同一物种不同个体的移植物。在一些实施例中，来源细胞群从自体供体中获得。在一些实施例中，来源细胞群从异体供体中获得。在一些实施例中，来源细胞群从健康的异体供体中获得，并且将使用本文所述方法制备的细胞群用于癌症患者的移植。
在一些实施例中，来源细胞群可以从新鲜制备的样品中获得。来源细胞群也可以从冷冻保存的样品中获得，该冷冻样品在用本文公开的方法培养的当前立时解冻。可以使用37℃的水浴解冻冷冻保存的PBMC。
在一些实施例中，来源细胞群包含PBMC，并且本文所述的方法包含从供体的周边血液中获得PBMC。供体可为自体供体。供体可为异体供体。PBMC可以是新鲜制备的。PBMC也可以为冷冻保存且在当成本文公开方法中的来源细胞群使用的当前立时解冻。
在一些实施例中，本文提供的方法可以在培养期间将来源细胞群中的gdT细胞扩增至少1,000倍。在一些实施例中，在培养期间gdT细胞扩增了至少500倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少15,000倍、至少20,000倍、至少30,000倍、至少40,000倍、至少50,000倍、至少60,000倍、至少70,000倍、至少80,000倍、或至少100,000倍。在一些实施例中，来源细胞群源自单一供体。在一些实施例中，来源细胞群源自超过一个或多个供体(例如，2、3、4、5、或来自2-5、2-10、或5-10个供体，或更多)。在一些实施例中，通过本文提供的方法产生的细胞群包含来自少至一个供体的临床相关数量(至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、或至少1012、或从约107到约1012)的gdT细胞。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得的来源细胞群的时间起的少于40天内(例如，约30天、约20天、约2周、或约1周)提供临床相关数量(例如，至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、或至少1012、或从约107到约1012)的gdT细胞。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得来源细胞群的时间起的少于30天内提供临床相关数量的gdT细胞。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得来源细胞群的时间起的少于20天内提供临床相关数量的gdT细胞。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得来源细胞群的时间起的约2周内(例如，14-18天)提供临床相关数量的gdT细胞。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得来源细胞群的时间起的16天内提供临床相关数量的gdT细胞。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得来源细胞群的时间起的16天内提供有至少108、至少109、至少1010、或至少1011个gdT细胞的细胞群。在一些实施例中，本文所述的方法可以在从单一供体获得来源细胞群的时间起的16天内提供至少1010个gdT细胞。
在一些实施例中，本文提供的扩增gdT细胞的方法可以包含倍增时间小于5天的群体。在一些实施例中，gdT细胞在培养期间的倍增时间可以小于4.5天、小于4.0天、小于3.9天、小于3.8天、小于3.7天、小于3.6天、小于3.5天、小于3.4天、小于3.3天、小于3.2天、小于3.1天、小于3.0天、小于2.9天、小于2.8天、小于2.7天、小于2.6天、小于2.5天、小于2.4天、小于2.3天、小于2.2天、小于2.1天、小于2.0天、小于46小时、小于42小时、小于38小时、小于35小时、小于32小时、小于30小时、小于29小时、小于28小时、小于27小时、小于26小时、小于25小时、小于24小时、小于23小时、小于22小时、小于21小时、小于20小时、小于19小时、小于18小时、小于17小时、小于16小时、小于15小时、小于14小时、小于13小时，或小于12小时。
本文提供的方法会造成gdT细胞在细胞群内的富集。在一些实施例中，产生的细胞群至少50％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、或至少90％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少75％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少80％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少85％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少90％是gdT细胞。在一些实施例中，产生的细胞群至少95％是gdT细胞。
Tab细胞具有高反应性并且会引起移植物抗宿主疾病，因此本文提供的适合用来施用于患者的细胞群仅含有低量的abT细胞。在一些实施例中，本文提供的方法产生的细胞群具有少于约10％的abT细胞，例如少于约5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、或0.05％的abT细胞。在一些实施例中，利用本文描述的方法制备的细胞群含有少于约1％的abT细胞。
细胞表面标志物表达的增加或减少可以额外地或替代性地用来表征通过本文描述的方法制备的细胞群，包括例如CD69。在一些实施例中，通过本文所述方法制备的细胞群相较于扩增前的来源群体，较大百分比的gdT细胞表达CD69。例如，在一些实施例中，通过本文所述的方法制备的细胞群的gdT细胞超过约30％，例如超过约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％表达CD69。在一些实施例中，通过本文所述方法制备的细胞群相较于来源细胞群具有较高的CD69平均表达。在一些实施例中，通过本文所述方法制备的细胞群表达低水平的PD-1和/或TIM-3。关于表面标志物的更多详细信息描述于下方的第5.2节中。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包含在产生的细胞群的细胞表面加上靶向部分。如本文所用的靶向部分与目标细胞上的生物标志物建立特异性的结合。在一些实施例中，靶向部分藉由与靶向部分接合的第一连结子和与细胞接合的第二连结子之间的相互作用复合于细胞表面。在一些实施例中，靶向部分作为例如嵌合抗原受体(「CAR」)或T细胞受体(「TCR)等受体蛋白的细胞外结构域外源性地表达于本文提供的gdT细胞的表面。因此，在一些实施例中，本文提供的方法进一步包含将编码CAR或TCR的核酸导入gdT细胞中。更多细节请参阅下文第5.2.1至5.2.3节。
在本文所述方法的一些实施例中，细胞培养在可透气性装置中。可透气性装置或可透气性细胞培养装置是配备着可透气表面的组织培养容器。在一些实施例中，细胞可以接种在这种可透气表面上。在一些实施例中，可透气性装置是G-Rex装置。如本领域已知的，G-Rex装置是在底部具有可透气性薄膜的细胞培养瓶，其支持大体积的培养基而不影响气体交换(Bajgain等人，2014，Molecular Therapy-Methods&Clinical Development，14015)。在一些实施例中，可透气性装置可以是生物反应器。在一些实施例中，生物反应器可以是WAVE生物反应器。在一些实施例中，生物反应器可以是搅拌槽生物反应器。
目前本领域中用来扩增gdT细胞的一些方法包含用滋养细胞或来自微生物病原体的抗原(例如某些细菌成分)培养gdT细胞的步骤。滋养细胞可以是异体的PBMC、或经转化的细胞(例如，EBV转化的淋巴母细胞细胞系)，或两者兼而有之。细菌成分可以是，例如，结核分枝杆菌低分子胜肽抗原(Mycobacterium tuberculosis low molecular peptideantigen，Mtb-Ag)、葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A，SEA)和链球菌蛋白A(Streptococcal protein A)。使用滋养细胞或致病成分对细胞的接受者造成潜在风险。因此，在临床给药之前确保去除可能对潜在移植接受者有害的滋养细胞、细菌成分或任何外来物质是至关重要的。滋养细胞必须平行培养并在使用前照射辐射；如果辐射照射不足，滋养细胞可能会超过gdT细胞的生长，从而污染细胞制造。没有任何滋养细胞和微生物病原体的离体培养是有优势的，因为它简化了培养过程。同时，较少的处理降低了在培养过程中引入污染的风险。因此，在不使用滋养细胞或微生物病原体的情况下生产临床相关数量的gdT细胞是更具成本效益且更安全的。本文提供的方法能够产生临床相关数量具有足够活性的gdT细胞，且无需使用滋养细胞或微生物病原体。因此，在一些实施例中，本文提供的方法没有使用滋养细胞或微生物病原体(如细菌成分)来刺激gdT细胞的增生和/或活性。
一些离体富集gdT细胞的方法包含正向选汰gdT细胞。如本领域所理解的，正向选汰是指涉及使用所需细胞群的正向特征(例如表面标志物的表达)来选择目标细胞的过程。舍弃不具有这种正向特征的细胞。例如，对细胞群中gdT细胞的正向选汰可以使用，例如，与针对TCRVδ2+的抗体接合的珠子来捕获gdT细胞。舍弃未结合的细胞。正向选汰可用来制备具有高纯度所需细胞种类的细胞群。然而，额外的正向选汰步骤和所需细胞种类(例如，gdT)的连带损失也可能包含产生的细胞群的质量。本文提供的方法可以在不使用正向选汰的情况下制备具有高纯度gdT细胞的细胞群。因此，在一些实施例中，本文提供的方法不包含对gdT细胞的正向选汰。在一些实施例中，本文提供的方法不包含任何正向选汰。
图1A提供本文所述方法的示范性程序，包含：(S11)在装置中，于添加有磷酸抗原、第一细胞激素和(iii)HPL的培养基中培养细胞群；(S12)从细胞群中去除abT细胞；和(S13)在没有来自培养基的磷酸抗原的情况下培养细胞群至少一天。
图1B也提供本文所述方法的示范性程序，包含：(1)第1天：在可透气性培养装置中，在添加有0.1-20μM唑来磷酸盐(zoledronate)和200-3000IU/ml IL-2的完全生长培养基中接种5-200×106个PBMC；(2)第2天和第4天：对培养基补充100-2500IU/ml的IL-2；(3)第6天：去除abT细胞并将剩余的细胞重新接种到添加有100-2500IU/ml IL-2的完全生长培养基中；(4)第7-13天：每隔一天于培养基中补充100-2500IU/ml的IL-2，并根据需求重新接种细胞；和(5)第14天：将培养基换成完全生长培养基。
如本领域中具有通常知识者应当理解的，本文公开的方法的各个方面存在多种组合和排列。这些组合和排列明确地涵盖于本公开的范围内。
5.2富含gdT细胞的细胞群
本文还提供通过本文所述方法获得的细胞群。本文公开的细胞群富含具有类NK特性的gdT细胞，如某些生物标志物的表达所示。在一些实施例中，本文提供的是脊椎动物细胞群。在一些实施例中，本文提供的是哺乳动物细胞群。在一些实施例中，本文提供的细胞群是人类细胞群、非人类的灵长类动物细胞群、犬细胞群、猫细胞群或嚙齿动物细胞群。在一些实施例中，本文提供的细胞群是鼠细胞群。在一些实施例中，本文提供的细胞群是猴细胞群。在一些实施例中，本文提供的细胞群是人类细胞群。
因此，在一些实施例中，本文提供的细胞群的gdT细胞是脊椎动物gdT细胞。在一些实施例中，gdT细胞是哺乳动物gdT细胞。在一些实施例中，gdT细胞选自由人类、非人类的灵长类动物、犬科动物、猫科动物、嚙齿类动物所组成的群组。在一些实施例中，gdT细胞可以是鼠gdT细胞。在一些实施例中，gdT细胞可以是猴gdT细胞。在一些实施例中，gdT细胞可为人类gdT细胞。
在一些实施例中，本文公开的细胞群包含1×106-1×1011个细胞，其中35-100％的细胞为gdT细胞。在一些实施例中，本文公开的细胞群包含约1×106、约1.5×106、约2×106、约2.5×106、约3×106、约3.5×106、约4×106、约4.5×106、约5×106、约5.5×106、约6×106、约6.5×106、约7×106、约7.5×106、约8×106、约8.5×106、约9×106、约9.5×106、约1×107、约1.5×107、约2×107、约2.5×107、约3×107、约3.5×107、约4×107、约4.5×107、约5×107、约5.5×107、约6×107、约6.5×107、约7×107、约7.5×107、约8×107、约8.5×107、约9×107、约9.5×107、约1×108、约1.5×108、约2×108、约2.5×108、约3×108、约3.5×108、约4×108、约4.5×108、约5×108、约5.5×108、约6×108、约6.5×108、约7×108、约7.5×108、约8×108、约8.5×108、约9×108、约9.5×108、约1×109、约1.5×109、约2×109、约2.5×109、约3×109、约3.5×109、约4×109、约4.5×109、约5×109、约5.5×109、约6×109、约6.5×109、约7×109、约7.5×109、约8×109、约8.5×109、约9×109、约9.5×109、约1×1010、约1.5×1010、约2×1010、约2.5×1010、约3×1010、约3.5×1010、约4×1010、约4.5×1010、约5×1010、约5.5×1010、约6×1010、约6.5×1010、约7×1010、约7.5×1010、约8×1010、约8.5×1010、约9×1010、约9.5×1010、或约1×1011个细胞，其中35-100％的细胞是gdT细胞。
在一些实施例中，本文公开的细胞群包含约1×106个细胞。本文公开的细胞群可以包含约5×106个细胞。本文公开的细胞群可以包含约1×107个细胞。本文公开的细胞群可以包含约5×107个细胞。本文公开的细胞群可以包含约1×108个细胞。本文公开的细胞群可以包含约5×108个细胞。本文公开的细胞群可以包含约1×109个细胞。本文公开的细胞群可以包含约5×109个细胞。本文公开的细胞群可以包含约1×1010个细胞。本文公开的细胞群可以包含约5×1010个细胞。本文公开的细胞群可以包含约1×1011个细胞。
本文公开的细胞群包含35-100％的gdT细胞。在本文公开的细胞群的一些实施例中，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少90％的细胞是gdT细胞。在一些实施例中，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的细胞是gdT细胞。在本文公开的细胞群的一些实施例中，至少70％的细胞是gdT细胞。在一些实施例中，至少75％的细胞群是gdT细胞。在一些实施例中，至少80％的细胞群是gdT细胞。在一些实施例中，至少85％的细胞群是gdT细胞。在一些实施例中，至少90％的细胞群是gdT细胞。在一些实施例中，至少95％的细胞群是gdT细胞。在一些实施例中，至少98％的细胞群是gdT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群没有对gdT细胞进行过正向选汰。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，不超过30％的细胞是abT细胞。在一些实施例中，本文所述的细胞群中不超过29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％的细胞是abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群具有不超过5％的abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群具有不超过2％的abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群具有不超过1％的abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群具有不超过0.5％的abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群具有不超过0.1％的abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群基本上不含abT细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群没有可检测到的abT细胞。
在一些实施例中，本文公开的细胞群包含至少0.5×106、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、5.5×106、6×106、6.5×106、7×106、7.5×106、8×106、8.5×106、9×106、9.5×106、1×107、1.5×107、2×107、2.5×107、3×107、3.5×107、4×107、4.5×107、5×107、5.5×107、6×107、6.5×107、7×107、7.5×107、8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.5×108、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108、4.5×108、5×108、5.5×108、6×108、6.5×108、7×108、7.5×108、8×108、8.5×108、9×108、9.5×108、1×109、1.5×109、2×109、2.5×109、3×109、3.5×109、4×109、4.5×109、5×109、5.5×109、6×109、6.5×109、7×109、7.5×109、8×109、8.5×109、9×109、9.5×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、2.5×1010、3×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、5×1010、5.5×1010、6×1010、6.5×1010、7×1010、7.5×1010、8×1010、8.5×1010、9×1010、9.5×1010、或1×1011个gdT细胞。在一些实施例中，本文公开的细胞群包含至少1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、或1×1011个gdT细胞。在一些实施例中，本文公开的细胞群包含至少5×106个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×107个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×107个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×108个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×108个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×109个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×109个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×1010个gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×1010个gdT细胞。
本文提供的细胞群的gdT细胞可以包含Vδ1T细胞、Vδ2T细胞、Vδ3T细胞、Vδ5T细胞、或其任何组合。在一些实施例中，至少30％的gdT细胞是Vδ2T细胞。在一些实施例中，本文公开的细胞群中的gdT细胞至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％为Vδ2T细胞。在一些实施例中，gdT细胞包含Vγ9Vδ2T细胞。在一些实施例中，本文公开的细胞群中的gdT细胞至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是Vγ9Vδ2T细胞。
如本领域所知的，gdT细胞可进一步分为以下四个记忆类型亚组：(1)终端分化的效应记忆(TDEM或TEMRA)细胞，以CD45RA+CD27-为表征；(2)中央记忆(CM或TCM)细胞，以CD45RA-CD27+为表征；(3)初始细胞，以CD45RA+CD27+为表征；和(4)效应记忆细胞(EM或TEM)细胞，以CD45RA-CD27-为表征(Guerra-Maupome等人，2019，ImmunoHorizons.3(6)208-218；Dieli等人，2003，J Exp Med.198(3)：391-7)。富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群的特征还在于它们主要包含效应记忆细胞。在本文提供的细胞群的一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％的本文提供的细胞群的gdT细胞。在一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少75％的gdT细胞。在一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少80％的gdT细胞。在一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少85％的gdT细胞。在一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少90％的gdT细胞。在一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少95％的gdT细胞。在一些实施例中，EM和TDEM细胞构成至少98％的gdT细胞。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少10％的TDEM细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含10–90％的TDEM细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％的TDEM细胞。在一些实施例中，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的gdT细胞是TDEM细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少30％的TDEM细胞。本文提供的细胞群可以包含至少40％的TDEM细胞。本文提供的细胞群可以包含至少50％的TDEM细胞。本文提供的细胞群可以包含至少60％的TDEM细胞。本文提供的细胞群可以包含至少70％的TDEM细胞。本文提供的细胞群可以包含至少80％的TDEM细胞。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少10％的EM细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含10-90％的EM细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％的EM细胞。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含不超过5％的初始细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含不超过1％、2％、3％、4％、或5％的初始细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含1-5％的初始细胞。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含不超过5％的CM细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含不超过1％、2％、3％、4％、或5％的中央记忆细胞。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含1–5％的CM细胞。
表达CD69代表gdT细胞的活化。在本文公开的细胞群的一些实施例中，至少有30％的CD69+细胞。本文公开的细胞群可以包含至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少77％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的gdT细胞是CD69+gdT细胞。在一些实施例中，在本文提供的细胞群中，至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的gdT细胞为CD69+。在一些实施例中，本文提供的细胞群中至少30％的gdT细胞为CD69+。在一些实施例中，至少35％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少40％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少45％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少50％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少55％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少60％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少65％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少70％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少75％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少80％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少85％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少90％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少95％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少96％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少97％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少98％的gdT细胞是CD69+。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、5.5×106、6×106、6.5×106、7×106、7.5×106、8×106、8.5×106、9×106、9.5×106、1×107、1.5×107、2×107、2.5×107、3×107、3.5×107、4×107、4.5×107、5×107、5.5×107、6×107、6.5×107、7×107、7.5×107、8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.5×108、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108、4.5×108、5×108、5.5×108、6×108、6.5×108、7×108、7.5×108、8×108、8.5×108、9×108、9.5×108、1×109、1.5×109、2×109、2.5×109、3×109、3.5×109、4×109、4.5×109、5×109、5.5×109、6×109、6.5×109、7×109、7.5×109、8×109、8.5×109、9×109、9.5×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、2.5×1010、3×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、5×1010、5.5×1010、6×1010、6.5×1010、7×1010、7.5×1010、8×1010、8.5×1010、9×1010、9.5×1010、或1×1011个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，本文公开的细胞群包含至少1×106个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×106个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×107个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×107个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×108个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×108个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×109个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×109个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少1×1010个CD69+gdT细胞。在一些实施例中，细胞群包含至少5×1010个CD69+gdT细胞。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000，85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少5000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约5000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少10000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约10000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少20000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约20000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少30000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约30000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少40000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约40000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少50000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约50000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少60000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约60000到约70000个CD69分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少70000个CD69分子。平均每个gdT细胞可以表达约70000到约100000个CD69分子。
在本文公开的细胞群的一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约20000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约30000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少40000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约40000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000至约70000个CD69分子。在一些实施例中，表达CD69的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个CD69分子。表达CD69的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约100000个CD69分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中：表达CD69的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD69分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，30-100％的gdT细胞表达DNAM-1。在一些实施例中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞表达DNAM-1。在一些实施例中，至少50％的细胞表达DNAM-1。在一些实施例中，至少60％的细胞表达DNAM-1。在一些实施例中，至少70％的细胞表达DNAM-1。在一些实施例中，至少80％的细胞表达DNAM-1。在一些实施例中，至少90％的细胞表达DNAM-1。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、或300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子。平均每个gdT细胞可以表达约400至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、或至少3000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少1000个DNAM-1分子。平均每个gdT细胞可以表达约1000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少5000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少10000个DNAM-1分子。平均每个gdT细胞可以表达约10000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少20000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少50000个DNAM-1分子。平均每个gdT细胞可以表达约50000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少80000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少100000个DNAM-1分子。平均每个gdT细胞可以表达约100000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少150000个DNAM-1分子。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少200000个DNAM-1分子。平均每个gdT细胞可以表达约200000至约300000个DNAM-1分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、或210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、或300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，组合物中30-100％的gdT细胞平均每个细胞表达500–300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个DNAM-1分子。表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞可以表达约400至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个DNAM-1分子。表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个DNAM-1分子。表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个DNAM-1分子。表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少80000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少100000个DNAM-1分子。表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞可以表达约100000至约300000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少150000个DNAM-1分子。在一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞表达至少200000个DNAM-1分子。表达DNAM-1的gdT细胞平均每个细胞可以表达约200000至约300000个DNAM-1分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达DNAM-1的gdT细胞各自表达至少300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、或300000个DNAM-1分子。
本文所述的细胞群的抗肿瘤活性还反映在NK细胞毒性受体(例如，CD56、CD16、NKG2D、NKp44、和NKp46)和去颗粒(degranulation)标志物(例如，CD107a)的增强表达上。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达(1)细胞毒性受体(例如，CD56、CD16、NKG2D、NKp44和NKp46)，和/或(2)去颗粒标记物(例如，CD107a)的gdT细胞的百分比增加。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达(1)细胞毒性受体(例如，CD56、CD16、NKG2D、NKp44和NKp46)和/或(2)去颗粒标记物(例如，CD107a)的gdT细胞平均每个细胞表达更多的分子(即，具有更高的每个细胞的分子数(Number of Molecules per Cell)，或「NMC」)。本文提供的细胞群的进一步特征在于表明gdT细胞治疗潜力的其他标志物(包括例如INFγ、DNAM-1、颗粒酶B、TIGIT、CD18、NKp30、CCR7、CD25、CD38、CD36、和CD103)的表达增强，以及表明gdT细胞缺乏活性的标志物(如PD-1)的表达下降。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，至少30％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，至少40％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，至少50％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，至少60％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，至少70％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，约30％到约80％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，约40％到约80％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，约50％到约80％的gdT细胞表达CD56。在一些实施例中，约60％到约80％的gdT细胞表达CD56。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个CD56分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000到约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个CD56分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000到约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个CD56分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000到约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个CD56分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000到约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个CD56分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000到约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个CD56分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000到约100000个CD56分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的gdT细胞表达CD56，其中表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个CD56分子。本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000至约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个CD56分子。本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000至约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个CD56分子。本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞可表达约10000至约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个CD56分子。本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个CD56分子。本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000至约80000个CD56分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个CD56分子。本文提供的表达CD56的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约100000个CD56分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CD56的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD56分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少20％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少30％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少40％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少50％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少60％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少70％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，至少80％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，约20％至约90％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，约30％至约90％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，约40％至约90％的gdT细胞表达CD16。在一些实施例中，约60％至约90％的gdT细胞表达CD16。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD16分子。在一些实施例中，组合物中10％-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-500000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少80000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约100000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约90000个CD16分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约80000至约90000个CD16分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000至约90000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个CD16分子。在一些实施例中，本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞表达至少80000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约100000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约90000个CD16分子。本文提供的表达CD16的gdT细胞平均每个细胞可以表达约80000至约90000个CD16分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CD16的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个CD16分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少30％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少40％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少50％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少60％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少70％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少80％的gdT细胞表达NKG2D。在一些实施例中，至少90％的gdT细胞表达NKG2D。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约100000个NKG2D分子。本文提供的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约80000个NKG2D分子。
在一些实施例中，组合物中30-100％的gdT细胞平均每个细胞表达至少40-500000个NKG2D分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少400个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少1000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可以表达约1000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少5000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可以表达约5000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少10000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可以表达约10000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少20000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少30000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少50000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可以表达约50000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少60000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可以表达约60000至约80000个NKG2D分子。在一些实施例中，本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞表达至少70000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可以表达约70000至约100000个NKG2D分子。本文提供的表达NKG2D的gdT细胞平均每个细胞可表达约70000至约80000个NKG2D分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKG2D的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、或500000个NKG2D分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞表达NKp44。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp44分子。在一些实施例中，组合物中1-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个NKp44分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKp44的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp44分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKp44的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp44分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞表达NKp46。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp46分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKp46的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp46分子。在一些实施例中，组合物中4％-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个NKp46分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKp46的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp46分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少10％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少20％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少30％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少40％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少50％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少60％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少70％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，至少80％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，约10％至约80％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，约10％至约70％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，约10％至约60％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，约20％至约80％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，约20％至约60％的gdT细胞表达CD107a。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CD107a分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的gdT细胞表达CD107a。在一些实施例中，表达CD107a的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CD107a分子。在一些实施例中，组合物中10-80％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个CD107a分子。在一些实施例中，表达CD107a的gdT细胞各自至少表达400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CD107a分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少0.1％的gdT细胞表达IFNγ。在一些实施例中，组合物中至少0.1％、0.2％、0.5％、0.7％、1％、2％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、32％、35％、37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、或100％的gdT细胞表达IFNγ。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个IFNγ分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达IFNγ的gdT细胞平均每个细胞表达至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个IFNγ分子。在一些实施例中，组合物中0.1％-100％的gdT细胞平均每个细胞表达100-200000个IFNγ分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达IFNγ的gdT细胞各自表达至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个IFNγ分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，10-100％的gdT细胞表达颗粒酶B。在一些实施例中，组合物中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的gdT细胞表达颗粒酶B。在一些实施例中，至少25％的细胞表达颗粒酶B。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个颗粒酶B分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达颗粒酶B的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个颗粒酶B分子。在一些实施例中，组合物中30％-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个颗粒酶B分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达颗粒酶B的gdT细胞每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个颗粒酶B分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，0-80％的gdT细胞表达TIGIT。在一些实施例中，组合物中至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％的gdT细胞表达TIGIT。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个TIGIT分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达TIGIT的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000个TIGIT分子。在一些实施例中，组合物中30％-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个TIGIT分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达TIGIT的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个TIGIT分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，10-100％的gdT细胞表达CD18。在一些实施例中，组合物中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的gdT细胞表达CD18。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CD18分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CD18的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CD18分子。在一些实施例中，组合物中30-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个CD18分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CD18的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CD18分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，5-100％的gdT细胞表达NKp30。在一些实施例中，组合物中至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的gdT细胞表达NKp30。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp30分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKp30的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp30分子。在一些实施例中，组合物中30-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个NKp30分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达NKp30的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个NKp30分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，1-20％的gdT细胞表达CCR7。在一些实施例中，组合物中至少1％、2％、5％、10％、12％、15％、或20％的gdT细胞表达CCR7。在本文提供的细胞群的一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CCR7分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CCR7的gdT细胞平均每个细胞表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CCR7分子。在一些实施例中，组合物中30-100％的gdT细胞平均每个细胞表达400-200000个CCR7分子。在本文提供的细胞群的一些实施例中，表达CCR7的gdT细胞各自表达至少400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或200000个CCR7分子。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，0.5％-100％的gdT细胞表达CD25。在一些实施例中，组合物中至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的gdT细胞表达CD25。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，30-100％的gdT细胞表达CD38。在一些实施例中，组合物中至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的gdT细胞表达CD38。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，0-10％的gdT细胞表达CD36。在一些实施例中，组合物中0.1％-10％的gdT细胞表达CD36。在一些实施例中，组合物中至少0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2.5％、5％、7.5％、或10％的gdT细胞表达CD36。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，0-10％的gdT细胞表达CD103。在一些实施例中，组合物中至少0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、或10％的gdT细胞表达CD103。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，1-60％的gdT细胞表达PD-1。在一些实施例中，组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、32％、35％、37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％或60％的gdT细胞表达PD-1。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，30-100％的gdT细胞可以介导ADCC反应。在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的gdT细胞可以介导ADCC反应。在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少5×107、6×107、7×107、7.5×107、8×107、9×107、1×108、2×108、2.5×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、7.5×108、8×108、9×108、1×109、2×109、2.5×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、7.5×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、2.5×1010、3×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、5×1010、5.5×1010、6×1010、6.5×1010、7×1010、7.5×1010、8×1010、8.5×1010、9×1010、9.5×1010、或1×1011的gdT细胞可以介导ADCC反应。
在一些实施例中，本文提供包含至少70％gdT细胞的细胞群，其中(1)平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子；(2)至少30％的gdT细胞是CD69+；或(1)和(2)两者。在一些实施例中，本文提供的细胞群包含至少70％的gdT细胞，其中(1)平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子和(2)至少30％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少500、至少1000、至少2000、或至少3000个DNAM-1分子。在一些实施例中，至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的gdT细胞是CD69+。在一些实施例中，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的gdT细胞是TDEM细胞。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，在与目标细胞共培养后，(1)40-100％的gdT细胞表达TNFα，(2)60-100％的gdT细胞表达CD107a，或(1)和(2)两者；其中目标细胞为癌细胞、肿瘤细胞、受HIV或其他病毒感染的细胞、受真菌感染的细胞、或受原虫感染的细胞；或者其中所述目标细胞为Raji、Daudi、K562、或其他液态肿瘤；或者其中所述目标细胞为A549、SK-OV-3、BT-474、或其他固态肿瘤。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，与目标细胞共培养后，至少60％的gdT细胞被活化以表达CD107a。在本文提供的细胞群的一些实施例中，与目标细胞共培养后，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞被活化以表达CD107a。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，与目标细胞共培养后，至少40％的gdT细胞被活化以表达TNF-α。在本文提供的细胞群的一些实施例中，与目标细胞共培养后，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的gdT细胞被活化以表达TNF-α。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，与癌细胞共培养后，(1)至少40％的CD69+gdT细胞表达TNFα；(2)至少40％的CD69+gdT细胞表达颗粒酶B；或(1)和(2)两者。在一些实施例中，与癌细胞共培养后，至少40％的CD69+gdT细胞表达TNFα。在一些实施例中，与癌细胞共培养后，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD69+gdT细胞表达TNFα。在一些实施例中，与癌细胞共培养后，至少40％的CD69+gdT细胞表达颗粒酶B。在一些实施例中，与癌细胞共培养后，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD69+gdT细胞表达颗粒酶B。
如本领域普通技术人员应当理解的，可以用本文公开的标志物各个方面的多种组合和排列来表征本文所述的细胞群。这些组合和排列明确地涵盖于在本公开的范围内。一些范例列举于下。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，gdT细胞表达(1)平均每个细胞至少400个CD56分子；(2)平均每个细胞至少400个CD16分子；(3)平均每个细胞至少400个NKG2D分子；(4)平均每个细胞至少400个CD107a分子；(5)平均每个细胞最多2800个PD-1分子；(6)平均每个细胞至少5000个DNAM-1分子；或(7)每个细胞平均至少400个CD69分子；或其任何组合。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，gdT细胞表达(1)平均每个细胞约30000至约70000个CD69分子；(2)平均每个细胞约60000至约80000个CD56分子；(3)平均每个gdT细胞表达约80000至约90000个NKG2D分子；(4)平均每个gdT细胞表达约100000至约300000个DNAM-1分子；或其任何组合。
在一些实施例中，本文提供的细胞群包含(1)40-100％的CD69+细胞；(2)50-80％的CD56+细胞；(3)20-90％的CD16+细胞；(4)90-100％的NKG2D+细胞；(5)20-60％的CD107a+细胞；或(6)90-100％的DNAM-1+细胞；或其任何组合。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，(1)至少95％的CD69+gdT细胞表达DNAM-1；(2)至少25％的CD69+gdT细胞表达颗粒酶B；或(1)和(2)两者。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少95％、96％、97％、98％、或99％的细胞表达CD3。在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少95％、96％、97％、98％、或99％的细胞表达NKG2D。在本文提供的细胞群的一些实施例中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的细胞表达CD107a。在本文提供的细胞群的一些实施例中，最多25％、20％、15％、10％、或5％的细胞表达PD-1。在本文提供的细胞群的一些实施例中，(1)至少95％、96％、97％、98％、或99％的细胞表达CD3；(2)至少95％、96％、97％、98％、或99％的细胞表达NKG2D；(3)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的细胞表达CD107a；(4)最多25％、20％、15％、10％、或5％的细胞表达PD-1；或(1)-(4)的任合组合。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，(1)至少40％的细胞表达CD56；(2)至少30％的细胞表达CD16；(3)至少50％的细胞表达NKG2D；(4)至少30％的细胞表达CD107a；或(5)最多25％的细胞表达PD-1；或其任何组合。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，(1)至少4％的γδT细胞每个细胞表达至少400个NKp46分子；(2)至少10％的γδT细胞每个细胞表达至少400个CD56分子；(3)至少10％的γδT细胞每个细胞表达至少400个CD16分子；(4)至少30％的γδT细胞每个细胞表达至少400个NKG2D分子；(5)至少1％的γδT细胞每个细胞表达至少400个NKp44分子；(6)0-100％的γδT细胞表达CD25；(7)30-100％的γδT细胞表达CD38；(8)0-60％的γδT细胞表达PD-1；(9)5-100％的γδT细胞表达NKp30；(10)10-100％的γδT细胞表达CD18；(11)0-80％的γδT细胞表达TIGIT；(12)30-100％的γδT细胞表达DNAM-1；(13)0-10％的γδT细胞表达CD36；(14)0-10％的γδT细胞表达CD103；(15)1-20％的γδT细胞表达CCR7；(16)0-100％的γδT细胞表达IFNγ；(17)10-100％的γδT细胞表达颗粒酶B；(18)30-100％的γδT细胞为CD3+Vδ2+；(19)30-100％的γδT细胞能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)反应；或(20)至少80％的γδT细胞每个细胞表达至少400个CD69分子；或(1)-(2)的任何组合。
在本文提供的细胞群的一些实施例中，(1)至少4％的γδT细胞表达NKp46，其中表达NKp46的γδT细胞平均每个细胞表达至少400个NKp46分子；(2)至少10％的γδT细胞表达CD56，其中表达CD56的γδT细胞平均每个细胞表达至少400个CD56分子；(3)至少10％的γδT细胞表达CD16，其中表达CD16的γδT细胞平均每个细胞表达至少400个CD16分子；(4)至少30％的γδT细胞表达NKG2D，其中表达NKG2D的γδT细胞平均每个细胞表达至少40个NKG2D分子；(5)至少1％的γδT细胞表达NKp44，其中表达NKp44的γδT细胞平均每个细胞表达至少400个NKp44分子；(6)至少80％的γδT细胞表达CD69，其中表达CD69的γδT细胞平均每个细胞表达至少400个CD69分子；或(1)-(6)的任合组合。
在一些实施例中，本文提供的细胞群是经分离的。在一些实施例中，细胞群可以从人体或动物体中分离。在一些实施例中，分离的细胞群基本上不含一种或多种在体内与该细胞群相关的细胞群。
本文公开的细胞群可以通过本文所述的培养方法获得。更多细节请参阅第5.1节。在一些实施例中，例如，本文所公开的细胞群自由单一供体来的来源细胞群起经20天或更短时间的离体培养，所述细胞群源自或取自来源细胞群。在一些实施例中，本文提供的细胞群没有针对gdT细胞进行过正向选汰。在一些实施例中，本文提供的细胞群没有针对CD69+细胞进行过正向选汰。在一些实施例中，本文提供的细胞群没有针对任何标志物进行过正向选汰。在一些实施例中，细胞群不含滋养细胞(例如，经转化的细胞)或外来抗原(例如，微生物成分)。
5.2.1经修饰的细胞群
可以进一步修饰本文提供的细胞群以增强它们的治疗潜力。因此，在一些实施例中，本文提供的方法进一步包含在产生的细胞群细胞的表面添加靶向部分。本文还提供了富含gdT细胞的细胞群，其中至少10％的gdT细胞包含复合于细胞表面的靶向部分。在一些实施例中，本文提供的细胞群中10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的gdT细胞包含至少一与目标细胞上的生物标志物产生特异性结合的靶向部分。
如本文所用的「靶向部分」可以通过对靶标产生优先作用或优先结合来区分目标和非目标。在一些实施例中，靶向部分与目标细胞上的生物标志物的产生特异性结合。可以基于对所需靶标(例如目标细胞上的生物标志物)具有或生产后具有结合亲和力来选择靶向部分(参见US 10,744,207)。在一些实施例中，生物标志物可以是肿瘤抗原或癌症抗原。
如本文所用，「特异性结合」一词，是指与替代物质相比，分子与靶标分子(例如，抗原决定基或蛋白质)的相互作用频率较高、速度较快、持续时间较长、亲和力较大、或上述的某些组合。可以藉由例如免疫测定、ELISA、生物层干涉仪(「BLI」)、SPR(例如，Biacore)或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定与靶标分子(例如，抗原)特异性结合的靶向部分(例如，抗体)。通常，特异性的反应将至少是背景信号或噪声的两倍，并且可能是背景的10倍以上。关于抗体特异性的讨论请参见，例如，Paul,ed.，1989，Fundamental ImmunologySecond Edition，Raven Press，New York第332-336页。与靶标分子特异性结合的靶向部分能以比其对不同分子的亲和力更高的亲和力与靶标分子结合。在一些实施例中，与靶标分子特异性结合的靶向部分能以比其对不同分子的亲和力大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、或大至少100倍的亲和力与靶标分子结合。在一些实施例中，与特定靶标分子特异性结合的靶向部分以极其低的亲和力结合其他分子，以至于使用本文所述或其他本领域已知的检定法无法检测到该结合。由于不同蛋白质多肽序列某些区域内的同源性和不同分子间的结构相似性，特异性结合可以包含识别多个靶标的分子。应当理解的是，在一些实施例中，特异性结合第一个靶标的靶向部分(例如，抗体)也许可以或也许不能特异性地结合第二个靶标。因此，「特异结合」不一定需要(尽管它可以包含)排他性的结合，意即，结合单一靶标。因此，在一些实施例中，靶向部分(例如，抗体)可以特异性地结合多于一个靶标。
如本文所用的「结合亲和力」一词通常是指靶向部分和靶标分子(例如，抗原)之间非共价性的相互作用的强度总和。靶向部分和靶标分子的结合是可逆过程，且该结合的亲和力通常以平衡解离常数(KD)报告。KD是解离率(koff或kd)与结合率(kon或ka)的比值。结合对间的KD越低，亲和力越高。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中的任何一种都可以用来达到本公开的目的。在一些实施例中，「KD」或「KD值」可以通过本领域已知的检定法来测量，例如通过结合检定法。KD可以在放射性标志的抗原结合检定法(RIA)中测量(Chen等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)。KD或KD值也可以通过使用生物膜干涉技术(biolayerinterferometry，BLI)来测量，例如使用Gator系统(Probe Life)或Octet-96系统(Sartorius AG)。KD或KD值也可以通过Biacore，(使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ))以利用表面电浆共振检定法(SPR)来测量。在一些实施例中，「特异性结合」是指，例如，靶向部分以约0.1mM或更小的KD结合靶标分子。在一些实施例中，「特异性结合」是指靶向部分以约10μM或更小或约1μM或更小的KD结合靶标。在一些实施例中，「特异性结合」是指靶向部分以约0.1μM或更小、约0.01μM或更小、或约1nM或更小的KD结合靶标。
在一些实施例中，靶向部分以10-6M或以下、10-7M或以下、10-8M或以下、5×10-9M或以下、10-9M或以下、5×10-10M或以下、10-10M或以下、5×10-11M或以下、10-11M或以下、5×10- 12M或以下、10-12M或以下；或范围从10-12M到10-7M、从10-11M到10-7M、从10-10M到10-7M、从10-9M到10-7M、从10-8M到10-7M、从10-10M到10-8M、从10-9M到10-8M、从10-11M到10-9M、或从10-10M到10-9M的KD与生物标志物结合。在一些实施例中，KD小于1、5、10、11、15、20、21、25、30、31、35、40、41、45、50、51、55、60、61、65、70、71、75、80、81、85、90、91、95、100、101、105、110、111、115、120、121、125、130、131、135、140、141、145、150、151、155、160、161、165、170、171、175、180、181、185、190、191、195、200、201、205、210、211、215、220、221、225、230、231、235、240、241、或245nM。在一些实施例中，KD小于250nM。
靶向部分可以针对的生物标志物包括细胞表面标志物。细胞表面标志物的非限制性例子包含碳水化合物、醣脂(glycolipid)、醣蛋白、呈现于造血谱系细胞上的CD(分化簇(cluster of differentiation))抗原(例如，CD2、CD4、CD8、CD21等)、γ-麸胺酸转胜肽酶
(γ-glutamyltranspcptidase)、黏附蛋白质(例如，ICAM-1、ICAM-2、ELAM-1、VCAM-1)、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、和其他配体受体、离子通道、以及免疫球蛋白μ链的膜结合形态。在一些实施例中，与目标细胞相关的生物标志物以每个细胞约或少于约100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50、或更少的拷贝数存在于目标细胞的表面上。在一些实施例中，目标细胞群中与目标细胞表面相关的生物标志物于每个细胞的平均密度为约或小于约100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50或更少的拷贝数。在一些实施例中，生物标志物与目标细胞相关联的方式是，目标细胞周围的流体或它所驻留的组织中的标志物浓度比在离目标细胞较远的流体或组织中发现的高，例如细胞分泌生物标志物的地方。令人特别感兴趣的是与疾病或疾病状态相关的生物标志物；令人更加感兴趣的是由与疾病或疾病状态相关的目标细胞(例如异常的细胞)表达的疾病相关生物标志物。
目前已发现多种疾病相关的生物标志物，且相应的靶向部分已被生成，例如靶向部分针对甲型胎儿蛋白(AFP)、C反应蛋白(CRP)、癌症抗原-50(CA-50)、卵巢癌相关的癌症抗原-125(CA-125)、乳腺癌相关的癌症抗原15-3(CA15-3)、癌症抗原-19(CA-19)和胃肠道癌相关的癌症抗原-242、癌胚抗原(CEA)、癌症相关抗原(CAA)、染色颗粒素A、上皮黏蛋白抗原(MC5)、人类上皮细胞特异性抗原(HEA)、路易士(a)(Lewis(a))抗原、黑色素瘤抗原、黑色素瘤相关抗原100、25、和150、类粘蛋白癌症相关抗原、多重耐药相关蛋白(MRPm6)、多重耐药相关蛋白(MRP41)、Neu致癌基因蛋白(C-erbB-2)、神经元特异烯醇酶(NSE)、P-醣蛋白(P-glycoprotein，mdr1基因产物)、多重耐药相关抗原、p170、多重耐药相关抗原、前列腺特异抗原(PSA)、CD56、和NCAM(参见专利US10,744,207)。
在一些实施例中，生物标志物是醣脂(glycolipid)、醣蛋白、呈现于造血谱系细胞上的分化簇(cluster of differentiation)抗原、γ-麸胺酸转胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白质、荷尔蒙、生长因子、细胞激素、配体受体、离子通道、免疫球蛋白μ链的膜结合形态、甲型胎儿蛋白、C反应蛋白(CRP)、染色颗粒素A、上皮黏蛋白抗原、人类上皮细胞特异性抗原、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重耐药相关蛋白、Neu致癌基因蛋白、神经元特异烯醇酶、P-醣蛋白(P-glycoprotein)、多重耐药相关抗原、p170、多重耐药相关抗原、前列腺特异抗原、神经节苷脂分子、MART-1、热休克蛋白、唾液酸多醣(sialyl-Tn)、酪胺酸酶、MUC-1、HER-2/neu、KSA、前列腺特异膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成长因子受体(EGF-R)、血管内皮生长因子(VEGF)、或黑色素瘤相关抗原(MAGE)。
在一些实施例中，靶向部分是胜肽、蛋白质、或适体。在一些实施例中，靶向部分可包含与目标细胞上的生物标志物特异性结合的抗体或抗原结合片段。生物标志物可以是本文公开的或本领域已知的任何生物标志物。在一些实施例中，靶向部分可包含与肿瘤抗原或癌症抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段。本文提供的方法进一步包含添加与肿瘤抗原特异性结合的抗体或其抗原结合单元至细胞表面。
在一些实施例中，靶向部分包含与目标细胞上的生物标志物特异性结合的抗体或抗原结合单元。如本领域所理解的，本文所用的「抗体」一词及其语法对等词是指通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标(例如蛋白质、多肽、胜肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、或前述的任何组合)的免疫球蛋白分子，其中所述抗原结合位点通常位在免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所用，该词涵盖完整多株抗体、完整单株抗体、单域抗体(single-domain antibody，sdAb；例如骆驼抗体、羊驼抗体)、单链Fv(scFv)抗体、重链抗体(HCAb)、轻链抗体(LCAb)、多特异性(multispecific)抗体、双特异性抗体(bispecific)、单特异性抗体(monospecific)、单价抗体、和任何其他包含抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白分子(例如，双可变结构域免疫球蛋白分子)，只要抗体呈现出所需的生物活性。抗体还包含但不限于小鼠抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和人类抗体。抗体可为五种主要免疫球蛋白类别中的任何一种：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，或其亚类(构造同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2)，依据它们重链恒定结构域的特性分别称为alpha、delta、epsilon、gamma、和mu。除非另有明确说明，本文所使用的「抗体」一词包含完整抗体的「抗原结合单元」。如本文所用的「抗原结合单元」一词是指完整抗体的一部分或片段，该部分或片段为完整抗体的抗原决定可变区。抗原结合单元的实例包含但不限于，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)、重链抗体(HCAb)、轻链抗体(LCAb)、双硫键连结的scFv(dsscFv)、双价抗体(diabodies)、三价抗体(tribodies)、四价抗体(tetrabodies)、微型抗体(minibodies)、双可变域抗体(DVD)、单可变域抗体(sdAbs；例如骆驼抗体、羊驼抗体)、和重链抗体的单可变域(VHH)，以及由抗体片段组成的双特异性或多特异性抗体。在一些实施例中，包含抗原结合单元的靶向部分是IgG亚型的单株抗体。
在一些实施例中，靶向部分是与癌症抗原特异性结合的抗体或抗原结合单元。癌症抗原可以选自由HER2/neu(ERBB2)、人类表皮生长因子受体3(HER3；ERBB3)、上皮成长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、GD2、CTLA4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮细胞粘附分子(EpCAM))、CA-125(MUC16)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(计画性死亡-配体1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(间皮素(mesothelin))、碳水化合物抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、似胰岛素生长因子1受体(IGF-1R)、CD3、MIF、叶酸受体α(folate receptor alpha；FOLR1)、群落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、TfR、MUC1、CD25(间白素-2受体(IL-2R))、CD115(群落刺激因子1受体(CSF1R))、间白素1B(IL1B)、CD105(内皮醣蛋白(Endoglin))、KIR、CD47、癌胚抗原(CEA)、间白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生长素2(angiopoietin 2)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(肿瘤坏死因子受体超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密连蛋白1(Claudin1；CLDN1)、前列腺特异膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纤维母细胞生长因子受体3(FGFR3)、一种杀手细胞类免疫球蛋白受体(a killer-cell immunoglobulin-likereceptors；KIRs)、一种肿瘤坏死因子受体蛋白(a TNF receptor protein)、一种免疫球蛋白、一种细胞激素受体(a cytokine receptor)、一种整合素、和活化自然杀手细胞的受体(activating NK cell receptors)所组成的群组。
在一些实施例中，靶向部分包含针对CD20的抗体(例如，利妥昔单抗；rituximab)。在一些实施例中，靶向部分包含针对HER2的抗体(例如，曲妥珠单抗；trastuzumab)。
5.2.2ACE细胞
在一些实施例中，靶向部分不是由gdT细胞产生的。在一些实施例中，靶向部分藉由与靶向部分接合的第一连结子和与细胞表面接合的第二连结子间的相互作用与复合于细胞表面。具有通过与靶向部分接合的第一连结子和与细胞表面接合的第二连结子间的相互作用复合于细胞表面的靶向部分的gdT细胞称为「ACE-gdT细胞」。
在一些实施例中，靶向部分和细胞表面的间隔长度为1nm至400nm。在一些实施例中，靶向部分和细胞表面相隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、或390nm的距离。在一些实施例中，靶向部分和细胞表面的间隔长度为1nm至20nm或1nm至33nm。在一些实施例中，靶向部分和细胞表面的间隔长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、或32nm。
在一些实施例中，靶向部分可以通过分别与靶向部分和细胞接合的连结子之间的相互作用添加到本文提供的细胞群的gdT细胞上。在一些实施例中，第一和第二连结子是相同的。在一些实施例中，第一连结子和第二连结子是不同的。在一些实施例中，连结子是外源性的连结子，该外源连结子不是其连结的细胞所产生的。
在一些实施例中，第一和第二连结子包含彼此反应形成共价键的反应性基团，并且靶向部分通过两个反应性基团之间形成的共价键复合于细胞表面。每个反应基团可以先直接与其附着的个体(例如靶向部分或治疗剂)反应以生成共价键(参见专利US10,744,207)。在一些实施例中，靶向部分通过耦合基团与第一连结子和/或第二连结子接合。在一些实施例中，耦合基团是NHS酯或其他活化酯、烷基或酰基卤、双官能交联剂、或顺丁烯二酰亚胺基团。
在一些实施例中，连结子可以是以非共价性相互作用的结合对。结合对的成员彼此特异性地结合，包含但不限于，DNA结合域和目标DNA；白胺酸拉链和目标DNA；生物素和抗生物素蛋白；生物素和卵白素；调钙素结合蛋白和调钙素；荷尔蒙和荷尔蒙受体；凝集素和碳水化合物；细胞膜受体和受体配体；酶和基质；抗原和抗体；促效剂和拮抗剂；多核苷酸(RNA或DNA)杂交序列；适体和靶标；和锌指和目标DNA。
在一些实施例中，两个连结子以10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、5×10-9M或更小、10-9M或更小、5×10-10M或更小、10-10M或更小、5×10-11M或更小、10-11M或更小、5×10-12M或更小、或10-12M或更小；或范围从10-12M到10-7M、从10-11M到10-7M、从10-10M到10-7M、从10-9M到10-7M、从10-8M到10-7M、从10-10M到10-8M、从10-9M到10-8M、从10-11M到10-9M、或从10-10M到10-9M的KD相互结合。在一些实施例中，第一连结子和第二连结子之间的KD小于1、5、10、11、15、20、21、25、30、31、35、40、41、45、50、51、55、60、61、65、70、71、75、80、81、85、90、91、95、100、101、105、110、111、115、120、121、125、130、131、135、140、141、145、150、151、155、160、161、165、170、171、175、180、181、185、190、191、195、200、201、205、210、211、215、220、221、225、230、231、235、240、241、或245nM。在一些实施例中，两个连结子具有小于250nM的结合亲和力(KD)。
第一连结子和第二连结子之间的相互作用可以是直接的或间接的。在一些实施例中，第一连结子和第二连结子直接相互作用。通常，直接的相互作用是不需要与中间化合物相互作用的相互作用。在一些实施例中，第一和第二连结子间接地相互作用。通常，间接的相互作用经由一种或多种中间化合物介导。中间化合物可以与一个或两个连结子为相同或不同的类型。在一些实施例中，第一连结子和第二连结子通过同时与中间化合物相互作用而间接相互作用。例如，第一连结子和第二连结子可以是同一抗体，它们通过同时结合做为中间化合物的同一抗原(一个或多个拷贝数)而间接地相互作用。
在一些实施例中，第一连结子是第一多核苷酸，而第二连结子是第二多核苷酸。在一些实施例中，第一多核苷酸是由去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或其类似物、或其任何组合。在一些实施例中，第二多核苷酸是由去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或其类似物、或其任何组合(参见美国专利号10,744,207)。在一些实施例中，两个多核苷酸中的至少一个可以各自独立地为DNA、RNA或胜肽核酸(PNA)分子，或其组合(参见美国专利号10,744,207)。在一些实施例中，第一多核苷酸和第二多核苷酸可以是单链DNA(ssDNAs)。
在一些实施例中，(1)第一多核苷酸有4个到500个核苷酸，(2)第二多核苷酸有4个到500个核苷酸，或(1)和(2)两者。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸的长度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、300、400、或500nt。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸有20-200个核苷酸。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸有20-100个核苷酸。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸具有20-80个核苷酸。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸具有20-60个核苷酸。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸具有约20个核苷酸。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸具有约40个核苷酸。在一些实施例中，第一和/或第二多核苷酸具有约60个核苷酸。
两个多核苷酸连结子可以直接或间接地相互作用。在一些实施例中，第一和第二多核苷酸可以直接地相互作用，例如通过互补性彼此杂交。在一些实施例中，第一多核苷酸包含第一单链区，且第二多核苷酸包含与第一单链区互补的第二单链区，其中靶向部分通过第一单链区和与第一单链区互补的第二单链区之间的相互作用复合于细胞表面。在一些实施例中，第一单链区和第二单链区大体上地或完全地彼此互补。在一些实施例中，第一多核苷酸和第二多核苷酸大体上地或完全地彼此互补。例如，两个多核苷酸共享至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补性。在一些实施例中，连结子被设计为具有约或小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更低的GC含量。在一些实施例中，选择连结子使其具有约或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高的GC含量。在一些实施例中，连结子被设计成包含或由重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20次或重复直到达到连结子末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列所组成(例如，AAA...、或ATAT...)。在一些实施例中，选择连结子使其具有约或大于约30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、或更高的Tm(参见美国专利号10,744,207)。
在一些实施例中，第一或/和第二多核苷酸包含一序列，选自下表。组成的群组：20-mer poly-CA、20-mer poly-GGTT、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、和SEQ ID NO：26。
SEQ ID NO: 序列
1 CACACACACACACACACACA
2 TCATACGACTCACTCTAGGG
3 AGTTACCATGACGTCAATTTCAG
4 TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
5 CCCTAGAGTGAGTCGTATGA
6 CTGAAATTGACGTCATGGTAACT
7 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
8 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
9 ACTGACTGACTGACTGACTG
10 CAGTCAGTCAGTCAGTCAGT
11 GTAACGATCCAGCTGTCACT
12 AGTGACAGCTGGATCGTTAC
13 ACTGATGGTAATCTGCACCT
14 AGGTGCAGATTACCATCAGT
15 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
16 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
17 ACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTG
18 CAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT
19 TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
20 CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA
21 GTAACGATCCAGCTGTCACTGTAACGATCCAGCTGTCACT
22 AGTGACAGCTGGATCGTTACAGTGACAGCTGGATCGTTAC
23 TCATACGACTCACTCTAGGGTCATACGACTCACTCTAGGG
24 CCCTAGAGTGAGTCGTATGACCCTAGAGTGAGTCGTATGA
25 ACTGATGGTAATCTGCACCTACTGATGGTAATCTGCACCT
26 AGGTGCAGATTACCATCAGTAGGTGCAGATTACCATCAGT
在一些实施例中，第一连结子和第二连结子是通过与中间化合物相互作用而间接相互作用的两个多核苷酸。在一些实施例中，中间化合物是转接器多核苷酸(adapterpolynucleotide)。转接器多核苷酸可以包含DNA、RNA、核苷酸类似物、非典型核苷酸、经标记的核苷酸、经修饰的核苷酸、或其组合。转接器多核苷酸可以为单链、双链、或部分双链体。通常，部分双链体转接器包含一个或多个单链区和一个或多个双链区。双链的转接器可以包含两个相互杂交的个别寡核苷酸(也称为「寡核苷酸双链体」)，且杂交后可能会留下一个或多个3’端突出、一个或多个5’端突出、一个或多个由错配和/或未配对的核苷酸导致的突起，或这些的任何组合。与第一连结子多核苷酸和第二连结子多核苷酸相互作用的转接器多核苷酸可以包含相连的主链。例如，第一连结子多核苷酸和第二连结子多核苷酸可以通过互补性与转接器多核苷酸的不同部分相互作用。或者，第一连结子多核苷酸可以与双链连结子的第一链杂交，第二连结子多核苷酸可以与双链连结子的第二链杂交，而转接器的第一链和第二链可以彼此杂交，使得第一连结子和第二连结子通过与双链转接器多核苷酸的序列互补性间接相互作用。转接器多核苷酸也可以相反的包含不相连的主链，例如当两个或多个双链转接器多核苷酸(例如，2、3、4、5、或更多)在一个链上杂交时，第一连结子多核苷酸与该链的一端杂交，而第二个连结子多核苷酸与该链的另一端杂交(参见专利US10,744,207)。
连结子可以通过任何本领域已知的适合的方法与靶向部分(例如，抗体)或治疗单元(例如，细胞)接合。连结子可以通过共价键或非共价键连结来接合。在一些实施例中，连结子接合至部分(例如抗体)或治疗单元的原生官能基团，例如细胞表面上原生的或蛋白质中的原生基团。细胞表面可以包含任何合适的原生官能基团，例如氨基酸和糖。例如，包含顺丁烯二酰亚胺、二硫化物和酰化反应过程的试剂可用来与细胞表面蛋白上的半胱氨酸形成直接的共价键。酰胺耦合反应可用于天冬胺酸和麸胺酸以形成酰胺键。重氮阳离子耦合、酰化反应和烷化反应可用于细胞表面的酪胺酸以形成酰胺键连结。任何氨基酸(20个氨基酸或任何非自然氨基酸)都可用来形成直接共价键，其为寡核苷酸与细胞表面的连接。20种氨基酸为异白胺酸、白胺酸、离胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、苏胺酸、色胺酸和缬胺酸(必需氨基酸)，以及非必需氨基酸，丙胺酸、天冬酰胺、天冬胺酸、半胱氨酸、麸胺酸、麸酰胺、甘胺酸、脯胺酸、丝胺酸和酪胺酸，还有精胺酸和组胺酸。在一些实施例中，原生官能基团可以是氨基酸，例如离胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、苏胺酸、丝胺酸、天冬胺酸、麸胺酸或色胺酸。在其他实施例中，原生官能基团是离胺酸。在一些其他实施例中，原生官能基团可以是N-末端的丝胺酸或苏胺酸(参见US10,744,207)。
在一些实施例中，可以使用耦合基团将连结子接合至靶向部分或治疗单元。例如，耦合基团可以是经活化的酯(例如NHS酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)酯、二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)酯等)，或卤烷或酰卤(卤，例如-Cl、-Br、-I)。在一些实施例中，经活化的酯是经分离和/或纯化过的。在一些实施例中，经活化的酯是原位生成且/或使用。在一些例子中，耦合基团可以直接与治疗剂接合(例如，当作治疗剂使用的细胞的表面)无需预先修饰原生官能几团(例如，氨基酸)。例如，连结子可以通过与靶向部分(例如抗体、适体)或细胞表面上的氨基酸形成化学键结(例如酰胺键或酯键)来与靶向部分或治疗单元接合。在一些实施例中，耦合基团是NHS酯，其与靶向部分或治疗单元上的亲核性原生官能基团反应，产生酰化产物。例如，所述原生官能基团可以是胺，其藉由NHS酯形成酰胺来接合。或者，原生官能基团可以是羟基或巯基，它们可以藉由NHS酯分别形成酯或巯基酯键来接合(参见US 10,744,207)。
在一些实施例中，可以使用双官能交联剂将连结子接合到靶向部分或治疗单元上。双官能交联剂可以包含能与两个不同的官能靶标(如胜肽、蛋白质、大分子、半导体奈米晶体、或底物)耦合的两个不同的反应基团。所述的两个反应基团可以是相同的或不同的，且包含但不限于如硫醇、羧酸盐、羰基、胺、羟基、醛、酮、活性氢、酯、巯基或光反应性部分等的反应基团。在一些实施例中，交联剂在官能端上可以有一个胺反应性基团和一个硫醇反应性基团。在其他实施例中，双官能交联剂可以是NHS-PEO-顺丁烯二酰亚胺，其包含可使含胺和含巯基的分子共价接合的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和顺丁烯二酰亚胺基团。可用于将连结子接合至靶向部分或治疗单元的异质性双官能交联剂的进一步实例包含但不限于：具胺反应性+具巯基反应性的交联剂、具羰基反应性+具巯基反应性的交联剂、具胺反应性+光反应性的交联剂、具巯基反应性+光反应性的交联剂、具羰基反应性+光反应性的交联剂、具羧酸盐反应性+光反应性的交联剂、和具精胺酸反应性+光反应性的交联剂(参见专利US10,744,207)。
常见的交联剂可分为以下的类别(包含示例性的官能基团)：1.具胺反应性：交联剂与含胺(NH2)的分子，例如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰迭氮、NHS酯、氯化磺酰(sulfonylchlorides)、醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸盐、酰化剂(arylating agents)、亚胺酯(imidoester)、碳二亚胺、酸酐、炔烃等耦合；2.具硫醇反应性：交联剂与含巯基(SH)的分子，例如卤代乙酰基卤衍生物(haloacetyl halide derivate)和卤烷衍生物、顺丁烯二酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、酰化剂(arylating agents)、硫醇-二硫化物交换试剂等耦合；3.具羧酸盐反应性：交联剂与含羧酸(COOH)的分子，例如重氮烷和重氮乙酰化合物，如羰基二咪唑(carbonyldiimidazole)和碳二亚胺等耦合；4.具羟基反应性：交联剂与含羟基(-OH)的分子，例如环氧化物和环氧乙烷、羰基二咪唑(carbonyldiimidazole)、经过碘酸盐氧化、碳酸N,N’-二琥珀酰亚胺酯(N,N’-disuccinimidyl carbonate)或氯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxylsuccimidyl chloroformate)、酶促氧化、烷基卤素、异氰酸酯等耦合；5.具醛和酮反应性：交联剂与含醛(-CHO)或酮(R2CO)的分子，例如用于希夫碱生成反应或还原胺化反应的联胺衍生物等耦合；6.具活性氢反应性，例如用于曼尼赫缩合反应和碘化反应的重氮衍生物；和7.具光反应性，例如芳基迭氮化物(aryl azide)和卤代芳基迭氮化物(halogenated aryl azide)、二苯基酮、重氮化合物、二氮吮衍生物(参见专利US 10,744,207)。
有一些反应基团可以与多种官能基团反应。因此，每个类别都有子类别，每个子类别都包含多种化学药品。每个类别下的适用化学药品在本领域中是已知的，例如在Greg THermanson所著的BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996中，通过引用将其并入本文中。
示例性交联剂还包含聚乙二醇(PEG)，也称为聚环氧乙烷(PEO)。间隔物(Spacers)可作为具有纯烃间隔臂的试剂的替代品。PEG间隔物提高了试剂和接合物的水溶性，降低了接合物聚合的可能性，同时增加了交联剂的灵活性，从而降低间隔物本身免疫性反应。与包含有不同PEG链长的异质混合物的典型PEG试剂相反，这些PEO试剂是具有确定的分子量和5臂长间隔物的均质化合物，为交联应用时的优化和鉴定提供较佳的精确性。例如，范例中使用琥珀酰亚胺基-[(N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-六乙二醇]酯
(succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-hexaethyleneglycol]ester，通过溶解5mg的NHS-PEO6-顺丁烯二酰亚胺(NHS-PEO6-maleimide)(Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL 61105)来制备原液。
在一些实施例中，接合作用可以产生羧基或羰基，或胺基或硫基的等价物。此类基团的实例包含但不限于酮、酰亚胺、硫酮、酰胺、酰亚胺酰胺(imidamide)、硫酰胺、酯、亚胺酯(imidoester)、硫酯、胺甲酸酯、尿素、硫脲、碳酸酯、carbonimidate、和carbonthioate。在一些实施例中，接合作用可以产生腙或肟键。在一些实施例中，接合作用可以产生双硫键。在一些实施例中，可以使用天然化学连接(Native Chemical Ligation，NCL)法来接合连结子。连结子和耦合基团的其他实例公开于专利WO2010118235A1中，通过引用将其并入本文中。
在一些实施例中，连结子包含PEG区域或NHS酯。在一些实施例中，靶向部分通过NHS酯、经活化的酯、卤烷或酰卤、双官能交联剂、或顺丁烯二酰亚胺基团与第一连结子(例如多肽)接合。
将靶向部分添加到产生的细胞群的细胞的表面的示范性程序提供于下。普通技术人员应当理解，可以采用这些程序的变化型和其他替代方案来通过将靶向部分添加到细胞表面修饰本文所述的细胞群。
在一些实施例中，使用互补的多核苷酸作为连结子制备ACE-gdT细胞。示例性方法可以包含：(A)通过将第一ssDNA连结子耦合到gdT细胞制备gdT-ssDNA接合物；(B)通过将第二ssDNA连结子耦合到靶向部分制备靶向部分-ssDNA接合物；(C)通过混合gdT-ssDNA接合物和靶向部分-ssDNA接合物并使互补的ssDNA连结子们杂交制备ACE-gdT细胞。
为了说明的目的，步骤(A)可以包含步骤(a1)～(a4)：(a1)取得第一ssDNA(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3)；(a2)用硫醇基团修饰第一ssDNA的5’端(具硫醇修饰5’端的第一ssDNA)以取得细胞连结子原液(参见例如Zimmermann,J，2010，Nat.Protoc.5(6)：975-985；也可购自Integrated DNA Technologies)；(a3)混合10-500μL的细胞连结子原液和0.1-10μL的NHS-顺丁烯二酰亚胺(SMCC，Fisher Scientific)，并反应1-60分钟；以及(a4)将步骤(a3)得到的混合物与1×106-1×109个gdT细胞反应1-60分钟。
类似地，步骤(B)可以包含步骤(bl)～(b4)：(bl)取得第二ssDNA(例如，SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6)；(b2)用硫醇基团修饰第二ssDNA的5’端(具硫醇修饰5’端的第二ssDNA)以取得靶向部分连结子原液(参见例如，Zimmermann,J，2010；也可购自Integrated DNA Technologies)；(b3)混合10-500μL的靶向部分连结子原液和0.1-10μL的NHS-顺丁烯二酰亚胺(SMCC，Fisher Scientific)，并反应1-60分钟；和(b4)将从步骤(b3)取得的混合物与10-100μL的靶向部分原液(例如，利妥昔单抗(rituximab)或曲妥珠单抗(trastuzumab))反应10分钟至3小时。
在一些实施例中，步骤(C)可以包含混合gdT-ssDNA接合物和100-500μL的靶向部分-ssDNA接合物以使互补的ssDNA连结子们形成复合物。
5.2.3表达CAR和TCR的细胞
在一些实施例中，靶向部分作为受体蛋白的细胞外结构域外源性地表达于本文提供的gdT细胞表面上。受体蛋白可以包含细胞外结构域、细胞内结构域和跨膜序列，其中细胞外结构域包含靶向部分。在一些实施例中，受体蛋白为嵌合抗原受体(「CAR」)。在一些实施例中，受体蛋白为T细胞受体(「TCR」)。
5.2.3.1CARs
在一些实施例中，受体是CAR，并且本文提供的细胞群中的gdT细胞经修饰表达CAR。CAR是将免疫细胞(例如，T细胞)重新靶向肿瘤表面抗原的合成受体(Sadelain等人，Nat.Rev.Cancer.3(1)：35-45(2003)；Sadelain等人，Cancer Discovery 3(4)：388-398(2013))。CAR是经工程改造过的受体，它提供抗原结合和免疫细胞活化功能。CAR可以用来把抗体(例如单株抗体)的特异性移植到免疫细胞(例如gdT细胞)上。第一代受体将负责抗原辨识的抗体衍生肿瘤结合元件(antibody-derived tumor-binding element)，例如scFv与触发T细胞活化的CD3zeta或Fc受体讯息传递结构域连接起来。结合了活化和共刺激讯息传递结构域的第二代CAR的出现，已于化疗难治性的B细胞恶性肿瘤患者上产生令人鼓舞的结果(Brentjens等人，Science Translational Medicine 5(177)：177ra38(2013)；Brentjens等人，Blood 118(18)：4817-4828(2011)；Davila等人，Science TranslationalMedicine 6(224)：224ra25(2014)；Grupp等人，N.Engl.J.Med.368(16)：1509-1518(2013)；Kalos等人，Science Translational Medicine 3(95)：95ra73(2011))。CAR的细胞外抗原结合结构域通常源自单株抗体(mAb)或源自受体或其配体。CAR结合抗原后将触发细胞内结构域中免疫受体酪胺酸活化基序
(Immune-receptor-Tyrosine-based-Activation-Motif，ITAM)的磷酸化，从而启动诱导细胞溶解、分泌细胞激素和增生所需的传讯级联反应。
在一些实施例中，CAR可为「第一代」、「第二代」或「第三代」CAR(请见，例如，Sadelain等人，Cancer Discov.3(4)：388-398(2013)；Jensen等人，Immunol.Rev.257：127-133(2014)；Sharpe等人，Dis.Model Mech.8(4)：337-350(2015)；Brentjens等人，Clin.Cancer Res.13：5426-5435(2007)；Gade等人，Cancer Res.65：9080-9088(2005)；Maher等人，Nat.Biotechnol.20：70-75(2002)；Kershaw等人，J.Immunol.173：2143-2150(2004)；Sadelain等人，Curr.Opin.Immunol.21(2)：215-223(2009)；Hollyman等人，J.Immunother.32：169-180(2009))。
「第一代」CAR通常由与跨膜结构域融合的细胞外抗原结合结构域，例如单链可变片段(scFv)组成，所述跨膜结构域与T细胞受体链的细胞质/细胞内结构域融合。「第一代」CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，其为内源性T细胞受体(TCR)讯息的主要传递器。「第一代」CAR可以提供新生的抗原识别，并通过他们在单融合分子中的CD3ζ链讯息传递结构域导致CD4+和CD8+T细胞的活化，不依赖于HLA介导的抗原呈现。「第二代」CAR包含一个癌症抗原结合结构域，该结构域融合了一个能够活化T细胞等免疫细胞的细胞内讯息传递结构域和一个设计来增强免疫细胞(例如T细胞)的效力和持久性的共刺激结构域(Sadelain等人，Cancer Discov.3：388-398(2013))。因此，CAR的设计可以把抗原识别与讯息传递结合起来，这两种功能在生理上由TCR异二聚体和CD3复合物两种分开的复合物负责。「第二代」CAR在CAR细胞质的尾端包含来自各种共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40等)的细胞内结构域，来对细胞提供额外的讯息。「第二代」CAR既提供共刺激，例如通过CD28或4-1BB结构域，也提供活化，例如通过CD3ζ讯息传递结构域。研究表明，「第二代」CARs可以提高T细胞的抗肿瘤活性。「第三代」CAR提供多种共刺激，例如，通过包含CD28和4-1BB结构域，和活化，例如，通过包含CD3ζ活化结构域。「第四代」CARs是以第二代CAR为基础，但包含一种在CAR活化过程中持续性地或诱导性表达的蛋白质，例如间白素12(IL-12)。转导了这些第四代CAR的T细胞称为通用细胞激素介导杀伤重新定向T细胞(TRUCK)。这些CAR的活化促进所需细胞激素的产生和分泌，通过数种协同机制，如胞吐作用(穿孔素、颗粒酶)或死亡配体-死亡受体(Fas-FasL，TRAIL)系统来促进肿瘤杀伤。此外，目前正在研究「第五代」CAR；它们以第二代CAR为基础，但它们包含具有转录因子STAT3结合位点的截短的IL-2受体β链细胞质结构域。该受体的抗原特异性活化会同时触发TCR(通过CD3ζ结构域)、共刺激(CD28结构域)和细胞激素(JAK-STAT3/5)讯息传导，所述有效地提供欲驱动T细胞的完整活化和增生于生理上所需的三种协同讯息。上述CAR的其他变体(例如双CARs、分裂CARs和可诱导的分裂CARs)已被生成，以进一步增强经转输的T细胞的特异性和控制(Tokarew等人，British journal of cancer，120.1(2019):26-37)。
如上所述，CAR还包含在表达CAR的免疫细胞中起作用的讯息传递结构域。这种讯息传递结构域可以，例如，源自CDζ或Fc受体γ(参见Sadelain等人，Cancer Discov.3：388-398(2013))。通常，讯息传递结构域将在转导的免疫细胞(例如T细胞)中诱导持久性、运输(trafficking)和/或效应器(effector)等功能(Sharpe等人，Dis.Model Mech.8：337-350(2015)；Finney等人，J.Immunol.161：2791-2797(1998)；Krause等人，J.Exp.Med.188：619-626(1998))。在CDζ或Fc受体γ的情况下，讯息传递结构域对应于相应多肽的细胞内结构域或足以产生讯息传递的细胞内结构域片段。下文更详细地描述了示例性的讯息传递结构域。
CD3ζ：在一个非限制性实施例中，CAR可以包含衍生自CD3ζ多肽的讯息传递结构域，例如，衍生自CD3ζ细胞内结构域的讯息传递结构域，其能活化或刺激例如T细胞等的免疫细胞。CD3ζ包含3个免疫受体酪胺酸活化基序(Immune-receptor-Tyrosine-based-Activation-Motif，ITAM)，并在抗原结合后将活化讯息传递给细胞，例如T细胞等的淋巴谱系细胞。CD3ζ多肽可以具有对应于GenBank No.NP_932170(NP_932170.1，GI：37595565；见下文)的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CD3ζ多肽具有下文提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52至164的氨基酸序列，或其足以产生讯息传递活性的片段。示例性CAR具有包含CD3ζ多肽的细胞内结构域，所述CD3ζ多肽包含下文提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52至164。另一个示例性CAR具有包含CD3ζ多肽的细胞内结构域，该CD3ζ多肽包含下文提供的CD3ζ多肽的氨基酸52至164。再另一个示例性CAR具有包含CD3ζ多肽的细胞内结构域，该CD3ζ多肽包含下文提供的CD3ζ多肽的氨基酸52至164。见GenBank NP_932170以兹CD3ζ内的结构域的参考，例如，讯息胜肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至30；跨膜结构域，氨基酸31至51；胞内结构域，氨基酸52至164。
1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD
61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA
121 EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR(NP_932170；SEQ IDNO：27)
在某些非限制性实施例中，CAR的细胞内结构域可以进一步包含至少一个共刺激讯息传递结构域。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域可以包含两个共刺激讯息传递结构域。这种共刺激讯息传递结构域可以增加免疫细胞的活化。共刺激讯息传递结构域可以衍生自CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP10多肽、2B4多肽、CD27多肽、CD30多肽、CD40多肽等。包含4-1BB、ICOS或DAP-10等共刺激信号传导区域的细胞内结构域的CAR先前已被描述(参见专利U.S.7,446,190，通过引用将其并入本文，该专利还描述了4-1BB、ICOS和DAP-10的代表性序列)。在一些实施例中，CAR的细胞内结构域可以包含共刺激讯息传递区域，其包含两种共刺激分子，例如CD28和4-1BB(参见Sadelain等人，Cancer Discov.3(4)：388-398(2013))，或CD28和OX40，或其他如本文所公开的共刺激配体的组合。
CD28：分化簇28(CD28)是一种在T细胞表达的蛋白质，可为T细胞的活化和存活提供共刺激信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白质的受体。在一个实施例中，CAR可以包含源自CD28的共刺激讯息传递结构域。例如，如本文所公开的，CAR可以包含至少一部分的CD28细胞内/细胞质结构域，例如可以起共刺激讯息传递结构域作用的细胞内/细胞质结构域。CD28多肽可以具有对应于如下提供的具有GenBank No.P10747(P10747.1，GI：115973)或NP_006130(NP_006130.1，GI：5453611)的氨基酸序列或其片段。如果需要，本发明的CAR可以包含细胞内结构域外的其他CD28序列。例如，CAR可以包含CD28多肽的跨膜序列。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于CD28氨基酸180至220的CD28细胞内结构域或其片段的氨基酸序列。在另一个实施例中，CAR可以具有包含对应于氨基酸153至179的CD28跨膜结构域或其片段的氨基酸序列。示例性的CAR可以包含对应于CD28细胞内结构域的共刺激讯息传递结构域。示例性CAR还可以包含衍生自CD28的跨膜结构域。因此，示例性CAR可以包含来自CD28的两个结构域，共刺激讯息传递结构域和跨膜结构域。在一个实施例中，CAR具有包含CD28跨膜结构域和细胞内结构域的氨基酸序列并且包含CD28的氨基酸153至220。在另一个实施例中，CAR包含CD28的氨基酸117至220。另一个示例性CAR可以包含CD28的跨膜结构域和细胞内结构域。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自CD28多肽的跨膜结构域，该跨膜结构域包含下文提供的CD28多肽的氨基酸153至179。见GenBank NP_006130以兹CD28内的结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至18；细胞外结构域，氨基酸19至152；跨膜结构域，氨基酸153至179；细胞内结构域，氨基酸180至220。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘的结构域短或长的CD28序列。
1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD
61 SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP
121 PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR
181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS(NP_006130；SEQ ID NO：28)
4-1BB：4-1BB，又叫肿瘤坏死因子受体超家族成员9，可作为肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自4-1BB的共刺激讯息传递结构域。4-1BB多肽可以具有对应于GenBank No.P41273(P41273.1，GI：728739)或NP_001552(NP_001552.2，GI：5730095)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于氨基酸214至255的4-1BB细胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有对应于氨基酸187至213或其片段的4-1BB跨膜结构域。示例性CAR可具有包含如下提供的4-1BB多肽的细胞内结构域(例如，NP_001552的氨基酸214至255)。请见GenBankNP_001552以兹4-1BB内结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至17；细胞外结构域，氨基酸18至186；跨膜结构域，氨基酸187至213；细胞内结构域，氨基酸214至255。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘的结构域短或长的4-1BB序列。
1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR
61 TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC
121 CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE
181 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG
241 CSCRFPEEEE GGCEL(NP_001552；SEQ ID NO：29)
OX40：OX40，又叫肿瘤坏死因子受体超家族成员4前驱物或CD134，是TNFR-超家族受体的成员。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自OX40的共刺激讯息传递结构域。OX40多肽可具有对应于下文提供的具有GenBank No.P43489(P43489.1，GI：1171933)或NP_003318(NP_003318.1，GI：4507579)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于氨基酸236至277的OX40细胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有包含对应于OX40氨基酸215至235的OX40跨膜结构域或其片段的氨基酸序列。请见GenBank NP_003318以兹OX40内结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至28；细胞外结构域，氨基酸29至214；跨膜结构域，氨基酸215至235；细胞内结构域，氨基酸236至277。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的OX40序列。
1 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ
61 NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK
121 PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ
181 GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL
241 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI(NP_003318；SEQ ID NO：30)
ICOS：可诱导型T细胞共刺激剂前驱物(Inducible T-cell costimulatorprecursor，ICOS)，又叫CD278，是一种表达于活化的T细胞的CD28超家族共刺激分子。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自ICOS的共刺激讯息传递结构域。ICOS多肽可具有对应于下文提供的具有GenBank No.NP_036224(NP_036224.1，GI：15029518)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于ICOS氨基酸162至199的ICOS细胞内结构域的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有包含对应于ICOS氨基酸141至161的ICOS跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。请见GenBank NP_036224以兹ICOS内结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至20；细胞外结构域，氨基酸21至140；跨膜结构域，氨基酸141至161；细胞内结构域，氨基酸162至199。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘的结构域短或长的ICOS序列。
1 MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ
61 ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK
121 VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY
181 MFMRAVNTAK KSRLTDVTL(NP_036224；SEQ ID NO：31)
DAP10：DAP10，又叫造血细胞讯息传递传感器，是一种与造血细胞中的一个大受体家族相关的讯息传递子单元。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自DAP10的共刺激结构域。DAP10多肽可具有对应于下文提供的具有GenBank No.NP_055081.1(GI：15826850)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于氨基酸70至93的DAP10细胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有对应于氨基酸49至69的DAP10跨膜结构域或其片段。请见GenBank NP_055081.1以兹DAP10内结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至19；细胞外结构域，氨基酸20至48；跨膜结构域，氨基酸49至69；细胞内结构域，氨基酸70至93。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的DAP10序列。
1 MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
61 SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG(SEQ ID NO：32)
CD27：CD27(TNFRSF7)是在人类CD8+和CD4+T细胞的亚群、NKT细胞、NK细胞的亚群和造血前身细胞上表达的跨膜受体并在FOXP3+CD4 T细胞和B细胞的亚群中被诱导。先前的研究发现，CD27可以活跃地提供共刺激信号，以提高人类T细胞体内的存活率和抗肿瘤活性。请见Song和Powell；Oncoimmunology 1，no.4(2012)：547-549。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自CD27的共刺激结构域。CD27多肽可具有对应于下文提供的具有UniProtKB/Swiss-Prot No.：P26842.2(GI：269849546)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含CD27细胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有CD27的跨膜结构域或其片段。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的CD27序列。
1 MARPHPWWLC VLGTLVGLSA TPAPKSCPER HYWAQGKLCC QMCEPGTFLV KDCDQHRKAA
61 QCDPCIPGVS FSPDHHTRPH CESCRHCNSG LLVRNCTITA NAECACRNGW QCRDKECTEC
121 DPLPNPSLTA RSSQALSPHP QPTHLPYVSE MLEARTAGHM QTLADFRQLP ARTLSTHWPP
181 QRSLCSSDFI RILVIFSGMF LVFTLAGALF LHQRRKYRSN KGESPVEPAE PCHYSCPREE
241 EGSTIPIQED YRKPEPACSP(SEQ ID NO:33)
CD30：CD30及其配体(CD30L)分别为肿瘤坏死因子受体(TNFR)和肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。CD30在许多方面的表现与OX40相似，并且可以藉由TCR的刺激诱导增强增生和细胞激素的生成。Goronzy和Weyand，Arthritis research&therapy 10，no.S1(2008)：S3。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自CD30的共刺激结构域。CD30多肽可具有对应于下文提供的具有GenBank No.：AAA51947.1(GI：180096)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含CD30细胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有CD30的跨膜结构域或其片段。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的CD30序列。
1 MRVLLAALGL LFLGALRAFP QDRPFEDTCH GNPSHYYDKA VRRCCYRCPM GLFPTQQCPQ
61 RPTDCRKQCE PDYYLDEADR CTACVTCSRD DLVEKTPCAW NSSRVCECRP GMFCSTSAVN
121 SCARCFFHSV CPAGMIVKFP GTAQKNTVCE PASPGVSPAC ASPENCKEPS SGTIPQAKPT
181 PVSPATSSAS TMPVRGGTRL AQEAASKLTR APDSPSSVGR PSSDPGLSPT QPCPEGSGDC
241 RKQCEPDYYL DEAGRCTACV SCSRDDLVEK TPCAWNSSRT CECRPGMICA TSATNSCARC
301 VPYPICAAET VTKPQDMAEK DTTFEAPPLG TQPDCNPTPE NGEAPASTSP TQSLLVDSQA
361 SKTLPIPTSA PVALSSTGKP VLDAGPVLFW VILVLVVVVG SSAFLLCHRR ACRKRIRQKL
421 HLCYPVQTSQ PKLELVDSRP RRSSTQLRSG ASVTEPVAEE RGLMSQPLME TCHSVGAAYL
481 ESLPLQDASP AGGPSSPRDL PEPRVSTEHT NNKIEKIYIM KADTVIVGTV KAELPEGRGL
541 AGPAEPELEE ELEADHTPHY PEQETEPPLG SCSDVMLSVE EEGKEDPLPT AASGK(SEQID NO：34)
CD40：CD40及其配体(CD40L或CD154)一开始被认为有助于T细胞依赖性的B细胞活化。该途径现在被认为是一种活化APC并增强其活化T细胞能力的机制。CD154介导的CD40刺激为CD28-CD80/CD86的初始共刺激途径提供重要的反馈机制。Goronzy和Weyand，Arthritis research&therapy 10，no.S1(2008)：S3。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自CD40的共刺激结构域。CD40多肽可具有对应于下文提供的具有UniProtKB/Swiss-ProtNo.：P25942.1(GI：269849546)序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含CD40细胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有CD40的跨膜结构域或其片段。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的CD40序列。
1MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL
61 PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV
121 LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN
181 KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD
241 DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ(SEQ ID NO：35)
CAR的细胞外结构域可以与前导(leader)胜肽或讯息胜肽融合，所述胜肽引导新生蛋白进入内质网并使其随后易位至细胞表面。应当理解的是，一旦含有讯息胜肽的多肽在细胞表面表达，该讯息胜肽通常在多肽于内质网中进行加工并转移到细胞表面的过程中经由蛋白水解被移除。因此，诸如CAR的多肽通常在细胞表面以没有讯息胜肽的成熟蛋白形式表达，而前驱体形式的多肽则包含讯息胜肽。如果CAR需要醣基化和/或锚定在细胞膜中，则讯息胜肽或前导可为必不可少的。讯息序列或前导序列是多肽，通常存在于新合成蛋白质的N端，引导它们进入分泌途径。讯息胜肽与CAR细胞外抗原结合结构域的N端共价性地连接成为一个融合蛋白质。在一个实施例中，讯息胜肽包含CD8多肽，其包含氨基酸MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：36)。应当理解的是CD8讯息胜肽的使用是示范例。本领域所熟知的任何合适的信号胜肽都可以应用在CAR上，以用来在免疫细胞中提供细胞表面的表达(见Gierasch Biochem.28：923-930(1989)；von Heijne，J.Mol.Biol.184(1)：99-105(1985))。特别有用的讯息胜肽可以衍生自本文提供的免疫细胞中原生表达的细胞表面蛋白，包含任何本文公开的多肽的讯息胜肽。因此，任何合适的讯息胜肽皆可用来引导CAR表达于本文提供的免疫细胞的细胞表面。
在某些非限制性的实施例中，CAR的细胞外抗原结合结构域可以包含连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区的连结子序列或胜肽连结子。在一个非限制性实例中，连结子包含具有所列的氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：37)。
在某些非限制性实施例中，CAR还可以包含将CAR的结构域彼此连接的间隔物区或序列。例如，间隔物可以包含在讯息胜肽和抗原结合结构域间、在抗原结合结构域和跨膜结构域间、在跨膜结构域和细胞内结构域间、和/或细胞内结构域内的结构域之间，例如，在刺激结构域和共刺激结构域间。间隔物区可以够灵活到让各个结构域可以与其他多肽相互作用，例如可以让抗原结合结构域在方向上具有灵活性以促成抗原识别。间隔物区可以是例如来自IgG的铰链区、免疫球蛋白的CH2CH3(恒定)区和/或部分的CD3(分化簇3)或适合作为间隔物的一些其他序列。
CAR的跨膜结构域通常包含跨越至少一部分细胞膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域会导致不同的受体稳定度。抗原识别后，受体聚集并将讯息传递给细胞。在一个实施例中，CAR的跨膜结构域可以衍生自在免疫细胞中原生表达的另一个多肽。在一个实施例中，CAR可以具有衍生自CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、或在免疫细胞中表达的其他多肽的跨膜结构域。或者，跨膜结构域可以衍生自不在免疫细胞中原生表达的多肽，只要该跨膜结构域可以作用于将讯息从抗原与CAR结合传递到细胞内讯息传递结构域和/或共刺激结构域。应当理解的是根据需要，包含多肽跨膜结构域的多肽部分可以包含来自该多肽的额外序列，例如，与跨膜结构域的N-端或C-端相邻的额外序列，或多肽的其他区域。
CD8：分化簇8(CD8)是一种跨膜醣蛋白，作为T细胞受体(TCR)的共同受体。CD8与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，且对I类MHC蛋白具有特异性。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自CD8的跨膜结构域。CD8多肽可以具有对应于下文提供的具有GenBank No.NP_001139345.1(GI:225007536)序列的氨基酸序列，或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于氨基酸183至203的CD8跨膜结构域的氨基酸序列，或其片段。在一个实施例中，示例性CAR具有衍生自CD8多肽的跨膜结构域。在一个非限制性实施例中，CAR可包含衍生自CD8多肽包含氨基酸183至203的跨膜结构域。此外，CAR可包含铰链结构域，其包含下文提供的CD8多肽的氨基酸137–182。在另一个实施例中，CAR可以包含下文提供的CD8多肽的氨基酸137-203。在又一个实施例中，CAR可以包含下文提供的CD8多肽的氨基酸137至209。请见GenBank NP_001139345.1以兹CD8内结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至21；细胞外结构域，氨基酸22至182；跨膜结构域氨基酸，183至203；细胞内结构域，氨基酸204至235。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含超出氨基酸183至203的跨膜结构域的额外的CD8序列。还应当理解，如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的CD8序列。
1 MALPVTALLL PLALLLHAAR PSQFRVSPLD RTWNLGETVE LKCQVLLSNP TSGCSWLFQP
61 RGAAASPTFL LYLSQNKPKA AEGLDTQRFS GKRLGDTFVL TLSDFRRENE GYYFCSALSN
121 SIMYFSHFVP VFLPAKPTTT PAPRPPTPAP TIASQPLSLR PEACRPAAGG AVHTRGLDFA
181 CDIYIWAPLA GTCGVLLLSL VITLYCNHRN RRRVCKCPRP VVKSGDKPSL SARYV(NP_001139345.1；SEQ ID NO:38)
CD4：分化簇4(CD4)，又叫T细胞表面醣蛋白CD4，是一种发现在例如辅助性T细胞、单核细胞、巨噬细胞、和树突状细胞等免疫细胞表面的醣蛋白。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自CD4的跨膜结构域。CD4以多种同功型存在。应当理解的是，可以选择任何同功型来达到所需作用。示例性同功型包含同功型1(NP_000607.1，GI：10835167)、同功型2(NP_001181943.1，GI:303522479)、同功型3(NP_001181944.1，GI：303522485；或NP_001181945.1，GI：303522491；或NP_001181946.1，GI：303522569)等。下面提供了一种示例性同功型同功型1的序列。在一个实施例中，CAR可以具有包含对应于氨基酸397至418的CD4跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。参见GenBank NP_000607.1以兹CD4内的结构域的参考，例如讯息胜肽，氨基酸1至25；细胞外结构域，氨基酸26至396；跨膜结构域氨基酸，397至418；细胞内结构域，氨基酸419至458。应当理解的是如果需要，CAR中可以包含超出氨基酸397至418跨膜结构域的额外CD4序列。还应当理解，如果需要，CAR中可以包含较特定描绘结构域短或长的CD4序列。
1 MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK
61 ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL
121 LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG
181 TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW
241 QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA
301 LEAKTGKLHQ EVNLVVMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV
361 LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW STPVQPMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFFCV
421 RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI(NP_000607.1；SEQ ID NO：39)
FcRγ：活化类型的IgG受体FcγR形成多聚体复合物，包括Fc受体公用的γ链(FcRγ)，其含有细胞内酪胺酸活化基序(Tyrosine-based-Activation-Motifs，ITAM)，它的活性化触发氧化爆发、释放细胞激素、吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和去颗粒化(degranulation)。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自FcRγ的跨膜结构域。在一个实施例中，CAR可以包含衍生自FcRγ的共刺激结构域。FcRγ多肽可以具有对应于具有以下提供的NCBI参考序列：NP_004097.1(GI：4758344)序列的氨基酸序列，或其片段。在一个实施例中，CAR可以具有包含FcRγ胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施例中，CAR可以具有FcRγ的跨膜结构域或其片段。
1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV RKAAITSYEK
61 SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ(SEQ ID NO：40)
本文提供的CAR可以包含如上文公开的靶向部分。本文提供的GdT细胞可以在细胞内表达靶向选自以下组合的肿瘤抗原的CAR，该组合由CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、B细胞成熟抗原(BCMA)、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、癌胚抗原(CEA)、Her2、GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、GPC3、间皮素(Mesothelin)、前列腺特异膜抗原(PSMA)、ROR1、上皮成长因子受体(EGFR)、MUC1、和NY-ESO-1所组成。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞可以表达具有靶向选自以下组合的肿瘤抗原的抗体或抗原结合单元的CAR，该组合由CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、B细胞成熟抗原(BCMA)、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、癌胚抗原(CEA)、Her2、GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、GPC3、间皮素(Mesothelin)、前列腺特异膜抗原(PSMA)、ROR1、上皮成长因子受体(EGFR)、MUC1和NY-ESO-1所组成。
出于示例性的目的，在一些实施例中，CAR包含抗CD19的抗体作为靶向部分。在一些实施例中，CAR包含抗B细胞成熟抗原(BCMA)的抗体作为靶向部分。在一些实施例中，CAR包含抗CD22的抗体作为靶向部分。在一些实施例中，CAR包含抗CD20的抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))。在一些实施例中，CAR包含抗HER2的抗体(例如，曲妥珠单抗(trastuzumab))。
5.2.3.2TCRs
在一些实施例中，靶向部分作为受体蛋白的一部分外源性地表达在细胞表面。在一些实施例中，受体蛋白是TCR。TCR是抗原特异性的分子，负责识别抗原呈现细胞(APC)或任何有核细胞表面上的MHC产物中所呈现的抗原胜肽。这个系统通过其TCR赋予T细胞识别整批由细胞表达的细胞内抗原(包括病毒蛋白)的潜在能力，这些抗原被加工成短肽，与细胞内的MHC分子结合，然后作为胜肽-MHC复合物被递送到细胞表面。这个系统让外来蛋白质(例如，突变的癌症抗原或病毒蛋白质)或异常表达的蛋白质可以成为T细胞的靶标(例如，Davis和Bjorkman(1988)Nature，334，395-402；Davis等人，(1998)Annu Rev Immunol，16，523-544)。
根据结合的亲和力(或解离速率)，TCR和胜肽-MHC复合物的相互作用可以驱动T细胞进入不同的活化状态。TCR的识别过程让T细胞可以藉由提供多样性的TCR库来区分正常健康的细胞和例如已经藉由病毒或恶性肿瘤而成为经转化的细胞，其中有很高的可能性会存在着一个或多个TCR的外来胜肽与MHC分子结合的结合亲和力高于能刺激T细胞活性的阈值(Manning和Kranz(1999)Immunology Today，20，417-422)。
研究显示通过体外培养识别的从人类或小鼠T细胞株分离出的野生型TCR具有相对较低的结合亲和力(KD＝1-300μM))(Davis等人(1998)Annu Rev Immunol，16，523–544)。部分原因是T细胞在胸腺发育时经过对自身-胜肽-MHC配体的负向选汰(耐受性诱导)，这使亲和力太高的T细胞被淘汰(Starr等人(2003)Annu Rev Immunol，21，139–76)。为了弥补这些相对较低的亲和力，T细胞演化出一种共受体系统，其中细胞表面分子CD4和CD8与MHC分子结合(分别和II类和I类)，并在介导讯息传递的活动中与TCR协同作用。CD8在此过程中特别有效，可以让具有非常低亲和力(例如，KD＝300μM)的TCR介导高效的抗原特异性活性。
定向演化可用来生成对特定胜肽-MHC复合物具有较高亲和力的TCR。可以使用的方法包含酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol，4，55-62；Holler等人(2000)ProcNatl Acad Sci USA，97，5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol，23，349-54)、和T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods，339，175-84)。三种方法都涉及工程改造或修饰TCR，其展现野生型TCR的正常、低亲和力，以增加对同源胜肽-MHC复合物(T细胞对其具有特异性的原始抗原)的亲和力。
因此，在一些实施例中，本文提供的gdT细胞可以在细胞表面外源性地表达TCR。在一些实施例中，TCR包含α(α)链和β(β)链(分别由TRAC和TRBC编码)。人类TRAC可以具有对应UniProtKB/Swiss-Prot No.：P01848.2(登录号：P01848.2 GI：1431906459)的氨基酸序列。人类TRBC可以具有对应GenBank序列ALC78509.1(登录号：ALC78509.1 GI：924924895)的氨基酸序列。在一些实施中，TCR包含γ链(γ)和δ(δ)链(分别由TRGC和TRDC编码)。人类TRGC可以具有对应UniProtKB/Swiss-Prot：P0CF51.1(登录号：P0CF51.1 GI：294863156)的氨基酸序列，或对应UniProtKB/Swiss-Prot：P03986.2(登录号：P03986.2 GI：1531253869)的氨基酸序列。人类TRDC可以具有对应UniProtKB/Swiss-Prot：B7Z8K6.2(登录号：B7Z8K6.2 GI：294863191)的氨基酸序列。αβ链(或γδ链)的细胞外区域负责抗原识别和接合。抗原结合通过CD3多聚体复合物刺激下游讯息传递，该复合物为三个二聚体(εγ、εδ、ζζ)与αβ(或γδ)链的细胞内结构域相关联。
本文提供的TCR可以被基因工程改造以结合特定抗原。在一些实施例中，本文提供的gdT细胞可以表达具有靶向部分的TCR，该靶向部分靶向细胞中的肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、B细胞成熟抗原(BCMA)、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、癌胚抗原(CEA)、Her2、GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、GPC3、间皮素(Mesothelin)、前列腺特异膜抗原(PSMA)、ROR1、上皮成长因子受体(EGFR)、MUC1和NY-ESO-1所组成的群组。在一些实施例中，靶向部分是抗体或抗原结合单元，且本文提供的gdT细胞可以表达具有靶向肿瘤抗原的抗体或抗原结合单元的TCR，该肿瘤抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、B细胞成熟抗原(BCMA)、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、癌胚抗原(CEA)、Her2、GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、GPC3、间皮素(Mesothelin)、前列腺特异膜抗原(PSMA)、ROR1、上皮成长因子受体(EGFR)、MUC1和NY-ESO-1所组成的组合。
出于示例性的目的，在一些实施例中，TCR包含抗CD19的抗体作为靶向部分。在一些实施例中，TCR包含抗B细胞成熟抗原(BCMA)的抗体作为靶向部分。在一些实施例中，TCR包含抗CD22的抗体作为靶向部分。在一些实施例中，TCR包含抗CD20的抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))。在一些实施例中，TCR包含抗HER2的抗体(例如，曲妥珠单抗(trastuzumab))。
5.2.3.3生产含有CAR/TCR的gdT细胞的方法
关于修饰本文提供的gdT细胞以达重组性的表达本文公开的CAR或TCR，可以使用合适的表达载体将编码CAR或TCR的一种或多种核酸引入细胞中(例如，Rozenbaum等人，Frontiers in immunology11(2020)：1347)。在一些实施例中，本文提供了制造富含CARgdT细胞或TCR gdT细胞的细胞群的方法，所述gdT细胞具有类NK的特性，所述方法包含上文第5.1节所述的培养方法，进一步包含将编码CAR或TCR的核酸引入gdT细胞。如本领域普通技术人员应当理解的，可以在培养期间的不同时间点引入编码CAR或TCR的核酸。在一些实施例中，核酸在培养前期引入。在一些实施例中，核酸在培养的后期引入。在一些实施例中，编码CAR或TCR的核酸可以在培养的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天引入。在一些实施例中，编码CAR或TCR的核酸在gdT细胞扩增一段时间后(例如，1至10天、1至8天、1至6天、1至4天或1至2天)引入。在一些实施例中，编码CAR或TCR的核酸可以在第2天或以后、第3天或以后、第4天或以后、第5天或以后、或第6天或以后引入。在一些涉及去除abT细胞的实施例中，可以在去除abT细胞之前或之后将核酸引入gdT细胞。本领域普通技术人员将能够进一步优化程序。
为了说明的目的，下文提供了从PBMC制造富含具有类NK特性的CAR gdT细胞的细胞群的示例性方法，该方法包培养细胞16天并包含以下程序：
可以将一种或多种编码CAR或TCR的核酸引入目标gdT细胞。将多核苷酸引入宿主细胞的物理性方法包含磷酸钙沉淀法、脂质转染(lipofection)、粒子轰击法、显微注射法、电穿孔法等。在一些实施例中，可以使用DNA转染和转位子。在一些实施例中，使用睡美人系统或PiggyBac系统(例如，Ivics等人，Cell，91(4)：501-510(1997)；等人，(2007)Nucleic Acids Research.35(12)：e87)。将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包含胶体分散系统(例如大分子复合物)、奈米胶囊、微球、珠子、和以脂质作为基底的系统，包含水中油滴型乳化液、微胶粒、混合型微胶粒、和脂质体。脂质体(例如，人造膜囊泡)是用来作为体外和体内的递送载体的示例性胶体系统。
在一些实施例中，可以将编码CAR或TCR的核酸选殖到合适的载体上，例如逆转录病毒载体，并使用众所周知的分子生物学技术将其引入到目标gdT细胞中(见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999))。可以使用任何适合在细胞，特别是人类免疫细胞中表达的载体。所述载体含有合适的表达元件，例如提供编码的核酸在目标细胞中表达的启动子。在逆转录病毒载体的情况下，可以选择性地活化细胞以提高转导效率(见Parente-Pereira等人，J.Biol.Methods1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；Movassagh等人，Hum.Gene Ther.11：1189-1200(2000)；Rettig等人，Mol.Ther.8：29-41(2003)；Agarwal等人，J.Virol.72：3720-3728(1998)；Pollok等人，Hum.Gene Ther.10：2221-2236(1998)；Quinn等人，Hum.Gene Ther.9：1457-1467(1998)；也可参见商品化的方法，例如DynabeadsTM human T cell activatorproducts，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。
在一个实施例中，载体是反转录病毒载体，例如，γ反转录病毒载体或慢病毒载体，用它们来把CAR或TCR引入目标细胞内。为了对细胞进行基因修饰以表达CAR或TCR，通常使用反转录病毒载体来进行转导。然而，应当理解的是可以使用任何适合的病毒载体或非病毒性的递送系统。反转录病毒载体和洽当的包装细胞系的组合也是可行的，其中病毒壳蛋白具有感染人类细胞的活性。目前已知多种能生产双嗜性(amphotropic)病毒的细胞系，包含但不限于PA12(Miller等人，Mol.Cell.Biol.5：431-437(1985))；PA317(Miller等人，Mol.Cell.Biol.6：2895–2902(1986))；和CRIP(Danos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464(1988))。非双嗜性颗粒也是可行的，例如具有口泡性口炎病毒之醣蛋白(VSVG)、RD114或长臂猿白血病毒(GALV)套膜的假型(pseudotyped)颗粒和任何其他本领域已知的假型(pseudotyped)颗粒(Relander等人，Mol.Therap.11：452-459(2005))。可能的转导方法还包含直接将细胞与病毒生产细胞共同培养(例如，Bregni等人，Blood 80：1418-1422(1992))，或在含有或不含洽当的生长因子和多价阳离子下，将细胞与病毒上清液本身或浓缩的载体原液一同培养(参见，例如，Xu等人，Exp.Hemat.22：223-230(1994)；Hughes等人，J.Clin.Invest.89：1817-1824(1992))。
一般来说，所选载体展现高效的感染以及稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette等人，Human Gene Therapy 8：423-430(1997)；Kido等人，Current EyeResearch 15：833-844(1996)；Bloomer等人，J.Virol.71：6641-6649(1997)；Naldini等人，Science 272：263 267(1996)；和Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：10319-10323(1997))。可以使用的其他病毒载体包含例如腺病毒、慢病毒、和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒衍生的载体、或带状疱疹病毒，例如艾斯坦[氏]-巴尔[氏]病毒(参见，例如Miller，Hum.Gene Ther.1(1)：5-14(1990)；Friedman，Science 244：1275-1281(1989)；Eglitis等人，BioTechniques 6：608-614(1988)；Tolstoshev等人，CurrentOpin.Biotechnol.1：55-61(1990)；Sharp，Lancet 337：1277-1278(1991)；Cornetta等人，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.36：311-322(1989)；Anderson，Science 226：401-409(1984)；Moen，Blood Cells 17：407-416(1991)；Miller等人，Biotechnology7：980-990(1989)；Le Gal La Salle等人，Science 259：988-990(1993)；和Johnson，Chest 107：77S-83S(1995))。反转录病毒载体开发的特别完善并已在临床上使用(Rosenberg等人，N.Engl.J.Med.323：370(1990)；Anderson等人，美国专利号5,399,346)。
对表达本文公开的融合蛋白和/或合成受体特别有用的载体包含已用于人类基因治疗的载体。在一个非限制性的实施例中，载体是反转录病毒载体。在T细胞或其他免疫细胞(包括经工程改造过的T细胞)中使用反转录病毒载体来表达已被描述(参见Scholler等人，Sci.Transl.Med.4：132-153(2012)；Parente-Pereira等人，J.Biol.Methods 1(2)：e7(1-9)(2014)；Lamers等人，Blood 117(1)：72-82(2011)；Reviere等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：6733-6737(1995))。在一个实施例中，载体是SGF反转录病毒载体，例如SGFγ-反转录病毒载体，其为衍生自Moloney鼠白血病的反转录病毒载体。SGF载体曾于之前被描述(参见，例如，Wang等人，Gene Therapy 15：1454-1459(2008))。
本文使用的载体采用合适的启动子以兹在特定的宿主细胞中表达。启动子可以是可诱导型启动子或持续表现型启动子。在一个具体实施例中，表达载体的启动子提供在干细胞例如造血干细胞中的表达。在一个具体实施例中，表达载体的启动子提供在免疫细胞例如T细胞中的表达。也可以使用非病毒性的载体，只要该载体包含合适的表达元件以用来在目标细胞中表达。一些载体，例如反转录病毒载体，可以整合到宿主基因组中。如果需要，可以使用诸如核酸酶、类转录活化因子核酸酶(transcription activator-like effectornuclease，TALEN)、锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和/或常间回文重复序列丛集系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)、同源重组、非同源性末端接合、微同源介导的末端接合、同源介导的末端接合等技术来施行靶向的基因整合(Gersbach等人，Nucl.Acids Res.39：7868-7878(2011)；Vasileva等人CellDeath Dis.6：e1831.(Jul 23 2015)；Sontheimer，Hum.Gene Ther.26(7)：413-424(2015)；Yao等人Cell Research volume 27,第801–814页(2017))。
可以选择性地设计载体和构建体以包含报告分子。例如，可以设计载体以表达报吿蛋白，该报告蛋白会有助于辨别包含载体或载体提供的核酸(例如整合到宿主染色体的核酸)的细胞。在一个实施例中，报告分子可以透过具有融合蛋白或合成受体的双顺反子(bicistronic)或多顺反子(multicistronic)的表达构建体表达。示例性的报告蛋白包含但不限于萤光蛋白，例如mCherry、绿色萤光蛋白(GFP)、蓝色萤光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、和mKalama1)、青色萤光蛋白(例如ECFP、Cerulean、和CyPet)、以及黄色萤光蛋白(例如YFP、Citrine、Venus、和YPet)。
使用常规的分子生物学技术可以利用检定法来测定本文公开的融合蛋白或合成受体的转导效率。如果构建体中包含标志物，例如萤光蛋白，可以通过FACS分析监测基因转移效率来计量经转导的(例如，GFP+)免疫细胞(例如T细胞)的部分，和/或通过定量聚合酶链锁反应来监测。使用建立完善的共培养系统(Gade等人，Cancer Res.65：9080-9088(2005)；Gong等人，Neoplasia 1：123-127(1999)；Latouche等人，Nat.Biotechnol.18：405-409(2000))可以测定表达癌症抗原的成纤维细胞AAPC(与对照组相比)是否引导表达合成受体(例如CAR)的经转导的免疫细胞(例如T细胞)释放细胞激素(针对IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF进行细胞上清液LUMINEX(Austin TX)检定)、T细胞增生(通过羧基萤光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)标记)和T细胞存活率(通过膜联蛋白V(Annexin V)染色)。可以评估CD80和/或4-1BBL对T细胞存活、增生和功效的影响。T细胞可以经受癌症抗原阳性目标细胞的反复刺激，并且可以确认在反复刺激下T细胞的增生和细胞激素的反应是否维持或减弱。可以在同等的检定条件下并排比较癌症抗原CAR构建体。可以使用铬释放检定法来进行数个E：T比率的细胞毒性检定。
5.2.4医药组合物
本文还提供包含本文所述的富含gdT的细胞群和药学上可接受的载剂的医药组合物。在一些实施例中，本文提供的医药组合物可以进一步包含一种或多种额外的活性药剂，例如适合用来治疗所述医药组合物预期治疗的疾病的活性药剂。例如，可刺激或增强来自本文所述细胞群的ADCC反应的特异性结合肿瘤抗原的抗体，因此可以与本文所述细胞群或医药组合物共同使用。
「药学上可接受的载剂」或「药学上可接受的赋形剂」等词是指对个体施与药物时适合与活性药剂一起使用而不会引起不想要的生物效应或以有害的方式与医药组合物中的任何其他成份相互作用的物质。
在一些实施例中，医药组合物是水性制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮液，但也可以包含胶体、分散液、乳液、和多相材料。「水性制剂」一词的定义为包含至少50％w/w水的制剂。同样，「水溶液」一词的定义为包含至少50％w/w水的溶液，而「水性悬浮液」一词的定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。可用于本文提供的医药组合物的药学上可接受的载剂包含生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和延迟吸收剂等。药学上可接受的载剂可以包含，例如，缓冲液(例如中性缓冲食盐水、磷酸盐缓冲食盐水等)；碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇)；蛋白质；多肽或氨基酸(例如甘胺酸)；抗氧化剂；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)或麸胺基硫)；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施例中，医药组合物是冷冻保存的，医师或患者在使用前将溶剂和/或稀释剂添加于其中；同时可用于本文所述医药组合物的冷冻保存溶液包含例如二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施例中，本文提供的医药组合物基本上不含污染物。在一些实施例中，本文提供的医药组合物没有可检测到的污染物量。污染物包含例如内毒素、霉浆菌、细菌成分、和滋养细胞(例如，经转化的细胞)。
本文提供的医药组合物中的细胞群富含gdT细胞。在一些实施例中，作为药物使用的细胞群包含至少50％的gdT，例如超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过95％或超过99％的gdT细胞。在一些实施例中，作为药物使用的细胞群包含至少80％的gdT。在一些实施例中，作为药物使用的细胞群包含至少85％的gdT。在一些实施例中，作为药物使用的细胞群包含至少90％的gdT。在一些实施例中，作为药物使用的细胞群包含至少95％的gdT。在一些实施例中，细胞群富含CD69+gdT细胞。在一些实施例中，作为药物使用的细胞群包含至少70％的gdT细胞，其中(1)平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子；(2)至少30％的gdT细胞为CD69+；或(1)和(2)两者。在一些实施例中，细胞群包含至少70％的gdT细胞，其中(1)平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子和(2)至少30％的gdT细胞为CD69+。在一些实施例中，平均每个gdT细胞表达至少500、至少1000、至少2000、或至少3000个DNAM-1分子。在一些实施例中，至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的gdT细胞为CD69+。在作为药物使用的细胞群的一些实施例中，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的gdT细胞是TDEM细胞。
本文提供的医药组合物可以配制成，例如，用于非肠道(例如，静脉内、皮下、腹腔内、肌内、脊髓鞘内)给药。在一些实施例中，本文提供的医药组合物被配制成用于非肠道给药。在一些实施例中，本文提供的医药组合物中包含的载剂适用于非肠道给药(例如，通过注射或输液)。在一些实施例中，本文提供的医药组合物被配制成用于静脉内给药。在一些实施例中，本文提供的医药组合物中包含的载剂适用于静脉内给药。
本文提供的医药组合物可以储存在0℃或0℃以下。在一些实施例中，本文提供的细胞群或医药组合物在0℃或0℃以下储存至少一周、至少两周、至少1个月、至少3个月、至少6个月、或至少1年后可以维持其治疗效力。
在一些实施例中，本文提供的细胞群或医药组合物储存于4℃、0℃或-20℃或更低的温度下。在一些实施例中，本文提供的细胞群或医药组合物储存在设计来在低至4℃、0℃、-20℃或-80℃的温度下储存生物材料(例如，人类细胞或动物细胞)的容器内。
在一些实施例中，本文提供的细胞群或医药组合物被配制于冷冻培养基中并放置在低温储存装置(例如液氮冷冻机(-195℃)或超低温冷冻机(-65℃、-80℃或-120℃))中长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年、或至少5年。冷冻培养基可以包含二甲基亚砜(DMSO)、和/或氯化钠(NaCl)、和/或右旋糖、和/或硫酸葡聚醣和/或羟乙基淀粉(HES)，且带有生理pH缓冲剂以把pH值维持在约6.0至约6.5、约6.5至约7.0、约7.0至约7.5、约7.5至约8.0或约6.5至约7.5。冷冻保存的细胞群和医药组合物能保持它们的功能。在一些实施例中，制剂中不使用防腐剂。冷冻保存的细胞群和医药组合物可以解冻并作为异体的现成细胞产品施用于(例如，注入)多个患者。在一些实施例中，将细胞群解冻然后在施用前通过如本文所述的抗体、蛋白质、胜肽和/或细胞激素刺激细胞群来进一步加工。在一些实施例中，冷冻保存的细胞群在施用之前可以修饰以添加如本文所述的靶向部分。
5.3使用方法
本文公开的细胞群富含具有类NK特性的gdT细胞并且能够杀死目标细胞和调节免疫反应。因此，本文提供的细胞群和医药组合物可以作为药物使用。在一些实施例中，本文提供为有需要的个体治疗疾病或病症的方法，其包含向个体施用本文所述的细胞群或医药组合物。在一些实施例中，本文提供本文所述的细胞群或医药组合物用于治疗有需要的个体的疾病或病症的用途。在一些实施例中，本文提供本文所述的细胞群或医药组合物在制备用于治疗有需要的个体的疾病或病症的药物中的用途。
如本文所用的与疾病或病状、或患有疾病或病状的个体有关的「治疗」一词及其语法对等词是指抑制、消除、减少、和/或改善症状、症状的严重程度、和/或与正在治疗的疾病或病症相关的症状的频率的作用。例如，当用在癌症或肿瘤相关，「治疗」一词及其语法对等词是指降低癌症或肿瘤严重程度、或延缓或减缓癌症或肿瘤进展的作用，包含(a)抑制癌症或肿瘤的生长或阻止其发展，(b)导致癌症或肿瘤的消退，或(c)延迟、改善或最小化一种或多种与癌症或肿瘤的存在相关的症状。
如本文所用的「施用」一词及其语法对等词是指通过本文所述或其他本领域中已知的方法将治疗物或医药组合物递送或致使其递送至个体体内的行为。治疗物可以是化合物、多肽、抗体、细胞、或细胞群。施用治疗物或医药组合物包含开立将治疗物或医药组合物递送到个体体内的处方。
如本文所用，「有效量」、「治疗有效量」等词和它们的语法对等词是指以一个在对个体施用时能够对疾病、病症或病状的任何症状、面向或表征产生任何可检测到的正向影响的量，单独或作为医药组合物的一部分并且以单一剂量或作为一系列剂量的一部分向个体施用药剂。治疗有效量可以通过测量相关的生理影响来确定。确切的需求量因个体而异，取决于个体的年龄、体重和一般状况、所要治疗病症的严重程度、临床医生的判断等。任何个别病例中的恰当「有效量」可由本领域普通技术人员透过常规实验来测定。
如本文所用的「个体」一词是指任何动物(例如，脊椎动物)。个体包含但不限于人类、非人类的灵长类动物、猴、犬、猫、嚙齿动物等，它们将成为特定治疗的接受者。个体可以是人类。个体可以是哺乳动物。个体可以是家畜。个体可以是宠物。个体可以具有特定的疾病或病状。
在一些实施例中，本文提供的细胞群和医药组合物可以用于治疗癌症、传染病或发炎性疾病。在一些实施例中，本文提供的细胞群和医药组合物可用于调节有需要的个体的免疫反应。在一些实施例中，本文提供为需要的个体治疗癌症、传染病或发炎性疾病的方法，包含施用治疗有效量的本文所述细胞群。或者，施用包含细胞群的治疗有效量的医药组合物。
在一些实施例中，疾病或病症可以是癌症、肿瘤、自身免疫疾病、神经疾病、HIV感染、造血细胞相关疾病、代谢症候群、致病性疾病、病毒感染、真菌感染、原虫感染、或细菌感染。因此，本文提供的细胞群，包含利用本文描述的方法制备的那些细胞群，以及本文提供的医药组合物，可用于例如癌症治疗、自身免疫疾病的治疗、神经疾病的治疗、人类免疫不全病毒(HIV)的根除、造血细胞相关疾病、代谢症候群的治疗、致病性疾病的治疗、病毒感染的治疗、真菌感染的治疗、原虫感染的治疗、和细菌感染的治疗。在一些实施例中，本文所述的细胞群和医药组合物可用于治疗与异常细胞相关的疾病或病症。在一些实施例中，疾病或病症是过度增生性的疾病。
如上文所提供的，在一些实施例中，本文所述的细胞群或医药组合物经修饰以具有复合于gdT细胞表面的靶向部分。在一些实施例中，细胞群或医药组合物可用于治疗与异常细胞相关的疾病或病症。在一些实施例中，异常细胞表达靶向部分特异性结合的抗原，并且靶向部分和抗原之间的相互作用会诱导gdT细胞的ADCC反应，这造成疾病细胞的杀伤。
在一些实施例中，本文还提供了本文提供的细胞群或医药组合物在治疗肿瘤或癌症中的用途。在一些实施例中，本文提供在有需要的个体身上治疗肿瘤或癌症的方法，包含对个体施用本文提供的细胞群或医药组合物。在一些实施例中，肿瘤或癌症是固态肿瘤。在一些实施例中，肿瘤或癌症是血液癌症或液态癌症。在一些实施例中，本文所述的细胞群或医药组合物的gdT细胞在细胞表面具有靶向部分，该靶向部分包含特异性结合肿瘤抗原的抗体。
在一些实施例中，可用本文提供的细胞群或医药组合物治疗的疾病或病症是棘皮瘤(acanthoma)、腺细胞癌(acinic cell carcinoma)、听神经瘤(acoustic neuroma)、肢端小痣性黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)、汗腺顶端汗腺瘤(acrospiroma)、急性嗜酸性粒细胞白血病(acute eosinophilic leukemia)、急性淋巴母细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia)、急性巨核母细胞白血病(acute megakaryoblasticleukemia)、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia)、急性成熟骨髓芽球性白血病(acute myeloblastic leukemia with maturation)、急性髓源型树突状细胞白血病(acute myeloid dendritic cell leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myeloidleukemia)、急性前髓细胞白血病(acute promyelocytic leukemia)、牙釉母细胞瘤(adamantinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、腺样囊状癌(adenoid cystic carcinoma)、腺瘤(adenoma)、牙源性腺瘤样肿瘤(adenomatoid odontogenic tumor)、肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma)、成人型T细胞白血病(adult t-cell leukemia)、侵略性NK细胞白血病(aggressive NK-cell leukemia)、爱滋病相关癌症(AIDS-related Cancers)、爱滋病相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、肺泡状软组织肉瘤(alveolar soft partsarcoma)、造釉细胞性纤维瘤(ameloblastic fibroma)、肛门癌(anal cancer)、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)、甲状腺未分化癌(anaplastic thyroidcancer)、血管免疫芽细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic t-cell 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endocrine neoplasiasyndrome)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、蕈状肉芽肿(mycosis fungoides)、蕈状肉芽肿(mycosis fungoides)、骨髓增生性疾病(myelodysplastic disease)、骨髓增生异常症候群(myelodysplastic syndromes)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、骨髓性肉瘤(myeloid sarcoma)、骨髓增生性疾病(myeloproliferative Disease)、黏液瘤(myxoma)、鼻腔癌(nasal cavity cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)、肿瘤(neoplasm)、神经鞘瘤(neurinoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、神经纤维瘤(neurofibroma)、神经瘤(neuroma)、结节性恶性黑色素瘤(nodular melanoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、非黑色素瘤的皮肤癌(nonmelanoma skin cancer)、非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer)、眼部肿瘤(ocular oncology)、寡星状细胞瘤(oligoastrocytoma)、寡树突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、嗜酸细胞瘤(oncocytoma)、视神经鞘脑膜瘤(opticnerve sheath meningioma)、口腔癌(oral cancer)、口腔癌(oral cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、骨肉瘤(osteosarcoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、上皮卵巢癌(ovarian epithelial cancer)、卵巢生殖细胞肿瘤(ovarian germ cell tumor)、卵巢低恶性瘤(ovarian low malignant potentialtumor)、乳腺Paget氏疾病(Paget’s disease of the breast)、肺上沟癌(pancoasttumor)、胰脏癌(pancreatic cancer)、胰脏癌(pancreatic cancer)、乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer)、乳突瘤病(papillomatosis)、副神经节瘤(paraganglioma)、鼻窦癌(paranasal sinus cancer)、甲状旁腺腺瘤(parathyroidcancer)、阴茎癌(penile cancer)、血管周围上皮样细胞瘤(perivascular epithelioidcell tumor)、咽癌(pharyngeal cancer)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、中分化松果体实质肿瘤(pineal parenchymal tumor of intermediate differentiation)、松果体母细胞瘤(pineoblastoma)、垂体细胞瘤(pituicytoma)、垂体腺瘤(pituitary adenoma)、脑下垂体瘤(pituitary tumor)、浆细胞肿瘤(plasma cell neoplasm)、胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonary blastoma)、多胚瘤(polyembryoma)、T淋巴母细胞淋巴瘤(precursort-lymphoblastic lymphoma)、原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervoussystem lymphoma)、原发性体液淋巴瘤(primary effusion lymphoma)、原发性肝细胞癌(primary hepatocellular cancer)、原发性肝癌(primary liver cancer)、原发性腹膜癌(primary peritoneal cancer)、原始神经外胚层肿瘤(primitive neuroectodermaltumor)、前列腺癌(prostate cancer)、腹膜假黏液瘤(pseudomyxoma peritonei)、直肠癌(rectal cancer)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、与在第15号染色体上NUT基因相关的呼吸道癌(respiratory tract carcinoma involving the nut gene on chromosome15)、视网膜胚细胞瘤(retinoblastoma)、横纹肌瘤(rhabdomyoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、Richter转化(Richter’s transformation)、荐椎尾骨畸胎瘤(sacrococcygeal teratoma)、唾液腺肿瘤(salivary gland cancer)、肉瘤(sarcoma)、神经鞘瘤(schwannomatosis)、皮脂腺癌(sebaceous gland carcinoma)、继发性肿瘤(secondary neoplasm)、精原细胞瘤(seminoma)、浆液性肿瘤(serous tumor)、支持间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索间质肿瘤(sex cord-stromal tumor)、Sezary症候群(sezary syndrome)、印戒细胞癌(signet ring cell carcinoma)、皮肤癌(skincancer)、小蓝圆细胞肿瘤(small blue round cell tumor)、小细胞癌(small cellcarcinoma)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、小细胞淋巴癌(small celllymphoma)、小肠癌(small intestine cancer)、软组织肉瘤(soft tissue sarcoma)、体抑素瘤(somatostatinoma)、煤烟疣(soot wart)、脊髓肿瘤(spinal cord tumor)、脊髓肿瘤(spinal tumor)、脾脏缘带淋巴癌(splenic marginal zone lymphoma)、鳞状上皮细胞瘤(squamous cell carcinoma)、胃癌(stomach cancer)、表浅散播型黑色素瘤(superficialspreading melanoma)、小脑幕上神经外胚层母细胞瘤(supratentorial primitiveneuroectodermal tumor)、表面上皮间质肿瘤(surface epithelial-stromal tumor)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)、T细胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblasticleukemia)、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-cell large granular lymphocyteleukemia)、T细胞白血病(T-cell leukemia)、T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T幼淋巴细胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、畸胎瘤(teratoma)、末期淋巴癌(terminallymphatic cancer)、睪丸癌(testicular cancer)、鞘细胞瘤(thecoma)、咽喉癌(throatcancer)、胸腺癌(thymic carcinoma)、胸腺癌(thymoma)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肾盂、输尿管和过度上皮细胞癌(transitional cell cancer of renal pelvis andureter)、移形上皮细胞癌(transitional cell carcinoma)、脐尿管癌(urachal cancer)、尿道癌(urethral cancer)、泌尿生殖器肿瘤(urogenital neoplasm)、子宫肉瘤(uterinesarcoma)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma)、阴道癌(vaginal Cancer)、瓦-马二氏症(Verner Morrison syndrome)、疣状癌(verrucous carcinoma)、视觉通路神经胶质瘤(visual pathway glioma)、外阴肿瘤(vulvar cancer)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、华生氏肿瘤(Warthin’s tumor)、威尔母氏肿瘤(Wilms’tumor)。
一些实施例中，本文提供了本文所述的细胞群或医药组合物在过继免疫疗法中的用途。「过继免疫疗法」一词通常是指将免疫细胞转移至个体体内以治疗疾病，例如过度增生性的疾病、HIV或其他病毒感染性疾病、真菌感染性疾病、细菌感染性疾病、原虫感染性疾病、自身免疫性疾病、神经疾病、造血细胞相关疾病、代谢症候群、或致病性疾病。
过继免疫疗法可以是自体性的，即，细胞群被转移回取得该细胞群的相同患者，或者免疫疗法可以是异体的，意即，来自一个人的gdT细胞可以转移到不同的患者体中。在涉及异体转移的情况下，细胞群基本上不含ab T细胞。为了说明的目的，治疗的方法可以包含：从供体个体获得来源细胞群(例如，PBMC)；如本文所述培养来源细胞群以产生富含类NK的gdT细胞的细胞群；并将细胞群施用于一受体个体。
接受治疗的患者或个体可以是患有本文所述疾病或病症的人类病患。在一些实施例中，个体是癌症病患。在一些实施例中，个体是受病毒感染的患者(例如，被CMV感染或被HIV感染的患者)。在一些实施例中，个体曾经和/或正在接受癌症或肿瘤的治疗。
因为gdT细胞是非MHC限制性的，所以它们不会将它们转移入的宿主识别为外来物，所以不太会引起移植物抗宿主病。在一些实施例中，本文提供的细胞群和医药组合物可以「现成(off the shelf)」的使用并转移到任何接受者体中，用于例如异体的过继免疫疗法。如本文所述，通过本文所述方法获得的gdT细胞在不受任何活化的情况下表达细胞毒性特征，因此可能可以有效杀死肿瘤细胞或其他病原体。例如，如本文所述获得的gdT细胞可以在不受任何活化的情况下表达CD69、NKG2D、IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B中的一个或多个，优选者全部表达。在一些实施例中，通过本文所述的方法获得的gdT细胞表达高水平的NKG2D，因此对与恶性肿瘤相关的NKG2D配体(例如，MICA)产生反应。
在一些情况下，可以对个体施用治疗有效量的上述细胞群或医药组合物(例如，用于治疗癌症)。在一些情况下，治疗有效量的细胞群或医药组合物每个剂量包含约10×1012、约9×1012、约8×1012、约7×1012、约6×1012、约5×1012、约4×1012、约3×1012、约2×1012、约1×1012、约9×1011、约8×1011、约7×1011、约6×1011、约5×1011、约4×1011、约3×1011、约2×1011、约1×1011、约9×1010、约7.5×1010、约5×1010、约2.5×1010、约1×1010、约7.5×109、约5×109、约2.5×109、约1×109、约7.5×108、约5×108、约2.5×108、约1×108、约7.5×107、约5×107、约2.5×107、约1×107、约7.5×106、约5×106、约2.5×106、约1×106、约7.5×105、约5×105、约2.5×105、或约1×105个gdT细胞。在一些实施例中，一个剂量可以包含约1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、或5×109个gdT细胞。在一些实施例中，一个剂量包含至少约1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、或5×109个细胞。在一些实施例中，一个剂量包含最多约1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、或5×109个gdT细胞。
在一些实施例中，在治疗过程中，治疗有效量的细胞群或医药组合物可包含约10×1012、约9×1012、约8×1012、约7×1012、约6×1012、约5×1012、约4×1012、约3×1012、约2×1012、约1×1012、约9×1011、约8×1011、约7×1011、约6×1011、约5×1011、约4×1011、约3×1011、约2×1011、约1×1011、约9×1010、约7.5×1010、约5×1010、约2.5×1010、约1×1010、约7.5×109、约5×109、约2.5×109、约1×109、约7.5×108、约5×108、约2.5×108、约1×108、约7.5×107、约5×107、约2.5×107、约1×107、约7.5×106、约5×106、约2.5×106、约1×106、约7.5×105、约5×105、约2.5×105、或约1×105个gdT细胞。在一些实施例中，在治疗过程中，治疗有效量的细胞群或医药组合物可包含至少10×1012、至少9×1012、至少8×1012、至少7×1012、至少6×1012、至少5×1012、至少4×1012、至少3×1012、至少2×1012、至少1×1012、至少9×1011、至少8×1011、至少7×1011、至少6×1011、至少5×1011、至少4×1011、至少3×1011、至少2×1011、至少1×1011、至少9×1010、至少7.5×1010、至少5×1010、至少2.5×1010、至少1×1010、至少7.5×109、至少5×109、至少2.5×109、至少1×109、至少7.5×108、至少5×108、至少2.5×108、至少1×108、至少7.5×107、至少5×107、至少2.5×107、至少1×107、至少7.5×106、至少5×106、至少2.5×106、至少1×106、至少7.5×105、至少5×105、至少2.5×105、或至少1×105个gdT细胞。在一些实施例中，在治疗过程中，治疗有效量的细胞群或医药组合物可包含最多10×1012、最多9×1012、最多8×1012、最多7×1012、最多6×1012、最多5×1012、最多4×1012、最多3×1012、最多2×1012、最多1×1012、最多9×1011、最多8×1011、最多7×1011、最多6×1011、最多5×1011、最多4×1011、最多3×1011、最多2×1011、最多1×1011、最多9×1010、最多7.5×1010、最多5×1010、最多2.5×1010、最多1×1010、最多7.5×109、最多5×109、最多2.5×109、最多1×109、最多7.5×108、最多5×108、最多2.5×108、最多1×108、最多7.5×107、最多5×107、最多2.5×107、最多1×107、最多7.5×106、最多5×106、最多2.5×106、最多1×106、最多7.5×105、最多5×105、最多2.5×105、或最多1×105个gdT细胞。
在一些实施例中，细胞群或医药组合物的治疗有效量剂量可以包含约1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、或5×108个gdT细胞/kg。在一些实施例中，剂量可包含最多约1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、或5×108个gdT细胞/kg。在一些实施方案中，剂量可以包含约1.1×106-1.8×107个gdT细胞/kg。
在一些实施例中，个体在治疗期间施用一剂。在一些实施例中，个体在治疗期间至少施用两剂。在一些实施例中，个体先接受初剂然后再接受一次或多次的(例如，2、3、4、或5次)后续施用。在一个实施例中，所述一次或多次的后续施用在前一次施用后的15天内(例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天)施用。为了说明的目的，在一些实施例中，个体在三次施药的过程中总共接受了约5×107个gdT细胞，例如，个体接受3×107个gdT细胞的初剂，第二次施用为1.5×107个gdT细胞，以及第三次施用为1.5×107个gdT细胞，其中每次施用是在前次施用后的4、3、或2天内施用。本领域的普通技术人员将能够根据需要和适当性调整和优化剂量。
在一些实施例中，一种或多种的额外治疗药剂可以施用于个体。在一些实施例中，本文所述的细胞群和医药组合物作为一般用来治疗此类疾病的其他既定疗法的辅助或联合来当成治疗疾病的药物使用。可以在施用本文提供的细胞群或医药群体之前、同时或之后施用额外的治疗药剂。额外的治疗药剂可以选自由免疫治疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、放射性治疗剂、抗血管生成剂、或其任何组合所组成的群组。额外的治疗药剂可以是免疫治疗剂，其可以作用于个体体内的靶标(例如个体自身的免疫系统)和/或经转移的gdT细胞。在一些实施例中，额外的治疗药剂是靶向肿瘤抗原的抗体。
可以用任何常规方式施用组合物。本文所述的细胞群和医药组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内注射、或腹膜内(例如通过皮内或皮下注射)施予个体。gdT细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结、或感染部位。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面会以范围格式呈现。应当理解的是，以范围格式描述仅仅是为了方便和简洁，因此不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1到6的范围描述应该被认为已经具体公开子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的每个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。所述的应用与范围的广度无关。
5.4范例
以下提供的范例仅为了说明的目的，除非另有说明，否则不旨在限制。因此，本发明绝不应被理解为限于以下实施例，而是应被理解为包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化型。
本文中描述的示例性的基因和多肽参照GenBank编号、GI编号和/或SEQ ID NOs。应当理解的是，本领域技术人员可以通过参考序列来源轻易地鉴别同源序列，序列来源包含但不限于GenBank(ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和EMBL(embl.org/)。
研究中使用的一些培养基被称为「完全生长培养基」或「完全培养基」。完全生长培养基是以RPMI-1640为基底然后添加1-30vol％的HPL和100-2500IU/mL(0.0612-1.53μg/mL)的人类IL-2，而完全培养基是以RPMI-1640为基底然后添加1-30vol％的HPL。下面描述的研究中HPL和IL-2的实际使用浓度为个别标明的。
5.4.1制备富含具有类NK特性的gdT细胞的组合物
按照图1B所示的程序制备富含gdT细胞(具有类NK特性的T细胞)的细胞群：在第0天，在37℃水浴中解冻一管冷冻保存的人类PBMC。重新悬浮1mL解冻的PBMC并在室温下以400x g离心3-5分钟。重新悬浮细胞，并将3×107个重悬的细胞转移到含有进一步添加了1μM唑来磷酸盐(zoledronate)的完全生长培养基(5％(v/v)HPL和700IU/mL(0.4284μg/mL)人类IL-2)的G-Rex装置中，然后将培养体积填充到G-Rex装置的最大容量。在第2天和第4天之间补充人类IL-2。在第6天，根据制造商的说明，用抗TCRα/β-生物素标记然后使用抗生物素微珠(MicroBead)去除经扩增的细胞群中的TCRα/βT细胞。将洗脱的细胞以1×106个细胞/mL的细胞密度重新接种到更大的G-Rex装置中。在第8天和第16天间，根据需要重新接种细胞、更换培养基、和/或补充人类IL-2。在第16天收获培养的细胞以供后续的应用。
在第0、2、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、和第16天时监测葡萄糖的水平(Kabelitz等人，2020.Cell Mol Immunol.17(9)：925-939)。在第0、6、8、10、13、和第16天时监测细胞数。将在不同天获得的细胞悬液的每个样品与等体积的台盼蓝混合，并计算培养物中的总细胞数。如图2所示，上述方法在16天内快速的将3×107个的人类PBMC扩增为具有1.55×1010个细胞的细胞群。
5.4.2利用流式细胞术对产生的细胞群表征分析
通过流式细胞术对在上文第5.4.1节所述的研究中第16天获得的细胞(下文称为「第16天产生的细胞群」或「Ctrl-gdT细胞」)进行表征分析。首先将细胞在室温下以400x g离心3分钟。舍弃去上清液后，用1mL的Dulbecco磷酸盐缓冲生理食盐水(DPBS)重新悬浮并洗涤细胞沈淀物。再次离心细胞悬浮液，然后移除上清液。用DPBS重新悬浮细胞沉淀物，然后将0.1mL的细胞悬浮液(5×105个细胞)等分到1.5mL的Eppendorf管中。然后分别用针对TCRα/β、TCRVδ2、CD16、CD3、CD25、CD38、CD56、CD69、CD107a、NKG2D、PD-1、NKp30、NKp44、和NKp46的萤光染料接合抗体对5×105个细胞进行染色(所有的抗体皆购自BioLegend)。利用碘化丙啶(PI，ThermoFisher Scientific)的阴性染色来测定组合物中的细胞活性。将细胞在室温下以400x g离心3分钟。去除上清液后，用1mL的DPBS重悬细胞沉淀物。重新离心，然后通过流式细胞术分析0.5mL DPBS-重悬的细胞的TCRα/β+、TCRVδ2+、CD16+、CD3+、CD25+、CD38+、CD56+、CD69+、CD107a+、NKG2D+、PD-1+、NKp30+、NKp44+、NKp46+和PI+群体的百分比和/或平均萤光强度(MFI)。结果显示在图3A-3C并总结于下表中。
通过流式细胞术进一步分析第16天产生的细胞群中TCRVδ2+细胞TCRVδ2+、CD18+、TIGIT+、NKG2D+、DNAM-1+、CD36+、CD69+、PD-1+、CD103+、CCR7+、TNFα+、IFNγ+、颗粒酶B+、和CD107a+群体的百分比和/或MFI。具体来说，对第16天产生的细胞群中的细胞用针对TCRVδ2的萤光染料接合抗体以及针对CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1、CD36、CD69、PD-1、CD103、CCR7、TNFα、IFNγ、颗粒酶B、CD107a、CD45RA和CD27的萤光染料接合抗体共同染色(所有抗体均购自BioLegend)。通过PI染色测定细胞活性。进一步对PI-TCRVδ2+圈选的细胞群(PI阴性和TCRVδ2阳性细胞)进行上述标志物百分比/MFI的表征分析。使用PI-TCRVδ2+细胞(即gdT细胞)的数量作为总数(分母)计算百分比，并分别对圈选的标志物阳性gdT群体决定MFI值。结果显示在图4A-4C并总结于下。
将MFI转换成每个细胞的平均分子数(「NMC」)：流式细胞术结果中的MFI值也被转换为NMC。如本文所用，NMC是指在细胞表面上检测到的平均分子数。例如，如果一个细胞群的50％可检测到地表达受体X，且每个细胞表达约400个受体X分子，则此表达受体X的亚细胞群中受体X的NMC应为400(以具有可检测到的表达的细胞数作为分母)，而不是200(以全部细胞的数量作为分母)。为了将MFI转换成NMC，建立源自QuantumTMSimply试剂盒(Bangs Laboratories，Inc.#817)的标准曲线。使用QuantumTMSimply/>试剂盒中的5瓶微球(「#1、#2、#3和#4」4个群体包覆着逐渐增量的抗小鼠IgG Fc抗体，1个未包覆的空白样品)。将10μL的抗小鼠IgG Fc抗体结合微球(包含#1、#2、#3、和#4)和空白微球各自与5μg/mL的其中一种相应抗体以0.1mL的总反应体积于室温下反应10分钟。
用0.5mL的DPBS洗涤微球后将细胞悬浮液在室温下以400x g离心5分钟。去除上清液然后用流式细胞术分析悬浮的QSC(QuantumTMSimply试剂盒)微球。按照制造商的指示，将各个微球采集到的MFI代入制造商提供的计算表(QuickCal V2.3)中的相应栏位，以生成每个抗体相应的标准曲线。对于每种抗体，在标准曲线建立后，接着将相应抗体染色后细胞群的MFI代入QuickCal表中来转换成细胞表面上相应受体的平均数量。
以下的MFI/NMC转换出于示例性目的提供于下。例如，在第5.4.2节所述的研究中，「NKG2D+PI-TCRVδ2+细胞群」(或表达NKG2D的gdT群)的MFI为6193；根据研究中使用的小鼠抗人类NKG2D IgG的标准曲线，QuickCal表将此MFI值转换为17347的NMC(图5C；x代表MFI，y代表NMC)，意味着在这项研究中细胞表面上平均检测到17347个NKG2D分子。值得注意的是，因为「NKG2D+PI-TCRVδ2+细胞群」被圈选以用来测量MFI值，所以计算出的NMC值对应于整个gdT细胞群中表达NKG2D的亚群中每个细胞的平均NKG2D分子数。另一个例子，在第5.4.8节所述的研究中，在5vol％HPL组中「PI-TCRVδ2+细胞群」(或gdT细胞群)的MFI为18488；根据研究中使用的小鼠抗人类NKG2D IgG的标准曲线，QuickCal表将此MFI值转换为61721的NMC(图5C)，意味着在此研究中细胞表面平均检测到61721个NKG2D分子。此处，因为MFI值是在圈选的「PI-TCRVδ2+细胞群」中测量的，因此计算的NMC值对应于整个gdT细胞群中NKG2D的NMC。
以下抗体的标准曲线(standing curve)显示在图5A-5Q中：PE-接合的小鼠抗人类CD56 IgG(图5A)、PE-Cy7-接合的小鼠抗人类CD16 IgG(图5B)、小鼠抗人类NKG2D IgG(图5C)、小鼠抗人类NKp44IgG(图5D)、小鼠抗人类NKp46 IgG(图5E)、小鼠抗人类IFNγIgG(图5F)、小鼠抗人类DNAM-1IgG(图5G)、Alexa647-接合的小鼠抗人类颗粒酶B IgG(图5H)、小鼠抗人类TIGIT IgG(图5I)、FITC-接合的小鼠抗人类TNFαIgG(图5J)、小鼠抗人类CD18 IgG(图5K)、小鼠抗人类TCRVd2 IgG(图5L)、小鼠抗人类NKp30 IgG(图5M)、小鼠抗人类PD-1IgG(图5N)；PE-接合的小鼠抗人类CD69 IgG(图5O)；APC-接合的小鼠抗人类CD107a IgG(图5P)；和小鼠抗人类CCR7 IgG(图5Q)。
还分析了PI-TCRVδ2+圈选内群体的表型以区分初始(CD45RA+CD27+)、CM(CD45RA-CD27+)、EM(CD45RA-CD27-)和TDEM(CD45RA+CD27-)细胞。如图6所示，PI-TCRVδ2+圈选内的细胞主要富含EM细胞(CD45RA-CD27-；26.43％)和TDEM细胞(CD45RA+CD27-；73.57％)。
NK细胞毒性受体(CD56、CD16、DNAM-1、NKG2D、NKp44和NKp46)和去颗粒化(degranulation)标志物(CD107a)的表达增强了gdT细胞的类NK抗肿瘤活性，而EM和TDEM细胞在gdT细胞中的富集有助于它们在肿瘤炎症微环境中的定位。CD69的表达代表gdT细胞的活化。因此，本文所述的培养方法快速且选择性地扩增PBMC中具有类NK特性的gdT细胞，体现于第16天产生的细胞群的细胞中(1)NK细胞毒性受体(CD56、CD16、DNAM-1、NKG2D、NKp44和NKp46)、(2)去颗粒化标志物(CD107a)和(3)活化标志物(CD69)的表达增加。
5.4.3ACE-gdT细胞的制备
ACE-gdT-CD20细胞的制备：通过使用互补的细胞连结子和利妥昔单抗(rituximab)连结子将利妥昔单抗(rituximab，市售的抗CD20抗体)与Ctrl-gdT细胞(如第5.4.1节所述制备的第16天产生的细胞群)结合获得ACE-gdT-CD20细胞，其包含以下步骤：
(A’)制备细胞连结子并将细胞连结子(第一ssDNA)与Ctrl-gdT细胞结合以制备gdT-ssDNA接合物；
(B’)制备利妥昔单抗连结子并将利妥昔单抗连结子(与第一ssDNA互补的第二ssDNA)与利妥昔单抗结合以制备利妥昔单抗-ssDNA接合物；和
(C’)混合gdT-ssDNA接合物和100-500μL的利妥昔单抗-ssDNA接合物，通过让互补的ssDNA连结子杂交来制备ACE-gdT-CD20细胞。
步骤(A’)包含以下步骤(a1’)～(a4’)：
(a1’)取得第一ssDNA(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3)；
(a2’)用硫醇基团修饰第一ssDNA的5’端(经硫醇修饰5’端的第一ssDNA)以取得细胞连结子原液(参见例如，Zimmermann,J，2010；也可购自Integrated DNA Technologies)；
(a3’)将10-500μL的细胞连结子原液和0.1-10μL的NHS-顺丁烯二酰亚胺(SMCC，可购自Fisher Scientific)混合后反应1–60分钟；和(a4’)将步骤(a3’)产生的混合物与1×106-1×109个Ctrl-gdT细胞混合并反应1-60分钟。
步骤(B’)包含以下步骤(b1’)～(b4’)：
(b1’)取得第二ssDNA(SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6)；
(b2’)用硫醇基团修饰第二ssDNA的5’端(经硫醇修饰5’端的第二ssDNA)以取得利妥昔单抗连结子原液(参见例如Zimmermann,J，2010；也可购自IntegratedDNATechnologies)；
(b3’)将10–500μL的利妥昔单抗连结子原液和0.1–10μL的NHS-顺丁烯二酰亚胺(SMCC，可购自Fisher Scientific)混合并反应1–60分钟；和
(b4’)将步骤(b3’)产生的混合物与10–100μL的利妥昔单抗原液混合并反应10分钟至3小时。
ACE-gdT-HER2细胞的制备：通过使用互补的细胞连结子和曲妥珠单抗(trastuzumab)连结子将曲妥珠单抗(trastuzumab，市售的抗HER2抗体)与Ctrl-gdT细胞(如第5.4.1节所述制备的第16天产生的细胞群)结合来取得ACE-gdT HER2细胞，包含以下步骤：
(A”)制备细胞连结子并将细胞连结子(第一ssDNA)与Ctrl-gdT细胞结合以制备gdT-ssDNA接合物；
(B”)制备曲妥珠单抗(trastuzumab)连结子并将曲妥珠单抗(trastuzumab)连结子(与第一ssDNA互补的第二ssDNA)与曲妥珠单抗(trastuzumab)结合以制备曲妥珠单抗-ssDNA接合物；和
(C”)混合gdT-ssDNA接合物和100-500μL的曲妥珠单抗-ssDNA接合物，通过让互补的ssDNA连结子杂交来制备ACE-gdT-HER2细胞。
步骤(A”)包含以下步骤(a1”)～(a4”):
(a1”)取得第一ssDNA(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3)；
(a2”)用硫醇基团对第一ssDNA的5’端进行修饰(经硫醇修饰5’端的第一ssDNA)以取得细胞连结子原液(参见例如Zimmermann,J，2010；也可购自IntegratedDNATechnologies)；
(a3”)将10–500μL的细胞连结子原液和0.1-10μL的NHS-顺丁烯二酰亚胺(SMCC，可购自Fisher Scientific)混合后反应1-60分钟；和
(a4”)将步骤(a3”)产生的混合物与1×106-1×109个Ctrl-gdT细胞混合后反应1-60分钟。
步骤(B”)包含以下步骤(b1”)～(b4”)：
(b1”)取得第二ssDNA(SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6)；
(b2”)用硫醇基团修饰第二ssDNA的5’端(经硫醇修饰5’端的第二ssDNA)以取得曲妥珠单抗(trastuzumab)连结子原液(参见例如Zimmermann,J，2010；也可购自IntegratedDNATechnologies)；
(b3”)将10-500μL的曲妥珠单抗(trastuzumab)连结子原液和0.1-10μL的NHS-顺丁烯二酰亚胺(SMCC，可购自Fisher Scientific)混合后反应1-60分钟；和
(b4’)将步骤(b3”)产生的混合物与10-100μL的曲妥珠单抗(trastuzumab)原液混合后反应10分钟至3小时。
5.4.4利用流式细胞术鉴定ACE-gdT细胞
将上文第5.4.1节所述的第16天产生的细胞群分成2组：一组作为对照组(Ctrl-gdT)，另一组使用上文第5.4.3节中描述的方法进一步修饰以制备ACE-gdT-CD20组。简短来说，每组50万个细胞分别用针对TCRα/β、TCRVδ2、CD16、CD3、CD25、CD38、CD56、CD69、CD107a、NKG2D、PD-1、NKp30、NKp44、和NKp46的萤光染料接合抗体各自染色。通过PI阴性染色测定组合物中的细胞活性。在室温下以400x g离心细胞3分钟。去除上清液后，用1mL的DPBS重新悬浮细胞沉淀物。重复离心步骤，然后用流式细胞术分析0.5mL DPBS-重悬的细胞TCRα/β+、TCRVδ2+、CD16+、CD3+、CD25+、CD38+、CD56+、CD69+、CD107a+、NKG2D+、PD-1+、NKp30+、NKp44+、NKp46+和PI+群体的百分比。结果显示于图7A-7C并总结于下。
**前缀「Cryo-」表示细胞群在研究前经过冷冻保存和解冻
TCRVδ2+gdT细胞：通过流式细胞术进一步分析每组中TCRVδ2+细胞TCRVδ2+、CD18+、TIGIT+、NKG2D+、DNAM-1+、CD36+、CD69+、PD-1+、CD103+、CCR7+、TNFα+、IFNγ+、颗粒酶B+、CD107a+、CD45RA、和CD27群体的百分比和/或MFI。以针对TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1、CD36、CD69、PD-1、CD103、CCR7、TNFα、IFNγ、颗粒酶B(GZMB)、CD107a、CD45RA和CD27的萤光染料接合抗体对对照组细胞或Cryo-ACE-gdT-CD20组细胞进行共同染色。通过PI染色测定细胞活性。
如图8A-8C所示和下方的汇总，进一步表征分析对照组和Cryo-ACE-gdT-CD20组中PI-TCRVδ2+-圈选内群体的百分比/MFI。使用PI-TCRVδ2+细胞(即gdT细胞)的数量作为总数(分母)计算百分比，并对各自圈选的标志物阳性gdT群体决定MFI值。
同时分析PI-TCRVδ2+-圈选内群体的表型以区分初始(CD45RA+CD27+)、CM(CD45RA-CD27+)、EM(CD45RA-CD27-)和TDEM(CD45RA+CD27-)细胞。如图9所示，对照组中PI-TCRVδ2+圈选的细胞主要富含EM细胞(CD45RA-CD27-；26.43％)和TDEM细胞(CD45RA+CD27-；73.57％)群体。与之一致地，ACE-gdT-CD20组中PI-TCRVδ2+-圈选的细胞也主要富含EM细胞(CD45RA-CD27-；21.47％)和TDEM细胞(CD45RA+CD27-；78.53％)。
5.4.5Ctrl-gdT细胞和ACE-gdT-HER2细胞的细胞毒性
使用xCELLigence实时细胞分析系统(xCELLigence RTCA系统，ACEA BiosciencesInc.)来测量效应细胞对目标细胞的细胞毒性。使用96孔的xCELLigence E-盘，然后将孔分成仅有效应细胞的对照孔(ESA)、仅有目标细胞的对照孔(TSA)、实验孔、和目标细胞全部裂解的对照孔(TML)。使用如上所述制备的ACE-gdT-HER2和Ctrl-gdT细胞群作为效应细胞，并使用贴壁的卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞系(HTB-77，ATCC)作为目标细胞。
将2×104个SK-OV-3细胞接种于每个TSA孔、实验孔和TML孔中，使其静置2-4小时。当目标细胞的细胞指数(cell index，CI)达到0.5时，在ESA孔和实验孔中加入效应细胞(ACE-gdT-HER2或Ctrl-gdT)，使E：T比(效应细胞数对目标细胞数的比值)达到1、2、5或10。将裂解缓冲液加到TML细胞中来测定孔的CI，因为裂解了这些孔中所有的目标细胞。TSA孔中没有添加效应细胞或裂解缓冲液。
Control-gdT细胞也接种在含有不同浓度(10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、或10μg/mL)的曲妥珠单抗(trastuzumab)中。对于这些样品，E：T比为2。
将xCELLigence E-盘放置于xCELLigence实时细胞分析系统中18个小时以检测CI的实时变化(37℃和5％二氧化碳)。贴附在xCELLigence E-盘底部的目标细胞越多，检测到的CI就越高。因此，根据以下公式将CI转换成实验孔中裂解的目标细胞的百分比：裂解的目标细胞百分比(％)＝{1-[(实验孔的CI-ESA孔的CI-TML孔的CI)÷(TSA孔的CI-TML孔的CI)]}×100％
如图10A所示，任何浓度的曲妥珠单抗(trastuzumab)本身都不会杀死目标细胞SK-OV-3，而在曲妥珠单抗(trastuzumab)存在时，高达22％的目标细胞SK-OV-3被controlgdT细胞裂解。该结果显示依照本公开制备的细胞群的细胞毒性，该毒性对存在的抗体是剂量依赖性的，显示control gdT细胞介导ADCC反应。图10B进一步显示，ACE-gdT-HER2细胞在E/T为1、2、5和10时分别杀死0％、18％、68％和92％的SK-OV-3；而control-gdT细胞在E/T为1、2、5和10时分别杀死0％、0％、15％和58％的SK-OV-3。该结果显示Ctrl-gdT细胞对SK-OV-3的细胞毒性，该细胞毒性在与曲妥珠单抗(trastuzumab)接合后被进一步增强了，如对ACE-gdT-HER2细胞的观察。
5.4.6Ctrl-gdT细胞和ACE-gdT-CD20细胞的细胞毒性
从ATCC购买CD20+Daudi人类淋巴瘤细胞系、CD20+Raji人类淋巴瘤细胞系、和CD20-K562人类淋巴瘤细胞系，并使用它们作为目标细胞。将目标细胞离心(400x g，3分钟)后，用1mL RPMI生长培养基重悬细胞然后调整成2×106个细胞/ml。根据制造商的说明，将600万个目标细胞在DPBS中用5μM的萤光染料羧基萤光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE，ThermoFisher Scientific)在室温下染色10分钟。经染色的细胞用DPBS洗涤两次，然后接种在24孔的细胞培养板中(每孔100万个)。用如第5.4.3节所述制备的ACE-gdT-CD20(利妥昔单抗接合的gdT细胞)和Ctrl-gdT细胞群当效应细胞。
经CFSE-染色的目标细胞(2×105)与效应细胞以2：1、5：1或10：1的E：T比在24孔细胞培养盘中于37℃、5％的二氧化碳中共同反应4小时。收获细胞培养物并用1：500稀释的PI染色。透过使用流式细胞术测定细胞毒性：裂解的目标细胞百分比(％)＝10000个圈选的CFSE+目标细胞中PI+细胞的数量
结果(裂解的目标细胞百分比)显示在图11A-11C。图11A中的柱状图显示controlgdT细胞和利妥昔单抗接合的gdT细胞在不同效应细胞(E)对目标细胞(T)的比例下杀死CD20阳性人类淋巴瘤细胞系Raji的细胞毒性功能的比较。在CD20阳性Raji-Luc模型中，对照组中的control gdT细胞(Ctrl-gdT)在E：T比为2：1到10：1时产生的细胞毒性为21.95±0.21％-43.13±1.29％，而ACE-gdT-CD20细胞杀死39.14±0.86％-69.38±2.77％的目标细胞。图11B中的柱状图显示control gdT细胞和ACE-gdT-CD20细胞在不同效应细胞(E)对目标细胞(T)的比例时杀死CD20阳性人类淋巴瘤细胞系Daudi的细胞毒性功能的比较。在CD20阳性Daudi-Luc模型中，对照组中的control gdT细胞(Ctrl-gdT)在E：T比为2：1至10：1时产生的细胞毒性为19.68±1.38％-43.66±0.66％，而ACE-gdT-CD20细胞杀死了41.19±0.6％-71.22±1.42％的目标细胞。图11C中的柱状图显示control gdT细胞和利妥昔单抗接合的gdT细胞在不同的效应细胞(E)对目标细胞(T)的比例时杀死CD20阴性人类淋巴瘤细胞系K562的细胞毒性功能的比较。在CD20阴性K562人类淋巴瘤细胞系模型中，结果显示对照组中的control gdT细胞(Ctrl-gdT)在E：T比为2：1到10：1时杀死了9.31±0.80％-44.12±1.41％的目标细胞而ACE-gdT-CD20细胞在相同范围的E：T比例时杀死11.59±1.76％-49.93±2.31％的目标细胞。如所提供的，Ctrl-gdT细胞对所有肿瘤细胞系皆表现出剂量依赖性的细胞毒性，而ACE-gdT-CD20细胞群对CD20+肿瘤细胞系表现出增强的细胞毒性。
5.4.7冷冻保存期间细胞毒性的维持
下述研究是为了确认冷冻保存不会影响本文公开细胞群的细胞毒性。如上所述制备目标细胞(Daudi细胞和Raji细胞)。本研究中使用的效应细胞包含(1)新鲜的第16天产生的细胞群；(2)如第5.4.3节所述制备的新鲜ACE-gdT-CD20细胞群；(3)冷冻保存然后解冻的第16天产生的细胞群；(4)冷冻保存然后解冻的ACE-gdT-CD20细胞群。使用源自三个不同供体(供体1、2、和3)的PBMC细胞进行平行实验。
将经CFSE染色的目标细胞(2×105)与效应细胞以2：1、5：1和10：1的E：T比在24孔细胞培养盘的孔中于37℃、5％的CO2里共同反应4小时。收获细胞培养物然后用1：500稀释的PI染色。透过使用流式细胞术测定细胞毒性：裂解的目标细胞百分比(％)＝10000个圈选的CFSE+目标细胞内PI+细胞的数量。
结果显示在图12A-12C(Raji模型中新鲜细胞群)、13A-13C(Daudi模型中新鲜细胞群)、14A-14C(Raji模型中的冷冻的保存细胞群、和15A-15C(Daudi模型中冷冻保存的细胞群)并总结于下。分图A、B、和C分别对应供体1、2、和3的结果。在Daudi-Luc模型中，新鲜的Ctrl-gdT细胞(新鲜的经16天培养的PBMC细胞)在E：T比例为1：1至10：1时产生的细胞毒性为9.18±0.62％-38.59±1.93％，而新鲜的ACE-gdT-CD20细胞(新鲜的CD20连结的经16天培养的PBMC细胞)杀死16.99±1.16％-55.95±2.21％的目标细胞。在Raji-Luc模型中，冷冻保存的Ctrl-gdT细胞(冷冻保存的经16天培养的PBMC细胞)在E：T比为1：1到10：1时为4.40±0.28％-41.96±1.85％，而冷冻保存的ACE-gdT-CD20细胞(冷冻保存的CD20连结的经16天培养的PBMC细胞)杀死9.50±1.05％-68.13±0.47％的目标细胞。在Daudi-Luc模型中，冷冻保存的Ctrl-gdT细胞(冷冻保存的经16天培养的PBMC细胞)在E：T比为1：1到10：1时产生的细胞毒性为5.83±0.95％-56.94±2.47％，而冷冻保存的ACE-gdT-CD20细胞(冷冻保存的CD20连结的经16天培养的PBMC细胞)杀死10.02±1.29％-74.01±1.51％的目标细胞。
如所提供的，该研究中使用的细胞群的细胞毒性在冷冻保存和解冻后大致上是被维持的。
5.4.8人类血小板裂解物的影响
重复第5.4.1节中所述的制备富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群的方法，其中在培养基中添加三种不同浓度的HPL(1、5、或20vol％的HPL)。在培养期间监测葡萄糖含量和细胞数。在不同的培养天数取得样品，将其与等体积的台盼蓝混合，然后计数细胞。从而计算培养物中的总细胞数。
*在第1批中，在第7天重新接种细胞的部分亚群。括号中的数字对应为了进一步扩增而重新接种的细胞数量。
图16A-16B提供在培养期间测量到的细胞数，进一步将其与细胞活性数据一同总结在上表中。如所示，在5和20vol％HPL组都观察到gdT细胞群的快速扩增，含有5vol％HPL的组在培养结束时显示出最大的扩增量。
根据上文第5.4.2和5.4.4节中描述的方法进行对PI-TCRVδ2+-圈选内细胞群的标志物谱性分析。备注，使用PI-TCRVδ2+细胞(即gdT细胞)的数量作为总数(分母)计算百分比，但每个标志物以MFI为基础的NMC值测定为gdT群体中(而非标志物为阳性的部分细胞群)。结果总结于下。合起来，这些结果证明在包含5％或20vol％HPL的培养基中培养产生的细胞群中的gdT细胞具有类NK细胞毒性特性。
此外，如下所示，在5和20vol％HPL组中产生的细胞群主要皆为EM细胞和TDEM细胞，只有约1％的初始细胞和约1％的CM细胞，再次为产生细胞群的治疗潜力背书。
同时分析了产生的细胞群的细胞毒性。简而言之，将目标Raji细胞接种在96孔盘中(每孔5,000个)，并将5和20vol％HPL组中的产生的细胞群与Raji细胞以2：1、5：1和10：1的E：T比共同反应4小时。然后通过上文第5.4.5和5.4.6节中描述的冷光性细胞毒性检定分析培养物。
如图17A-17B所示，在5和20vol％HPL组中均观察到有效的细胞毒性。在5％HPL组中观察到较高的细胞毒性，这可能是由于gdT细胞上DNAM1的表达增加(NMC中测得)和/或该组中TDEM细胞的百分比增加。
5.4.9容器的影响
重复第5.4.1节中描述的制备富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群的方法，除了使用不同的细胞培养容器，包含(1)透气性的细胞培养容器(G-Rex装置)和(2)不透气性的细胞培养容器(T瓶)。在培养期间监测葡萄糖含量和细胞数。在不同培养天数时取得样品，将其与等体积的台盼蓝混合，并计数细胞。从而计算培养物中的细胞总数。如图18A所示，当培养在G-Rex中，细胞群在第7天和第16天之间迅速地扩增，但在不透气的T瓶中培养时则没有。当细胞群培养在T-瓶时，还观察到细胞活性的下降(图18B)。
根据上文第5.4.2和5.4.4节中描述的方法对PI-TCRVδ2+-圈选的细胞群进行针对CD56、CD16、DNAM-1、NKG2D、和CD69的标志物谱性分析。标志物阳性群体的百分比和以MFI为基础的NMC统整于下。备注，使用PI-TCRVδ2+细胞(即gdT细胞)的数量作为总数(分母)计算百分比，但是对每个标志物以MFI为基础的NMC值测定为于gdT群体中(而非标志物为阳性的部分群体)。如所示，在G-Rex组中观察到gdT细胞的某些活化标志物(例如CD56、CD16、和DNAM)的表达显著性地较高。
此外，如下所示，在G-Rex-和T-瓶-培养的组中产生的细胞群主要均是EM细胞和TDEM细胞，只有约1％的初始细胞和约1％的CM细胞。
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这些结果表明，使用具有较佳透气性的容器制备的细胞群具有较佳的扩增能力和较强的毒性，通过较高的活化受体包含细胞毒性受体(CD56、CD16、DNAM-1)百分比和每个细胞平均数量以及较高的TDEM群体的百分比来证明。如所示，在G-Rex组中观察到显著性地较高百分比的TDEM细胞。
5.4.10去除αβT的影响
重复第5.4.1节中描述的制备富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群的方法包含(1)在第6天进行abT细胞的去除，(2)不进行abT细胞的去除；(3)在第16天进行abT细胞的去除或(4)在第0天进行abT细胞的去除。
在培养期间监测细胞数。在不同的培养天数时取得样品，将其与等体积的台盼蓝混合，并计数细胞。从而计算培养物中的细胞总数。在第16天，第1组有1.55×1010个细胞，第2组有5×109个细胞，第3组有2.74×109个细胞，而第4组未能扩增。在去除前第2组有8.52％的abT细胞，而第3组在去除前有20％的abT细胞。
这些结果表明，在离体培养细胞群数天(例如，1-5天)后，可以去除abT细胞。此外，第3组具有比第2组少的细胞，这表明当abT细胞的百分比相对较低(例如，小于10％)时去除它们将有助于在培养结束时达到最高的gdT细胞数。
同时也根据上文第5.4.2节和第5.4.4节中描述的方法进行标志物谱性分析。
5.4.11CD69+为细胞毒性的标志物
为了评估以受体CD69作为产生的细胞群的细胞毒性阳性标志物，可以实施于上文中描述的细胞毒性检定。例如，可以使用Raji细胞作为目标细胞，然后可以使用(1)CD69+gdT细胞和(2)从如第5.4.1节所述制备的第16天产生的细胞群中分离出的CD69-gdT细胞，作为效应细胞。
可以使用不同的方法分离CD69+细胞和CD69-细胞。例如，可以从第16天产生的细胞群中分离出TCRVδ2+细胞，然后可以使用CD69磁性微珠(Miltenyi)分离CD69+(与微珠结合的)和CD69-(洗脱的)的gdT细胞。另一个例子，可以使用人类CD69 MicroBead试剂盒II(Miltenyi Biotech)，然后根据分离试剂盒制造商的说明可以分离出CD69+gdT细胞。简单来说，将悬浮在40μL autoMACS运行缓冲液中的约1×107个收获的gdT细胞与试剂盒中提供的10μL生物素接合的抗CD69抗体在4℃下反应15分钟。所述结合可以按比例放大。将前述混合物与每107个细胞约20μL的抗生物素微珠和30μL的autoMACS运行缓冲液混合，总共100μL的混合物在4℃下反应15分钟。每107个染色的细胞用1-2mL的autoMACS运行缓冲液洗涤，然后用400x g离心5分钟。将离心后的细胞以每108个细胞500μL的autoMACS运行缓冲液重新悬浮，并加载到平衡过的去除管柱中以分离gdT细胞群中的CD69+和CD69-部分。
具有不同比例CD69+和CD69-gdT细胞的群体可以通过混合gdT细胞CD69+和CD69-群体分离的部分来制备，例如，CD69+对CD69-的比例为0：1、1：2、1：1、2：1、和1：0。然后可以对混合的群体进行如上方小节中所述的标志物谱性分析和细胞毒性检定。
5.4.12Ctrl-gdT细胞和ACE-gdT-CD20细胞在小鼠模型中杀死肿瘤
在第0天，将100μL无血清培养基中的1×105个表达CD20的Raji/Luc细胞经静脉注射到12周大的雌性SCID-Beige小鼠(BioLasco Taiwan Co.，Ltd，China)中，然后将其分成三组：赋形剂组、control-gdT组、和ACE-gdT-CD20组。使用如第5.4.3节所述制备的ACE-gdT-CD20(利妥昔单抗接合的gdT)细胞群和Ctrl-gdT细胞群作为效应细胞。
将1×107个效应细胞(ACE-gdT-CD20细胞或Ctrl-gdT细胞)分别经静脉注射到对照组和ACE-gdT-CD20组的小鼠中。注射等体积的无血清培养基到赋形剂组的小鼠中。在第3、7和第10天重复相同的治疗。利用IVIS体内成像系统(例如，PerkinElmer)监测每只小鼠的生物发光。
如图19A-19C所示，ACE-gdT-CD20细胞群在整个治疗过程中皆显示出有效的抗肿瘤活性并抑制肿瘤负荷。与其他两组相比，施用ACE-gdT-CD20的小鼠的存活率显著性提高。
5.4.13CD69+gdT细胞在具有液态肿瘤的小鼠模型中杀死肿瘤。
将第5.4.11节中描述的CD69+gdT细胞和CD69-gdT细胞混合以制备具有不同CD69+细胞含量的组合物。在小鼠模型中测量这些细胞群的肿瘤杀伤活性。
一次性施药：在第0天对35只雌性的免疫功能低下的NSG小鼠(JacksonLaboratory)或SCID-Beige小鼠(BioLasco Taiwan Co.，Ltd.，China)，每只经静脉注射5×105个表达萤光素酶的目标细胞(Raji)。将小鼠分为7组，并施予不同量的CD69+Ctrl-gdT细胞作为效应细胞。第一组：2×106个；第2组：5×106个；第三组：1×107个；第4组：2×107个；第5组：3×107个；第6组：5×107个；第7组：0(只有培养基)
在第0、3、8、11、18、25和32天，通过体内成像系统(例如，AMI HTX(SpectralImaging)；IVIS(PerkimElmer))检测发光。施予CD69+Ctrl-gdT细胞的小鼠的小鼠生物发光图像预期会呈现剂量依赖性的肿瘤减少。
多次施药：使用如上所述的相同目标细胞；按照下方的治疗计画使用不同数量的效应细胞(CD69+Ctrl-gdT)。
在第0、3、8、11、15、18、22、25、32、39、46、53和60天时利用体内成像(例如，AMI HTX(Spectral Imaging)；IVIS(PerkimElmer))检测发光。施予CD69+Ctrl-gdT细胞的小鼠的小鼠生物发光图像预期将显示剂量依赖性的肿瘤减少，同时如果总共注射了至少1.5×107个CD69+Ctrl-gdT细胞，则预期具有有效的抗肿瘤活性。当单位剂量较低时(例如，第1-3组中的7.5×106个)，预期需要多次注射才能达到显著的治疗效果。当单位剂量高时(例如，第6组中的6×107个)，即使只注射一次，也预期产生有效的抗肿瘤活性。较少的注射次数有助于患者依从性。
5.4.14CD69+gdT细胞在固态瘤小鼠模型中杀死肿瘤
使用SK-OV-3细胞(CELL BIOLABS Inc)作为目标细胞重复第5.4.13节中描述的研究(单次施药和多次施药)。
在施用CD69+Ctrl-gdT细胞的小鼠的小鼠生物发光图像预期显示剂量依赖性的肿瘤减少，同时如果总共注射至少1.5×107个CD69+Ctrl-gdT细胞时，则预期产生有效的抗肿瘤活性。当单位剂量较低时(例如，第1-3组的7.5×106个细胞)，预期需要多次注射才能达到显著的治疗效果。当单位剂量高时(例如，第6组中的6×107个)，即使只注射一次，也有望产生有效的抗肿瘤活性。较少的注射次数有助于患者的依从性。
5.4.15用不同的添加物制备具有类NK特性的gdT细胞
重复第5.4.1节中描述的制备富含具有类NK特性的gdT细胞的细胞群的方法，其中培养基中的5vol％HPL换成(1)HPL、(2)人类AB血清、或(3)不同浓度的胎牛血清(FCS)(每种添加为1vol％、5vol％或20vol％)。在培养期间监测细胞数，并进行上面小节中描述的标志物谱性分析和细胞毒性检定。预期在HPL组中观察到较佳的gdT细胞扩增和更高的NK细胞毒性显示于分子谱性中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非意图限制本发明专利申请的范围。因此，凡不脱离本公开精神的任何改动或修改，均应包含在本发明专利申请的范围内。
所有本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文，用于描述和公开例如本文公开的组合物和方法，其可与当前描述的发明结合使用。本文讨论的出版物仅在提供本申请提申日前的公开内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认凭借在先发明或出于任何其他原因，本文所述的发明人无权先于该等公开内容。
6.参考以电子方式提交的序列表
本申请通过引用将序列表与本申请合并为2022年4月9日创建的名为『GDT_ST25.TXT』的ASCII文档，大小为33,393位元组。
序列表
<110> 英属开曼群岛商育世博股份有限公司(Acepodia, Inc.)
<110> 育世博生物科技股份有限公司（Acepodia Biotechnologies Ltd.）
<120> 富含γδ T细胞的新颖组合物、其制备方法、及其用途
<130> GDT
<150> US 63/175,689
<151> 2021-04-16
<150> US 63/253,323
<151> 2021-10-07
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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aggtgcagat taccatcagt aggtgcagat taccatcagt 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类CD3ζ
<400> 27
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
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Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
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Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD28
<400> 28
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 29
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 4-1BB
<400> 29
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 OX40
<400> 30
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
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Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
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Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 31
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 ICOS
<400> 31
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro
165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
<210> 32
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 DAP10
<400> 32
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
85 90
<210> 33
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD27
<400> 33
Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr
20 25 30
Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe
35 40 45
Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His
65 70 75 80
Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys
85 90 95
Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys
100 105 110
Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu
115 120 125
Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His
130 135 140
Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met
145 150 155 160
Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr
165 170 175
His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile
180 185 190
Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
210 215 220
Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu
225 230 235 240
Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro
245 250 255
Ala Cys Ser Pro
260
<210> 34
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD30
<400> 34
Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn
20 25 30
Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys
35 40 45
Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp
50 55 60
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg
65 70 75 80
Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
85 90 95
Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met
100 105 110
Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His
115 120 125
Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
130 135 140
Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys
145 150 155 160
Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln
165 170 175
Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met
180 185 190
Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu
195 200 205
Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys
225 230 235 240
Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys
245 250 255
Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro
260 265 270
Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile
275 280 285
Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro
290 295 300
Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys
305 310 315 320
Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn
325 330 335
Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln
340 345 350
Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr
355 360 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
370 375 380
Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly
385 390 395 400
Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile
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Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys
420 425 430
Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg
435 440 445
Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met
450 455 460
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
465 470 475 480
Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser
485 490 495
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
500 505 510
Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly
515 520 525
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
530 535 540
Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
545 550 555 560
Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
565 570 575
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
580 585 590
Ser Gly Lys
595
<210> 35
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD40
<400> 35
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 36
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类CD8的讯息胜肽
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连结子
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD8
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
35 40 45
Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp
85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe
115 120 125
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
130 135 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235
<210> 39
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类 CD4
<400> 39
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys
20 25 30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
35 40 45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
50 55 60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala
65 70 75 80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
85 90 95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
100 105 110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
115 120 125
Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130 135 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145 150 155 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
165 170 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
180 185 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
195 200 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210 215 220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225 230 235 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
245 250 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
260 265 270
Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
275 280 285
Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290 295 300
Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr
305 310 315 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
325 330 335
Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
340 345 350
Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
355 360 365
Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370 375 380
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile
385 390 395 400
Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile
405 410 415
Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met
420 425 430
Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro
435 440 445
His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
450 455
<210> 40
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类Fc受体γ链
<400> 40
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
50 55 60
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
65 70 75 80
His Glu Lys Pro Pro Gln
85

Claims (59)

1.一种制造富含γδT(gdT)细胞的细胞群的方法，包含在添加有(i)一磷酸抗原、(ii)一细胞激素、和(iii)人类血小板裂解物(“HPL”)的培养基中培养一包含gdT细胞的来源细胞群。
2.如权利要求第1项所述之方法，其中在培养期间，该细胞群不与一滋养细胞或肿瘤细胞接触。
3.如权利要求第1项或第2项所述之方法，该方法不包含对gdT细胞的正向选汰。
4.如权利要求第1项到第3项中任一项所述之方法，其中培养所述细胞群3到40天，4到40天，5到40天，6到40天，7到40天，10到40天，10到30天，6到20天，12到20天，或14到18天。
5.如权利要求第1项到第4项中任一项所述之方法，进一步包含去除αβT(abT)细胞。
6.如权利要求第5项所述之方法，其中在培养时间的一半左右去除该abT细胞。
7.如权利要求第5项所述之方法，其中该细胞培养了14到18天，且于第4天到第10天间去除该abT细胞。
8.如权利要求第1项到第7项中任一项所述之方法，其中该细胞激素系在培养期间补充。
9.如权利要求第8项所述之方法，其中该细胞激素一周补充一次、一周两次、一周三次、每隔一天、或每天。
10.如权利要求第1项到第9项中任一项所述之方法，其中所述细胞激素为间白素2(IL-2)、间白素4(IL-4)、间白素6(IL-6)、间白素7(IL-7)、间白素8(IL-8)、间白素9(IL-9)、间白素12(IL-12)、间白素15(IL-15)、间白素18(IL-18)、间白素21(IL-21)、间白素33(IL-33)、或其任何组合。
11.如权利要求第10项所述之方法，其中所述细胞激素为间白素2。
12.如权利要求第1项到第11项中任一项所述之方法，其中所述细胞激素以200-3000IU/mL的浓度添加。
13.如权利要求第1项到第12项中任一项所述之方法，其中在培养期间不补充该磷酸抗原。
14.如权利要求第1项到第13项中任一项所述之方法，其中该磷酸抗原为一双磷酸盐，选自由氯磷酸盐、依替磷酸盐、阿仑磷酸盐、帕米磷酸盐、唑来磷酸盐(唑来磷酸)、奈立磷酸盐、伊班磷酸盐、和帕米磷酸盐所组成的群组。
15.如权利要求第14项所述之方法，其中所述磷酸抗原是唑来磷酸盐。
16.如权利要求第1项到第13项中任一项所述之方法，其中该磷酸抗原选自由焦磷酸溴代醇(BrHPP)、4-羟基-丁-2-烯基焦磷酸(HMBPP)、异戊烯基焦磷酸(IPP)、和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)所组成的群组。
17.如权利要求第1项到第16项中任一项所述之方法，其中所述磷酸抗原以0.1-20μM的浓度添加。
18.如权利要求第1项到第17项中任一项所述之方法，其中该HPL以1-20vol％的浓度添加。
19.如权利要求第1项到第18项中任一项所述之方法，其中该培养基包含浓度为600-5000mg/L的葡萄糖。
20.如权利要求第1项到第19项中任一项所述之方法，其中该培养基为无血清的培养基。
21.如权利要求第1项到第20项中任一项所述之方法，其中所述细胞群培养在一含有透气性表面的装置中。
22.如权利要求第21项所述之方法，其中所述装置为G-Rex装置。
23.如权利要求第1项到第22项中任一项所述之方法，其中所述来源细胞群包含周边血单核细胞(PBMCs)、骨髓、脐带血、或其组合。
24.如权利要求第23项所述之方法，其中所述来源细胞群包含PBMCs。
25.如权利要求第24项所述之方法，进一步包含从周边血液获得PBMCs。
26.如权利要求第1项到第25项中任一项所述之方法，其中在培养期间，该来源细胞群中的该gdT细胞扩增了至少1,000倍。
27.如权利要求第1项到第26项中任一项所述之方法，其中产生的细胞群中至少75％是gdT细胞。
28.如权利要求第1项到第27项中任一项所述之方法，还包含在产生的细胞群的细胞表面添加一靶向部分。
29.如权利要求第28项所述之方法，其中所述靶向部分藉由与靶向部分接合的第一连结子和与细胞表面接合的第二连结子间的相互作用与复合于细胞表面。
30.如权利要求第28项所述之方法，其中该靶向部分是外源性地表达的。
31.如权利要求第1项到第30项中任一项所述之方法，进一步包含在培养后冷冻保存该细胞群。
32.一种细胞群，其系由权利要求第1项到第31项中任一项所述之方法所获得。
33.一种细胞群，其包含至少70％gdT细胞，其中(1)平均每个gdT细胞表达至少400个DNAM-1分子，(2)至少30％的gdT细胞为CD69+；或(1)和(2)两者。
34.如权利要求第33项所述之细胞群，其中平均每个gdT细胞表达至少500、至少1000、至少2000、至少3000个DNAM-1分子。
35.如权利要求第33项或第34项所述之细胞群，其中至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的gdT细胞为CD69+。
36.如权利要求第33项到第35项中任一项所述之细胞群，其中至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、或至少80％的gdT细胞为终端分化的效应(TDEM)细胞。
37.如权利要求第33项到第36项中任一项所述之细胞群，包含至少1×106、至少5×106、至少1×107、至少5×107、至少1×108、至少5×108、至少1×109、至少5×109、至少1×1010、至少5×1010、或至少1×1011个gdT细胞。
38.如权利要求第33项到第37项中任一项所述之细胞群，其中所述细胞群未经对gdT细胞的正向选汰。
39.如权利要求第33项到第38项中任一项所述之细胞群，其中所述细胞群从来自单一供体的来源细胞群起经离体培养20天或更短的时间，所述细胞群源自或取自来源细胞群。
40.如权利要求第33项到第39项中任一项所述之细胞群，其中：
(1)平均每个所述gdT细胞表达至少400个CD56分子；
(2)平均每个所述gdT细胞表达至少400个CD16分子；
(3)平均每个所述gdT细胞表达至少400个NKG2D分子；
(4)平均每个所述gdT细胞表达至少400个CD107a分子；
(5)平均每个所述gdT细胞表达最多2800个PD-1分子；
(6)平均每个所述gdT细胞表达至少5000个DNAM-1分子；
(7)平均每个所述gdT细胞表达至少400个CD69分子；
(8)平均每个所述gdT细胞表达至少100个颗粒酶B分子；或其任何组合。
41.如权利要求第33项到第40项中任一项所述之细胞群，其中至少30％的gdT细胞为Vδ2T细胞。
42.如权利要求第33项到第41项中任一项所述之细胞群，其中至少10％的gdT细胞包含一复合于细胞表面的靶向部分。
43.如权利要求第42项所述之细胞群，其中靶向部分不是核酸。
44.如权利要求第42项或第43项所述之细胞群，其中所述靶向部分为与目标细胞上的生物标志物特异性结合的抗体或抗原结合单元。
45.如权利要求第44项所述之细胞群，其中所述生物标志物为肿瘤抗原。
46.如权利要求第44项或第45项所述之细胞群，其中所述gdT细胞表达包含抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
47.如权利要求第42项到第45项中任一项所述之细胞群，其中所述靶向部分不是由gdT细胞产生的。
48.如权利要求第42项到第45项中任一项所述之任一细胞群，其中所述靶向部分藉由与靶向部分接合的第一连结子和与细胞表面接合的第二连结子之间的相互作用复合于细胞表面。
49.如权利要求第48项所述之细胞群，其中所述第一连结子是一第一多核苷酸，且第二连结子是一第二多核苷酸。
50.如权利要求第49项所述之细胞群，其中(1)第一多核苷酸具有4到500个核苷酸，(2)第二多核苷酸具有4到500个核苷酸，或(1)和(2)两者。
51.如权利要求第32项到第50项中任一项所述之细胞群其为冷冻保存的。
52.一种医药组合物，其包含如权利要求第32项到第51项中任一项所述之细胞群和一药学上可接受载剂。
53.如权利要求第32项到第51项中任一项所述之细胞群或如权利要求第52项所述之医药组合物，其在0℃或0℃以下储存至少一周、至少两周、至少1个月、至少3个月、或至少6个月后可以维持其治疗效力。
54.一种用途，其系将如权利要求第32项到第53项中任一项所述之细胞群或医药组合物用于过继免疫治疗。
55.一种用途，其系将如权利要求第32项到第53项中任一项所述之细胞群或医药组合物用于疾病或病症治疗。
56.一种为有需要的个体治疗疾病或病症的方法，包含对该个体施用如权利要求第32项到第53项中任一项所述之细胞群或医药组合物。
57.如权利要求第55项或第56项所述之用途，其中所述疾病或病症为肿瘤或癌症。
58.如权利要求第55项或第56项所述之用途，其中所述疾病或病症是自身免疫疾病、神经元疾病、造血细胞相关疾病、代谢综合症、致病性疾病、HIV或其他病毒感染、真菌感染、原虫感染、或细菌感染。
59.如权利要求第56到58项所述之任一方法，其中所述个体为人类。
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