CN112639083A - 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的方法，以及通过此类方法产生的组合物。

Description

制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月31日提交的美国临时申请62/726,155；要求2018年11月30日提交的美国临时申请62/773,679；以及要求2019年6月7日提交的美国临时申请62/858,482的优先权，其每个的全部内容通过引用以其整体结合在此。
序列表
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技术领域
本发明总体上涉及制备经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及包含所述免疫效应细胞的组合物。
背景技术
使用T细胞(特别是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继性细胞转移(ACT)疗法在若干个血液癌症试验中显示出前景。目前，基因修饰的T细胞的制造是一个复杂的过程。存在对改善表达CAR的细胞治疗产品的产生、提高产品质量和使产品的治疗功效最大化的方法和程序的需求。
发明内容
本披露内容关于制备经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及使用此类方法产生的组合物。还披露了使用此类组合物用于治疗受试者的疾病(例如癌症)的方法。
在一些实施例中，本发明的特征在于制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或与刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；(ii)使细胞(例如T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和(iii)收获细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时(例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、或25小时，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行；(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行；或(c)例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(ii)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(ii)与步骤(i)一起进行。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(i)开始后不晚于20小时进行。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(i)开始后不晚于18小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、或25小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于24小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体未扩增。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体扩增不超过10％。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂不包含水凝胶。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂不包含水凝胶。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂不包含海藻酸盐。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂不包含海藻酸盐。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含水凝胶。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含水凝胶。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含海藻酸盐。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含海藻酸盐。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂包含来自阔得技术公司(Quad Technologies)的MagCloudzTM。
在一些实施例中，与通过其他类似方法(不包括步骤(i))制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中表达CAR的细胞的百分比，例如来自步骤(iii)的细胞群体显示更高百分比(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)的表达CAR的细胞。
在一些实施例中，在来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过5％或10％。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的更高百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的更高百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前，在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天(例如持续5、6、7、8、或9天)。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的百分比相差不超过5％或10％)。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的更低百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的更低百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前，在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天(例如持续5、6、7、8、或9天)。
在一些实施例中，如与在步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比增加。在一些实施例中，如与在步骤(i)开始时细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比增加。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(GeneSetScore)(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比较低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％或300％)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比较低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％或300％)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比较低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比较低(例如，至少约50％、100％、125％、150％或175％)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比较低(例如，至少低约50％、100％、或125％)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比较低(例如，至少约50％、100％、或125％)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上缺氧)相比较低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上缺氧)相比较低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上自噬)相比较低(例如，至少低20％、30％、或40％)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与通过其他类似方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上自噬)相比较低(例如，至少低20％、30％、或40％)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
在一些实施例中，例如如使用在实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)上扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)上扩增(例如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评价)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天(例如持续5、6、7、8或9天)。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个表达CAR的活细胞的剂量)。
在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，来自步骤(iii)的细胞群体中活细胞的数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。在一些实施例中，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于0.5、1、1.5、或2小时(例如小于1或1.5小时)。
在一些实施例中，步骤(i)和(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、或MALT1抑制剂的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)和(ii)在包含IL-7、IL-21，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)和(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)在包含IL-7、IL-21，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(ii)在包含IL-7、IL-21，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，所述细胞培养基是包含血清替代物的无血清培养基。在一些实施例中，该血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体(例如实验室、医院或医疗保健提供者)的新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的从白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体(例如实验室、医院或医疗保健提供者)的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，本发明的特征在于制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：(1)使细胞(例如T细胞，如从冷冻的白细胞单采产物分离的T细胞)群体与细胞因子(选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合)接触；(2)使细胞(例如T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如T细胞)群体；和(3)收获细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行，或在步骤(1)开始后不晚于5小时(例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时)进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时(例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、24、或25小时，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时)进行；或(b)例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(2)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，步骤(2)与步骤(1)一起进行。在一些实施例中，步骤(2)在步骤(1)开始后不晚于5小时进行。在一些实施例中，步骤(2)在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时进行。在一些实施例中，步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时进行。在一些实施例中，步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于22、23、24、或25小时进行。在一些实施例中，步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于24小时进行。
在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过10％。
在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-7接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-21和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出在表达CAR的细胞中初始细胞的更高百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括使细胞群体与例如抗CD3抗体接触。
在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与在步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与在步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与在步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过5％或10％。在一些实施例中，如与在步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加。在一些实施例中，,如与在步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。在一些实施例中，如与在步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加至少10％或20％。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的更高百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)，在所述其他类似方法中步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出初始细胞(例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的更高百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天(例如持续5、6、7、8、或9天)。
在一些实施例中，来自步骤(3)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过5％或10％。在一些实施例中，如与在步骤(1)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，来自步骤(3)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比降低。在一些实施例中，如与在步骤(1)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比降低至少10％或20％。在一些实施例中，如与在步骤(1)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，在来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比降低至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的更低百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更低)，在所述其他类似方法中步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞)的更低百分比(例如至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前，在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天(例如持续5、6、7、8、或9天)。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)上扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估的)，在所述其他类似方法中步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行。在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)上扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天(例如持续5、6、7、8、或9天)。
在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，来自步骤(3)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(1)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
在一些实施例中，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，例如如通过活细胞数目进行评估，来自步骤(3)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增少于0.5、1、1.5、或2小时(例如少于1或1.5小时)。
在一些实施例中，细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触，或如果进行接触，接触步骤少于2小时(例如不超过1小时或1.5小时)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3(例如抗CD3抗体)的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段或scFv)、小分子或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。
在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含不超过2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含约2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含不超过2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含约2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含不超过2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含约2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体(例如实验室、医院或医疗保健提供者)的新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的从白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体(例如实验室、医院或医疗保健提供者)的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
在一些实施例中，这些前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。在一些实施例中，在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％的表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
在一些实施例中，步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的细胞培养基中进行。在一些实施例中，例如10、15、20、或25天后，IL-15增加细胞群体扩增的能力。在一些实施例中，IL-15增加在细胞群体中表达IL6Rβ的细胞的百分比。
在前述方法的一些实施例中，该方法在封闭系统中进行。在一些实施例中，T细胞分离、活化、转导、孵育和洗涤均在封闭系统中进行。在前述方法的一些实施例中，该方法在分开的装置中进行。在一些实施例中，T细胞分离、活化和转导、孵育、和洗涤在分开的装置中进行。
在前述方法的一些实施例中，该方法进一步包括在细胞培养基中添加佐剂或转导增强试剂以增强转导效率。在一些实施例中，佐剂或转导增强试剂包含阳离子聚合物。在一些实施例中，佐剂或转导增强试剂选自：LentiBOOSTTM(西里昂生物技术公司(SirionBiotech))、vectofusin-1、F108、海美溴铵(聚凝胺)、PEA、普朗尼克F68、普朗尼克F127、泊洛沙姆或LentiTransTM。在一些实施例中，佐剂是LentiBOOSTTM(西里昂生物技术公司(Sirion Biotech))。
在前述方法的一些实施例中，用病毒载体转导细胞群体(例如，T细胞)包括在增强转导效率的条件下使细胞群和病毒载体经受离心力。在一个实施例中，通过离心接种(spinoculation)转导细胞。
在前述方法的一些实施例中，细胞(例如，T细胞)在细胞培养瓶中被活化和转导，所述细胞培养瓶在基底处包含气体可渗透膜，其支持大的培养基体积而基本上不损害气体交换。在一些实施例中，通过经由对流提供对营养物的接近，例如基本上不间断的接近来实现细胞生长。
在前述方法的一些实施例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，与抗原结合的抗原结合结构域选自：CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。在一些实施例中，抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列。在一些实施例中，抗原结合结构域包含VH和VL，其中所述VH和VL通过接头连接，任选地其中所述接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。
在一些实施例中，跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包含CD8的跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码跨膜结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述铰链区包含SEQ ID NO:2、3、或4的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码铰链区的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:13、14、或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域。在一些实施例中、初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，所述初级信号传导结构域包括由CD3ζ衍生的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码初级信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，所述共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB或与CD83特异性结合的配体的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包括由4-1BB衍生的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:18的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含由4-1BB衍生的功能性信号传导结构域和由CD3ζ衍生的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR进一步包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的前导序列。
在一些实施例中，本发明的特征在于通过任何前述方法或本文披露的任何其他的方法制备的表达CAR的细胞(例如自体同源或同种异体表达CAR的T细胞或NK细胞)群体。在一些实施例中，本文披露了包含药物组合物，所述药物组合物包含本文披露的表达CAR的细胞群体和药学上可接受的运载体。
在一些实施例中，在使用本文所述的方法生产的最终的CAR细胞产物中，珠(例如CD4珠、CD8珠和/或TransACT珠)的总量不超过在制造过程中添加的珠的总量的0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、或0.5％。
在一些实施例中，本发明的特征在于表达CAR的细胞(例如自体同源或同种异体表达CAR的T细胞或NK细胞)群体，其包含具有一个或多个以下特征：(a)如与在被工程化以表达CAR之前，在相同的细胞群体中初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，约相同百分比的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+T细胞；(b)例如如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+ T细胞；(c)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，增加的百分比的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+ T细胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；(d)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，约相同百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+ T细胞；(e)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+ T细胞；(f)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，降低的百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+ T细胞，例如降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；(g)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，约相同百分比的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞；(h)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞；或(i)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，增加百分比的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞。
在一些实施例中，本发明的特征在于表达CAR的细胞(例如自体同源或同种异体表达CAR的T细胞或NK细胞)群体，其中：(a)细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；(b)细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；(c)细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；(d)细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；或(e)细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。
在一些实施例中，本发明的特征在于增加受试者中免疫应答的方法，包括向受试者施用本文披露的表达CAR的细胞群体或本文披露的药物组合物，从而增加受试者的免疫应答。
在一些实施例中，本文披露了在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文披露的表达CAR的细胞群体或本文披露的药物组合物，从而在受试者中治疗癌症。在一些实施例中，所述癌症是实体癌，例如选自：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)、子宫癌、肾癌、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌癌症、食道癌或膀胱癌，或其转移癌中的一种或多种。在一些实施例中，所述癌症是液体癌，例如选自：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
在一些实施例中，所述方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施例中，所述第二治疗剂是抗癌治疗剂，例如化学疗法、放射疗法或免疫调节疗法。在一些实施例中，所述第二治疗剂是IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))。
虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如序列数据库参考号)通过引用以其全文而结合。例如本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如在本文的任一表中)均通过引用而结合。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。
此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。根据说明书和附图并且如权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是清楚的。
附图说明
图1A-1I：当纯化的T细胞与细胞因子一起孵育时，初始细胞是转导的优势群体。图1A是示出示例性细胞因子过程的图。图1B是显示转导后在每个指定时间点的CD3+CAR+细胞百分比的一对图。图1C是显示与在两个独立供体中仅细胞因子群体(右)相比，CD3/CD28珠刺激群体(左)中CD3+CCR7+CD45RO-群体内的转导的一组图。对于在图1C中称为“短暂刺激IL7+IL15”的样品，用珠刺激细胞2天，然后在IL7和IL15存在下将它们除去。图1D、1E和1F是一组流式细胞术图，显示经三天期间的每天用IL2(图1D)、IL15(图1E)和IL7+IL15(图1F)培养的T细胞亚群的转导。图1G是一组流式细胞术图，显示在用IL2(右上图)或IL-15(右下图)刺激后CCR7和CD45RO在第0天(左)和第1天(右)的T细胞分化。图1H和1I是显示CD3+CCR7+RO-、CD3+CCR7+RO+、CD3+CCR7-RO+、和CD3+CCR7-RO-细胞在第0天或与指定的细胞因子培养24小时后的百分比的一组图。
图2A-2D：用一天的细胞因子刺激产生的CART是功能性的。图2A：用MOI为1转导纯化的T细胞，并且在所有测试的细胞因子条件下，在第1天和第10天观察到的表达CAR的细胞的百分比是相似的。CART在一天内产生并在收获后经由CD3/CD28珠扩增9天以模拟体内环境。图2A是显示第1天CART(左)和第10天CART(右)的每种条件下CD3+CAR+细胞的平均百分比的一对图。图2B：使用Nalm6作为靶细胞测量扩增后第1天CART的细胞毒性能力。图2B是显示来自每种条件的CART对CD19阳性Nalm6细胞的％杀伤的图。使用CD3/CD28珠扩展的第10天的CART被标记为“第10天”。所有其他样本都是第1天的CART。图2C：测试了响应于Nalm6靶细胞的扩增的第1天CART的IFNg的分泌。图2C是显示在CD19阳性或CD19阴性靶细胞存在下来自每种条件的CART的IFN-γ分泌量的图。图2D：通过测量EDU的掺入来测试第1天CART的增殖能力。图2D是显示每种条件下EDU阳性细胞的平均百分比的图。与图2B类似，第10天CART被标记为“第10天”，并且所有其他样品是第1天CART。
图3A-3B：MOI和培养基组合物对第0天转导的影响。图3A：在IL15、IL2+IL15、IL2+IL7、或IL7+IL15的存在下，用从1至10的范围的MOI转导纯化的T细胞。无论使用何种细胞因子，都观察到转导的线性增加。图3A是一组图，其中对于每种测试的条件，绘制CD3+CAR+细胞的百分比相对于MOI的图。图3B：培养基组合物影响细胞因子过程中的转导。图3B是显示每种测试的条件在第1天(左)或第8天(右)的CD3+CAR+细胞百分比的一对图。“2.50”指示2.50的MOI。“5.00”指示5.00的MOI。
图4A-4D：24小时内产生的CAR T细胞可以消除肿瘤。图4A：用CAR19转导纯化的T细胞，并在24小时后收获。图4A是一组流式细胞术图，显示使用用IL2、IL15和IL7+IL15培养的CAR19对T细胞的转导，说明了用每种细胞因子条件的转导。图4B：显示在所有测试的条件下平均存活率超过80％的图表。图4C：与第10天的对应物相比，外周血中第1天CART的扩增在体内增加。对于每种测试的条件，在输注后的指定时间点，活CD45+CD11b-CD3+CAR+细胞的百分比。第10天CART标记为“D10 1e6”或“D10 5e6”，并且所有其他样品是第1天CART。图4D：第1天CART可以消除体内肿瘤，尽管与第10天CART相比具有延迟的动力学。图4D是显示对于每种测试的条件，在肿瘤接种后的指定时间点的总通量的图。在肿瘤接种后4天施用CART。第10天CART被标记为“5e6 d.10”，并且所有其他样品是第1天CART。
图5A-5B：细胞因子过程是可扩展的。图5A：在
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上富集T细胞，并将B细胞隔室减少至小于1％。图5A是一组流式细胞术图，显示用抗CD3抗体(左)或抗CD19抗体和抗CD14抗体(右)对leukopak细胞(上)或CD4+CD8+富集后的细胞(下)的细胞染色。图5B：富集后在24孔板或PL30袋中用CAR19转导来自冷冻的单采的纯化的T细胞。24小时后收获CART。图5B是一组流式细胞术图，显示在IL2或hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)存在下制备的细胞的CD3和CAR染色。
图6A-6C：通过活化过程制备的CART在体内显示出优异的抗肿瘤功效。图6A和6B是绘制的肿瘤植入后肿瘤负荷相对于指定时间点的图。“d.1”指示使用活化过程制造的CART。“d.9”指示使用传统的9天扩增方案制造的CART，在本研究中用作阳性对照。图6C是显示来自小鼠的生物发光的一组代表性图像。
图7A-7B：表达IL6Rα和IL6Rβ的细胞富集在分化程度较低的T细胞群体中。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查CD4(图7A)和CD8(图7B)T细胞亚群上IL6Rα和IL6Rβ的表达水平。
图8A和8B：表达IL6Rα和IL6Rβ的细胞均富集在分化程度较低的T细胞群体中。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查CD4(图8A)和CD8(图8B)T细胞亚群上指定的表面抗原的表达水平。
图9：表达IL6Rα的细胞表达分化程度较低的T细胞的表面标志物。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查IL6Rα高、中和低表达细胞亚群中各种表面抗原的表达水平。
图10：表达IL6Rβ的细胞表达分化程度较低的T细胞的表面标志物。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查IL6Rβ高、中和低表达细胞亚群中各种表面抗原的表达水平。
图11：TCR接合后IL6Rα而非IL6Rβ表达下调。在第0天用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点检查IL6Rα和IL6Rβ的表达水平。
图12：TCR接合后细胞因子处理的T细胞的倍数扩增。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点监测细胞数量。
图13A和13B：TCR接合后，IL2、IL7和IL15处理不影响细胞大小和活力。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点监测细胞大小(图13A)和活力(图13B)。
图14：细胞因子处理后各种表面分子在CD4 T细胞上的表达动力学。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点通过流式细胞术检查各种表面分子的表达。
图15：细胞因子处理后各种表面分子在CD8 T细胞上的表达动力学。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点通过流式细胞术检查各种表面分子的表达。
图16：在TCR接合后，IL6Rβ表达主要限于表达CD27的T细胞亚群。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在第15天通过流式细胞术检查IL6Rβ表达。
图17：在TCR接合后，IL6Rβ表达主要限于不表达CD57的T细胞亚群。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在第25天通过流式细胞术检查IL6Rβ表达。
图18：常见的γ链细胞因子处理的T细胞在第25天产生功能性细胞因子。在第0天，在指定的细胞因子存在下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在第25天通过流式细胞术检查产生T细胞的IL2、IFNγ和TNFα的百分比。
图19A和19B：第1天的BCMA CAR表达使用来自两个健康供体的T细胞中的MOI＝2.5的ARM。图19A是一组显示通过流式细胞术测量的BCMA CAR表达的直方图。图19B是列出流式细胞术分析中使用的试剂/条件的表。
图20A、20B、和20C：使用ARM过程制造的细胞的从第1天至第4天的体外CAR表达动力学。CAR在第3天稳定表达。图20A是一组显示在指定时间点通过流式细胞术测量的CAR表达的直方图。图20B和20C分别是显示CAR+％和MFI值随时间的曲线图。
图21A和21B：在KMS-11-luc多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型中的体内分类。每只小鼠接受第1天CART产品的1.5E6。图21A是一组显示CART细胞中第1天和第7天CAR表达的直方图。图21B是显示CART处理后肿瘤动力学(BLI水平)的图。
图22A、22B、和22C：使用剂量滴定在KMS-11-luc多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型中BCMA CAR的体内分类。图22A是一组显示在第1天和第3天的CAR表达直方图。图22B是显示使用两种不同剂量的CART治疗后肿瘤摄入动力学的图：一个剂量的1.5e5 CAR+ T细胞和一个剂量的5e4 CAR+ T细胞。基于第3天CAR表达将CAR+细胞的剂量标准化。图22C是显示在经该研究过程中体重动力学的图。
图23A、23B、和23C.图23A和23B是显示在其细胞表面上表达CAR的T细胞的百分比(图23A)和随时间观察的CD3+CAR+细胞的平均荧光强度(MFI)(图23B)的图(重复效率从图23C所示的两个流量图平均)。图23C是一组流式细胞术图，显示了基于UTD样品的活CD3+细胞上表面CAR表达的门控策略。图中的数字指示CAR阳性百分比。
图24A和24B.图24A是显示起始材料(
Figure BDA0002952123060000331
产品)的端对端组合物和在培养开始后的不同时间点收获时的图。初始(n)、中枢记忆(cm)、效应记忆(em)、和效应子(eff)亚群由CD4、CD8、CCR7和CD45RO表面表达或其缺乏来定义。指定了CD4组合物。对于每个时间点，左侧柱显示整体CD3+群体(总)的细胞组成，右侧柱显示CAR+级分的细胞组成。图24B是一组流式细胞术图，显示应用于活CD3+事件的门控策略，以确定整体CD3+群体(总)和CAR+级分内的总转导效率(顶行)，CD4/CD8组合物(中间行)和记忆亚群(底行)。
图25.表达表面CAR的T细胞亚群随时间的动力学，表示为各亚群中活细胞的数量。
图26.从预洗涤计数确定培养起始后12至24小时的活细胞回收(在收获时回收的活细胞数与接种的活细胞数)。
图27.在培养开始后12至24小时收获快速CART的活力，如在收获时的预洗涤和洗涤后所确定的。
图28A、28B、28C、和28D.图28A是显示通过流式细胞术分析的起始材料(健康供体leukopak；LKPK)和富含T细胞的产物的组合物的图。数字指示亲本的百分比(活细胞，单细胞)。T：T细胞；mono：单核细胞；B：B细胞；CD56(NK)：NK细胞。图28B是一组流式细胞术图，显示用于确定转导率(前向散射FSC对比CAR)和T细胞亚群(CD4对比CD8和CCR7对比CD45RO)的活CD3+事件的门控策略。对于ARM-CD19 CAR(使用活化快速制造(ARM)过程制造的CD19CART细胞)和TM-CD19 CAR(使用传统制造(TM)过程制造的CD19CART细胞)，左下图表示总培养物，而右图表示CAR+ T细胞。“ARM-UTD”和“TM-UTD”分别指根据ARM和TM过程制造的未转导的T细胞(UTD)。象限中的数字指示亲本群体的百分比。TM-UTD和TM-CD19 CAR图中的框表明TM过程向TCM表型偏斜。ARM-UTD和ARM-CD19 CAR图中的框表示通过ARM过程维护初始样细胞。NA：不适用。图28C是显示ARM-CD19 CAR和TM-CD19 CAR的端对端T细胞组成的图。在适用的情况下，显示“总”和“CAR+”群体的组成。各个群体的百分比是指亲本的百分比(CD3+或CAR+CD3+)(如果适用)。指定了相应的总或CAR+群体的CD4细胞的百分比。LKPK：Leukopak起始材料；4和8：分别为CD4+和CD8+；eff：效应子；em：效应子记忆；cm：中枢记忆；n：初始样。数据代表用3个不同的健康供体(n＝3)进行3次全规模运行，并且有几次小规模运行用于优化该过程。图28D是表示图28C中所示百分比的表。
图29A、29B、29C、和29D.细胞培养上清液中的细胞因子浓度。IFN-γ(图29A和29B)和IL-2(图29C和29D)。图29A和29C：将TM-CD19 CAR、ARM-CD19 CAR和各自的UTD与NALM6-WT(ALL)、TMD-8(DLBCL)共培养，或不与癌细胞(仅T细胞)共培养。48小时后收集上清液。图29B和29D：ARM-CD19 CAR与NALM6-WT、NALM6-19KO(CD19阴性)共培养或单独培养。24小时或48小时后收集上清液。为了进一步评估抗原特异性细胞因子分泌，将ARM-CD19 CAR单独培养24小时，洗涤，然后与靶细胞共培养24小时。显示的数据来自2个健康供体T细胞，并且代表2个实验，总计3个供体。
图30A、30B、和30C.图30A是概述异种移植小鼠模型以研究ARM-CD19 CAR的抗肿瘤活性的图。图30B是一组流式细胞术图，显示了来自哨兵小瓶(sentinel vial)的ARM-CD19CAR细胞上CAR表达的测定。在流式细胞术分析之前，将ARM-CD19 CAR细胞培养图中所述的时间段。CAR表达的门控基于同种型对照(Iso)染色。图30C是显示ARM-CD19 CAR在异种移植小鼠模型中的体内功效的图。给NSG小鼠注射前B ALL系NALM6，表达荧光素酶报告基因；肿瘤负荷表示为全身发光(p/s)，描绘为平均肿瘤负荷，具有95％置信区间。在肿瘤接种后第7天，用各自剂量的ARM-CD19 CAR或TM-CD19 CAR处理小鼠(活CAR+ T细胞的数目)。由于X-GVHD的发作，高剂量ARM-CD19 CAR组在第33天终止。载体(PBS)和未转导的T细胞(UTD)用作阴性对照。对于所有组，n＝5只小鼠，除了对于ARM-UTD 1×106剂量组和所有TM-CD19 CAR剂量组的n＝4。用来自5个不同健康供体的CAR-T细胞进行5次异种移植研究，其中3个包括与TM-CD19 CAR的比较。
图31A、31B、31C、和31D.在相应的CAR-T细胞剂量下用ARM-CD19 CAR或TM-CD19CAR处理的携带NALM6肿瘤的小鼠的血浆细胞因子水平。将小鼠放血并通过MSD测定法测量血浆细胞因子。对于用CAR-T(图31A和31C)或ARM-和TM-UTD(图31B和31D)细胞处理的小鼠，显示了IFN-γ(图31A和31B)和IL-2(图31C和31D)。每个剂量内的条形代表组内不同时间点的组内的平均细胞因子水平(从左侧开始：第4、7、10、12、16、19、23、26天)。水平条和数字指示文本中描述的ARM-CD19 CAR(1×106剂量组)和TM-CD19 CAR(0.5×106剂量组)之间的倍数变化比较：3倍(IFN-γ)；和10倍(IL-2)。由于肿瘤负荷或体重减轻而被取下的组没有显示最后的时间点。测量2项研究的血浆细胞因子水平。no tum：无肿瘤。
图32.用PBS载体、UTD、TM-CD19 CAR或ARM-CD19 CAR处理的携带NALM6肿瘤的小鼠中总和和CAR+ T细胞浓度的时间过程。在CAR-T细胞注射后4、7、14、21和28天采集血样。在设计的时间点通过流式细胞术分析总T细胞(CD3+，上)和CAR+ T细胞(CD3+CAR+，下)浓度，描绘为具有95％置信区间的平均细胞。
图33A和33B.三方共培养上清液中的IL-6蛋白水平，以pg/mL表示。ARM-CD19 CAR/K562共培养细胞(图33A)或TM-CD19 CAR/K562细胞共培养细胞(图33B)，以不同比例(1:1和1:2.5)孵育6或24小时，然后将其添加至PMA分化的THP-1细胞中另外24小时。显示了与K562-CD19细胞共培养的CAR-T细胞，与K562-间皮素细胞共培养的CAR-T细胞和仅CAR-T细胞的结果。为清楚起见未示出1:5比率。仅ARM-CD19 CAR和仅TM-CD19 CAR的指定条代表没有靶细胞的CAR-T细胞培养物(6小时，24小时)。平均值+SEM，n＝1(TM-CD19 CAR)和n＝3(ARM-CD19 CAR)的重复。
图34A、34B、和34C.ARM过程保留了BCMA CAR+ T胞的干细胞性。评估使用ARM过程制备的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞在解冻时(图34A)和解冻后48小时(图34B)的CAR表达。还评估了解冻后48小时产物的CCR7/CD45RO标志物(图34C)。显示的数据是来自使用两个供体T细胞进行的两个实验的一个代表。
图35A和35B.TM过程主要产生中枢记忆T细胞(TCM)(CD45RO+/CCR7+)，而初始样T细胞群体几乎在使用TM过程制造的CAR+ T细胞中消失。在第9天评估使用TM过程制备的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞的CAR表达(图35A)。还在解冻后产物的第9天评估CCR7/CD45RO标志物(图35B)。显示的数据是来自使用两个供体T细胞进行的两个实验的一个代表。
图36A、36B、36C、和36D.ARM处理的BCMA CAR-T细胞表现出BCMA特异性活化并分泌更高水平的IL2和IFN-γ。细胞培养上清液中的IL-2和IFN-γ浓度。使用ARM或TM过程制造的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞和各自的UTD与KMS-11以2.5:1的比例共培养。20小时后收集上清液。对于ARM产物，IFN-γ浓度显示在图36A中，IL-2浓度显示在图36B中。对于TM产物，IFN-γ浓度显示在图36C中，IL-2浓度显示在图36D中。显示的数据是来自使用两个供体T细胞进行的两个实验的一个代表。
图37A、37B、和37C.输入细胞(图37A)、第1天细胞(图37B)和第9天细胞(图37C)的单细胞RNA序列数据。“nGene”图显示每个细胞表达基因的数量。“nUMI”图显示每个细胞的独特分子标识符(UMI)的数量。
图38A、38B、38C、和38D.T-分布随机邻域嵌入(TSNE)图比较输入细胞(图38A)、第1天细胞(图38B)和第9天细胞(图38C)的增殖特征，其基于基因CCNB1、CCND1、CCNE1、PLK1、和MKI67的表达确定。每个点代表该样品中的一个细胞。显示为浅灰色的细胞不表达增殖基因，而深色阴影的细胞表达一种或多种增殖基因。图38D是小提琴图，示出了基因集的基因集评分的分布，所述基因集由多个基因集成，所述多个基因表征第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的静息对比活化T细胞状态。在图38D中，较高的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明静息T细胞表型增加，而较低的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明活化的T细胞表型增加。与第9天和第1天细胞相比，输入细胞总体上处于静息状态。第1天细胞显示最大的活化基因集评分。
图39A、39B、39C、39D和39E.输入细胞、第1天细胞和第9天细胞的基因集分析。在图39A中，基因集“向上TEM对比向下TSCM”的较高基因集评分表明该样品中细胞的效应记忆T细胞(TEM)表型增加，而较低的基因集评分表明干细胞记忆T细胞(TSCM)表型增加。在图39B中，基因集“向上Treg对比向下Teff”的较高基因集评分表明增加的调节性T细胞(Treg)表型，而较低的基因集评分表明增加的效应T细胞(Teff)表型。在图39C中，基因集“向下干细胞性”的较低基因集评分表明干细胞性表型增加。在图39D中，基因集“向上缺氧”的较高基因集评分表明高缺氧表型增加。在图39E中，基因集“向上自噬”的较高基因集评分表明高自噬表型增加。在记忆、干细胞样和分化特征方面，第1天细胞看起来与输入细胞相似。另一方面，第9天细胞显示出更高的代谢应激富集。
图40A、40B、和40C.输入细胞的基因簇分析。图40A-40C是小提琴图，示出了来自输入细胞的四个簇的基因集分析的基因集评分。图40A-40C小提琴图中重叠的每个点表示细胞的基因集评分。在图40A中，基因集“向上Treg对比向下Teff”的较高基因集评分表明Treg细胞表型增加，而基因集“向上Treg对比向下Teff”的较低基因集评分表明Teff细胞表型增加。在图40B所示，基因集“逐渐增加记忆分化”的较高基因集评分表明晚期记忆T细胞表型增加，而基因集“逐渐增加记忆分化”的较低基因集评分表明早期记忆T细胞表型增加。在图40C中，基因集“向上TEM对比向下TN”的较高基因集评分表明效应记忆T细胞表型增加，而基因集“向上TEM对比向下TN”的较低基因集评分表明初始T细胞表型增加。簇3中的细胞显示在晚期记忆进一步分化的T细胞状态中，与处于早期记忆的簇1和簇2中的细胞相比，呈现较低分化的T细胞状态。簇0似乎处于中间T细胞状态。总之，该数据示出了输入细胞内存在相当水平的异质性。
图41A、41B、和41C.TCR测序和测量克隆型多样性。第9天细胞具有更平坦的克隆型频率分布(更高的多样性)。
图42是显示在患有复发和/或难治性多发性骨髓瘤的成年患者中使用ARM过程制造的BCMA CART细胞的I期临床试验的设计的流程图。
图43是显示在存在或不存在两种不同浓度(30μM和100μM)的AZT的情况下病毒添加后不同收集时间点的ARM-BCMA CAR表达的FACS分析的图。在活化和细胞接种时，在AZT处理之前1小时添加慢病毒载体。
图44A和44B是显示在解冻时ARM-BCMA CAR的CAR表达的评估(图44A)和解冻后48小时和在48h解冻后产物CCR7/CD45RO标志物以及第9天的TM-BCMA CAR的CAR表达的评估(图44B)。显示的数据是来自使用来自两个供体的T细胞进行的两个实验的一个代表。
图45A和45B是显示细胞培养上清液中的细胞因子浓度的图。将ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR以及各自的UTD与KMS-11共培养。24小时后收集上清液。显示的数据是来自使用来自两个供体的T细胞进行的两个实验的一个代表。
图46是显示用于测试ARM-BCMA的异种移植物功效研究的概要的图。
图47是比较异种移植模型中ARM-BCMA CAR的功效与TM-BCMA CAR的功效的图。给NSG小鼠注射MM细胞系KMS11，表达荧光素酶报告基因。肿瘤负荷表示为全身发光(p/s)，描绘为平均肿瘤负荷+SEM。在肿瘤接种后第8天，用各自剂量的ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理小鼠(活CAR+ T细胞的数目)。载体(PBS)和UTD T细胞用作阴性对照。对于所有组，N＝5只小鼠，除了对于ARM-BCMA CAR(1e4个细胞)、PBS和UTD组N＝4。
图48A、48B和48C是显示用ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理的小鼠的血浆IFN-γ动力学的图。在相应的CAR-T细胞剂量下用UTD、ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理的携带KMS11-luc肿瘤的小鼠的血浆IFN-γ水平。所有IFN-γ水平均表示为平均值±SEM。将小鼠放血并通过Meso Scale Discovery(MSD)测定法测量血浆细胞因子。
图49是显示体内ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR的细胞动力学的图。用不同剂量的TM UTD、ARM UTD、ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR处理的携带KMS11肿瘤的小鼠的外周血中的细胞动力学。细胞计数表示为平均细胞计数+SD。在肿瘤接种后第8天，用各自剂量的ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理小鼠(活CAR+ T细胞的数目)。载体(PBS)和UTD T细胞用作阴性对照。在CAR-T注射后第7、14和21天采集血液样品，并在设计的时间点通过流式细胞术分析。对于所有组，N＝5只小鼠，除了对于ARM-BCMA CAR(1e4个细胞)、PBS和UTD组N＝4。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
本发明的组合物和方法涵盖具有指定序列，或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％或95％同一性或更高同一性的序列的多肽和核酸。在氨基酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一氨基酸序列含有足够或最小数量的氨基酸残基，这些氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或ii)是第二氨基酸序列中比对的氨基酸残基的保守置换，以使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同结构域和/或共同功能活性，例如含有与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的共同结构域的氨基酸序列。
在核苷酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足够或最小数量的核苷酸，这些核苷酸与第二核酸序列中的比对核苷酸相同，以使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽域或共同功能多肽活性，例如与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列。
术语“变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，变体是功能性变体。
术语“功能性变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考氨基酸序列的一种或多种活性的多肽。
术语细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或IL-6)包括天然存在的细胞因子(包括具有至少10％、30％、50％或80％的活性(例如天然存在的细胞因子免疫调节活性)的其片段和功能变体)的全长、片段或变体，例如功能变体。在一些实施例中，细胞因子具有与天然存在的细胞因子基本相同的氨基酸序列(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，或由与编码细胞因子的天然存在的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列编码(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在一些实施例中，如上下文所述，细胞因子进一步包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域(例如，IL-15/IL-15R)。
术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。
在一些实施例中，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一些实施例中，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自共刺激分子的功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含衍生自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含衍生自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-端)处的任选前导序列。在一些实施例中，CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物)也称为XCAR。例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMA CAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
如本文所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，该蛋白质或多肽序列与抗原特异性结合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、骆驼科VHH结构域和由如二价片段的抗体片段形成的多特异性分子，该二价片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个或更多个(例如两个)Fab片段，或所连接的抗体的两个或更多个(例如两个)分离的CDR或其他表位结合片段。抗体片段也可以掺入单结构域抗体、多抗体、微抗体、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗体片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
I.术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。在一些实施例中，scFv可包含NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH的结构。
如本文所用，所述术语“互补性决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸的序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“乔西亚”编号方案)、或其组合。在组合的卡巴特和乔西亚编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为卡巴特CDR、乔西亚CDR或两者的一部分的氨基酸残基。
包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR组合物的部分可以以多种形式存在，例如其中抗原结合结构域表达为多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)，或例如人或人源化抗体)的一部分(Harlow等人,1999,于：Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],NY[纽约]；Harlow等人,1989,于：Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],New York[纽约]；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一些实施例中，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在一些实施例中，CAR包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(在本文中也称为“抗靶标结合结构域”)是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一些实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“双特异性抗体(bispecific antibody)”和“双特异性抗体(bispecificantibody)”是指在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点的分子。因此，双特异性抗体能够同时或依次结合两种不同的抗原。用于生产双特异性抗体的方法是本领域已知的。用于组合两种抗体的各种形式也是本领域已知的。如本领域技术人员已知的，本发明的双特异性抗体的形式包括但不限于双抗体、单链双抗体、Fab二聚化(Fab-Fab)、Fab-scFv和串联抗体。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫响应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗肿瘤作用”和“抗癌作用”在本文中可互换使用，是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积或癌体积减少、肿瘤细胞或癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、肿瘤细胞增殖或癌细胞增殖减少、肿瘤细胞存活率或癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗肿瘤作用”或“抗癌作用”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤或癌症发生的能力来表现。
术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些实施例中，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用，术语“单采(apheresis)”是指本领域公认的体外过程，通过该过程，将供体或患者的血液从该供体或患者移出并使血液穿过分离出一种或多种所选择的特定成分的装置，并使其余部分(例如，通过回输法)返回至该供体或患者的循环。因此，在“单采样品”的上下文中是指使用单采获得的样品。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一些实施例中，通过本文所述的方法治疗的癌症包括多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
“源自”(当该术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的置换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的CAR。
在刺激和/或共刺激分子刺激的上下文中，术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)和/或具有其同源配体的共刺激分子(例如，CD28或4-1BB)的结合诱导的应答，例如，首次或二次应答，由此介导信号转导事件，例如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，和/或细胞骨架结构的重构等。
术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其针对T细胞信号传导途径的至少一些方面提供以刺激方式调节TCR复合物的初级活化的一个或多个初级胞质信号传导序列。在一些实施例中，CAR内的含ITAM的结构域独立于内源性TCR复合物重现初级TCR的信号传导。在一些实施例中，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合而引发，并且其导致T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CARS中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，该免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。在实施例中，细胞内信号结构域转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
细胞内信号传导结构域产生信号，该信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含源自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或者“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:9或10提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB和与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。
细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人4-1BB氨基酸序列。“4-1BB共刺激结构域”是指4-1BB的共刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO:7提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。在一些实施例中，表达包括被引入细胞的mRNA的翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的
Figure BDA0002952123060000531
基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间(例如，两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间、或两个多肽分子之间)的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像，宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。在一些实施例中，“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”包括核苷酸/核苷衍生物或类似物。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换，例如保守置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换(例如，保守置换)可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”、“肿瘤抗原”、“过度增殖性障碍抗原”、和“与过度增殖性障碍相关的抗原”可互换地指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在一些实施例中，这些属于是指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本发明的过度增殖性障碍抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、卵巢癌、胰腺癌等等)或者浆细胞增殖性障碍，例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,GeneTher[基因疗法]2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]2012 19(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，该细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要该抗原存在于支持癌细胞的细胞上。
如在scFv的语境中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一些实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:41)。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5并且n＝6、n＝7、n＝8、n＝9并且n＝10。在一些实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在一些实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:25)的多个重复。描述于WO 2012/138475中的接头也包括在本发明的范围内，该专利通过援引并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA。在一些实施例中，该RNA是mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施例中，聚(A)在50个和5000个之间。在一些实施例中，聚(A)大于64个。在一些实施例中，聚(A)大于100个。在一些实施例中，聚(A)大于300个。在一些实施例中，聚(A)大于400个。聚(A)序列可以经化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'多聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将多聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。多聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性障碍的进展。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物，例如，人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施例中，在体外培养细胞。在一些实施例中，不在体外培养细胞。
如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其后代。
术语“特异性结合”是指抗体或配体，其识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质，但是其中抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽(在最简单的实施例中典型地为两个)，当在免疫效应细胞中时这些多肽为细胞提供针对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在一些实施例中，RCAR包含至少细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含源自刺激分子和/或本文在CAR分子的语境中定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR中的多肽组并不是相互连续的，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，RCAR包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR在如本文所述的细胞(例如免疫效应细胞)，例如表达RCAR的细胞(本文还称为“RCARX细胞”)中表达。在一些实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一些实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。RCAR可以为表达RCAR的细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化表达RCAR的细胞的免疫效应特性。在实施例中，RCAR细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以提供对包含由该抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的特异性。
当该术语在本文中使用时，“膜锚”或“膜系链结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜的多肽或部分(例如肉豆蔻酰基)。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“开关结构域”是指实体(典型地是基于多肽的实体)，该实体在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合。该缔合导致连接到(例如融合到)第一开关结构域的第一实体和连接到(例如融合到)第二开关结构域的第二实体的功能偶联。第一开关结构域和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，该开关是细胞内的。在实施例中，该开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽(例如基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子(例如雷帕霉素类似物(rapalogue))。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如结合myc肽的scFv)，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个myc scFv的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如myc受体)，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子不在受试者中天然发生，或者不以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素(Rapamycin)或雷帕霉素类似物，例如RAD001。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素，或催化性mTOR抑制剂)联合使用时，术语“低免疫增强剂量”是指mTOR抑制剂部分但不是完全抑制mTOR活性的剂量，例如，如通过P70 S6激酶活性的抑制测量的。本文讨论了用于评价mTOR活性的方法，例如通过抑制P70 S6激酶。剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一些实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性T细胞数目的减少和/或PD-1阴性T细胞数目的增加，或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率的增加。在一些实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致初始T细胞的数目增加。在一些实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致以下中的一个或多个：
以下标志物中的一个或多个例如在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达增加：CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2；
KLRG1在例如记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达减少；并且
记忆T细胞前体，例如具有以下特征中的任一个或组合的细胞的数目增加：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、减少的KLRG1、和增加的BCL2；
其中，例如，与未治疗的受试者相比，例如至少瞬时地发生上述任何变化。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
如本文所用的“复发的”或“复发”是指疾病(例如癌症)或疾病的体征和症状(如改善或响应期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的回返或再现。应答初始期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。例如，如在B-ALL的上下文中，再现可能涉及例如在完全应答之后血液、骨髓(>5％)或任何髓外位点中的母细胞再现。在本上下文中，完全应答可能涉及<5％BM母细胞。更通常地，在一些实施例中，应答(例如，完全应答或部分应答)可能涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一些实施例中，初始应答期持续至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4周；至少1、2、3、4、6、8、10、或12个月；或至少1、2、3、4、或5年。
范围：贯穿本披露内容，能以范围形式呈现本发明的各个实施例。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％、或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％、和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
当该术语在本文中使用时，“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的，并且在下文更全面地描述。
如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在该病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，由于是组合施用，所以所述治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，与不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加、或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。
术语“消耗(deplete)”或“耗减(depleting)”在本文中可互换使用，是指在进行例如选择步骤(例如，阴性选择)的过程之后，样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少。消耗可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分消耗。在一些实施例中，消耗为与进行该过程之前样品中的细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
如本文所用，“初始T细胞”是指抗原缺乏经验的T细胞。在一些实施例中，抗原缺乏经验的T细胞在胸腺中而不在外周遇到其同源抗原。在一些实施例中，初始T细胞是记忆细胞的前体。在一些实施例中，初始T细胞表达CD45RA和CCR7，但不表达CD45RO。在一些实施例中，初始T细胞可以通过CD62L、CD27、CCR7、CD45RA、CD28和CD127的表达以及不存在CD95或CD45RO同种型来表征。在一些实施例中，初始T细胞表达CD62L、IL-7受体-α、IL-6受体和CD132，但不表达CD25、CD44、CD69或CD45RO。在一些实施例中，初始T细胞表达CD45RA、CCR7、和CD62L，但不表达CD95或IL-2受体β。在一些实施例中，使用流式细胞术评估标志物的表面表达水平。
术语“中枢记忆T细胞”是指人类中CD45RO阳性并表达CCR7的T细胞亚群。在一些实施例中，中枢记忆T细胞表达CD95。在一些实施例中，中枢记忆T细胞表达IL-2R、IL-7R和/或IL-15R。在一些实施例中，中枢记忆T细胞表达CD45RO、CD95、IL-2受体β、CCR7和CD62L。在一些实施例中，使用流式细胞术评估标志物的表面表达水平。
术语“干细胞记忆T细胞(stem memory T cell)”、“干细胞记忆T细胞(stem cellmemory T cell)”、“干细胞样记忆T细胞”、“记忆干细胞T细胞”、“T记忆干细胞”、“T干细胞记忆细胞”或“TSCM细胞”是指具有干细胞样能力的记忆T细胞的亚群，例如，自我更新的能力和/或重建记忆和/或效应子T细胞亚群的多潜能性能力。在一些实施例中，干细胞记忆T细胞表达CD45RA、CD95、IL-2受体β、CCR7和CD62L。在一些实施例中，使用流式细胞术评估标志物的表面表达水平。在一些实施例中，示例性的干细胞记忆T细胞披露于Gattinoni等人,Nat Med.[自然医学]2017年1月06日；23(1):18-27，将其通过引用以其整体并入本文。
为清楚起见，除非另有说明，否则将细胞或细胞群体分类为“不表达”或具有“不存在”或对特定标志物“阴性”可能不一定意味着标志物的绝对缺失。本领域技术人员可以容易地将细胞与阳性和/或阴性对照进行比较，和/或设定预定阈值，并且当细胞具有表达水平低于预定阈值或细胞群体具有低于使用常规检测方法(例如，使用流式细胞术，例如，如本文实例中所述的)的预定阈值的总表达水平时，将细胞或细胞群体分类为不表达或对标志物呈阴性。例如，代表性的门控策略如图1G所示。例如，CCR7阳性、CD45RO阴性细胞显示在图1G的左上象限中。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)”是指反映细胞显示效应记忆T细胞(TEM)表型对比干细胞记忆T细胞(TSCM)表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)表明TEM表型增加，而较低的基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)表明TSCM表型增加。在一些实施例中，通过测量在TEM细胞中上调和/或在TSCM细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY、和GFPT2。在一些实施例中，使用RNA序列确定每个细胞的基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图39A中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上Treg对比向下Teff)”是指反映细胞显示调节性T细胞(Treg)表型对比效应T细胞(Teff)表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上Treg对比向下Teff)表明Treg表型增加，而较低的基因集评分(向上Treg对比向下Teff)表明Teff表型增加。在一些实施例中，通过测量Treg细胞中上调和/或在Teff细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上Treg对比向下Teff)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3、和FOXP3。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(向上Treg对比向下Teff)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图39B中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向上Treg对比向下Teff)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向下干细胞性)”是指反映细胞显示低干细胞性表型的程度的分数。较低的基因集评分(向下干细胞性)表明干细胞性表型增加。在一些实施例中，通过测量在分化干细胞中上调而在造血干细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向下干细胞性)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1、和XRCC5。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(向下干细胞性)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图39C中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向下干细胞性)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上缺氧)”是指反映细胞显示高缺氧表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上缺氧)表明缺氧表型增加。在一些实施例中，通过测量在经历缺氧的细胞中上调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上缺氧)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11、和XRCC6。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(向上缺氧)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图39D中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向上缺氧)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上自噬)”是指反映细胞显示自噬表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上自噬)表明自噬表型增加。在一些实施例中，通过测量在经历自噬的细胞中上调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上自噬)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593、和ZNF681。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(向上自噬)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图39E中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向上自噬)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上静息对比向下活化)”是指反映细胞显示静息T细胞表型对比活化T细胞表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明静息T细胞表型增加，而较低的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明活化的T细胞表型增加。在一些实施例中，通过测量在静息T细胞中上调和/或在活化T细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上静息对比向下活化)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862、和ZNF91。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(向上静息对比向下活化)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图38D中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向上静息对比向下活化)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(逐渐增加记忆分化)”是指反映细胞在记忆分化中的阶段的分数。基因集“逐渐增加记忆分化”的较高基因集评分表明晚期记忆T细胞表型增加，而基因集“逐渐增加记忆分化”的较低基因集评分表明早期记忆T细胞表型增加。在一些实施例中，通过测量在记忆分化期间上调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上自噬)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、和KLRB1。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(逐渐增加记忆分化)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图40B中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(逐渐增加记忆分化)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上TEM对比向下TN)”是指反映细胞显示效应记忆T细胞(TEM)表型对比初始T细胞(TN)表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上TEM对比向下TN)表明TEM表型增加，而较低的基因集评分(向上TEM对比向下TN)表明TN表型增加。在一些实施例中，通过测量在TEM细胞中上调和/或在TN细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上TEM对比向下TN)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK、和KLRB1。在一些实施例中，使用RNA序列确定基因集评分(向上TEM对比向下TN)，例如，单细胞RNA序列(scRNA序列)，例如，如实例10中结合图40C中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(向上TEM对比向下TN)。
在基因集评分值(例如，中位数基因集评分值)的上下文中，当阳性基因集评分减少100％时，该值变为0。当阴性基因集评分增加100％时，该值变为0。例如，在图39A中，第1天样品的中位数基因集评分是-0.084；第9天样品的中位数基因集评分是0.035；并且输入样品的中位数基因集评分是-0.1。在图39A所示，将输入样品的中位数基因集评分增加100％导致基因集评分值为0；以及将输入样品的中位数基因集评分增加200％导致基因集评分值为0.1。在图39A所示，将第9天样品的中位数基因集评分降低100％导致基因集评分值为0；以及将第9天样品的中位数基因集评分降低200％导致基因集评分值为-0.035。
如本文所用，术语“珠”是指具有固体表面的离散颗粒，其尺寸范围为直径从约0.1μm至数毫米。珠可以是球形的(例如，微球)或具有不规则的形状。珠可包括多种材料，包括但不限于顺磁性材料、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、SepharoseTM、纤维素、尼龙等。在一些实施例中，珠是相对均匀的、直径约4.5μm、球形、超顺磁性聚苯乙烯珠，例如，用抗CD3抗体(例如CD3ε)和CD28的混合物涂覆，例如，共价偶联。在一些实施例中，珠是
Figure BDA0002952123060000761
在一些实施例中，抗CD3和抗CD28抗体都与相同的珠偶联，模拟抗原呈递细胞对T细胞的刺激。
Figure BDA0002952123060000762
的性质和
Figure BDA0002952123060000763
用于细胞分离和扩增的用途是本领域熟知的，例如，参见Neurauter等人,Cell isolation andexpansion using Dynabeads[使用Dynabeads进行细胞分离和扩增],Adv Biochem EngBiotechnol.[生物化学工程生物技术的进展]2007；106:41-73，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“纳米基质”是指包含可移动聚合物链基质的纳米结构。纳米基质的尺寸为1至500nm，例如10至200nm。在一些实施例中，移动聚合物链的基质与一种或多种激动剂附接，所述激动剂向T细胞提供活化信号，例如激动剂抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施例中，纳米基质包含附接的胶体聚合物纳米基质，例如共价附接至一种或多种刺激分子的激动剂和/或一种或多种共刺激分子的激动剂。在一些实施例中，一种或多种刺激分子的激动剂是CD3激动剂(例如，抗CD3激动性抗体)。在一些实施例中，一种或多种共刺激分子的激动剂是CD28激动剂(例如，抗CD28激动剂抗体)。在一些实施例中，纳米基质通过不存在固体表面来表征，例如，作为激动剂的附着点，例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施例中，纳米基质是WO 2014/048920A1中披露的纳米基质或来自美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotcc GmbH)的
Figure BDA0002952123060000771
GMP T Cell TransActTM试剂盒中给出的纳米基质，其通过引用整体并入本文。
Figure BDA0002952123060000772
GMP T Cell TransActTM由共价附接至针对人CD3和CD28的人源化重组激动剂抗体的胶体聚合物纳米基质组成。
本文的组合物和方法的各个实施例在下文进一步详细描述。另外的定义在整个申请书中陈述。
描述
本文提供了制造经工程化以表达CAR(例如本文所述的CAR、包含此类细胞的组合物)的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，以及使用此类细胞治疗受试者中的疾病(例如癌症)的方法。在一些实施例中，本文披露的方法可以在不到24小时内制造经工程化以表达CAR的免疫效应细胞。不希望受理论束缚，本文提供的方法在制造过程中保留T细胞的未分化表型，例如初始T细胞。这些具有未分化表型的表达CAR的细胞在输注后可在体内持续更长时间和/或更好地扩增。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的干细胞记忆T细胞，例如，如使用scRNA序列测量的(例如，如使用实例10中结合图39A中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的效应T细胞，例如，如使用scRNA序列测量的(例如，如使用实例10中结合图39B中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞更好的保留T细胞的干细胞性，例如，如使用scRNA序列测量的(例如，如使用实例10中结合图39C中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞显示低水平的缺氧，例如，如使用scRNA序列测量的(例如，如使用实例10中结合图39D中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞显示低水平的自噬，例如，如使用scRNA序列测量的(例如，如使用实例10中结合图39E中所述的方法测量的)。
在一些实施例中，本文披露的方法不涉及使用珠，例如
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(例如，CD3/CD28
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)，并且不涉及去珠步骤。在一些实施例中，通过本文披露的方法制造的CART细胞可以以最小的离体扩增施用于受试者，例如，小于1天、小于12小时、小于8小时、小于6小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、或没有离体扩张。因此，本文描述的方法提供了制备改进的表达CAR的细胞产物的快速制造过程，所述细胞产物用于治疗受试者的疾病。
细胞因子过程
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，该方法包括：(1)使细胞群体与细胞因子(选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合)接触；(2)使细胞(例如，T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如，T细胞)群体；和(3)收获细胞(例如，T细胞)群体用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行，或在步骤(1)开始后不晚于5小时(例如，在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时)进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时(例如，在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时，例如，在步骤(1)开始后不晚于24小时)进行；或(b)例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如，不超过10％)。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(2)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
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装置)。然后使用本文所述的细胞因子过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，在细胞因子过程结束时，将CAR T细胞冷冻保存，然后解冻并向受试者施用。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
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装置)。然后使用本文所述的细胞因子过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
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装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)并使用本文所述的细胞因子过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，在细胞(例如，T细胞)接种后，将一种或多种细胞因子(例如选自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如IL-6/sIL-6R)中的一种或多种的细胞因子)以及编码CAR的载体(例如慢病毒载体)添加至细胞中。孵育20-24小时后，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
与传统的CART制造方法不同，在此提供的细胞因子过程不涉及CD3和/或CD28刺激或离体T细胞扩增。与抗CD3和抗CD28抗体接触并且在体外广泛扩增的T细胞倾向于显示向中枢记忆表型的分化。不希望受理论束缚，在此提供的细胞因子过程在CART制造期间保留或增加T细胞的未分化表型，产生可在输注入至受试者后持续更长时间的CART产物。
在一些实施例中，使细胞群体与一种或多种细胞因子接触(例如，一种或多种选自IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)的细胞因子)。
在一些实施例中，使细胞群体与IL-2接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-21和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体进一步与LSD1抑制剂接触。在一些实施例中，使细胞群体进一步与MALT1抑制剂接触。
在一些实施例中，使细胞群体与20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300U/ml的IL-2接触。在一些实施例中，使细胞群体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-15接触。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR的DNA分子转导细胞群体。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触同时使细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂(例如抗CD3抗体)和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如抗CD28抗体)接触，或如果进行接触，接触步骤少于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外与刺激CD3/TCR复合物的药剂(例如抗CD3抗体)和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如抗CD28抗体)接触20、21、22、23、24、25、26、27、或28小时。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制备的细胞相比，使用在此提供的细胞因子过程制造的细胞群显示在表达CAR的细胞中较高百分比的初始细胞(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％)，所述其他类似方法还包括使细胞群与例如，结合CD3/TCR复合物的试剂(例如，抗CD3抗体)和/或结合细胞表面上的共刺激分子的试剂(例如，抗CD28抗体)接触。
在一些实施例中，在此提供的这种细胞因子过程在包含不超过0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、或8％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，在此提供的这种细胞因子过程在包含LSD1抑制剂、MALT1抑制剂或其组合的细胞培养基中进行。
活化过程
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，该方法包括：(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或与刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触；(ii)使细胞(例如T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和(iii)收获细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时(例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、或24小时，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行；(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行；或(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(ii)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0002952123060000852
Figure BDA0002952123060000853
装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0002952123060000851
装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0002952123060000861
装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)并使用本文所述的活化过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，使细胞(例如，T细胞)与抗CD3和抗CD28抗体接触例如12小时，然后用编码CAR的载体(例如，慢病毒载体)转导。培养开始后24小时，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
不希望受理论束缚，简短的CD3和CD28刺激可以促进自我更新T细胞的有效转导。与传统的CART制造方法相比，本文提供的活化过程不涉及延长的离体扩增。与细胞因子过程类似，本文提供的活化过程还在CART制造期间保留未分化的T细胞。
在一些实施例中，使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗-CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，该基质包含聚合物或由其组成，例如，可生物降解或生物相容的惰性材料，例如，其对细胞无毒。在一些实施例中，该基质由亲水性聚合物链组成，由于链的水合作用，其在水溶液中获得最大的移动性。在一些实施例中，该移动基质可以是胶原蛋白、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物。多糖可包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯树胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶或海藻酸盐。其他聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚胺、聚乙烯亚胺、聚季铵盐聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物或聚氨酯。在一些实施例中，移动基质是葡聚糖的聚合物。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR的DNA分子转导细胞群体。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触同时使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0.5小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于20小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于19小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于18小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于17小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于16小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于15小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于13小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于12小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于11小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于10小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于9小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于8小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于7小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于6小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30分钟，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，该活化过程在无血清细胞培养基中进行。在一些实施例中，该活化过程在包含一种或多种选自以下的细胞因子的细胞培养基中进行：IL-2、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)。在一些实施例中，hetIL-15包含NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG(SEQ ID NO:309)的氨基酸序列。在一些实施例中，hetIL-15包含与SEQ ID NO:309具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化过程在包含LSD1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，该活化过程在包含MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，无血清细胞培养基包含血清替代物。在一些实施例中，该血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。在一些实施例中，ICSR的水平可以是，例如，高达5％，例如，约1％、2％、3％、4％或5％。不希望受理论束缚，使用细胞培养基，例如，表21或表25中所示的快速培养基(Rapid Media)，包含ICSR，例如2％ICSR，可以改善本文所述制造过程中的细胞活力。
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，该方法包括：(a)提供从受试者收集的单采样品(例如，新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品)；(b)从单采样品中选择T细胞(例如，使用阴性选择、阳性选择或无珠选择)；(c)将分离的T细胞接种，例如，1x106至1x107个细胞/mL；(d)使T细胞与刺激T细胞的药剂接触，例如，刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如，使T细胞与抗CD3和/或抗CD28抗体接触，例如，使T细胞与TransAct接触)；(e)使T细胞与编码CAR的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触(例如，使T细胞与包含编码CAR的核酸分子的病毒接触)例如6-48小时，例如，20-28小时；以及(f)洗涤和收获T细胞用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制T细胞)或施用。在一些实施例中，步骤(f)在步骤(d)或(e)开始后不迟于30小时进行，例如，在步骤(d)或(e)开始后不迟于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时。
通过本文披露的过程制造的表达CAR的细胞群体
在一些实施例中，本披露的特征在于免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如，通过本文所述的任何制造方法制备，经工程化以表达CAR，其中工程化的免疫效应细胞表现出抗肿瘤特性。在一些实施例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。示例性抗原是本文所述的癌症相关抗原。在一些实施例中，该细胞(例如，T细胞或NK细胞)是用CAR转化的，并且CAR在细胞表面上表达。在一些实施例中，该细胞(例如，T细胞或NK细胞)是用编码CAR的病毒载体转导该细胞的。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施例中，细胞可以稳定地表达CAR。在一些实施例中，该细胞(例如，T细胞或NK细胞)是用编码CAR的核酸(例如mRNA、cDNA或DNA)转染的。在一些此类实施例中，细胞可以瞬时表达CAR。
在一些实施例中，本文提供的细胞群体是由本文所述的任何制造过程(例如，细胞因子过程或本文所述的活化过程)制备的细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)群体，经工程化以表达CAR。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比，与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)增加例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过其他类似方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示较高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)，所述其他类似方法持续例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体持续，例如超过3天(例如，在体外扩增细胞群体持续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比不少于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比，与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)降低例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过其他类似方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示较低百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如，至少低5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)，所述其他类似方法持续例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体持续，例如超过3天(例如，在体外扩增细胞群体持续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比不超过40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％。
在一些实施例中，与通过其他类似方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体在体内施用后体持续更长时间或在更高水平上扩增(例如，至少高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)(例如，使用实例1中结合图4C描述的方法评估)，所述其他类似方法持续例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体持续，例如超过3天(例如，在体外扩增细胞群体持续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)。
在一些实施例中，在制造过程开始前(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始前)，已经富集了用于表达IL6R的细胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ阳性的细胞)的细胞群体。在一些实施例中，在制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)，细胞群体包括，例如，不少于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的表达IL6R的细胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ阳性的细胞)。
药物组合物
此外，本披露提供表达CAR的细胞组合物及其在治疗(在其他疾病中)癌症或任何恶性肿瘤或涉及表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞或组织的自身免疫疾病等的药物或方法中的用途。在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含表达CAR的细胞，例如，通过本文所述的制造过程(例如，细胞因子过程，或本文所述的活化过程)制备的多个表达CAR的细胞，与一个或多种药学上或生理学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂组合。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供了免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，这些免疫效应细胞被工程化为含有一种或多种CAR，该一种或多种嵌合蛋白将免疫效应细胞引导至癌症。这通过CAR上的抗原结合结构域实现，该抗原结合结构域对癌症相关抗原具有特异性。存在两类可以通过本文所述的CAR靶向的癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞表面上表达的癌症相关抗原；和(2)本身在细胞内的癌症相关抗原，然而，这种抗原的片段(肽)通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。
因此，例如，通过本文所述的方法获得的免疫效应细胞可以被工程化以含有靶向以下癌症相关抗原之一(肿瘤抗原)的CAR：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、Legumain、HPV E6、E7、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶以及mut hsp70-2。
可以作为本文所述的CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列在表1中列出，其中aa代表氨基酸，na代表编码相应肽的核酸。
表1.CAR的各种组分的序列
Figure BDA0002952123060000971
Figure BDA0002952123060000981
Figure BDA0002952123060000991
Figure BDA0002952123060001001
Figure BDA0002952123060001011
双特异性CAR
在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些实施例中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一些实施例中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施例中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案和双特异性抗体分子的各种构型描述于例如2015年3月13日提交的WO 2015/142675的第455-458段中，其通过引用以其整体并入。
在一些实施例中，双特异性抗体分子的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列(例如scFv，该scFv对CD19具有结合特异性，例如包含如本文所述的scFv，或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR)和第二免疫球蛋白可变结构域序列(该第二免疫球蛋白可变结构域序列对不同抗原上的第二表位具有结合特异性)。
嵌合TCR
在一些实施例中，本发明的抗体和抗体片段(例如，CD19抗体及片段)可以接枝到T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生嵌合TCR。不受理论的束缚，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文所披露的scFv可以接枝到TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如，细胞外恒定结构域的至少一部分)、跨膜结构域和胞质结构域。作为另一个实例，抗体片段(例如，本文所述的VL结构域)可以接枝到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段(例如，本文所述的VH结构域)可以接枝到TCRβ链的恒定结构域(或者，VL结构域可以接枝到TCRβ链的恒定结构域，VH结构域可以接枝到TCRα链)。作为另一个实例，可以将抗体或抗体片段的CDR移植到TCRα和/或β链中以产生嵌合TCR。例如，本文披露的LCDR可以接枝到TCRα链的可变结构域中，并且本文披露的HCDR可以接枝到TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。这种嵌合TCR可以通过例如本领域已知的方法来产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy[基因疗法]2000；7:1369-1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2004；11:487-496；Aggen等人,GeneTher.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。
非抗体支架
在实施例中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如，纤连蛋白、锚蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小模块免疫药物、大抗体(maxybody)、蛋白A或affilin。非抗体支架具有与细胞上的靶抗原结合的能力。在实施例中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要所得多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结合区即可。
非抗体支架包括：纤连蛋白(诺华公司(Novartis)，马萨诸塞州)、锚蛋白(分子配偶体公司(Molecular Partners AG，苏黎世，瑞士)、结构域抗体(Domantis公司(Domantis,Ltd.)，坎布里奇，马萨诸塞州，和Ablynx nv，津维纳拉德，比利时)、脂质运载蛋白(PierisProteolab AG，弗赖辛，德国)、小型模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，西雅图，华盛顿州)、maxybody(Avidia,Inc.，山景城，加利福尼亚州)、蛋白质A(亲合体公司(Affibody AG)，瑞典)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，哈雷，德国)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的相反配体的分子的细胞外结构域、或其相反配体结合片段。
免疫效应细胞可包含重组DNA构建体，其包含编码CAR的序列，其中CAR包含与肿瘤抗原(例如，本文描述的肿瘤抗原)特异性结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)，和细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。如其他地方所述，本文所述的方法可包括用编码CAR的核酸(例如本文所述的CAR)转导来自例如T调节性细胞耗减的细胞群体的细胞。
在一些实施例中，CAR包含scFv结构域，其中scFv前面可以是任选的前导序列(如SEQ ID NO:1中提供的)、并且后面是任选的铰链序列(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38中提供的)、跨膜区(如SEQ ID NO:6中提供的)、包含SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:16的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ序列，例如，其中这些结构域是连续的并在相同的阅读框中以形成单一融合蛋白。
在一些实施例中，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一些实施例中，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域)。
示例性前导序列提供为SEQ ID NO:1。示例性铰链/间隔子序列提供为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38。示例性跨膜结构域序列被提供为SEQ ID NO:6。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO:7所提供。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列被提供为SEQ ID NO:16。示例性CD3ζ结构域序列提供为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
在一些实施例中，免疫效应细胞包括重组核酸构建体，该重组核酸构建体包含编码CAR的核酸分子，其中核酸分子包含编码抗原结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列是连续的并在相同的阅读框中。可用于CAR中的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ、CD28、CD27、4-1BB等的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
编码所希望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达核酸分子的细胞中筛选文库，通过从已知包含该核酸分子的载体中获得核酸分子，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。可替代地，感兴趣的核酸可以合成产生，而不是克隆。
可以使用例如逆转录病毒或慢病毒载体构建体将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞。
也可以使用例如可以直接转染到细胞中的RNA构建体将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞。用于产生用于转染的mRNA的方法涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚(A)以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如，本文描述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文描述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文描述的IRES)、待表达的核酸和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(例如，实例中描述的，例如，SEQ ID NO:35)。这样产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一些实施例中，模板包含针对CAR的序列。在一些实施例中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到细胞中，例如，T细胞中。
抗原结合结构域
在一些实施例中，多个免疫效应细胞，例如T调节性细胞耗减的细胞群体，包括编码CAR的核酸，所述CAR包含靶特异性结合元件，否则称为抗原结合结构域。结合元件的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，可以作为本文所述的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一些实施例中，包含抗原结合结构域的CAR的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的可替代支架(如重组纤连蛋白结构域等)、T细胞受体(TCR)或其片段(例如，单链TCR)等。在一些情况下，抗原结合结构域衍生自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。
CD19 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD19 CAR的细胞(例如，表达与人CD19结合的CAR的细胞)。
在一些实施例中，所述CD19 CAR的抗原结合结构域具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一些实施例中，所述CD19 CAR的抗原结合结构域包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。
在一些实施例中，所述CD19 CAR包括根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。WO 2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。
在一些实施例中，亲本鼠scFv序列是在PCT公开WO 2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体。在一些实施例中，所述抗CD19结合结构域是WO 2012/079000中所述的scFv。
在一些实施例中，所述CAR分子包含在PCT公开WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，其提供特异性结合至人CD19的鼠来源的scFv片段。
在一些实施例中，CD19 CAR包含在PCT公开WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。
在一些实施例中，氨基酸序列是：
Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:292)，或与其基本同源的序列。
在一些实施例中，所述CD19 CAR具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。在实施例中，CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，该CTL019通过用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自身失活、复制缺陷型慢病毒(LV)载体的转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在其他实施例中，所述CD19 CAR包括根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19 CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将该文献通过引用以其整体并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，包含以下的氨基酸序列：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:293)
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，包含以下的氨基酸序列：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:294)
可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am SocGen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日，盐湖城)2013,文摘10。
示例性CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR、或描述于以下中的抗CD19 CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013):4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，CD19 CAR序列，例如披露于表2中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。
表2.示例性抗CD19分子的氨基酸序列
Figure BDA0002952123060001101
Figure BDA0002952123060001111
Figure BDA0002952123060001121
Figure BDA0002952123060001131
BCMA CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达BCMA CAR的细胞(例如，表达与人BCMA结合的CAR的细胞)。示例性BCMA CAR可包括WO 2016/014565的表1或16中披露的序列，其通过引用并入本文。BCMA CAR构建体可包括任选的前导序列；任选的铰链结构域，例如CD8铰链结构域；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域；细胞内结构域，例如，4-1BB细胞内结构域；和功能性信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在某些实施例中，这些结构域邻接并在同一阅读框中以形成单个融合蛋白。在其他实施例中，结构域在分开的多肽中，例如，在如本文描述的RCAR分子中。
在一些实施例中，该BCMA CAR分子披露于WO2016/014565中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列、或基本上(例如，95％-99％)与其相同的序列。
可以用于抗BCMA CAR构建体的另外的示例性BCMA靶向序列披露于WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，将其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将该公开的内容通过引用以其整体特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。
在一些实施例中，BCMA CAR序列，例如披露于表3-15中的CDR、VH、VL、scFv、或全长-CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域包含人抗体或人抗体片段。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表3-10和12-15中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或本文(例如，表3-10和12-15中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表3、表7和表12中)所述的人VL和/或本文(例如，表3、表7和表12中)所述的人VH。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是scFv，该scFv包含表3、表7和表12的氨基酸序列的VL和VH。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含：包含具有提供于表3、7、和12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如，保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如，保守取代)的氨基酸序列、或与表3、7和12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列的VL，和/或包含提供于表3、7、和12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如，保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如，保守取代)的氨基酸序列、或与表3、7和12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列的VH。
表3：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0002952123060001151
Figure BDA0002952123060001161
Figure BDA0002952123060001171
Figure BDA0002952123060001181
Figure BDA0002952123060001191
Figure BDA0002952123060001201
Figure BDA0002952123060001211
Figure BDA0002952123060001221
Figure BDA0002952123060001231
表4：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
Figure BDA0002952123060001232
Figure BDA0002952123060001241
表5：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
Figure BDA0002952123060001242
表6：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
Figure BDA0002952123060001251
表7：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0002952123060001252
Figure BDA0002952123060001261
Figure BDA0002952123060001271
Figure BDA0002952123060001281
Figure BDA0002952123060001291
Figure BDA0002952123060001301
Figure BDA0002952123060001311
Figure BDA0002952123060001321
Figure BDA0002952123060001331
Figure BDA0002952123060001341
表8：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
Figure BDA0002952123060001342
表9：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
Figure BDA0002952123060001343
表10：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
Figure BDA0002952123060001351
表11：基于PI61的示例性抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0002952123060001352
Figure BDA0002952123060001361
Figure BDA0002952123060001371
Figure BDA0002952123060001381
表12：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0002952123060001382
Figure BDA0002952123060001391
Figure BDA0002952123060001401
Figure BDA0002952123060001411
Figure BDA0002952123060001421
Figure BDA0002952123060001431
表13：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
Figure BDA0002952123060001432
Figure BDA0002952123060001441
表14：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
Figure BDA0002952123060001442
表15：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
Figure BDA0002952123060001443
Figure BDA0002952123060001451
在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：
(1)选自以下中的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1、SEQ ID NO:55的LC CDR2和SEQ ID NO:56的LCCDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:84的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:46的HC CDR3；(iii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:68的HC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:76的HC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:131的LC CDR2和SEQ ID NO:132的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:96的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；(iii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:115的LC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:130的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:87的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:109的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:182的LC CDR2和SEQ ID NO:183的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:148的LC CDR2和SEQ ID NO:149的LCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:170的LC CDR2和SEQ ID NO:171的LCCDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:179的HC CDR1、SEQ ID NO:180的HC CDR2和SEQ ID NO:181的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:137的HC CDR1、SEQ ID NO:138的HC CDR2和SEQ ID NO:139的HCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:160的HC CDR1、SEQ ID NO:161的HC CDR2和SEQ ID NO:162的HCCDR3。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、84、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、84、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、46、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:47、48、68、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、76、57、58和59的氨基酸序列。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、85、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、51、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:49、50、69、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、77、60、58和56的氨基酸序列。
在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含scFv，该scFv包含VH(例如，本文所述的VH)和VL(例如，本文所述的VL)。在一些实施例中，VH通过接头(例如，本文所述的接头，例如表1中所述的接头)附接至VL。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n为1、2、3、4、5或6，优选地3或4(SEQ ID NO:26)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下取向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一些实施例中，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合BCMA蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
CD20 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD20 CAR的细胞(例如，表达与人CD20结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，表达CD20 CAR的细胞包括根据WO2016164731和WO 2018067992(将其内容通过引用并入本文)所述的抗原结合结构域。示例性CD20结合序列或CD20 CAR序列披露于例如WO 2018067992的表1-5中。在一些实施例中，CD20 CAR包含WO 2018067992或WO 2016164731中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
CD22 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD22 CAR的细胞(例如，表达与人CD22结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，表达CD22 CAR的细胞包括根据WO2016164731和WO 2018067992(将其内容通过引用并入本文)所述的抗原结合结构域。示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于例如WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A、和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些实施例中，CD22 CAR序列包含WO2018067992或WO 2016164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
在实施例中，CAR分子包含结合CD22的抗原结合结构域(CD22CAR)。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向人CD22。在一些实施例中，抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。
人CD22 CAR的序列在如下提供。在一些实施例中，人CD22 CAR是CAR22-65。
人CD22 CAR scFv序列
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO:285)
人CD22 CAR重链可变区
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 286)
人CD22 CAR轻链可变区
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO 287)
表16 CD22 CAR的重链可变区CDR(CAR22-65)
Figure BDA0002952123060001501
表17 CD22 CAR的轻链可变区CDR(CAR22-65)。该表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。
Figure BDA0002952123060001502
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表16中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表17中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表17中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表16中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据卡巴特编号方案、乔西亚编号方案、或其组合定义CDR。
VL和VH结构域在scFv中出现的顺序可以是变化的(即，VL-VH或VH-VL取向)，并且其中“G4S”亚基(SEQ ID NO:25)(其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:25)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:28)或(G4S)4)(SEQ ID NO:27))的一个、两个、三个或四个中任一种的拷贝可连接可变结构域以创建整个scFv结构域。替代性地，CAR构建体可以包含例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:43)的接头。替代性地，CAR构建体可以包含例如包含序列LAEAAAK(SEQ ID NO:308)的接头。在一些实施例中，CAR构建体不包括VL和VH结构域之间的接头。
这些克隆均含有源自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
EGFR CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达EGFR CAR的细胞(例如，表达与人EGFR结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达EGFRvIIICAR的细胞(例如，表达与人EGFRvIII结合的CAR的细胞)。示例性EGFRvIII CAR可包括WO2014/130657中披露的序列，例如WO 2014/130657的表2，其通过引用并入本文。
示例性EGFRvIII结合序列或EGFR CAR序列可包含WO2014/130657中披露的EGFRCAR的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列。
间皮素CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达间皮素CAR的细胞(例如，表达与人间皮素结合的CAR的细胞)。示例性间皮素CAR可包括WO 2015090230和WO 2017112741中披露的序列，例如WO 2017112741的表2、3、4和5，其通过引用并入本文。
其他示例性CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130635中指定。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/028896的表2、表6、和表9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/028896中指定。
在一些实施例中，CAR分子包含本文描述的CLL1 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0051651A1中的CLL1 CAR。在实施例中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中所示的核苷酸序列。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CLL-1，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014535的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VLCDR)在WO 2016/014535中指定。
在一些实施例中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中的CD33 CAR。在实施例中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中所示的核苷酸序列。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD33，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014576的表2或表9的CAR分子(例如CAR33-1至CAR-33-9中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014576中指定。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275A1、或WO 2015/090230中的抗体)，和/或一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)。在一些实施例中，该抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，抗原结合结构域是描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗原结合结构域。
在实施例中，抗原结合结构域靶向BCMA并且描述于US-2016-0046724-A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CD19并且描述于US-2015-0283178-A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CD123并且描述于US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CLL1并且描述于US 2016/0051651 A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CD33并且描述于US 2016/0096892 A1中。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4等，如例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO2016/014535、和WO 2016/025880中所述，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合GFR ALPHA-4，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/025880的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码GFRALPHA-4CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/025880中指定。
在一些实施例中，本文所述的任何CAR分子(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，该抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，肿瘤抗原是2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675中描述的肿瘤抗原，该国际申请通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，所述肿瘤抗原选自以下中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3
(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother ofthe Regulator of Imprinted Sites))，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；Legumain；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施例中，该抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，抗肿瘤抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，如本文所述的抗癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一些实施例中，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合如本文描述的癌症相关抗原蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施例中，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369-1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487-496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其整体并入本文)。例如，scTCR可以被工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的与癌症相关的靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以设计为包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜衍生的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如该细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白衍生的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如该细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一些实施例中，跨膜结构域是与所用的CAR的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些实施例中，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞(例如，CART细胞)表面上的另一种CAR同源二聚化。在一些实施例中，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或置换，以使与相同的表达CAR的细胞(例如，CART)中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些实施例中，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下一个或多个跨膜区：例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可以至少包括共刺激分子的一个或多个跨膜区，该共刺激分子为例如MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一些实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一些实施例中，该铰链或间隔子包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列(例如由其组成)。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:3的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码的铰链。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ IDNO:15的核苷酸序列编码的铰链。
在一些实施例中，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:16的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
胞质结构域
本发明的CAR的胞质结构域或区包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责活化已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。
用于在本发明的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能性能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞活化是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一些实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。
在一些实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在本发明中特别有用的含有初级细胞内信号传导结构域的分子的另外实例包括DAP10、DAP12、和CD32的那些。
CAR的细胞内信号传导结构域可以单独包含初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导结构域)，或者它可以与在本发明的CAR的上下文中有用的任何其他所希望的一种或多种细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域(例如，CD3ζ链部分)和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。此类分子的实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体等等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。本发明的CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些实施例中，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:7的信号传导结构域。在一些实施例中，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:9(突变型CD3ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3ζ)的信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一些实施例中，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:19的核酸序列编码。
在一些实施例中，细胞内被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，CD28的信号传导结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施例中，CD28的信号传导结构域由SEQ ID NO:37的核酸序列编码。
在一些实施例中，细胞内被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在一些实施例中，ICOS的信号传导结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施例中，ICOS的信号传导结构域由SEQ ID NO:39的核酸序列编码。
CAR与其他分子或药剂的共表达
第二CAR的共表达
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包含不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标(例如，CD19)或不同的靶标(例如，除CD19以外的靶标，例如，本文所述的靶标))的第二CAR。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以限制CAR对表达两个靶标的细胞的活性。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR(其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，并包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR(其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，并包括针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域)。
在一些实施例中，表达CAR的细胞包含本文所述的XCAR和抑制性CAR。在一些实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如也表达X的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)的细胞内结构域。
在一些实施例中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不相互作用。例如，表达第一CAR和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域(例如，作为片段，例如scFv)，该抗原结合结构域不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、衍生自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域、和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术的、或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施例中，SDAB分子可以衍生自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如像衍生自在鲨鱼血清中发现的称为新颖抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。WO03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中描述了产生衍生自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法。
在一些实施例中，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露了此类单结构域分子。出于清楚的原因，衍生自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH在本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现，具有多个嵌合膜嵌入受体(这些嵌合膜嵌入受体包含抗原结合结构域，受体的抗原结合结构域之间具有相互作用)的细胞可能是不希望的，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有第一非天然存在的嵌合膜嵌入受体和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，该嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还披露了编码包含最小化这种相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的核酸，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一些实施例中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。
在一些实施例中，本文的组合物包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不因第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，存在第二CAR情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是不存在CAR情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况。在一些实施例中，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的药剂的共表达
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或适合性的药剂。
例如，在一些实施例中，该药剂可以是抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的药剂。在一些实施例中，调制或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。
在实施例中，例如如本文所述的药剂(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)；或例如，抑制性蛋白质或系统(例如聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN))可以用于在表达CAR的细胞中抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的表达。在一些实施例中，该药剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一些实施例中，调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如，将抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一些实施例中，该药剂包含例如抑制性分子(如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ、或这些中的任一个的片段(例如这些中的任一个的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和为本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域(例如41BB、CD27、或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一些实施例中，该药剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少一部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体的CD28家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。已经显示PD1的两种配体PD-L1和PD-L2在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人2003J Mol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一些实施例中，该药剂包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的细胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也称为PD1 CAR)。在一些实施例中，PD1 CAR与本文所述的XCAR组合使用时，改善了T细胞的持久性。在一些实施例中，CAR是PD1 CAR，其包含PD1的细胞外结构域，如SEQ ID NO:24中加下划线所指示的。在一些实施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在一些实施例中，该药剂包含编码PD1 CAR(例如，本文所述的PD1 CAR)的核酸序列。在一些实施例中，PD1 CAR的核酸序列如SEQ ID NO:23所提供，PD1 ECD以下划线标出。
在另一个实例中，在一些实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体，例如，如本文所述。共刺激分子配体的实例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL、和LIGHT。在实施例中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施例中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一些实施例中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一些实施例中，共刺激配体是CD80或CD86。在一些实施例中，共刺激分子配体是CD70。在实施例中，可以进一步工程化本文所述的表达CAR的免疫效应细胞以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共表达
在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)进一步包含趋化因子受体分子。T细胞中趋化因子受体CCR2b或CXCR2的转基因表达增强了向分泌CCL2或CXCL1的实体瘤(包括黑色素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,J Immunother.[免疫疗法杂志]2010年10月；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.[人基因疗法]2002年11月1日；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论的约束，据信在识别由肿瘤(例如实体瘤)分泌的趋化因子的表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体可以改善表达CAR的细胞向肿瘤的归巢，促进表达CAR的细胞向肿瘤的浸润，并增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在或重组趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的表达CAR的细胞(例如CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)、或其趋化因子结合片段。在一些实施例中，基于由肿瘤分泌的一种或多种趋化因子选择有待用本文所述CAR表达的趋化因子受体分子。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞进一步包含(例如表达)CCR2b受体或CXCR2受体。在一些实施例中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在同一载体或在两个不同载体上。在其中本文所述CAR和趋化因子受体分子在同一载体上的实施例中，CAR和趋化因子受体分子各自处于两个不同启动子的控制下或处于同一启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供免疫效应细胞，例如，通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞，其包括编码本文所述的一种或多种CAR构建体的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子提供为信使RNA转录物。在一些实施例中，核酸分子提供为DNA构建体。
本文描述的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其组合。在一些实施例中，核酸分子是编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其他实施例中，核酸分子是包括任何前述核酸分子的载体。
在一些实施例中，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，该核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施例中，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，该核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。各种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
因此，在一些实施例中，例如通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含结合本文所述肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的细胞内信号传导结构域)(包含刺激结构域，例如共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域，例如本文所述的ζ链))。
本发明还提供了载体，其中插入了编码CAR的核酸分子，例如本文所述的核酸分子。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)、和感兴趣的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713)。
在一些实施例中，包含编码所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在一些实施例中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子如睡美人系统、crisper、CAS9和锌指核酸酶完成。见下文June等人2009Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，该文献通过援引并入本文。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY[纽约冷泉港出版社]中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以活化转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR编码核酸分子的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已经显示出可有效地从克隆到慢病毒载体中的核酸分子驱动CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。在一些实施例中，EF1a启动子包含实例中提供的序列。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB(Epstein-Barr)病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。
以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:190)示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:198)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:191)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:192)
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:193)
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择标志物基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在一些实施例中，选择标志物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择标志物和报告基因二者都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调节序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在实施例中，载体可包含两种或多种编码CAR的核酸序列，例如本文所述的CAR，例如CD19 CAR，和第二CAR，例如，抑制性CAR或特异性结合CD19以外的抗原的CAR。在此类实施例中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在一些实施例中，两种或更多种CAR可以例如通过一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括T2A、P2A、E2A或F2A位点。
将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过例如本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约)。将多核苷酸引入到宿主细胞中的适合的方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在一些实施例中，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(K&K Laboratories)(普莱恩维尤(Plainview)，纽约)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从阿凡提极地脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源性核酸引入对宿主细胞中的方法还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组核酸序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一些实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下自然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公布号WO 2014/145252中，该专利的内容特此通过援引并入。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中。简而言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当该细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当该细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，该表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。
调节嵌合抗原受体的策略
在一些实施例中，希望CAR活性可控制的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。可以通过多种方式调节CAR活性。例如，使用例如与二聚化结构域融合的半胱天冬酶的诱导型细胞凋亡(参见,例如，Di Stasa等人,N Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011年11月3日；365(18):1673-1683)可用作本发明的CAR疗法中的安全开关。在一些实施例中，表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)进一步包含诱导型细胞凋亡开关，其中将人半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)或修饰形式与允许条件二聚化的修饰的人FKB蛋白融合。在小分子，如雷帕霉素类似物(例如，AP 1903、AP20187))存在下，诱导型半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)被活化并导致表达本发明CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于半胱天冬酶的诱导型细胞凋亡开关(或这种开关的一个或多个方面)的实例已描述于，例如，US 2004040047；US 20110286980；US 20140255360；WO 1997031899；WO2014151960；WO 2014164348；WO 2014197638；WO 2014197638；所有这些文献通过引用并入本文。
在另一个实例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚物药物(例如利米度塞(rimiducid)(也称为AP1903(BellicumPharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致活化细胞的半胱天冬酶-9和细胞凋亡。诱导型半胱天冬酶-9分子含有二聚化化学诱导物(CID)结合结构域，其在CID的存在下介导二聚化。这导致表达CAR的细胞的诱导性和选择性耗减。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与一种或多种CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。诱导型半胱天冬酶-9可以提供安全性开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如，Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]2008；15(10):667-75；临床试验标识号NCT02107963；和Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的可替代策略包括利用使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体，例如通过使表达CAR的细胞耗减，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。此类受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺乏信号传导能力但保留被能够诱导ADCC的分子识别的表位，例如西妥昔单抗
Figure BDA0002952123060001821
，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后消耗表达CAR的细胞(参见例如，WO2011/056894，和Jonnalagadda等人,Gene Ther.[基因疗法]2013；20(8):853-860)。另一种策略包括表达高度紧密的标志物/自杀基因，其将来自本文所述的表达CAR的细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位组合，其结合利妥昔单抗(rituximab)，这导致表达CAR的细胞的选择性消耗，例如通过ADCC(参见例如，Philip等人,Blood.[血液]2014；124(8):1277-1287)。用于耗减本文所述的表达CAR的细胞的其他方法包括施用CAMPATH，它是一种单克隆抗CD52抗体，其选择性地结合并靶向成熟淋巴细胞，例如表达CAR的细胞，以便例如通过诱导ADCC进行破坏。在其他实施例中，可以使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性地靶向表达CAR的细胞。在一些实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性(例如ADCC或ADC活性)，从而减少表达CAR的细胞的数量。在其他实施例中，CAR配体，例如抗独特型抗体，可以与诱导细胞杀伤的药剂(例如毒素)偶联，从而减少表达CAR的细胞的数量。替代性地，CAR分子本身可以被配置成使得活性可以被调节，例如打开和关闭，如下所述。
在其他实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由T细胞耗减剂识别的靶蛋白。在一些实施例中，靶蛋白是CD20，并且T细胞耗减剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在一些实施例中，一旦需要减少或消除表达CAR的细胞，就施用T细胞耗减剂，例如以减轻CAR诱导的毒性。在其他实施例中，T细胞耗减剂是抗CD52抗体，例如阿仑单抗，如本文实例中所述。
在其他实施例中，RCAR包含一组多肽，典型地在最简单的实施例中有两个，其中本文所述的标准CAR的组分(例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域)在单独的多肽或成员上分配。在一些实施例中，该组多肽包含二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本发明的CAR利用二聚化开关，如例如WO 2014127261中所述的那些，该文献通过引用并入本文。本文和例如2015年3月13日提交的国际公开号WO 2015/090229的段落527-551中提供了此类可调节性CAR的另外的描述和示例性构型，将该文献通过引用以其整体特此并入。在一些实施例中，RCAR涉及开关结构域，例如FKBP开关结构域(如SEQ ID NO:275所示)，或包含具有与FRB结合的能力的FKBP片段(例如，如SEQ ID NO:276所示)。在一些实施例中，RCAR涉及包含FRB序列(例如，如SEQ ID NO:277所示)，或突变FRB序列(例如，如SEQ ID NO:278-283中任一项所示)的开关结构域。
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(SEQ ID NO:275)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(SEQ ID NO:276)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(SEQ ID NO:277)
表18：示例性突变体FRB对二聚化分子具有增加的亲和力。
Figure BDA0002952123060001831
Figure BDA0002952123060001841
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。RNA CAR及其使用方法描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第553-570段中，该文献通过引用以其全文并入。
免疫效应细胞可包括由信使RNA(mRNA)编码的CAR。在一些实施例中，将编码本文所述CAR的mRNA导入免疫效应细胞(例如，通过本文所述的方法制备的)用于产生表达CAR的细胞。
在一些实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有对本文所述的肿瘤相关抗原的抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域，例如CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包括细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一些实施例中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一些实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一些实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在一些实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(可读框)，包括5'和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一些实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。实施例中的RNA具有5'和3'UTR。在一些实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。
在一些实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，该RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，该RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的可读框上游。在一些实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一些实施例中，mRNA具有5'端帽和3'聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，该多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003)。
将聚(A)/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚(A)/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有聚(A)/T 3'伸展段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的聚(A)/T区段可以在PCR过程中通过使用含有聚T尾(如100T尾)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:32))的反向引物产生，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一些实施例中，聚(A)尾在100和5000个腺苷之间(例如SEQ ID NO:33)。
在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一些实施例中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:34)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到聚(A)尾中。ATP类似物还可以增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一些实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文所述的技术获得5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生物化学科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯],330:958-966(2005))。
通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，该序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞通透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些实施例中，可以使用非病毒方法将编码本文所述的CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBacTM(PB)转座子系统。参见例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961-2971；Huang等人Mol.Ther.[分子疗法]16(2008):580-589；Grabundzija等人Mol.Ther.[分子疗法]18(2010):1200-1209；Kebriaei等人Blood.[血液学]122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy[分子疗法],16.9(2008):1515-16；Bell等人Nat.Protoc.[自然实验手册]2.12(2007):3153-65；和Ding等人Cell.[细胞]122.3(2005):473-83，所有这些文献均通过援引并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从运载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶标DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与运载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将它插入到宿主细胞的基因组中。参见例如，Aronovich等人，同上。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见例如，Grabundzija等人Nucleic AcidsRes.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，所有这些文献均通过援引并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献均通过援引并入本文。
SBTS的使用允许转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，该细胞例如使用转座子系统(如，SBTS)稳定地表达本文所述的CAR。
根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如质粒)递送至细胞(例如，T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共同递送至宿主细胞中。
在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述的CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
制造/生产方法
在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括在用细胞处理后施用T细胞耗减剂(例如，如本文所述的免疫效应细胞)，从而减少(例如，消耗)表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)。此类T细胞耗减剂可用于有效消耗表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)以减轻毒性。在一些实施例中，表达CAR的细胞根据本文的方法制造，例如，根据本文的方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施例中，在施用细胞后一周、两周、三周、四周或五周施用T细胞耗减剂，例如本文所述的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，T细胞耗减剂是消耗表达CAR的细胞的药剂，例如，通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原(例如靶抗原)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如受体)。此类靶蛋白的实例包括但不限于EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
在一些实施例中，CAR表达细胞共表达CAR和靶蛋白，例如，天然表达靶蛋白或被工程化以表达靶蛋白。例如，该细胞，例如免疫效应细胞群体，可包括含有CAR核酸(例如，如本文所述的CAR核酸)的核酸(例如，载体)和编码靶蛋白的核酸。
在一些实施例中，T细胞耗减剂是CD52抑制剂，例如抗CD52抗体分子，例如阿仑妥珠单抗。
在其他实施例中，该细胞，例如免疫效应细胞群体，表达如本文所述的CAR分子(例如，CD19CAR)和由T细胞耗减剂识别的靶蛋白。在一些实施例中，靶蛋白是CD20。在实施例中，其中靶蛋白是CD20，T细胞耗减剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。
在任何上述方法的进一步的实施例中，该方法进一步包括将细胞，例如造血干细胞或骨髓移植到哺乳动物中。
在一些实施例中，本发明的特征在于一种在细胞移植前调节哺乳动物的方法。该方法包括给哺乳动物施用有效量的包含CAR核酸或多肽的细胞，例如CD19 CAR核酸或多肽。在一些实施例中，细胞移植是干细胞移植，例如，造血干细胞移植，或骨髓移植。在其他实施例中，在细胞移植前调节受试者，包括减少受试者中表达靶细胞的数量，例如表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞。
淘洗
在一些实施例中，本文描述的方法的特征在于淘洗方法，其去除不需要的细胞，例如单核细胞和胚细胞，从而导致适合CAR表达的所需免疫效应细胞的富集改进。在一些实施例中，本文所述的淘洗方法针对从先前冷冻的样品(例如，解冻的样品)富集适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞进行了优化。在一些实施例中，与从本领域已知的淘洗方案收集的细胞制剂相比，本文所述的淘洗方法提供了具有改进的纯度的细胞制剂。在一些实施例中，本文所述的淘洗方法包括使用起始样品(例如，细胞样品，例如，解冻的细胞样品)优化的粘度，通过用某些等渗溶液(例如，PBS)稀释，并使用流速的优化组合并通过淘洗装置收集的每个级分的收集体积。可应用于本发明的示例性淘洗方法描述于WO2017/117112的第48-51页，其通过引用整体并入本文。
密度梯度离心
过继性细胞治疗产品的制造需要使所希望的细胞(例如，免疫效应细胞)远离外周血单采起始材料中存在的血细胞和血液成分的复杂混合物。通过Ficoll溶液使用密度梯度离心成功分离了外周血衍生的淋巴细胞样品。然而，Ficoll不是用于分离治疗用细胞的优选试剂，因为Ficoll不适合临床使用。此外，Ficoll含有乙二醇，它对细胞有潜在毒性。此外，冷冻保存后解冻的单采产物的Ficoll密度梯度离心产生次优的T细胞产物，例如，如本文实例中所述。例如，在通过Ficoll溶液的密度梯度离心分离的细胞制剂中观察到最终产物中T细胞的损失，伴随非T细胞的相对增加，特别是不希望的B细胞、胚细胞和单核细胞。
不希望受理论束缚，据信免疫效应细胞(例如T细胞)在冷冻保存期间脱水，变得比新鲜细胞更稠密。不希望受理论束缚，还据信免疫效应细胞(例如T细胞)比其他血细胞保持密集更久，因此与其他细胞相比，在Ficoll密度梯度分离期间更容易丢失。因此，不希望受理论束缚，与Ficoll或具有与Ficoll相同密度(例如，1.077g/mL)的其他培养基相比，认为密度大于Ficoll的培养基提供了所希望的免疫效应细胞的改进的分离。
在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培养基。在一些实施例中，密度梯度培养基包含约60％的碘克沙醇于水中的溶液。
在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用具有密度大于Ficoll的密度梯度培养基。在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用密度梯度培养基，其具有大于1.077g/mL，例如，大于1.077g/mL、大于1.1g/mL、大于1.15g/mL、大于1.2g/mL、大于1.25g/mL、大于1.3g/mL、大于1.31g/mL的密度。在一些实施例中，该密度梯度培养基具有约1.32g/mL的密度。
密度梯度离心的另外的实施例描述于WO 2017/117112的第51-53页，其通过引用整体并入本文。
通过选择富集
本文提供了选择特定细胞以改进适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞富集的方法。在一些实施例中，选择包括阳性选择，例如，选择所需的免疫效应细胞。在一些实施例中，该选择包括阴性选择，例如，选择不需要的细胞，例如，去除不需要的细胞。在实施例中，本文所述的阳性或阴性选择方法在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，例如本文所述的流通装置。示例性的阳性和阴性选择描述于WO 2017/117112的第53-57页，其通过引用整体并入本文。选择方法可以在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，也称为细胞加工系统，以进一步富集所希望的免疫效应细胞(例如，适合用于CAR表达的T细胞)的细胞制剂。示例性的流通装置描述于WO 2017/117112的第57-70页，其通过引用整体并入本文。示例性细胞分离和去珠方法描述于WO 2017/117112的第70-78页，其通过引用整体并入本文。
选择程序不限于WO 2017/117112的第57-70页所述的程序。可以使用经由CD19、CD14和CD26 Miltenyi珠与柱技术(
Figure BDA0002952123060001941
Plus或
Figure BDA0002952123060001942
)组合去除不需要的细胞进行阴性T细胞选择，或可以使用CD4和CD8 Miltenyi珠与柱技术的组合进行阳性T细胞选择(
Figure BDA0002952123060001943
或
Figure BDA0002952123060001944
)。可替代地，可以使用具有可释放CD3珠的无柱技术(GE医疗集团(GE Healthcare))。
此外，还可以使用诸如ThermoGenesis X系列装置的无珠技术。
临床应用
本文的所有过程均可根据临床优质生产规范(cGMP)标准进行。
该过程可用于细胞纯化、富集、收获、洗涤、浓缩或用于细胞培养基交换，特别是在制造过程开始时以及制造过程中收集原始起始原料(具体是细胞)用于选择或扩增用于细胞疗法的细胞。
该细胞可包括任意多个细胞。该细胞可以是相同的细胞类型，或混合的细胞类型。此外，该细胞可以来自一个供体，例如用于细胞疗法的自体供体或单个异体供体。可以通过例如白细胞单采或单采从患者获得细胞。细胞可以包括T细胞，例如可以包括具有大于50％T细胞、大于60％T细胞、大于70％T细胞、大于80％T细胞、或90％T细胞的群体。
选择过程在培养和扩增前选择细胞时特别有用。例如，用抗CD3和/或抗CD28涂覆的顺磁性颗粒可用于选择T细胞用于扩增或用于引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其他蛋白质的核酸。此类过程用于产生CTL019 T细胞用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)。
本文披露的去珠过程和模块可特别用于制造用于细胞疗法的细胞，例如在培养和扩增之前或之后纯化细胞。例如，涂覆有抗CD3和/或抗CD28抗体的顺磁性颗粒可用于选择性扩增T细胞，例如通过引入编码嵌合抗原受体的核酸(CAR)或其他蛋白质被修饰的或将要被修饰的T细胞，使得CAR由T细胞表达。在制造此类T细胞期间，可以使用去珠过程或模块将T细胞与顺磁性颗粒分离。这种去珠过程或模块用于产生例如用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的CTL019 T细胞。
在这里举例说明的一个此类过程中，经由单采(例如，白细胞单采)从供体(例如，用自体嵌合抗原受体T细胞产物治疗的患者)收集细胞(例如T细胞)。然后可以任选地纯化收集的细胞，例如，通过淘洗步骤、或经由靶细胞(例如，T细胞)的阳性或阴性选择。然后可以将顺磁性颗粒，例如抗CD3/抗CD28涂覆的顺磁颗粒添加到细胞群体中，以扩增T细胞。该过程还可包括转导步骤，其中将编码一种或多种所希望的蛋白质的核酸，例如CAR，例如靶向CD19的CAR，引入细胞中。可以将核酸引入慢病毒载体中。然后可以将细胞(例如，慢病毒转导的细胞)扩增数天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天，例如在合适的培养基存在下。在扩增之后，本文披露的去珠过程/模块可用于将所希望的T细胞与顺磁性颗粒分离。该过程可包括根据本披露的过程的一个或多个去珠步骤。然后可以配制去珠细胞用于施用给患者。CAR T细胞的实例及其制造进一步描述于例如WO 2012/079000中，其通过引用整体并入本文。本披露的系统和方法可以用于WO 2012/079000中描述的或与WO 2012/079000相关的任何细胞分离/纯化/去珠过程。另外的CAR T制造过程描述于例如WO 2016109410和WO2017117112中，其通过引用整体并入本文。
与常规系统和方法相比，本文的系统和方法可以类似地有益于其他细胞疗法产品，其浪费较少的所希望的细胞，引起较少的细胞损伤，并且更可靠地从细胞中去除磁性和任何非顺磁性颗粒，且较少的暴露于化学药剂或不暴露。
尽管上文仅具体描述了本披露的示例性实施例，但是应当理解，在不脱离本披露的精神和预期范围的情况下，这些示例的修改和变化是可能的。例如，除了所描述的那些之外，磁性模块和包含它们的系统可以以各种配置来布置和使用。此外，也可以使用非磁性模块。此外，该系统和方法可以包括未在本文具体描述的另外的组件和步骤。例如，方法可以包括预注，其中首先将流体引入组件中以去除气泡并降低对细胞悬浮液或缓冲液移动的阻力。此外，实施例可以仅包括本文描述的系统的一部分以与本文所述的方法一起使用。例如，实施例可涉及可在非一次性设备中使用的一次性模块、软管等，以形成能够分离或去珠细胞以产生细胞产物的完整系统。
在本领域中已经描述了可以与本发明结合的另外的制造方法和过程。例如，WO2017/117112的第86-91页描述了改进的洗涤步骤和改进的制造过程。
免疫效应细胞的来源
该部分提供了另外的方法或步骤，用于获得包含所希望的免疫效应细胞的输入样品；分离和加工所希望的免疫效应细胞(例如T细胞)；并去除不需要的物质(例如不需要的细胞)。可以将在该部分中描述的另外的方法或步骤与以下各项中的任何一种组合使用：淘洗、密度梯度离心、流动条件下的选择、或在前述部分中描述的经改进的洗涤步骤。
可以从受试者中获得细胞(例如T细胞或天然杀伤(NK)细胞)来源。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。
在本披露的一些实施例中，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术，和本文披露的任何方法，按其步骤的任何组合，从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞(例如T细胞)。在一些实施例中，通过单采获得来自个体的循环血液的细胞。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以去除血浆部分，并且任选地将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。在一些实施例中，使用本文所述的经改进的洗涤步骤洗涤细胞。
在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMateTM、或血液细胞回收仪(Haemonetics Cell Saver)5)、高级血液细胞回收仪(Haemonetics CellSaver Elite)(通用电气医疗集团赛分科技(GE Healthcare Sepax)或赛菲尔公司(Sefia))、或利用旋转膜过滤技术的装置(费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)LOVO)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyteA、补充有人血清白蛋白(HSA)的PBS-EDTA、或含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施例中，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗减单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离所希望的免疫效应细胞(例如T细胞)。
本文所述的这些方法可以包括例如使用例如(如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，该亚群是T调节性细胞耗减的细胞(例如CD25+耗减的细胞或CD25高耗减的细胞)群体。在一些实施例中，T调节性细胞耗减的细胞群体包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞或CD25高细胞。
在一些实施例中，使用抗CD25抗体，或其片段，或CD25-结合配体(例如IL-2)，从该群体中去除T调节性细胞(例如CD25+ T细胞或CD25高T细胞)。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段或CD25-结合配体与底物(例如珠)缀合，或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些实施例中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的底物缀合。
在一些实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减试剂从该群体中去除T调节性细胞(例如CD25+ T细胞或CD25高T细胞)。在一些实施例中，细胞与CD25耗减试剂的比率是1e7个细胞至20μL、或1e7个细胞至15μL、或1e7个细胞至10μL、或1e7个细胞至5μL、或1e7个细胞至2.5μL、或1e7个细胞至1.25μL。在一些实施例中，例如对于T调节性细胞，使用大于5亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用6亿、7亿、8亿、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+ T细胞。在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x109至1x1010个CD25+ T细胞，以及其间的任何整数值。在一些实施例中，所得T调节性细胞耗减的细胞群体具有2x109个T调节性细胞，例如CD25+细胞或CD25高细胞，或更少(例如1x109、5x108、1x108、5x107、1x107个、或更少的T调节性细胞)。
在一些实施例中，使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从该群体中去除T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)。在一些实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像耗减2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如Treg细胞)的数量)可以显著降低受试者复发的风险。例如，耗减Treg细胞的方法是本领域已知的。减少Treg细胞的方法包括但不限于，环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25-耗减、及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，耗减)Treg细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减Treg细胞。
不希望受特定理论的束缚，在单之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如Treg细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少Treg细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，减少Treg细胞的方法包括但不限于，向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。在一些实施例中，减少Treg细胞的方法包括但不限于，向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，耗减)Treg细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减Treg细胞。
在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一些实施例中，在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前，修饰表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)制造过程以耗减Treg细胞。在一些实施例中，在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前，将CD25耗减用于耗减Treg细胞。
在一些实施例中，有待去除的细胞群体既不是调节性T细胞或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞)。在一些实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除，或在所述耗减之后，或以另一种顺序去除。
本文所述的方法可以包括多余一个的选择步骤，例如多余一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体中去除细胞，从而提供T调节性细胞耗减的(例如CD25+耗减的或CD25高耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，该细胞群体适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一些实施例中，将肿瘤抗原表达细胞与T调节(例如CD25+细胞或CD25高细胞)同时去除。例如，抗CD25抗体或其片段以及抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于去除细胞的同一底物(例如，珠)上；或者抗CD25抗体或其片段或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至其混合物可以用于去除细胞的分开的珠上。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)的去除和肿瘤抗原表达细胞的去除是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体中去除细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性细胞耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)群体。例如，如本文所述示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如TGFβ)。在一些实施例中，将检查点抑制剂表达细胞与T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)同时去除。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)的去除和表达检查点抑制剂的细胞的去除是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)-缀合的珠(例如
Figure BDA0002952123060002011
M-450CD3/CD28 T)孵育持续足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中，该时间段是约30分钟。在一些实施例中，该时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在一些实施例中，该时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在一些实施例中，该时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在该过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他所希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。
在一些实施例中，可以选择表达以下中的一钟或多钟的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号：WO 2013/126712中。
为了通过阳性或阴性选择分离所希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在一些实施例中，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)以确保细胞和珠的最大接触。例如在一些实施例中，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。在一些实施例中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒，如珠)，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+ T细胞更有效地捕获。在一些实施例中，所使用的细胞浓度是5x106/ml。在一些实施例中，所使用的浓度可以是从约1x105/ml至1x106/ml，以及其间的任何整数值。
在一些实施例中，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
在一些实施例中，群体的多个免疫效应细胞不表达甘油二酯激酶(DGK)，例如是DGK缺陷型。在一些实施例中，群体的多个免疫效应细胞不表达Ikaros(例如是Ikaros缺陷型)。在一些实施例中，群体的多个免疫效应细胞不表达DGK和Ikaros，例如是DGK和Ikaros缺陷型。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群体中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在一些实施例中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法活化之前在室温静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便后续用于免疫效应细胞疗法中，以用于将受益于免疫效应细胞疗法的任意数目的疾病或病症，如本文所述的那些。在一些实施例中，血液样品或单采取自基本健康的受试者。在一些实施例中，血液样品或单采取自基本健康的受试者，该受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供以后使用。在一些实施例中，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在一些实施例中，在诊断如本文描述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在一些实施例中，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制性剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本发明的一些实施例中，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改善的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在一些实施例中，动员(例如用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病状，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。
在一些实施例中，表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在一些实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。
在其他实施例中，已经被或将被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，该mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTSTM免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一些实施例中，本申请的方法可利用包含至少约0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％或10％血清的培养基条件。在一些实施例中，该培养基包含约0.5％-5％、约0.5％-4.5％、约0.5％-4％、约0.5％-3.5％、约0.5％-3％、约0.5％-2.5％、约0.5％-2％、约0.5％-1.5％、约0.5％-1.0％、约1.0％-5％、约1.5％-5％、约2％-5％、约2.5％-5％、约3％-5％、约3.5％-5％、约4％-5％、或约4.5％-5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约0.5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约0.5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约1％血清。在一些实施例中，该培养基包含约1.5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约2％血清。在一些实施例中，该培养基包含约2.5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约3％血清。在一些实施例中，该培养基包含约3.5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约4％血清。在一些实施例中，该培养基包含约4.5％血清。在一些实施例中，该培养基包含约5％血清。在一些实施例中，该血清包含人血清，例如人AB血清。在一些实施例中，该血清是在收集后允许自然凝固的人血清，例如，非凝块(OTC)血清。在一些实施例中，该血清是血浆衍生的血清人血清。血浆来源的血清可以通过将在抗凝血剂(例如柠檬酸钠)存在下收集的混合的人血浆脱纤维来产生。
在一些实施例中，本申请的方法可利用包含无血清培养基的培养基条件。在一些实施例中，无血清培养基是OpTmizerTM CTSTM(美国生达医药集团(LifeTech))、ImmunocultTM XF(干细胞技术公司(Stemcell technologies))、CellGroTM(CellGenix)、TexMacsTM(美天旎公司(Miltenyi))、StemlineTM(西格玛公司(Sigma))、Xvivo15TM(瑞士龙沙集团(Lonza))、
Figure BDA0002952123060002061
(欧文科技公司(Irvine Scientific))、或
Figure BDA0002952123060002062
(RandD系统)。无血清培养基可以补充有血清置换物，例如来自美国生达医药集团(LifeTech)的ICSR(免疫细胞血清替代物)。血清置换物(例如ICSR)的水平可以是例如高达5％、例如约1％、2％、3％、4％、或5％。在一些实施例中，无血清培养基可补充有血清，例如人血清，例如人AB血清。在一些实施例中，该血清是在收集后允许自然凝固的人血清，例如，非凝块(OTC)血清。在一些实施例中，该血清是血浆衍生的人血清。血浆来源的血清可以通过将在抗凝血剂(例如柠檬酸钠)存在下收集的混合的人血浆脱纤维来产生。
在一些实施例中，T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一些实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。替代性地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一些实施例中，从受试者获得NK细胞。在一些实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
同种异体表达CAR的细胞
在本文所述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如该细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如被工程化以使其在其表面上不表达任何功能性TCR、工程化使得其不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基(例如，工程化使得其不表达(或表现出降低的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)、或工程化以使其在其表面上产生非常少的功能性TCR。替代性地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如被工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以被工程化，使得细胞表面表达HLA(例如HLA 1类和/或HLA II类)下调。在一些实施例中，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现HLA的下调。
在一些实施例中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLAII类)。
缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文所述的任何方法不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，该细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，该抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如TGFβ)。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA(如siRNA或shRNA)、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施例中，在细胞(例如T细胞)中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第649和650段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指源自CRISPR和Cas的系统，该系统可以用于在细胞(例如T细胞)中沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第651-658段中，将其通过引用以其全文并入。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化因子样效应核酸酶，一种可以用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第659-665段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可以用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第666-671段中，该文献通过引用以其全文并入。
端粒酶表达
端粒在体细胞持久性中起关键作用，其长度由端粒酶(TERT)维持。CLL细胞中的端粒长度可能非常短(Roth等人,“Significantly shorter telomeres in T-cells ofpatients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia[患有ZAP-70+/CD38慢性淋巴细胞白血病的患者T细胞中显著更短的端粒]”British Journal of Haematology[英国血液学杂志],143,383-386.,2008年8月28日)，并且在制造的表达CAR的细胞(例如CART19细胞)中可能甚至更短，限制了它们在过继转移至患者后其扩增的可能性。端粒酶表达可以从复制耗竭中拯救表达CAR的细胞。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在一些实施例中，免疫效应细胞(例如T细胞)异位表达端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)。在一些实施例中，本披露内容提供了产生表达CAR的细胞的方法，该方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与该核酸接触。
端粒酶表达可以是稳定的(例如，核酸可以整合到细胞的基因组中)或瞬时的(例如，核酸不整合，并且表达在一段时间后降低，例如几天)。通过用编码端粒酶亚基和选择标志物的DNA转染或转导细胞，并选择稳定的整合子，可以实现稳定的表达。替代性地或组合地，例如使用Cre/Lox或FLP/FRT系统可以通过位点特异性重组来完成稳定表达。
瞬时表达可以涉及用核酸(例如DNA或RNA，如mRNA)转染或转导。在一些实施例中，瞬时mRNA转染避免了有时与TERT稳定转染相关联的遗传不稳定性。外源端粒酶活性的瞬时表达描述于例如国际申请WO 2014/130909中，该申请通过引用以其全文并入。在实施例中，根据由现代化疗法公司(Moderna Therapeutics)商业化的信使RNA TherapeuticsTM平台进行端粒酶亚基的基于mRNA的转染。例如，该方法可以是在美国专利号8710200、8822663、8680069、8754062、8664194、或8680069中所述的方法。
在一些实施例中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亚基基因hEST2在肿瘤细胞中且在永生化期间上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ ID NO:284)
在一些实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:284的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:284的序列。在一些实施例中，hTERT在N末端、C末端、或两者处包含缺失(例如不超过5、10、15、20、或30个氨基酸)。在一些实施例中，hTERT在N末端、C末端、或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不超过5、10、15、20、或30个氨基酸)。
在一些实施例中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)。
免疫效应细胞(例如T细胞)的活化和扩增
通过本文所述的方法产生或富集的免疫效应细胞(例如T细胞)通常可以使用如例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法来活化和扩增。
通常，免疫效应细胞群体可以通过与表面接触而扩增，该表面附接有刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。具体地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化因子(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司(Diaclone,
Figure BDA0002952123060002131
France))，还可以使用本领域公知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.[移植学会会报]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一些实施例中，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级活化信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在一些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在一些实施例中，这些药剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于活化和扩增本发明中的T细胞。
在一些实施例中，将两种药剂固定在珠上，或者在相同的珠上(即“顺式”)，或者在分离的珠上(即“反式”)。通过举例，提供初级活化信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一些实施例中，使用针对CD4+ T细胞扩增和T细胞生长的与珠结合的每种抗体的1:1的比率。在本发明的一些实施例中，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一些实施例中，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一些实施例中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在一些实施例中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即，CD3:CD28的比率小于1。在一些实施例中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。
颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在一些实施例中，范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在一些实施例中包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些适合的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个适合的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一些实施例中，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一些实施例中，适合的颗粒与细胞的比率为1:5。在一些实施例中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一些实施例中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外的颗粒在之后每天或每隔一天加入到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一些实施例中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一些实施例中，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一些实施例中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一些实施例中，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，各种其他比率可适用于本发明。具体地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一些实施例中，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。
在一些实施例中，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将这些珠和这些细胞分离，并且然后培养细胞。在一些实施例中，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在一些实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28所附接的顺磁珠(3x28个珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一些实施例中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的
Figure BDA0002952123060002151
M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子(如钙和镁))中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶标细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含所关注的靶标细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文内。在一些实施例中，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一些实施例中，使用约100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿个细胞/ml、60亿个细胞/ml、50亿个细胞/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且在一些实施例中是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，例如通过本文所述的方法扩增用编码CAR(例如本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR)的核酸转导的细胞。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一些实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增8天或更短(例如7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、表面CAR表达、CAR定量PCR、或其组合。在一些实施例中，与在相同的培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示抗原刺激后细胞倍增方面至少一倍、两倍、三倍或四倍的增加。在一些实施例中，使细胞(例如，本文所述的表达CD19 CAR的细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得的细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述的CD19 CAR细胞)显示促炎细胞因子产生(例如IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml增加至少一、二、三、四、五、十倍或更多。
还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低基础培养基(Minimal Essential Media)、α-MEM、RPMI培养基1640、AIM-V、DMEM、F-12、或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza))、X-Vivo 20、OpTmizer、和IMDM)，该培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFNγ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNFα或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括但不限于RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、X-Vivo 20、OpTmizer、和IMDM，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
在一些实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当培养基(例如本文描述的介质)中扩增，该白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如通过本文描述的方法(如流式细胞术)测量。在一些实施例中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下扩增。
在实施例中，本文所述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体，IL-2从细胞群体中去除T调节性细胞(例如CD25+ T细胞或CD25高T细胞)。从细胞群体中去除T调节性细胞(例如CD25+ T细胞或CD25高T细胞)的方法是本文所述的。在实施例中，这些方法(例如制造方法)进一步包括使细胞群体(例如，其中T调节性细胞，如CD25+ T细胞或CD25高T细胞已经被耗减的细胞群体；或先前已接触抗CD25抗体其片段，或CD25-结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群体(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一些实施例中，在离体扩增过程中，本文所述的表达CAR的细胞与包含L-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一些实施例中，该接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+ T细胞)的存活和增殖。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群体(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性子集，则将该子集扩增到更大程度可能是有益的。
此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
一旦构建本文描述的CAR，可以使用各种测定来评价分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞、在不存在再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价本发明的CAR的作用的测定进一步详细描述于下文。
可以将初始T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析用于检测单体和二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第695段，该申请通过引用以其全文并入本文。
可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR+ T细胞的体外扩增。例如将CD4+和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术，在培养的第6天在CD4+和/或CD8+ T细胞亚群中评估GFP荧光。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。替代性地，在第0天将CD4+和CD8+ T细胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天使用表达CAR连同eGFP(使用2A核糖体跳跃序列)的双顺反子慢病毒载体转导。在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)的存在下，将培养基用如本文所述的癌症相关抗原+K562细胞(表达与如本文所述的癌症相关联的抗原的K562)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激。每隔一天以100IU/ml向培养基中添加外源IL-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计算GFP+ T细胞。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+ T细胞扩增。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III颗粒计数器或更高版本、耐克龙细胞计数仪(Nexcelom Cellometer Vision)、密理博赛普特计数器(Millipore Scepter)或其他细胞计数器在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
还可以将动物模型用于测量表达CAR的细胞活性，例如如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第698段，该申请通过引用以其全文并入。
例如如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第699段所描述，可以评估剂量依赖性CAR治疗反应，该文申请通过引用以其全文并入。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第700段中，该申请通过引用以其全文并入。
通过标准51Cr释放测定可以评估细胞毒性，例如如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第701段所述，该申请通过引用以其全文并入。也可以使用替代性的非放射性方法。
例如使用xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)，还可以通过测量贴壁细胞的电阻抗中的变化来评估细胞毒性。在一些实施例中，在多个时间点处测量细胞毒性。
在携带肿瘤的动物模型中可以将成像技术用于评估CAR的特定运输和增殖，例如如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第702段所述，该申请通过引用以其全文并入本文中。
其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。
替代性地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：表达CAR的细胞的检测和/或定量(例如，体外或体内(例如，临床监测))；免疫细胞扩增和/或活化；和/或涉及使用CAR配体的CAR特异性选择。在一些实施例中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域的抗体(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体)。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如本文所述的CAR抗原分子)。
在一些实施例中，披露了用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于体外或体内检测和/或定量表达CAR的细胞(例如，临床监测患者中的表达CAR的细胞，或给患者给药)。该方法包括：
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包含标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；
获得表达CAR的细胞(例如，获得含有表达CAR的细胞的样品，如制造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测表达CAR的细胞与CAR配体的结合。
在一些实施例中，披露了扩增和/或活化细胞(例如免疫效应细胞)的方法。该方法包括：
提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述表达CAR的细胞与CAR配体(例如，如本文所述的CAR配体)接触，从而产生活化的和/或扩增的细胞群体。
在某些实施例中，CAR配体存在于底物(例如，固定或附接至底物上，如非天然存在的底物)上。在一些实施例中，底物是非细胞底物。非细胞底物可以是选自例如板(例如微量滴定板)、膜(例如硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠的固体支持物。在实施例中，CAR配体存在于底物中(例如在底物表面上)。CAR配体可以与底物共价或非共价(例如，交联)固定、附接、或缔合。在一些实施例中，CAR配体与珠附接(例如共价附接)。在前述实施例中，免疫细胞群体可以在体外或离体扩增。该方法可以进一步包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞的群体，例如，使用本文所述的任何方法。
在其他实施例中，扩增和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定在底物(例如一个或多个珠)上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。
在一些实施例中，提供了用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及根据CAR配体的结合选择细胞。
在其他实施例中，提供了用于消耗、减少和/或杀伤表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；并且基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一些实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在一些实施例中，抗独特型抗体可以导致效应细胞活性(例如ADCC或ADC活性)。
可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，该文献的内容通过引用并入。
在一些实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号PCT/US2015/043219中所述，该专利的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，优化的T细胞亚群显示了增强的持久性。
在一些实施例中，CD4+ T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD4+ T细胞(例如ICOS结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CD8+ T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD8+ T细胞(例如，4-1BB结构域、CD28结构域，或ICOS结构域以外的其他共刺激结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
在一些实施例中，本文描述了治疗受试者的方法，例如患有癌症的受试者。该方法包括向所述受试者施用有效量的：
1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+ T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；并且
细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS结构域；并且
2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+ T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；并且
细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，如4-1BB结构域、CD28结构域、或除ICOS结构域的另一种共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，该方法进一步包括施用：
3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+ T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；并且
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，不存在于CARCD8+上，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
生物聚合物递送方法
在一些实施例中，如本文所披露的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/或可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第1004-1006段中，该申请通过引用以其全文并入。
药物组合物和治疗
在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括施用如本文所述产生的表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他的疗法组合。在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括施用包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物，任选地与一种或多种其他的疗法组合。在一些实施例中，本披露提供了运送或接收反应混合物的方法，该反应混合物包含如本文所述的表达CAR的细胞。在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括接收如本文所述产生的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他的疗法组合。在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括产生如本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其他的疗法组合。其他的疗法可以是例如癌症疗法(例如化疗)。
在一些实施例中，与降低Treg细胞群体的分子组合向受试者施用表达本文所述CAR的细胞。减少(例如耗减)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25耗减、环磷酰胺施用、调制GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。
在一些实施例中，将本文所述的疗法(例如表达CAR的细胞)与靶向GITR和/或调整GITR功能的分子组合施用受试者，如耗减调节性T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体。在实施例中，将表达本文所述CAR的细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一些实施例中，GITR结合分子和/或调整GITR功能的分子(例如GITR激动剂和/或Treg耗减GITR抗体)在表达CAR的细胞之前施用。例如在一些实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采之前施用。在实施例中，在施用(例如输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采之前向受试者施用环磷酰胺。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，向受试者施用环磷酰胺和抗GITR抗体。在一些实施例中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液学癌症，如ALL或CLL)。在一些实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有ALL。在实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌。示例性GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价体抗GITR抗体)，例如像描述于以下中的GITR融合蛋白：美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、欧洲专利号：8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754，或所述抗GITR抗体，例如在美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO 99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公开号：WO 2011/051726中。
在一些实施例中，将本文所述的CAR表达细胞与GITR激动剂(例如本文所述的GITR激动剂)组合施用受试者。在一些实施例中，在表达CAR的细胞之前施用GITR激动剂。例如在一些实施例中，可以在细胞的单采之前施用GITR激动剂。在一些实施例中，受试者患有CLL。
本文所述的方法可以进一步包括在药物组合物中配制表达CAR的细胞。药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文所述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。可以配制组合物，例如，用于静脉内施用。
在一些实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一些实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗癌症有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物以104至109个细胞/kg体重、在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括高达约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括约1.1x106-1.8x107个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19CAR细胞)的剂量包括约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括高达约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。
在一些实施例中，可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后随后重抽血液(或进行单采)，从其活化免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并用这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)回输患者。该过程可以每隔几周进行多次。在一些实施例中，可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。在一些实施例中，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)活化。
可以按任何方便的方式进行受试者组合物的施用。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内(例如，通过皮内或皮下注射)施用本文描述的组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
给药方案
在一些实施例中，表达CAR的活细胞(例如表达CD19、BCMA、CD20、或CD22 CAR的活细胞)的剂量包括约0.5x106个表达CAR的活细胞至约1.25x109个表达CAR的活细胞(例如0.5x106个表达CAR的活细胞至1.25x109个表达CAR的活细胞)。在一些实施例中，表达CAR的活细胞(例如表达CD19、BCMA、CD20、或CD22 CAR的活细胞)的剂量包括约1x106、约2.5x106、约5x106、约1.25x107、约2.5x107、约5x107、约5.75x107、或约8x107个表达CAR的活细胞。
患者选择
在本文披露的治疗受试者的任何方法或使用的组合物的一些实施例中，受试者患有癌症(例如血液癌)。在一些实施例中，癌症选自淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blastic plasmacytoid dendritic cellneoplasm)、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼(Castleman)病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。在一些实施例中，该癌症是复发性和/或难治性癌症。
在本文披露的治疗受试者的任何方法或所使用的组合物的一些实施例中，受试者患有CLL或SLL。在一些实施例中，患有CLL或SLL的受试者先前已经被施用BTK抑制剂疗法(例如依鲁替尼)持续至少1-12个月(例如6个月)。在一些实施例中，BTK抑制剂疗法(例如依鲁替尼疗法)是第二线疗法。在一些实施例中，受试者具有部分响应，或响应于BTK抑制剂疗法患有稳定的疾病。在一些实施例中，受试者对BTK抑制剂疗法不响应。在一些实施例中，受试者产生抗性，例如产生依鲁替尼抗性突变。在一些实施例中，依鲁替尼抗性突变包括在编码BTK的基因和/或编码PLCg2的基因中的突变。在一些实施例中，受试者是成人，例如至少18岁。
在本文披露的治疗受试者的任何方法或所使用的组合物的一些实施例中，受试者患有DLBCL，例如复发性和/或难治性DLBCL。在一些实施例中，患有DLBCL(例如复发性和/或难治性DLBCL)的受试者先前已经被施用至少2线化疗，例如抗CD20疗法和/或基于蒽环类的化疗。在一些实施例中，受试者先前已经接受干细胞疗法(例如自体同源干细胞疗法)并对所述干细胞疗法免疫响应。在一些实施例中，受试者不适合进行干细胞疗法(例如自体同源干细胞疗法)。在一些实施例中，受试者是成人，例如至少18岁。
用于评估CAR有效性的生物标志物
在一些实施例中，本文披露了在受试者(例如患有癌症的受试者，例如血液癌)中评估或监测表达CAR的细胞疗法(例如CD19或BCMA CAR疗法)的有效性的方法。该方法包括获得CAR疗法有效性的值，其中所述值指示表达CAR的细胞疗法的有效性或适合性。
在实施例中，在患有CLL或SLL的受试者中对CAR疗法具有有效性的值包括以下参数中的一、二、三种、或全部的测量值：
(i)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中编码BTK的基因的突变；
(ii)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中编码PLCg2的基因的突变；
(iii)例如如通过评估CD8、CD4、CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD43、CD79b、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、Tim-3、和/或CD81的水平和/或活性的微小残留病；或如通过免疫球蛋白深度测序评估；在样品中(例如来自受试者的单采样品或肿瘤样品)；或
(iv)样品(例如来自受试者的单采样品)中选自IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1a的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十种或全部的细胞因子的水平或活性。
在实施例中，在患有DLBCL(例如复发性和/或难治性DLBCL)的受试者中对CAR疗法具有有效性的值包括以下参数中的一种或两种的测量值：
(i)例如如通过评估CD8、CD4、CAR19、CD3、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、和/或Tim-3的水平和/或活性的微小残留病；或如通过免疫球蛋白深度测序评估；在样品中(例如来自受试者的单采样品或肿瘤样品)；或
(ii)样品(例如来自受试者的单采样品)中选自IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1a的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十种或全部的细胞因子的水平或活性。
在其他实施例中，对CAR疗法具有有效性的值进一步包括以下参数中的一、二、三、四、五、六或更多种(全部)的测量值：
(i)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中，静息TEFF细胞、静息TREG细胞、较年轻的T细胞(例如初始T细胞(例如初始CD4或CD8 T细胞、初始γ/δT细胞)、或干细胞记忆T细胞(例如干细胞记忆CD4或CD8 T细胞、或干细胞记忆γ/δT细胞)、或早期记忆T细胞中的一、二、三种或更多种(全部)、或其组合的水平或活性；
(ii)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中活化TEFF细胞、活化TREG细胞、较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)、或晚期记忆T细胞中的一、二、三种、或更多种(例如全部)、或其组合的水平或活性；
(iii)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中免疫细胞耗竭标志物，例如免疫检查点抑制剂(例如PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT和/或LAG-3)中的一、二、或更多种的水平或活性。在一些实施例中，免疫细胞具有耗竭表型，例如共表达至少两种耗竭标志物，如共表达PD-1和TIM-3。在其他实施例中，免疫细胞具有耗竭表型，例如共表达至少两种耗竭标志物，如共表达PD-1和LAG-3；
(iv)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中CD27和/或CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞，例如CD4+活CD8+ T细胞群体中的水平或活性；
(v)选自CCL20、IL-17a、IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1的生物标志物中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一种、或全部的水平或活性；
(vi)表达CAR的细胞产物样品，例如表达CLL-1的细胞产物样品中的细胞因子水平或活性(例如细胞因子谱系的质量)；或
(vii)制造的表达CAR的细胞产物样品中表达CAR的细胞的转导效率。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，表达CAR的细胞疗法包括多个(例如，一个群体)表达CAR的免疫效应细胞，例如多个(例如，一个群体)T细胞或NK细胞或其组合。在一些实施例中，表达CAR的细胞疗法是CD19 CAR疗法。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值从得自受试者的单采样品获得。可以在输注或再输注之前评估单采样品。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值从得自受试者的肿瘤样品获得。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值获得自制造得表达CAR的细胞产物样品(例如CD19CAR-表达细胞产物样品)。可以在输注或再输注之前评估制造的表达CAR的细胞产物。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在接受表达CAR的细胞疗法之前、期间或之后评估受试者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值评估基因表达、流式细胞术或蛋白质表达中的一种或多种的特征。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，该方法进一步包括基于本文披露的参数中的一种或多种的测量值，将受试者鉴定为反应者、无反应者、复发者或无复发者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者CD8+ T细胞的百分比)相比，反应者(例如完全反应者)具有或被鉴定为具有更高的(例如，统计学上显著更高的)CD8+ T细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者数量的CD27+CD45RO-免疫效应细胞)相比，反应者(例如完全反应者)具有或被鉴定为具有更高的CD27+CD45RO-免疫效应细胞(例如在CD8+群体中)百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者CD4+ T细胞的百分比)相比，反应者(例如完全反应者或部分反应者)具有或被鉴定为具有更高的(例如统计学上显著更高的)CD4+ T细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、较年轻的T细胞、或早期记忆T细胞)相比，反应者(例如完全反应者)具有或被鉴定为具有更高的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、较年轻的T细胞、或早期记忆T细胞中的一、二、三种或更多种(例如全部)或其组合的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如反应者数量的活化TEFF细胞、活化TREG细胞、较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的活化TEFF细胞、活化TREG细胞、较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞中一、二、三、或更多种(例如全部)，或其组合的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高免疫细胞耗竭标志物(例如一、二、或更多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT和/或LAG-3))的百分比。在一些实施例中，与来自反应者的表达PD-1或LAG-3的免疫效应细胞的百分比相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的表达PD-1、PD-L1、或LAG-3的免疫效应细胞(例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)(例如表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+ T细胞)的百分比。
在一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如共表达至少两种耗竭标志物(例如共表达PD-1、PD-L1和/或TIM-3)的免疫细胞)的百分比。在其他实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如共表达至少两种耗竭标志物(例如共表达PD-1和LAG-3)的免疫细胞)的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体(例如CLL-1CAR+细胞群体)中，与表达CAR的细胞疗法的反应者(例如完全反应者)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，反应者(例如，完全或部分反应者)具有以下特征中的一、二、三或更多种(或全部)：
(i)与参考值(例如无反应者数量的CD27+免疫效应细胞)相比，具有更多数量的CD27+免疫效应细胞；
(ii)与参考值(例如无反应者数量的CD8+ T细胞)相比，具有更多数量的CD8+ T细胞；
(iii)与参考值(例如无反应者数量的表达一种或多种检查点抑制剂的细胞)相比，具有更少数量的表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、或KLRG-1，或其组合的检查点抑制剂)的免疫细胞；或
(iv)与参考值(例如无反应者数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞、或早期记忆T细胞的)相比，具有更多数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞、或早期记忆T细胞中的一、二、三、四种或更多种(全部)、或其组合。
在实施例中，受试者是可以根据临床标准进一步评估由本文的方法鉴定的反应者、无反应者、复发者或无复发者。例如，完全反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的完全反应，例如完全缓解。例如，使用NCCN指南(NCCN
Figure BDA0002952123060002343
)、或如在Hallek M等人,Blood[血液](2018)131:2745-2760“iwCLLguidelines for diagnosis,indications for treatment,response assessment,andsupportive management of CLL[针对诊断、治疗适应症、反应评估和CLL的支持性管理的iwCLL指南],”中披露的国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(International Workshop onChronic Lymphocytic Leukemia(iwCLL))2018指南可以鉴定完全的反应，这些文献的完整内容通过引用以其全文并入本文。部分反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的部分反应，例如部分缓解。例如使用如本文所述的NCCN指南(NCCN
Figure BDA0002952123060002341
)或iwCLL 2018标准可以鉴定部分响应。无反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者未表现出对治疗的反应，例如患者病情稳定或疾病进展。例如使用如本文所述的NCCN指南(NCCN
Figure BDA0002952123060002342
)或iwCLL 2018标准可以鉴定无反应者。
替代性地，或与本文披露的方法组合，响应于所述值，执行以下一者、二者、三者或更多者：
例如向反应者或无复发者施用表达CAR的细胞疗法；
施用改变剂量的表达CAR的细胞疗法；
改变表达CAR的细胞疗法的排程或时程；
例如，将另外的药剂与表达CAR的细胞疗法(例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂)组合施用于无反应者或部分反应者；
在用表达CAR的细胞疗法治疗之前，将增加受试者中的较年轻的T细胞的数量的疗法施用于无反应者或部分反应者；
修改表达CAR的细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞，或例如针对被鉴定为无反应者或部分反应者的受试者而言，增加转导效率；
例如针对无反应者或部分反应者或复发者，施用替代疗法；或
如果受试者为或被鉴定为无反应者或复发者，则例如通过CD25耗减、施用环磷酰胺、抗GITR抗体中的一者或多者或它们的组合来减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
实例1：产生具有细胞因子刺激的CART
概述
该实例描述了CART制造过程(称为“细胞因子过程”)。在一些实施例中，将细胞(例如T细胞)接种在培养基(例如含血清的培养基，例如含有2％血清的培养基)中。将一种或多种细胞因子(例如选自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)中的一种或多种的细胞因子)以及编码CAR的载体(例如慢病毒载体)添加至细胞中。孵育20-24小时后，将细胞进行洗涤、配制、和冷冻保存。示例性细胞因子过程显示在图1A中。
与传统的CART制造过程相比，该修订过程消除了CD3/CD28刺激以及离体T细胞扩增。不希望受理论束缚，抗CD3/抗CD28珠驱动分化成中枢记忆细胞；并相反，细胞因子(例如IL-15、IL-21、和IL-7)可以帮助保留转导的CD3+ T细胞的未分化表型。因此，与使用传统方法产生的CART细胞相比，不涉及CD3/CD28活化的细胞因子可以产生具有更高初始/干细胞T细胞百分比的CART细胞。
方法
在收集后24小时内获得单采，纯化T细胞并通过流式细胞术评估获得的T细胞纯度。将T细胞冷冻并置于液氮中直至需要使用。
替代性地，使用
Figure BDA0002952123060002363
仪制备冷冻保存的单采样品并富集CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
按所需的最终浓度的1,000倍制备IL-7和IL-15。通过在培养基中稀释10倍来制备IL-2。
表19：细胞因子条件
条件
1. IL2
2. IL-7
3. IL-15
4. IL2+IL7
5. IL-7+IL-15
6. IL2+IL-15
7. 珠+IL2
8. 珠+IL15
在扩珠刺激的条件下，进行计算来铺板细胞，其中珠与细胞的最终浓度比率为3:1。使用
Figure BDA0002952123060002361
将
Figure BDA0002952123060002362
磁珠洗涤两次，并重悬浮于用于实验的所需体积的培养基中。将经洗涤的珠添加至含有特定细胞因子和细胞的管中。
在铺板时，将细胞用具有感染复数(MOI)为1的慢病毒载体转导。基于所使用的载体批次的感染复数(MOI)和浓度(滴度)计算有待转导的载体的比容。基于初始T细胞系测量滴度和MOI。
在仅使用细胞因子进行刺激的条件下，将细胞在洗涤后按1E7/ml的浓度重悬浮，并根据条件添加至已经包含细胞因子的锥形管中(表19)。添加细胞和细胞因子后，添加慢病毒载体，随后添加培养基。
在所有的条件下，将细胞混合，并将1ml铺板于24孔板的14个孔中。将细胞置于在37℃和5％CO2下的培养箱中。
在第二天收获细胞，记录这些细胞的浓度和生活力。使用细胞毒性和增殖(EDU)掺入测定法测量它们的功能。这些细胞被称为“第1天CART”。
将细胞针对T细胞分化状态进行免疫表型化，并使用流式细胞术评估CAR的转导。将细胞洗涤，添加生活力染料，随后添加抗体混合物(表20)，并将板在室温下孵育20分钟。孵育后，在BD fortessa上进行分析之前，将细胞洗涤两次并固定。
表20：将抗体组的抗原用于确定T细胞的分化状态
抗原
生活力
CD3
CD4
CD8
HLADR
CD28
CD45RO
CD95
CCR7
抗独特型
为确定第1天CART是否仍保持扩增收获后的能力，在T25烧瓶中使用CD3/CD28珠，按3:1的比率(珠与细胞)扩增5e6个细胞/条件。如先前所述洗涤
Figure BDA0002952123060002371
磁珠。该培养基不包含细胞因子。将细胞置于在37℃和5％CO2下的培养箱中。
在每2天用CD3/CD28珠扩增T细胞的情况下，对细胞计数，并在培养基中溢出长达10天。在第10天，收获细胞，计数，使用分化组免疫表型化(表20)并在Cryostor 10TM中冷冻。将这些细胞解冻用于功能性测定，包括细胞毒性测定、增殖测定和细胞因子分泌测定。
在CD3/CD28珠的存在下，将体外扩增10天的细胞称为“第10天CART”。
结果
当纯化的T细胞与细胞因子在不存在任何其他的活化刺激的情况下一起孵育时，从第1天至第4天转导增加(图1B)。独立于时间点和细胞因子条件，CAR阳性群体中的主要群体是初始的(图1D、1E、和1F)。消除活化剂导致原始群体的转导增强。值得注意的是，暴露于IL-2或IL-15在体外维持自我更新的T细胞(图1G)。在其他测试的细胞因子(IL-7；IL2+IL7；IL-7+IL-15；和IL2+IL-15)治疗下观察到类似的现象(数据未显示)。细胞因子过程(在该具体实例中使用IL2或IL-15)维持或略微增加CD45RO-CCR7+细胞的百分比(图1G)。对于IL-2、IL-15以及IL-7和IL-15的组合，类似的数据显示在图1H和1I中。用指定的细胞因子将T细胞培养24小时，维持CD3+ T细胞的初始表型，并降低中枢记忆T细胞的百分比(图1H和1I)。
为确保在24小时内观察到的转导稳定，将24小时内产生的CART洗涤以去除任何残留的病毒，并使用CD3/D28扩增珠在10天内扩增。扩增的细胞显示出与第1天CART几乎相当的转导，表明转导是稳定的(图2A)。
使用细胞毒性、细胞因子释放、和增殖测定来测试第1天CART和第10天CART的功能性。靶细胞是Nalm6细胞，表达CD19的B细胞ALL细胞系。细胞毒性测定表明，如与第10天CART相比，扩增后第1天CART在杀伤方面是相当的(图2B)，尽管第1天CART具有更少的转导细胞。针对IFN-γ分泌，比较已经扩增的相同的第1天CART，并且发现如与第10天CART相比，发现具有IFN-γ的更少的分泌(图2C)，这可能是由于经转导的细胞的数量的差异。在单独的研究(其中第1天CART具有更高水平的转导)中，它们分泌更高水平的IFN-γ(数据未显示)。此外，来自除了仅IL7条件之外的全部治疗条件的第1天CART显示出相比第10天CART的相似或更高的增殖(图2D)。图2D中所示的数据未针对转导水平进行标准化。
尽管在第10天CART中观察到稳定的转导，但效率始终较低。在四种细胞因子条件下测试慢病毒载体的增加的感染复数(MOI)的滴定，并且在所有经测试的条件下观察到与转导的线性关系(图3A)。
此外，比较不同的培养基组合物(主要是血清浓度从5％降低至2％至无血清)以确定它们是否影响转导效率。血清减少至2％人血清导致最高的转导效率(图3B)。单独添加Glutamax也被认为对转导效率具有显著影响。
接下来，使用小鼠ALL模型检查第1天CART和第10天CART的体内抗肿瘤活性。简言之，如上所述制造第1天CART和第10天CART，其中生活力高于80％(图4A和4B)。在携带肿瘤的小鼠中施用CART，并监测体内扩增。如图4C所示，第1天CART显示出比第10天对应物更高水平的体内扩增。特别地，在IL-2的存在下制造的CART显示出体内扩增的最高水平(图4C)。所有经测试的CART抑制体内的肿瘤生长，尽管与如第10天CART相比，第1天CART显示出延迟的动力学(图4D)。在该特定供体中，IL2条件证明了体内消除肿瘤的最大能力(图4D)。
此外，还测试了该制造过程是否可量化。在IL2或hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)的存在下，富集后在24孔板或PL30袋中用CAR19转导来自冷冻的单采样品的T细胞。hetIL-15已经被描述于WO 2014/066527中，其通过引用以其全文并入，并包含与人IL-15Ra的可溶形式复合的人IL-15。24小时后收获细胞并测试CAR的表达。如图5B所示，在IL2或hetIL-15的存在下，当将该过程在24孔板和PL30袋之间缩放时，观察到对转导无影响。
实例2：产生具有TCR刺激的CART
概述
该实例描述了CART制造过程(称为“活化过程”)。在一些实施例中，将细胞(例如T细胞)接种在包含IL-2的培养基(例如无血清培养基，例如OpTmizerTM培养基)中(例如含有OpTmizerTM补充剂、GlutaMAX和100IU/ml的IL-2的OpTmizerTM培养基)，置于细胞培养装置中，并与抗CD3/抗CD28(例如TransAct)接触。12小时后，将编码CAR的载体(例如慢病毒载体)添加至细胞中，并且将这些细胞放回到培养箱中。在开始细胞培养24小时后，收获细胞，取样并配制。不希望受理论束缚，例如使用抗CD3/抗CD28(例如TransAct)，简短的CD3和CD28活化促进自我更新T细胞的有效转导。
在该实例和其他实例中，将被称为“传统制造(TM)”的CART制造过程用作对照。在一些实施例中，T细胞选自新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品(例如使用阳性或阴性选择)，活化(例如使用抗CD3/抗CD28抗体包被的
Figure BDA0002952123060002401
)，与编码CAR分子的核酸分子接触(例如用包含编码CAR分子的核酸分子的慢病毒载体转导)，并在体外扩增例如7、8、9、10、或11天。在该实例中提供了示例性TM过程，作为用于从d9对照组制造CAR细胞的方法。
方法
在一些实施例中，在此提供的活化过程以冷冻的或新鲜的白细胞单采产物开始。在获得用于计数和QC的样品之后，将产品与细胞分选机(例如，安装的
Figure BDA0002952123060002402
装置试剂盒)附接并且开始程序。将细胞洗涤并与所希望的表面标志物或标志物(例如CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22、和/或CD56)结合的微珠孵育。通过使细胞通过磁柱来选择珠标记的细胞。如果希望，可以通过将阴性部分与结合第二组表面标志物(例如CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22、和/或CD56)的珠孵育来进一步分离细胞，并再次使细胞通过磁分离柱。将分离的细胞再次洗涤，并将分离缓冲液交换为细胞培养基。然后将纯化的细胞进行培养或冷冻保存以备后用。可以将冷冻保存的细胞解冻，在预热的细胞培养基中洗涤，并重悬浮于细胞培养基中。可以直接将新鲜的细胞添加至培养物中。将细胞按0.4-1.2e6个细胞/cm2的膜接种到膜生物反应器中，添加活化试剂，例如抗CD3/抗CD28珠/聚合物、纳米颗粒、或纳米胶体(和/或单独的或组合的以下任何共活化剂：刺激ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、或CD226的试剂)，并且将细胞培养基添加至最终体积为0.25-2ml/cm2的膜中。将编码CAR的载体(例如慢病毒载体)立即添加或在培养开始后18小时添加。在培养开始后，将细胞与上述载体和活化试剂一起孵育总共24小时。一旦培养已经进行了24小时，通过旋转或移液或以其他方式搅动将细胞重悬浮，并用适当的缓冲液溶解模拟试剂支架。洗涤细胞以去除不需要的试剂，并在冷冻保存培养基中重新配制。将细胞冷冻保存直至需要进行施用。
对于与图6A-6C相关的研究，使用以下方案。
使用自动化的淋巴分离液(ficoll)(Sepax 2，百思福生物公司(BioSafe))，从新鲜1/4的leukopack中纯化细胞以产生外周血单核细胞(PBMC)。使用免疫磁性阴性选择(泛T阴性选择试剂盒，美天旎公司)进一步纯化这些PBMC，以产生高纯度(98％-100％)的CD3 T细胞。将这些细胞与OpTmizerTM(赛默公司(Thermo))完全培养基(按每个包装插入物配制并补充有100IU/ml的IL-2(阿地白介素，普罗米修斯公司(Prometheus))置于培养基中，并且在膜生物反应器中抗CD3/CD28活化试剂呈推荐的剂量(TransAct，美天旎公司)。然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育12小时以进行活化。从培养箱中取出细胞，并以2.5tu/细胞的感染复数(MOI)将新鲜解冻的慢病毒载体添加到培养物中。将细胞返回培养箱中用于另外转导12小时。收获细胞，用培养基洗涤两次，并直接配制到无菌PBS(英杰公司(Invitrogen))中，并通过尾静脉注射到NSG小鼠中。使用补充有10％胎牛血清(Seradigm公司)(完全培养基，又称为“R10”)和抗CD3/28Expander
Figure BDA0002952123060002421
(赛默公司(Thermo))按3个珠/T细胞的RPMI培养基(赛默公司)，使来自d9对照组的细胞在烧瓶(T25-T225，康宁公司(Corning))中生长。然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育24小时以进行活化。从培养箱中取出细胞，并以2.5tu/细胞的MOI将新鲜解冻的慢病毒载体添加到培养物中。将细胞放回培养箱中再培养7天，每2天分裂一次以维持5e5个细胞/ml的浓度。将扩增的细胞转移到50ml离心管(康宁公司(Corning))中，并使用静置磁体(Dynamag-50，赛默公司)进行两轮珠去除。然后用培养基将去珠后的细胞洗涤两次，并配制成CryoStor10冷冻培养基(干细胞技术公司(STEMCELLTechnologies))，使用冷冻细胞装置(CoolCell device)(百思顺生物公司(BioCision))冷冻保存，并在气相液氮中保持最少48小时。将细胞解冻成预热的R10培养基，用培养基洗涤两次，然后配制到无菌PBS(英杰公司)中，并通过尾静脉注射到NSG小鼠中。
在没有预处理的情况下，在CART注射前4天，按1e6个细胞/小鼠向6-8周龄NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJl，杰克逊实验室(Jackson Labs))注射荧光化的NALM6肿瘤细胞(ATCC CRL-3273，ATCC)。按2e6、5e5、或2e5个CAR+细胞/NSG或匹配剂量的未转导的扩增T细胞或PBS媒介物对照注射PBS配制的CART细胞。通过每周抽血，双周荧光素酶成像(Xenogen IVIS，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))和每两周体重测量来监测小鼠。监测所有动物的毒性迹象(体重减轻，垂死)并且如果有症状则实施安乐死。在研究终止时(第5周)对所有存活的小鼠实施安乐死，并获得末梢血液、骨髓和脾脏样品。根据IACUC和所有其他适用的指南进行研究。
结果
使用上述活化过程产生CART细胞，并在小鼠ALL模型中表征它们的体内的抗肿瘤活性。如图6A-6C所示，使用活化过程制造的CART细胞在体内显示出强的抗肿瘤活性。
实例3：IL6R在T细胞上的表达和细胞因子对T细胞扩增的影响
材料和方法
T细胞培养
将先前冷冻的T细胞解冻，并在第0天在指定的细胞因子的存在下与αCD3/αCD28dynal珠接触(细胞与珠的比率为1比3)。自第3天，在第3、5、6、9、12、15、和18天，将T细胞生长培养基(RPMI1640、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mMHepes、55μMβ-巯基乙醇、10％FBS、和100U/ml的青霉素-链霉素)多于两次添加至具有指定的细胞因子(不含细胞因子、rhIL2(50IU/ml，诺华公司(Novartis))、IL6(10ng/ml、R&D系统)、IL7(10ng/ml、派普泰克公司(Peprotech))、IL15(10ng/ml，派普泰克公司)、和IL21(10ng/ml，派普泰克公司))的板中。将未用细胞因子，IL6或IL21处理的细胞培养直至第18天，并将用IL2、IL7或IL15处理的细胞培养直至第25天。
Cell表面染色
在指定的时间点处收获细胞，并然后用活/死染料(eFluro780，eBioscience公司)、CD3(生物传奇公司(BioLegend)，克隆号：OKT3)、CD4(生物传奇公司，克隆号：OKT4)、CD8(BD生物科学公司(BD Bioscience)，克隆号：RPA-T8)、CD45RO(生物传奇公司，克隆号：UCHL1)、CCR7(生物传奇公司，克隆号：G043H7)、CD27(BD Horizon公司，克隆号：L128)、CD127(生物传奇公司，克隆号：A019D5)、CD57(生物传奇公司，克隆号：HCD57)、CD126(生物传奇公司，克隆号：UV4)、和CD130(R&D系统公司，克隆号：28126)抗体染色。通过FACSFortessa获得细胞，并然后使用FlowJo程序进行数据分析。
细胞内细胞因子染色
为检验产生细胞因子的细胞的百分比，在第25天，收获T细胞，并然后在布雷菲德菌素A(生物传奇公司)的存在下在37℃下在培养箱中用PMA(50ng/ml，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和离子霉素(1μM，西格玛-奥德里奇公司)短暂活化4小时。然后用活/死染料(eFluro780，eBioscience公司)、CD3(生物传奇公司，克隆号：OKT3)、CD4(生物传奇公司，克隆号：OKT4)、CD8(BD生物科学公司(BD Bioscience)，克隆号：RPA-T8)抗体对T细胞染色，随后固定并透化。然后，用针对IFN-γ(生物传奇公司，克隆号：4S.B3)、IL-2(生物传奇公司，MQ1-17H12)、和TNF-a(生物传奇公司，Mab11)的抗体对T细胞进一步染色。通过FACSFortessa获得细胞，并然后使用FlowJo程序进行数据分析。
结果
IL6Rα和/或IL6Rβ表达细胞富集在CD4和CD8 T细胞二者的分化程度较低的T细胞亚群中。如图7A和7B所示，与相应的记忆T细胞相比，初始CD4和CD8 T细胞表达更高水平的IL6Rα和IL6Rβ。表达IL6Rα和IL6Rβ二者的T细胞主要是CD45RA+CD45RO-CD27+CD28+细胞(图8A和8B)。在TCR刺激后，IL6Rα而非IL6Rβ表达被下调(图11)。
接下来，比较不同细胞因子对T细胞扩增的影响。在所测试的细胞因子中，IL15、IL2、和IL7增强T细胞扩增，其中IL15显示出最大的增强(图12)。细胞因子治疗不影响细胞大小(图13A)或生活力(图13B)。IL15治疗还增强表达IL6Rβ的细胞的扩增(图14)。表达IL6Rβ的细胞在TCR结合后第15天主要在CD4和CD8二者的CD27+(图16)或CD57-(图17)T细胞亚群中，并在TCR活化后在第25天产生IL2、IFNγ、和TNFα细胞因子(图18)。
实例4：产生具有TCR刺激的CART用于临床前研究
用于临床前研究的第0天的单元操作开始于第0天使用的以下培养基的制造：快速缓冲液(Rapid Buffer)和快速培养基(表21)。快速缓冲液(RB)包含具有0.5％HSA的
Figure BDA0002952123060002441
缓冲液(美天旎公司)。快速培养基(表21)在制造的第0天配制，并且基础培养基包含现成的培养基(称为OpTmizerTM)，该培养基具有Glutamax、IL-2、CTSTM补充物、和ICSR。
Figure BDA0002952123060002451
仪在第0天启动用于使用。
表21：在CART制造过程中培养基类型和使用时间点
Figure BDA0002952123060002452
当
Figure BDA0002952123060002453
仪在第0天启动时，将健康供体的白细胞单采材料解冻，并且将单采材料合并到600-mL转移袋中，随后可接合到
Figure BDA0002952123060002454
上。从600mL转移袋中提取IPC样品，并通过NC200测量以获得活细胞计数和起始单采材料的生活力百分比。在完成
Figure BDA0002952123060002455
的启动后，将单采材料转移至应用袋中。在启动TCT程序后，在单采进入
Figure BDA0002952123060002456
仪后，该程序从3小时45分钟运行到4小时15分钟，具体取决于进行的阳性选择分离的数量。在第0天，TCT程序用快速缓冲液冲洗森切卡特公司(Centricult)的DMSO，进行血小板洗涤，体积减少，将单采与森切卡特公司的CD4和CD8微珠孵育，并然后通过阳性选择，使用
Figure BDA0002952123060002457
上的磁体，用微珠选择T细胞。用CD4和CD8试剂选择的T细胞用快速培养基洗脱到再应用袋中。从再应用袋中取出过程控制(IPC)样品，以确定可用于在培养容器(G-Rex500MCS)中接种的总活细胞数。
首先用快速培养基启动G-Rex培养装置，并然后将来自再应用袋的靶细胞体积添加到培养容器中。然后将活化试剂(TransACT)添加至培养容器中。在引入TransACT后，然后将慢病毒载体添加至培养容器中，并使用MOI为1.0进行载体添加。然后用快速培养基冲洗G-Rex500MCS培养容器至最终的培养基体积为250mL加上载体添加量的体积。然后将G-Rex培养容器置于培养箱中以使培养物孵育目标范围为20-28小时的24小时。
在目标孵育24小时后，将CART培养物从培养箱中取出，并在收获洗涤之前提取样品以获得活细胞计数和细胞培养物的生活力。在收获前取出的样品是IPC，并被用作进入LOVO洗涤装置中的输入，以确定细胞进入旋转过滤膜的流速。LOVO使用活的WBC浓度作为IPC。用于CART制造过程的程序被描述为用一种溶液洗涤4次并使用收获缓冲液(PBS+2.0％HSA)。在LOVO洗涤期间，将IPC袋用于减少体积并用收获缓冲液洗涤细胞，最后将其洗脱到输出袋中。然后对来自LOVO洗涤液的输出袋取样以获得活细胞计数和生活力，以便用sanisure瓶进行手动离心，并用冷冻缓冲液进行最终配制的最终步骤。
实例5：使用活化快速制造(ARM)过程产生BCMA CART
概述
该实例描述了CART制造过程(称为“活化快速制造(ARM)”)。在一些实施例中，将细胞(例如T细胞)在包含培养基(例如无血清培养基，例如OpTmizerTM培养基)、重组人IL-2(例如含有OpTmizerTM补充物、GlutaMAX和100IU/ml的IL-2的OpTmizerTM培养基)、抗CD3/抗CD28(例如TransAct)和编码BCMA CAR的载体(例如慢病毒载体)的细胞培养装置中培养。24小时后，将细胞(被称为“第1天CART产物”)收获、取样、并配制。不希望受理论束缚，例如使用抗CD3/抗CD28(例如TransAct)，简短的CD3和CD28活化促进自我更新T细胞的有效转导。在一些情况下，在培养后48小时、72小时和96小时或7天收获一些细胞用于测量体外BCMACAR表达动力学。第1天CART反应包括但不限于，体内细胞溶解活性和扩增。
使用ARM过程产生第1天BCMA CART
在一些实施例中，在此提供的活化过程以冷冻的或新鲜的白细胞单采产物开始。在获得用于计数和QC的样品之后，将产品与细胞分选机(例如，安装的
Figure BDA0002952123060002461
装置试剂盒)附接并且开始程序。将细胞洗涤并与微珠一起孵育，这些微珠结合所希望的表面标志物(例如CD4和CD8)。通过使细胞通过磁柱来选择珠标记的细胞。将分离的细胞再次洗涤，并将分离缓冲液交换为细胞培养基。然后将纯化的T细胞进行培养或冷冻保存以备后用。通过流式细胞术评估，分离的T细胞的纯度将通过QC步骤。可以将冷冻保存的细胞解冻，在预热的细胞培养基中洗涤，并重悬浮于细胞培养基中。可以直接将新鲜的细胞添加至培养物中。将细胞按0.4-1.2e6个细胞/cm2的膜接种到膜生物反应器上，添加活化试剂(例如抗CD3/抗CD28珠/聚合物、纳米颗粒、或纳米胶体，并且将细胞培养基添加至最终体积为0.25-2ml/cm2的膜中。在铺板时，按不同的感染复数(MOI)将细胞用编码BCMA CAR的慢病毒载体转导。基于细胞系(例如SupT1)测量滴度和MOI。在24小时，在染色之前将细胞洗涤以去除不需要的试剂，从而通过流式细胞术测量CAR表达并在冷冻保存培养基中重新配制为用于体内研究的“第1天CART产物”。
在该实施例中描述了使用ARM过程制造的表达BCMA CAR R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、或Hy03的T细胞的产生和表征。R1B6、R1F2、和R1G5的序列披露于表3-6中。PI61、B61-02、和B61-10的序列披露于表7-11中。Hy03的序列披露于表12-15中。
在使用编码BCMA CAR的慢病毒载体按MOI为2.5转导T细胞后24小时，使用rBCMA_Fc通过流式细胞术测量CAR的表达。如图19A所示，观察到活的CD3+ T细胞的整个群体以不同程度向右移动。转导以表达R1G5、R1B6或PI61的细胞显示出最高的CAR表达(图19A)。如通过流式细胞术测量的表达模式不同于转导表达CAR的细胞的典型流式细胞术直方图，其中CAR阳性群体与阴性群体明显分离。图19A表明通过rBCMA_Fc检测到可能存在“假转导或瞬时表达”，并不总是表示真实的基因表达。先前已经报道，在载体添加开始时观察到慢病毒假转导，并且在CD34+细胞中持续长达24小时，并且在293细胞中持续长达72小时(Haas DL,等人Mol Ther.[分子疗法]2000.291:71-80)。整合酶缺陷型慢病毒载体在CD34+细胞中引起瞬时eGFP表达持续长达10天，并且在293细胞中持续长达14天。尽管在T细胞中尚未广泛研究慢病毒假转导，但不能排除在如此短的时间内瞬时表达的这种可能性。因此，进行体外动力学研究以测量使用如下指定的ARM制造的细胞的CAR表达。
使用ARM过程制造的细胞的体外CAR表达动力学研究
在此描述的研究检验了使用ARM过程制造的细胞如何随时间表达CAR分子。简言之，使用ARM过程按MOI为1，制造来自健康供体的T细胞以表达BCMA CAR，并且在培养基中保持不同的时间段，并且通过流式细胞术，使用AF647标记的rBCMA_Fc，在24小时、48小时、72小时、96小时和第7天收获用于评估CAR表达动力学。了解CAR表达动力学有助于发现用于体内分类或临床给药策略的真实和稳定表达的替代时间点。
在第1天，按MOI为1转导的细胞的CAR表达模式(图20A)类似于按MOI为2.5转导的细胞的CAR表达模式(图19A)。两种MOI条件显示出在第1天假表达模式或瞬时表达模式(图19A和20A)。然而，在第2天，rBCMA_Fc阳性群体开始与UTD阴性对照组分离(图20A)。在第3和4天，代表表达BCMA CAR的细胞并且在UTD组中缺失的rBCMA_Fc阳性群体清楚地显示在转导细胞以表达BCMA CAR的所有组中。从第3天至第4天，CAR+％对于每种CAR构建体是相对稳定的(图20B)，其中在第3天观察到最高的MFI(图20C)(细胞在该时间点处是最大的)。与图19A中所示的数据一致，被转导以表达PI61、R1G5和R1B6的细胞是最高的CAR表达者(图20A)。值得注意的是，用编码R1F2或Hy03的载体转导的细胞在第1天未显示瞬时CAR表达，但在第3天和第4天后明显表达BCMA CAR分子(图20A)。总之，编码不同CAR的载体可能随时间具有不同的CAR表达动力学，并且选择第3天作为CAR表达的替代时间点。
评估第1天在体内ARM加工的BCMA CART的功能性
使用散播的KMS-11-luc多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型检验第1天CART在体内的抗肿瘤活性。荧光素酶报告基因允许通过定量生物发光成像(BLI)监测疾病负担。简言之，如上所述制造的第1天CART被施用携带肿瘤的小鼠。在第一次体内研究中(图21A和21B)，每只小鼠接受按1.5E6个细胞剂量的最终CART产物。在第1天和第7天分析CAR表达(图21A)。在体内功效研究中，表达PI61、R1G5或R1B6的细胞显示出有效的抗肿瘤活性(图21B)。表达R1F2的细胞显示出延迟的功效(图21B)。在CART注射后14天，UTD组也显示出部分抗肿瘤活性，这可能是由于同种异体反应(图21B)。第二个体内研究测试了CAR+ T细胞的剂量调整。CAR+ T细胞的剂量基于第3天的CAR+％(图22A)。通过BLI测量每周两次监测肿瘤摄入动力学。图22A显示在第1天和第3天检测的CAR表达。如图22B所示，体内结果表明在1.5e5个CAR+T细胞和5e4个CAR+ T细胞的两种剂量下，所有三个克隆PI61、R1B6和R1G5都能够排斥和清除肿瘤。图22C显示了在该研究过程中体重变化，未显示GVHD的迹象。
实例6：在12-24小时之间收获的快速CART的动力学
介绍
为确定是否可以在不到24小时内产生快速CART产物，表征了培养12-24小时后用于产生快速CART的动力学。使用从冷冻保存的健康供体单采中富集的T细胞，并且在接种时同时添加TransAct活化试剂和技术级CTL019载体，按小规模进行该评估。初步读数是新鲜收获的CART产品的生活力、扩增后活细胞回收、白细胞和T细胞亚群组成以及转导效率(如通过表面免疫表型分析测定)。
方法
慢病毒产生和滴度测定：用基于HEK293T的qPCR滴度为4.7×107TU/mL和基于近似的T细胞的滴度为1.88×107TU/mL制备编码CTL019的慢病毒载体。
T细胞分离：从Hemacare获得健康供体单采的冷冻保存的leukopak(LKPK)并储存在液氮中直至需要。在第0天，将单采解冻直至保留小的冰晶，然后用
Figure BDA0002952123060002491
加工的缓冲液稀释。然后在具有TS 520管组和T细胞转导(TCT)程序软件版本1.0的
Figure BDA0002952123060002492
上进行自动化的CD4/CD8阳性选择。将最终的
Figure BDA0002952123060002493
产物在OpTmizerTM完全T细胞培养基中洗脱，并且通过如由Cellometer Vision(Nexcelom公司)枚举的AO/PI染色测定细胞浓度和生活力。
培养起始和转导：将来自
Figure BDA0002952123060002501
产物的细胞立即接种到总共七个容器中：用于转导培养物的五个容器和用于未转导(UTD)培养物的两个容器。在时间点0处，将每个容器按0.6×106个活细胞/cm2膜的密度接种，加上GMP级TransAct，并用含有IL-2的OpTmizerTM完全T细胞培养基达到终浓度为1.2×106个活细胞/mL。将载体在室温下解冻，并基于近似的T细胞滴度按MOI为0.45添加到每种转导的培养物中。UTD对照中没有添加病毒。一旦接种，将培养物在37℃和5％CO2下孵育直至准备收获。
收获：培养开始后，在12至24小时的每个时间点处选择一种转导的培养物用于收获。通过旋转容器收获细胞以将细胞轻轻地从膜上重悬，然后将完整的培养物体积重悬浮并通过血清学移液管转移至锥形管。取少量等分试样用于进行预洗涤计数、生活力测定和流动染色。将每种培养物的剩余部分在50mL中洗涤两次(针对UTD容器，在100mL中洗涤两次)，重悬浮，并在洗涤后取等分试样以检查计数和生活力。
CART制造过程中的白细胞组成的流式细胞术和CD19-CAR表达：在适用的情况下，对培养之前和之后的过程中针对白细胞组成、T细胞表型和CAR表达的对样品进行染色。使用常规有序的荧光团标记的抗独特型抗体(eBioscience公司)评估转导的T细胞上的CTL019-CAR表达。在每个收获的时间点处，立即用活力染料(生物传奇公司(Biolegend))对培养物的等分试样进行染色，洗涤，然后用含有CD3染色和抗独特型抗体的两个流动板染色，并固定在多聚甲醛中用于获取。在流式细胞仪(BD LSRFortessa；将单色对照用于补偿)上测量样品，并用FlowJo软件分析数据。为了分析，将针对白细胞组成染色的所有样品都在活的CD45+单重态事件上预先门控，并且将针对T细胞亚群染色的所有样品都在活CD3+单重态事件上预先门控。使用荧光减一(FMO)对照建立CD45RO和CCR7的门控。
结果
在第0天和每个收获时间点处，使用流式细胞术表征在培养前LKPK，
Figure BDA0002952123060002511
产物以及培养后的CART产物的白细胞组成。鉴定的细胞类型是T细胞(CD3+)、单核细胞(CD14+)、B细胞(CD19+)、天然杀伤(NK)细胞(CD3-56+)和其他细胞(表22)。
Figure BDA0002952123060002512
富集产生第0天高度存活的(92.9％)的起始材料，并且富集T细胞(从48％至92％)，同时减少污染B细胞(6％至0.10％)，并将单核细胞和NK细胞各自降至4％以下。培养12-24小时后，活细胞的纯度另外增加3％-4.4％，与12小时后单核细胞和B细胞的立即减少以及在12小时和24小时之间的NK细胞逐渐减少相对应。在通过流式细胞术表达细胞外CAR的白细胞中，少于3％的是污染的细胞(即，不是T细胞)，其中在接种后15和18小时之间发生CAR纯度的最大跳跃(96.6％至99.2％)。
表22：CART产物的总白细胞组成
Figure BDA0002952123060002513
在培养18小时后表达CAR的细胞的纯度增加(表22)与具有CAR表面表达的T细胞百分比的增加同时发生(图23A和23C)。如先前在培养24小时后通过流式细胞术评估的快速CART产物所观察到的(参见实例5)，CAR表面表达不会形成明显的阳性和阴性群体。因此，使用UTD样品作为下限建立了对CAR阳性的门控。表达细胞外CAR的CD3+细胞的比例在接种后15小时仍然低于1％；并然后CAR表达每3小时增加3％-4％，至最大为11.8％而没有饱和(图23A)。如通过MFI测定的CAR表达强度在培养中也略微增加>18小时，但在24小时内保持暗淡(图23B)。
使用CD4、CD8、CD45RO、和CCR7的组合，在每个时间点处还评估了T细胞亚群(CD4:CD8比率和记忆亚群组成)(图24A和24B)；其中未分化的初始样T细胞被定义为CCR7+CD45RO-；中枢记忆细胞被定义为CCR7+CD45RO+；效应记忆细胞被定义为CCR7-CD45RO+；并且高度分化的效应T细胞被定义为CCR7-CD45RO-。在评估的所有时间点(包括UTD)中，与初始起始材料(分别为23％和52％)相比，培养物含有较大比例的初始细胞(40％-47％)和较低比例的中枢记忆细胞(33％-39％)。有趣的是，尽管在总组成中初始或中枢记忆T细胞的频率在12至24小时之间没有变化，之后的收获与更高频率的细胞外表达CAR的初始细胞和更低频率的细胞外表达CAR的中枢记忆细胞相关(在18小时，表达CAR的细胞中16％初始/63％中枢记忆相比在24小时时，表达CAR的细胞中24％初始/54％中枢记忆)。类似地，当总CD4:CD8比率没有显著变化时，CAR+细胞的CD4部分在18-24小时之间下降了10％(66％至56％)。将这些频率转换为总细胞数(图25)显示，最早表达CAR的T细胞亚群大多是在培养15-18小时之间的初始CD4细胞；然后初始CD8 CAR和中枢记忆CD8 CAR频率迅速增加。
在每个收获时间点处测定活细胞回收率(或倍数扩增)以及洗涤前和洗涤后的生活力(图26和27)。活细胞的回收率在接种后18小时降低13％(最低46％，与细胞外CAR表达的增加速率一致)，然后在之后的时间点处收获的培养物略微增加至52％(图26)。洗涤后产物生活力增加至71％-77％，其中生活力在15-24小时之间降低(图27)。
结论
在12-24小时之间测试的时间点中，与TransAct和技术级CTL019载体同时接种的快速CART显示24小时处的最高CAR表面表达。极少数细胞是CAR+(如在收获时测量)直到接种后15小时，之后％CAR增加得更快。CAR表达的强度是暗淡的，但在接种后18小时后缓慢增加。
由于前12小时内单核细胞损失，在接种后快速CART产品在12至24小时内的所有点处都变得比起始材料更纯(更高％T细胞)，随后NK细胞轻微损失并且通过
Figure BDA0002952123060002531
富集去除任何残留B细胞。
尽管在接种后18小时收获时总细胞回收率最低(24小时略微改善)，但整个T细胞组成在接种后12和24小时之间没有变化。首先表达细胞外CAR的T细胞在接种后15和18小时之间主要是中枢记忆CD4，然后初始和中枢记忆CD8显示CAR表达。
实例7：活化快速制造(ARM)过程的说明
在一些实施例中，使用连续活化快速制造(ARM)过程超过近似2天制造CART细胞，这将潜在地允许更多数量的较低分化的T细胞(T初始和TSCM(干细胞中枢记忆T)细胞)返回患者用于进行体内细胞扩增。较短的制造时间允许早期分化的T细胞特征在体内增殖以达到其所希望的末端分化状态，而不是在离体培养容器中。
在一些实施例中，使用冷冻保存的白细胞单采来源材料(例如非动员的自体同源外周血白细胞单采(LKPK)材料)制造CART细胞。冷冻保存的来源材料通过抗CD4/抗CD8免疫磁系统在生产的第一天(第0天)经历T细胞富集的加工步骤。然后将阳性部分接种在G-rex培养容器中，用抗CD3/CD28系统(TransACT)活化，并在同一天用编码CAR的慢病毒载体(LV)转导。在第二天，在转导20-28小时后，收获T细胞，洗涤四次，在冷冻培养基中配制，并然后通过控速冷冻仪(Controlled Rate Freezer(CRF))冷冻。从第0天的过程开始到第二天收获开始，在第0天接种后用目标为24小时将细胞培养20-28小时。
根据表21制备第0天的培养基。将冷冻保存的白细胞单采材料解冻。用快速缓冲液稀释解冻细胞(表21)，并在
Figure BDA0002952123060002532
装置上洗涤。通过
Figure BDA0002952123060002533
CD4和CD8微珠选择T细胞。一旦程序完成T细胞选择(大约3小时40分钟至4小时40分钟)，将包含悬浮在快速培养基中的细胞的再应用袋转移到转移包中(表21)。获取样品用于生活力和细胞计数。将来自阳性部分袋的细胞计数和生活力数据用于确定当接种培养容器用于活化和载体转导时的细胞浓度。
在通过
Figure BDA0002952123060002541
微珠(CD4和CD8)阳性选择T细胞后，将细胞接种在培养容器G-Rex中。一旦接种细胞，然后将活化试剂(TransACT)添加至培养容器中。在目标MOI为1.0(0.8-1.2)时，然后用编码CAR的慢病毒载体转导细胞。载体添加后，将培养容器转移至培养箱中，在标称温度为37℃(操作范围36℃-38℃)，其中标称5％CO2(操作范围4.5％-5.5％)下降培养容器孵育目标为24小时(操作范围20-28小时)。孵育后，将细胞用收获洗涤溶液(表21)洗涤四次，以去除任何未整合的载体和残留的病毒颗粒，以及任何其他与过程相关的杂质。然后，将细胞洗脱下来，并且取出用于细胞计数和生活力的样品用于测试，并且将结果用于确定重悬浮细胞用于与
Figure BDA0002952123060002542
CS10最终配制品中需要的体积。然后将细胞离心以去除收获洗涤溶液并进行冷冻保存。
在一些实施例中，在CART细胞中表达的CAR结合CD19。在一些实施例中，快速培养基(RM)中使用的IL-2(表21)可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。
在一些实施例中，在CART细胞中表达的CAR结合BCMA。在一些实施例中，快速培养基(RM)中使用的IL-2(表21)可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。
实例8：使用活化快速制造(ARM)过程制造的CD19 CART细胞的表征
本文披露了使用活化快速制造(ARM)过程制造的抗CD19 CAR-T细胞产物。与传统制造(TM)过程相比，ARM过程缩短了周转时间，前瞻性地允许向患者及时输注抗CD19 CAR-T细胞产物。此外，ARM过程还保留了推定的干细胞记忆T(T干细胞)细胞(一种与改善的抗肿瘤功效相关的细胞亚群)。制造的主要区别在于TM过程包括扩增阶段，其中抗CD19 CAR T细胞在配制前与白介素(IL-)2在体外培养9天，该ARM过程仅允许24小时培养后配制。这可以通过使用与单克隆抗体(mAb)偶联的完全生物相容性纳米基质来实现，这些单克隆抗体具有针对CD3和CD28的激动剂活性(与TM过程中使用的CD3/CD28顺磁珠不同)可以在转导后立刻用残留的慢病毒载体洗掉。来自异种移植小鼠模型的结果，以及T干细胞的最终产物富集，与增加的持久性和长期抗肿瘤作用相关的亚群表明如与使用TM过程制造的抗CD19 CAR T细胞相比，使用ARM过程制造的抗CD19 CAR T细胞的整体改善的治疗潜力。由异种移植小鼠模型揭示的另一个重要差异是与使用TM过程制造的对应物相比，使用ARM过程制造的抗CD19 CART细胞的潜在延迟细胞动力学扩增大约一周。这种延迟被估计为大约1周，这使得如使用TM过程制造的抗CD19 CAR T细胞，用于仔细监测3周的潜在毒性的窗口相应延长至4周。相反，来自体外细胞因子释放模型的非临床安全性数据表明，使用ARM过程制造的抗CD19 CAR T细胞和使用TM过程制造的那些细胞可能具有在体内诱导IL-6产生的相似潜力，并因此携带类似的细胞因子释放综合征(CRS)风险。基于这一证据，使用ARM过程制造的抗CD19 CAR T细胞将在患有晚期小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)/慢性淋巴细胞白血病(CLL)与布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)，依鲁替尼(Imbruvica)(一种在该适应症中已经批准的药物，并且作为DLBCL中的单一药物)组合治疗的I期开放标签临床研究中进行研究。
产生和体外分析
为在临床规模上测试抗CD19 CAR T细胞制造的ARM过程，将冷冻的健康供体白细胞单采产物(Leukopak，LKPK)用作起始材料，如图28A所述作为代表性实例。LKPK包含37％T细胞、4％NK细胞、37％单核细胞和15％B细胞(图28A)。解冻后，使用抗CD4和抗CD8微珠阳性选择T细胞。在阳性T细胞选择后产物的组成是95.4％T细胞、1.9％NK细胞、1.7％单核细胞、和0.1％B细胞(图28A)。
使用与抗CD3和抗CD28激动剂单克隆抗体缀合的聚合物纳米基质活化阳性选择的T细胞，并用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体转导。培养24小时后，收获细胞并冷冻保存(在该实例中，此类细胞被称为“ARM-CD19 CAR”)。并行地，使用相同的供体T细胞和慢病毒载体，用传统制造(TM)过程产生CAR-T细胞(在该实例中此类细胞被称为“TM-CD19 CAR”)。TM过程利用与抗CD3和抗CD28抗体偶联的顺磁珠和在组织培养烧瓶中的9天培养期，然后进行相同的收获和冷冻程序。通过流式细胞术分析每个过程产生的CAR-T细胞，以评估解冻后的CAR表达，以及T细胞表型(图28B-28D)。对T细胞表型的分析显示，ARM过程在CD8和CD4区室中保留了初始样T细胞(45.1％CD45RO-/CCR7+)，而TM过程主要产生中枢记忆T(TCM)细胞(与针对ARM-CD19 CAR的43.6％相比，68.6％CD45RO+/CCR7+)(图28C和28D)。重要的是，与TM过程相比，ARM过程更好地维持了原始初始样CD45RO-/CCR7+ T-细胞群体，同样在CAR+群体(起始材料中28.6％，对于ARM-CD19 CAR为37.5％，并且对于TM-CD19 CAR为4.5％)(图28C和28D)。该T细胞群体与由Fraietta,等人(2018)Nat Med[自然医学],24(5)；563-571描述的CD45RO-/CD27+ T干细胞大部分重叠；并且与CLL I期临床试验中的持续缓解相关联。
除了其表型外，还评估了最终的ARM-CD19 CAR细胞产物的体外功能。将ARM-CD19CAR和TM-CD19 CAR解冻，并与表达CD19的细胞系NALM6(ALL)或TMD-8(DLBCL)共培养。共培养48小时后上清液中细胞因子水平的比较显示，取决于刺激性癌细胞(NALM6或TMD-8，图29A和29C)，如与TM-CD19 CAR相比，由ARM-CD19 CAR分泌的IFN-γ水平增加11至17倍，并且由ARM-CD19 CAR分泌的IL-2水平增加3.5至10倍。用经历ARM或TM过程的未转导的(UTD)细胞(图29C)或用CD19-阴性NALM6(NALM6-19KO)靶细胞(图29D)的实验证实了由ARM-CD19CAR和TM-CD19 CAR的CD19特异性识别。在不存在CD19特异性刺激的情况下，由ARM-UTD和ARM-CD19 CAR的IFN-γ分泌的较高背景(分别为图29A和29B)可能是由于这些产物的活化性质。该背景分泌减少了48小时的共培养(图29B和29D)。在与靶细胞共培养的第一个24小时后，进行细胞的中间洗涤，然后再共培养24小时(24小时+24小时)，进一步增强了背景和CD19特异性细胞因子分泌之间的差异。这24小时+24小时的情况突出显示了由ARM-CD19CAR分泌的背景IFN-γ在最初的24小时后消失。
总之，用于产生ARM-CD19 CAR的ARM过程产生具有与TM-CD19 CAR相似或更高的CAR表达的T细胞。重要的是，ARM过程保持与输入材料类似的T细胞表型。ARM-CD19 CAR在体外表现出CD19特异性活化，并且如与TM-CD19 CAR相比分泌更高水平的IL-2，与其T干细胞表型相关。
体内功效
将体内功效研究用于指导ARM过程的发展，最终导致将该过程用于临床抗CD19CAR T细胞制造。对于此处描述的实验，在临床规模上产生ARM-CD19 CAR。并行地，使用相同的慢病毒载体和来自相同供体的T细胞产生TM-CD19 CAR。在免疫缺陷型NSG小鼠(NOD-scidIL2Rg-null)中评估使用不同的过程产生的CAR-T细胞的功效，该小鼠用B ALL细胞系NALM6接种。这种肿瘤细胞系在骨髓中移植，但在肿瘤负荷高的情况下还可以在循环中检测到。白血病接种后7天，小鼠组接受单次输注CAR+ T细胞(图30A)。在第0天，基于TM-CD19 CAR和ARM-CD19 CAR的解冻后流分析确定0.2×106、0.5×106和2×106个活的CAR+ T细胞的计划剂量。
由于担心在第0天解冻后ARM-CD19 CAR的假转导，将哨兵小瓶(sentinel vial)解冻并培养长达5天，并在不同的时间点通过流式细胞术分析CAR表达(百分比和平均荧光强度)(图30B)。如与第0天解冻后样品相比，之后时间点处的阳性细胞百分比较低。同时，每个细胞的CAR平均荧光强较高，反映了稳定转导的CAR-T细胞。将第3天的测量用于确定ARM-CD19 CAR的实际剂量，该剂量被测定为0.1×106、0.25×106和1×106个活的CAR+ T细胞。TM-CD19 CAR剂量保持不变(0.2×106、0.5×106和2×106个活的CAR+ T细胞)，因为解冻后样品的流分析在静息的、完全整合的CART细胞上进行。
ARM-CD19 CAR和TM-CD19 CAR均以剂量依赖性方式诱导肿瘤消退(图30C)。用0.5×106或2×106个TM-CD19 CAR细胞或0.25×106或1×106个ARM-CD19 CAR细胞处理的小鼠经历可持久的肿瘤消退。有趣的是，在所测试的相应最低剂量(0.2×106个TM-CD19 CAR细胞或0.1×106个ARM-CD19 CAR细胞)中，对TM-CD19 CAR反应不持续，并且所有小鼠最终在初始部分白血病控制后复发。相反，在最低剂量(0.1x106个)ARM-CD19 CAR处理的小鼠显示肿瘤负荷的稳定下降，持续到研究结束。肿瘤消退的动力学表明ARM-CD19 CAR的延迟活化约1周，表明T干细胞需要增殖并分化成效应细胞以便于发挥其抗肿瘤活性。
用通过两种制造过程产生的CAR-T细胞和UTD细胞处理的小鼠被每周放血两次以测量细胞因子水平(图31A-31D)。输注了CAR-T细胞(ARM-CD19 CAR或TM-CD19 CAR)的小鼠中循环IFN-γ水平显示出双相模式(图31A)。在CAR-T细胞输注后4-7天观察到早期IFN-γ峰，并且可能与肿瘤识别后的CD19特异性活化有关，因为该峰在输注TM-UTD或ARM-UTD的小鼠中不明显(图31B)。早期CD19介导的活化通过体内IL-2水平的伴随升高来证实(图31C)，然而其在稍后的时间点减少。
体内细胞动力学
作为评估NSG小鼠中ARM-CD19 CAR的功效的药理学研究的一部分，在体内评估CAR+ T细胞的扩增(图32)。在输注后直至4周，通过流式细胞术分析血液中的CD3+/CAR+ T细胞浓度。可以推断CAR-T细胞扩增。然而，由于X-GVHD发作所限制的研究时间，无法评估长期持续性。在所有剂量下均观察到ARM-CD19 CAR和TM-CD19 CAR的细胞扩增，除了最低剂量为0.2×106个细胞的TM-CD19 CAR。暴露(细胞注射后21天内的Cmax和AUC)随着TM-CD19 CAR和ARM-CD19 CAR的剂量增加而增加。为比较在相同剂量水平的ARM-CD19 CAR与TM-CD19CAR的扩增，将TM-CD19 CAR的暴露插补相当剂量的ARM-CD19 CAR(0.25×106和1×106个细胞)。与剂量为0.25×106和1×106个细胞的TM-CD19 CAR相比，Cmax高24至46倍，并且AUC0-21d高18至33倍。与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19 CAR峰扩增(Tmax)的时间延迟至少1周。
总之，在体外评估ARM-CD19 CAR的药理学研究表明，ARM-CD19 CAR具有早期分化的表型，并且具有分泌更多IFN-γ和IL-2的潜力。在体内，如与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19CAR表现出延迟但更高的细胞扩增，诱导更多的IL-2分泌，并且在较低剂量下控制肿瘤生长。所讨论的ARM-CD19 CAR的其他特征，例如在较晚时间点血浆IFN-γ水平升高和X-GVHD的早期发生均见于ARM-CD19 CAR以及ARM-UTD，是在此使用的异种移植小鼠模型的潜在限制。总之，这些结果支持以下假设：ARM-CD19 CAR包含具有更多干细胞性特征的T细胞，使得ARM-CD19 CAR能够有效地植入、扩增和排斥肿瘤。
体外IL-6释放测定
用于体外研究CART细胞的IL-6诱导潜力的三方共培养模型首先由Norelli,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；739-748发表，并且在此应用了一些改编。该模型由CAR-T细胞、白血病靶细胞和旁观者THP-1单核细胞组成，作为骨髓细胞的来源，用于最大化IL-6产生。在该体外细胞模型中，通过与表达CD19的靶标和THP-1细胞共培养，单独的ARM-CD19 CAR或TM-CD19 CAR的IL-6分泌增加(图33A和33B)。重要的是，由ARM-CD19 CAR诱导的时间依赖性CD19特异性IL-6分泌可与TM-CD19 CAR诱导的分泌重叠。在相同的体外模型中，在ARM-CD19 CAR条件下的CD19特异性IFN-γ分泌比在TM-CD19 CAR条件下高10倍(数据未显示)。
概述
这些结果表明，如与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19 CAR可能具有更高的抗肿瘤潜力和类似的安全性特征。由按所测试的最低剂量和通过更高的体内细胞扩增中更好的肿瘤控制来推断更大的抗肿瘤潜力。然而，这样的计算可能低估了ARM-CD19 CAR的总体治疗潜力，因为这是在ALL模型(NALM6)中测定的，这种模型比CLL和DLBCL这两种疾病适应症(其中最初研究ARM-CD19 CAR)更具攻击性。特别地，在CLL中，体内CAR-T细胞扩增与肿瘤消退强烈相关(Mueller,等人(2017)Blood.[血液]130(21)；2317-2325；Fraietta,等人(2018)NatMed[自然医学],24(5)；563-571)，与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19 CAR的显著更高的增殖潜力(高达20倍)可能导致有意义的优越功效。
在小鼠中，与CAR介导的肿瘤消退相关联的、由ARM-CD19 CAR诱导的IFN-γ和IL-2的早期全身释放分别比由传统制造的CAR-T细胞诱导的IFN-γ和IL-2的早期全身释放高3倍和10倍。没有在体内研究IL-6水平，因为在该菌株中缺乏功能性骨髓细胞导致不能产生炎性细胞因子(Norelli,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；739-748；Giavridis,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；731-738)。为了避免这种情况并评估由ARM-CD19 CAR诱导的体内IL-6释放的可能性，采用体外三方共培养系统，其中添加旁观者单核细胞作为炎性细胞因子的来源(Norelli,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；739-748)。在该系统中，ARM-CD19 CAR与传统制造的CAR-T细胞之间的IL-6产生相似，表明CRS具有相似的风险。相反，ARM-CD19 CAR细胞扩增的延迟动力学将需要将CRS监测期从TM-CD19 CAR典型的3周延长至4周。用ARM-CD19 CAR的体外实验还揭示了在解冻后培养的前3天内通过ARM-CD19 CAR的瞬时、非CAR介导的IFN-γ和IL-2分泌的可能性。基于接受重组人IL-2(阿地白介素)和重组人IFN-γ(ACTIMMUNE)的患者的数据进行全面的风险评估，并考虑到ARM-CD19 CAR输注后的预计暴露，表明如这些患者所描述体质症状(发烧、寒战、红斑)的风险会非常低。为进一步降低这种风险，接受ARM-CD19 CAR的患者将在输注细胞产物后住院至少72小时。
最后，在非GLP兼容性毒理学研究中，当通过血液或淋巴器官免疫表型分析评估以及相关器官组织学评估时，与传统制造的CAR-T细胞和经历ARM过程的未转导的细胞相比，植入ARM-CD19 CAR的NSG小鼠没有出现意外行为。
实例9：使用ARM过程制造的BCMA CART细胞
方法
T细胞分离
从Hemacare获得健康供体单采血液成分术的新鲜leukopak，并储存在气相液氮(LN2)中直至需要。在第0天，从LN2中取出两个四分之一的leukopak，在Plasmatherm(博科公司(Barkey)，里奥波尔德绍赫
Figure BDA0002952123060002615
德国)中加热直至留下小的冰晶，并用
Figure BDA0002952123060002611
过程缓冲液稀释。然后在具有TS 520管组和T细胞转导(TCT)程序软件版本1.0的
Figure BDA0002952123060002612
上进行自动化的CD4/CD8阳性选择。通过由CellometerVision(Nexcelom公司，罗伦斯，马萨诸塞州)枚举的AO/PI染色测定每种
Figure BDA0002952123060002613
输出(产物、废物和非靶细胞)的细胞计数和生活力，以评估总细胞回收率和T细胞回收率。将CD4/CD8富集的产物在OpTmizerTM完全T细胞培养基中洗脱，并使用24小时或传统的9天过程(TM)分开用于进一步培养。将剩余的T细胞在LN罐中冷冻。通过流式细胞术分析评估T细胞纯度。
使用ARM过程产生CAR-T细胞
将由
Figure BDA0002952123060002614
纯化的T细胞接种到不同规格的容器中(例如板、烧瓶、G-REX管)或森切卡特公司(centricult)的完整临床量表。接种后，除了临床级慢病毒载体，添加TransAct(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))(一种与抗CD3和抗CD28激动剂缀合的聚合物纳米基质)。在收获和冷冻保存之前，将细胞在含有100IU/mL人重组IL-2(普罗米修斯公司(Prometheus)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、2％ICRS(生命技术公司(LifeTechnologies))的OpTmizerTM完全T细胞培养基中孵育24小时。
将等分试样的冷冻保存的CAR-T细胞解冻到预热的OpTmizerTM完全培养基中，在培养和流式细胞术分析之前用20倍体积的预热的培养基洗涤两次，用于在解冻后的不同时间点处评估BCMA-CAR表达和干细胞性特征。将等分试样的细胞产物与靶细胞系共培养以评估响应于特异性抗原刺激的细胞因子释放。
使用TM过程产生CAR-T细胞
将
Figure BDA0002952123060002621
加工的T细胞重悬浮于温热的RPMI完全T细胞培养基中，并铺板于24孔板中。在37℃下将T细胞与人T-Expander CD3/CD28珠按珠与细胞的3:1比率孵育过夜。
在第1天，基于SUP-T1滴度按MOI为2添加慢病毒。向未转导的对照(UTD)中没有添加病毒。将T细胞在37℃下孵育过夜，然后添加1mL完全T细胞培养基/孔，之后将它们在37℃下孵育过夜。对于培养扩增的剩余7天，将T细胞转移到组织培养烧瓶中，并每两天用完全T细胞培养基稀释。
在第8天至第9天之间，将T细胞去珠，收获并在CryoStor CS10冷冻培养基中冷冻保存，在-80℃下在酷赛细胞冷冻仪(CoolCell Cell Freezing Containers)(百思顺生物公司Biocision)中冷冻，并在第二天转移至LN2。将T细胞的小的等分试样染色用于CAR表达。包括单色控制以进行补偿。在流式细胞仪(BD LSRFortessa公司)上测量样品，并用FlowJo软件分析数据。
靶细胞系和培养物
用慢病毒萤火虫荧光素酶报告基因构建体转染Nalm6细胞以产生Nalm6-luc细胞系。使细胞在37℃，5％CO2下的培养箱中生长。在使用前将等分试样的细胞用于检测肿瘤抗原BCMA表达。
在体外细胞因子分泌测定
在96孔平底板中，通过将CAR-T细胞与靶细胞按2.5倍的E:T比率孵育20小时，评估响应于表达BCMA的靶细胞的抗BCMA CAR-T(被称为效应细胞)的细胞因子分泌。使用ARM或TM过程产生PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞的效应细胞。使用ARM过程制造的CART细胞被铺板持续24小时冲洗条件以使细胞静置并使非特异性活性最小化。靶细胞包括BCMA阳性KMS11-luc或BCMA阴性NALM6-luc。将这些靶细胞添加至新鲜铺板的T细胞中或来自24小时冲洗条件(仅ARM细胞)的T细胞中。对于该测定，通过向BCMA CAR-T中添加UTD来标准化CAR-T细胞的％转导。这允许比较每个样品中相同数量的CAR-T和相同的总T细胞数。从每个孔收获从效应物到靶标的20小时共培养时间点的上清液，并在-20℃下冷冻以用于MSD细胞因子分析。将常规的MSD V-PLEX人IFN-γ、IL-2试剂盒(#K151A0H-4A)用于定量每种上清液样品中的分泌细胞因子。
结果
ARM过程保留了T细胞的干细胞性
通过流式细胞术分析使用ARM过程产生的CAR-T细胞以评估解冻时和解冻后48小时的CAR表达，以及T细胞表型(图34A、34B和34C)。对于使用TM过程制造的CAR-T细胞，在收获前第9天评估CAR表达(图35A)。BCMA-CAR在图34A所示的解冻时几乎检测不到。然而，在解冻后48小时，BCMA-CAR被明显表达为：对于PI61为32.9％、对于R1G5为35.9％、和对于BCMA10为17.4％。使用TM过程产生的第9天的细胞显示BCMA-CAR表达为：对于PI61为36％、对于R1G5为40％、和对于BCMA10为7％(图35A)。对CAR+T细胞表型的风险显示，ARM过程保留了初始样T细胞(对于PI61和R1G5为约60％的CD45RO-/CCR7+，对于BCMA10为32％的CD45RO-/CCR7+)(图34C)。TM过程主要产生中枢记忆T细胞(TCM)(对于所有三种BCMA CAR-T，72％至81％的CD45RO+/CCR7+)，而初始样T细胞群体几乎在使用TM过程制造的CAR+T细胞中消失(图35B)。总体而言，初始T-细胞群体与先前报道(Cohen AD,等人(2019).J ClinInvest.[临床研究杂志]130.pii:126397.doi:10.1172/JCI126397；Fraietta,JA,等人(2018).Nat Med[自然医学],24(5)；563-571)所描述的CD45RO-/CD27+ T干细胞大部分重叠，并且与响应和CAR-T扩增相关联。
除了其表型外，还评估了最终的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞产物的体外功能。将PI61、R1G5和BCMA10细胞产物解冻，并与BCMA-表达细胞系KMS-11按1:1的比率共培养。在共培养建立之前，将解冻后的ARM加工的细胞静置24小时。共培养24小时后对上清液中细胞因子水平的比较显示，如与图36A-36D所示的TM产品相比，由ARM产物分泌的IL-2增加约5至25倍，并且IFN-γ水平增加约3至7倍。使用经历ARM或TM过程的未转导的(UTD)细胞的实验证实了PI61、R1G5和BCMA10的BCMA特异性识别。
总之，使用ARM过程产生的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞表明体外BCMA特异性活化，并如与TM加工的产物相比分泌更高水平的IL-2和IFN-γ，与使用ARM过程产生的CART细胞的T干细胞表型相关。
实例10：使用ARM过程制造的CART细胞的基因特征分析
方法
单细胞RNA序列
使用10倍基因组学铬控制器和支持文库构建试剂盒生成单细胞RNA序列文库。
将冷冻保存的细胞解冻，计数并流式分选(如果研究问题需要)，然后加载到10倍基因组学仪器上。将各个细胞加载到液滴中，并经由GemCode珠对各个液滴内的RNA进行条形码化。条形码RNA从液滴中释放并转化为整个转录组Illumina相容的测序文库。
在Illumina HiSeq仪器上对生成的文库进行测序，并使用10倍基因组学分析过程和Loupe Cell Browser软件进行分析。
单细胞免疫细胞分析
使用整个转录组10倍基因组学单细胞文库作为模板材料以产生免疫细胞谱和谱系分析。从Chromium Single Cell 5'文库中PCR扩增T细胞受体序列，并在Illumina测序仪器上分析。
分析过程
单细胞RNA序列数据通过Cell Ranger分析过程从FASTQ文件开始处理。有关CellRanger分析过程的详细说明，请访问：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger。一般过程包括比对、过滤、条形码计数和UMI计数。细胞条形码用于产生基因条形码矩阵、确定簇，并进行基因表达分析。使用Seurat Bioconductor包将基因表达计数数据标准化。丢弃来自具有少于200个表达基因的分析的细胞。丢弃来自仅在2个细胞或更少的细胞中表达的分析的基因。使用比例因子10,000，使用Seurat对数标准化方法对剩余数据进行标准化。通过回归每个细胞检测到的分子数来缩放数据。通过获取基因集中所有基因的平均对数标准化基因表达值来计算基因集评分(基因集评分)。每个基因的z评分标准化，使得基因在样品上的平均表达为0，标准差为1。然后将基因集评分计算为基因集中基因标准化值的平均值。以下描述示例性基因集评分计算。
对于该基因集评分计算的实例，表23中提供了六(6)个基因的两(2)个样品的标准化基因表达。出于该示例性计算的目的，基因集由基因1-4组成。因此，样品1和2的基因集评分均为0。
表23：用于基因集评分计算的示例性数据集
样品1 样品2
基因1 -3 0
基因2 3 0
基因3 1 0
基因4 -1 0
基因5 10 4
基因6 -5 3
基因集“向上TEM对比向下TSCM”包括以下基因：MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY、和GFPT2。
基因集“向上Treg对比向下Teff”包括以下基因：C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3、和FOXP3。
基因集“向下干细胞性”包括以下基因：ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1、和XRCC5。
基因集“向上缺氧”包括以下基因：ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11、和XRCC6。
基因集“向上自噬”包括以下基因：ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593、和ZNF681。
基因集“向上静息对比向下活化”包括以下基因：ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862、和ZNF91。
基因集“逐渐增加记忆分化”包括以下基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、和KLRB1。
基因集“向上TEM对比向下TN”包括以下基因：MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK、和KLRB1。
描述相似过程和/或特征的其他基因集也可用于表征上述细胞表型。
细胞Ranger VDJ用于为每个单细胞5'文库产生单细胞VDJ序列和注释。LoupeCell Browser软件和Bioconductor软件包用于数据分析和可视化。
结果
该实施例旨在使用单细胞RNA序列(scRNA序列)比较用作输入细胞的纯化T细胞、使用ARM过程制造的CART细胞(标记为“第1天”细胞)和使用TM过程制造的CART细胞(标记为“第9天”)之间的T细胞状态。此外，进行单细胞TCR序列(scTCR序列)以研究克隆性并跟踪从输入到制造后材料的细胞分化。
如图37A-37C中所示，输入细胞具有最少的表达基因和UMI，表明这些细胞不具有转录活性并处于静止状态。第1天和第9天细胞表达更多基因，第9天细胞是最具转录活性的。类似的结果显示在图38A-38D中。输入细胞不表达增殖基因(图38A和38D)。
另外的基因集分析数据显示在图39A-39E中。使用中位数基因集评分比较不同的细胞群体。第1天细胞和输入细胞处于更年轻、更像干细胞的记忆状态(图39A-39C)。在图39A中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)值分别为-0.084、0.035和-0.1。在图39B中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)值分别为-0.082、0.087和-0.071。在图39C中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向下干细胞性)值分别为-0.062、0.14和-0.081。
另外，与第9天细胞相比，第1天细胞处于更理想的代谢状态(图39D和39E)。在图39D中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上缺氧)值分别为0.019、0.11和-0.096。在图39E中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上自噬)值分别为0.066、0.11和-0.09。
基于基因表达，输入细胞包含四个簇。簇0的特征在于LMNA、S100A4等的高表达。簇1的特征在于RP913、PRKCQ-AS1等的高表达。簇2的特征在于PR11-291B21.2、CD8B等的高表达。簇3的特征在于NKG7、GZMH、CCL5、CST7、GNLY、FGFBP2、GZMA、CCL4、CTSW、CD8A等的高表达。在输入细胞的T分布随机邻域嵌入(TSNE)图中，簇3从其他细胞中脱颖而出，簇1和簇2难以区分。
根据图40A-40C中所示的基因集分析，与簇1和簇2富集T效应表型相比，簇0和簇3富集T调节表型。簇3由晚期记忆/效应记忆(TEM)细胞支配，簇1和簇2由早期记忆和幼稚细胞支配，群集0在中间。大多数输入细胞处于早期记忆、初始状态。不希望受理论束缚，这些细胞在制造过程中可以做到最好。
在第1天细胞和第9天细胞中观察到较少的转录异质性(数据未显示)。
与输入群体一样，第1天细胞在TSNE图中显示出大的早期记忆细胞簇和较小的晚期记忆细胞簇。类似于输入细胞的簇3所见的。相反，第9天细胞在TSNE图中未显示出明显的早期记忆细胞簇。这意味着到第9天，细胞变得更均匀。
对TCR进行测序并测量克隆型多样性。总的来说，三种克隆型谱非常平坦-大多数克隆仅被挑选一次(图41A-41C和表24)。表24中的香农熵测量分布的平坦度。输入细胞中的显性克隆是晚期记忆细胞。第1天的细胞看起来与输入细胞相似，但开始均匀。到第9天，主导克隆基本上已经均匀，分布更加平坦。多样性测量在第9天是最高的，因为在第9天细胞中比在输入细胞或第1天细胞中具有更均匀和平坦的分布。
表24：TCR多样性的测量
输入 第1天产物 第9天产物
每个克隆型的平均克隆 1.10 1.05 1.07
估计的细胞数量 7344 7687 7233
克隆型的总数 5325 7403 6736
多样性 342.27 802.94 3382.62
标准化的香农熵 9.98E-01 9.95E-01 9.96E-01
概述
第1天和第9天产物之间存在显著的T细胞状态差异。第1天细胞与输入细胞更相似，并且具有干细胞性特征的富集，表明产物更有效。
实例11：I期、开放标签、B细胞成熟抗原(BCMA)定向CAR-T细胞
在患有复发和/或难治性多发性骨髓瘤(MM)成人患者中的研究
本研究评估抗BCMA CART-T细胞疗法在对至少两种既往治疗方案复发和/或难治的成人MM受试者的安全性和耐受性，所述疗法包括IMiD(例如来那度胺或泊马度胺)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米、卡非佐米)和批准的抗CD38抗体(如达雷木单抗)(如果有的话)，并且有证据证明疾病进展(IMWG标准)。
抗BCMA CAR包含PI61抗BCMA scFv、CD8铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。在该研究中，抗BCMA CAR-T细胞产品使用活化的快速制造(ARM)过程制造。此类细胞被称为“ARM-BCMA CAR”。具体地，使用可商购的磁珠捕获T细胞表面上的CD4和CD8共受体，从受试者的白细胞单采单位富集T细胞。然后用共价附接至针对人CD3和CD28的人源化重组激动剂抗体的胶体聚合物纳米基质刺激富集的T细胞。接种、活化和转导后24小时，收获CAR-T细胞并洗涤以除去残留的未整合的载体和未结合的活化基质。洗涤后，将BCMA CART细胞疗法浓缩并冷冻保存。在释放用于施用的产品之前，需要来自释放测试程序的结果。
与用于CAR-T细胞的TM过程(其依赖于在用慢病毒载体转导后持续7-8天的离体T细胞扩增期)相比，ARM过程不包括离体T细胞扩增。相反，ARM产生的T细胞在基因转移后24小时收获，允许它们在患者体内扩增。预测用ARM过程实现的更大的体内T细胞扩增导致分化程度较低的T细胞表型，在最终细胞产物中保留更大部分的记忆干T细胞。存在分化程度较低的记忆CAR-T细胞与临床研究中抗肿瘤效力的改善相关(Fraietta JA等人,(2018)NatMed[自然医学],24(5)；563-71)。不希望受理论束缚，由较大部分记忆T干细胞组成的BCMACART细胞导致患者中CAR-T细胞增殖增强，从而克服效应T细胞耗竭并且与在传统制造过程下产生的BCMA CART相比导致在MM患者中更持久的功效。
与使用传统制造(TM)过程制造的CART细胞相比，ARM过程生产的CAR-T细胞在整体产品和CAR阳性部分中由显著更大比例的初始样记忆T细胞(CCR7+/CD45RO-)组成。ARM-BCMA CAR已经以剂量反应的方式显示了临床前MM模型中的肿瘤清楚。与使用TM过程产生的BCMA CAR-T细胞相比，ARM-BCMA CAR的效力至少高5倍，并且导致体内CAR-T扩增，具有更高水平的全身细胞因子。总之，这些结果支持这样的假设：用ARM过程制造的抗BCMA CAR-T细胞产品含有具有明显记忆干细胞表型的T细胞，导致具有增强的植入、扩增和抗-MM特性的BCMA CAR-T细胞产物。
在该I期研究中，首先在筛选期间评估每个受试者的临床资格。符合纳入本研究的受试者必须满足以下所有标准：(1)ICF特征的时间的年龄≥18岁；(2)在筛选时ECOG的表现状态为0或1；(3)患有对至少2种既往治疗方案复发和/或难治的MM的受试者，所述疗法包括IMiD(例如来那度胺或泊马度胺)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米、卡非佐米)和批准的抗CD38抗体(如达雷木单抗)(如果有的话)，并且有证据证明疾病进展(IMWG标准)；(4)受试者必须患有由以下3项测量中的至少1项定义的可测量疾病：血清M-蛋白≥1.0g/dL，尿M-蛋白≥200mg/24小时，或无血清轻链(sFLC)>100mg/L的相关FLC；(5)根据机构的指导所有患者必须适于系列骨髓活检和/或抽吸采集，并愿意按照本研究所述的重复程序进行；(6)受试者在筛查时必须符合以下血液学值：绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1,000/mm3(≥1×109/L)，测试前7天内无生长因子支持，CD3+ T细胞绝对数>150/mm3(>0.15×109/L)，测试前7天内无输血支持，血小板≥50 000/mm3(≥50×109/L)，血红蛋白≥8.0g/dl(≥4.9mmol/L)；(7)患者必须由研究者认为适合接受氟达拉滨/环磷酰胺LD方案；以及(8)必须具有可接受用于制造的非流动细胞的白细胞单采材料。如果符合条件，受试者将进行白细胞单采产物收集并提交用于CAR-T制造。该受试者参加了他们的白细胞单采产物的接受，以便开始制造。
受试者仅在确认最终产品可用后才接受淋巴细胞清除(LD)化疗。LD化疗后，在解冻后90分钟内经由静脉内(i.v.)注射施用受试者单剂量的抗BCMA CAR-T细胞产物(图42)。ARM-BCMA CAR的起始剂量是1×107个活的CAR阳性T细胞。还测试了5×107个活的CAR阳性T细胞的剂量。每个受试者在抗BCMA CAR-T细胞施用后的前72小时住院。
对于药代动力学分析，在不同时间点收集系列血液样本，通过流式细胞术和qPCR测量外周血中ARM-BCMA CAR细胞动力学，通过流式细胞术和qPCR测量骨髓中的ARM-BCMACAR细胞动力学，以测量细胞和体液免疫原性，并通过ELISA测量在外周血中包括sBCMA、BAFF和APRIL在内的潜在的药效标志物。特别地，分析受试者外周血、骨髓或其他相关组织中CAR转基因的量；CAR阳性T细胞在外周血或骨髓中的表面表达；血清中的抗mCAR抗体；PBMC中IFN-γ阳性CD4/CD8T细胞的百分比；免疫细胞活化标志物；可溶性免疫因子和细胞因子(例如sBCMA、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-α)，CAR-T克隆性；以及血清中可溶性BCMA、APRIL和BAFF的水平。实例12：使用活化快速制造(ARM)过程制造BCMACART细胞
如表25所示，BCMA CART细胞的ARM过程随着培养基的制备而开始。
将冷冻保存的白细胞单采产物用作起始材料并加工用于T细胞富集。如果可行，利用单采文件来定义T细胞百分比。在单采文件上没有T细胞百分比数据的情况下，对进入的冷冻保存的白细胞单采产物进行哨兵小瓶测试以获得用于单采的T细胞百分比目标。T细胞百分比的结果确定了ARM过程第0天解冻的袋数。
表25：在BCMA CART制造过程中培养基和缓冲液类型和使用时间点
Figure BDA0002952123060002781
将冷冻保存的白细胞单采解冻、洗涤，然后使用
Figure BDA0002952123060002783
微珠技术进行T细胞选择和富集。用TransACT(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核细胞(VNC)，并用编码CAR的慢病毒载体转导。将用Miltenyi微珠选择的活细胞接种到
Figure BDA0002952123060002784
上的中心室(centricult)中，其是非湿润的孵育室。在培养过程中，将细胞悬浮在快速培养基中，这是一种基于OpTmizerTM CTSTM的培养基，这种培养基在其成分中含有CTSTM补充剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-2和2％免疫细胞血清替代品，以促进T细胞活化和转导。在将TransACT添加到培养基中的稀释细胞后，在接种当天进行一次慢病毒转导。慢病毒载体将在接种当天使用前即刻解冻，在室温下最多30分钟。
从第0天的过程开始到培养物洗涤和收获的开始，将BCMA CART细胞从接种后培养20-28小时。培养后，细胞悬浮液在中心室(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))内进行两次培养洗涤和一次收获洗涤。
在第1天在
Figure BDA0002952123060002782
上收获洗涤后，对细胞悬浮液进行取样以确定活细胞计数和活力。然后将细胞悬浮液转移到离心机中以手动沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于CS10(BioLife溶液)中，得到最终DMSO浓度为约10.0％的产物配置品。在收获结束时配制活细胞计数用于给药。然后将剂量分配到各个冷冻袋中并分析取样到冷冻瓶中。
冷冻保存的产品储存在受监控的安全、出入受限的区域的LN2储罐中直至最终释放和运输。
实例13：使用活化快速制造(ARM)过程制造的BCMA CART细胞的表征
概述
该实例描述了使用ARM过程制造的BCMA CART细胞的表征。与传统制造(TM)产物相比，ARM过程生产的CAR-T细胞由显著更大比例的初始样记忆T细胞(CCR7+/CD45RO-)组成。在多发性骨髓瘤(MM)的临床前模型中，使用ARM过程制造的BCMA CART细胞以剂量依赖性方式诱导肿瘤消退，与使用TM过程制造的BCMA CART细胞相比，杀死肿瘤的效率高达5倍。此外，与TM制造的细胞相比，ARM制造的细胞在体内显示出延长的CART扩增(比Cmax和AUC0-21d高高达3倍)并且诱导更高的全身细胞因子(IFN-γ增加3.5倍)。总之，这些结果支持这样的假设：用ARM过程制造的BCMA CART细胞含有具有明显记忆干细胞表型和增强的体内扩增潜力的T细胞。
使用ARM过程，CAR可以在病毒添加后96小时稳定表达(也可称为在产品解冻后72小时)。因此，病毒添加后96小时或解冻后72小时被认为是体外和体内活性的CAR表达的替代时间点。当与使用TM过程制造的BCMA CART细胞相比，使用ARM过程制造的BCMA CART细胞保留了分化程度较低的细胞群，并且在体外显示出更高的靶特异性细胞因子产生。
使用ARM过程制造的BCMA CART细胞使用可商购人质膜蛋白测定证明了对BCMA的高度特异性。该测定检测到与BCMA(TNFRSF17)的结合，但没有检测到其他强、中或弱结合物。筛选没有高度置信地鉴定BCMA CART产物中表达的抗人BCMA单链抗体可变片段(scFv)(PI61)的交叉反应蛋白的存在。进行靶分布研究以确定潜在的肿瘤外靶向毒性。利用免疫组织化学(IHC)、原位杂交(ISH)和聚合酶链反应(PCR)测定来检查正常人组织中BCMA的分布。这些分析表明BCMA表达仅限于含有正常浆细胞(PC)的部位，例如次级淋巴器官、骨髓和粘膜相关淋巴组织。由于中枢神经系统(CNS)的神经毒性一直是其他基于细胞的疗法的关注点，因此检查了脑中的表达。通过免疫组织化学，使用显示对BCMA特异的可商购抗体，或使用含有靶向scFv的BCMA的人-兔嵌合工具抗体的结合测定，未观察到CNS染色。通过原位杂交和基于PCR的剪接变体分析测量，这些组织中缺乏BCMA mRNA证实了这些发现。BCMACART靶向正常PC和表达BCMA的浆细胞样树突状细胞可能导致它们的消耗；然而，预计不会靶向其他细胞类型。
结果
下面描述的研究比较了使用ARM过程制造的BCMA CART细胞(称为“ARM-BCMACAR”)和使用TM过程制造的BCMA CART细胞(称为“TM-BCMA CAR”或“TM-BCMA CAR*”)。在ARM-BCMA CAR中表达的CAR和在TM-BCMA CAR*中表达的CAR具有相同的序列，包含PI61scFv、CD8铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。在TM-BCMA CAR中表达的CAR包含BCMA10 scFv、CD8铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。ARM-BCMA CAR体外表达动力学
与在8-9天后测量CAR转基因的慢病毒整合的TM对比，在ARM过程中，慢病毒转基因可能不会在慢病毒添加后24小时内完全整合并真正表达，因为可能发生慢病毒假转导(Haas DL等人,(2000)Mol Ther[分子疗法]；2(1):71-80；Galla M等人,(2004)Mol Cell[分子细胞]；16(2):309-15)。因此，通过在存在或不存在3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)的情况下在体外延长培养ARM-BCMA CAR来评估BCMA-CAR表达模式，以评估CAR转基因的潜在的假转导与稳定整合和表达。进行流式细胞术(FACS)分析以检测T细胞活化后24h、48h、72h、96h和168h的CAR表面表达以及用慢病毒载体转导。在一些情况下，ARM-BCMA CAR和该产物的等分试样在收获后立即冷冻，以在其他测定中进行另外的表征。
如图43所示，FACS分析表明BCMA-CAR在添加慢病毒载体后24小时几乎没有表达。然而，CAR+群体最初出现在48小时。病毒添加后48h至168h，CAR+群体在每个时间点轻微增加。CAR似乎从96h开始稳定表达。这与未转导(UTD)和AZT处理的样品形成对比，其在48小时的任何时间点都未显示CAR+群体(图43)。AZT能够在30μM和100μM剂量下有效抑制CAR表达，表明BCMA-CAR表达是由于病毒基因整合到宿主细胞基因组中，并且不太可能是慢病毒假转导的结果。ARM-BCMA CAR保留T细胞干细胞性
通过FACS分析ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR以评估解冻时CAR表达以及解冻后48小时的T细胞表型(图44A和44B)。在两个供体中观察到BCMA-CAR几乎检测不到(图44A)，这与图43中所示的CAR表达动力学研究中的观察结果一致。然而，在解冻后48小时，ARM-BCMACAR的BCMA-CAR表达为32.9％。相反，TM-BCMA CAR显示BCMA-CAR表达为7％(图44B)。对CAR+T细胞表型的分析显示，ARM过程保留了初始样T细胞(60％CD45RO-/CCR7+)，证明其比效应记忆T细胞群(CD45RO+/CCR7-)多26倍。TM过程主要在CAR+T细胞内产生中枢记忆T细胞(81％CD45RO+/CCR7+)。TM过程几乎不存在初始样T细胞群。这种初始的T细胞群与CD45RO-/CD27+T干细胞大部分重叠(由Cohen AD等人,(2019)J Clin Invest[临床研究杂志]；129(6):2210-21；和Fraietta等人(2018)Nat Med[自然医学],24(5)；563-571所述)并且与增强的CAR-T扩增和临床应答相关。
除了其表型外，还评估了最终的ARM-BCMA CAR细胞产物的体外活化。将ARM-BCMACAR和TM-BCMA CAR解冻，并与表达BCMA的细胞系KMS-11共培养。在共培养建立之前，将解冻后的ARM-BCMA CAR细胞静置24小时。共培养24小时后对上清液中细胞因子水平的比较显示，如与图45A和45B所示的TM-BCMA CAR相比，由ARM-BCMA CAR分泌的IL-2增加约5倍，并且IFN-γ水平增加约2倍。使用经历ARM或TM过程的UTD细胞的实验证实了ARM-BCMA CAR和TM-BCMA的BCMA特异性识别。然而，在不存在BCMA特异性刺激的情况下由ARM-UTD的IFN-γ分泌的较高背景(图45B)可能是由于ARM产物的活化性质。
总之，用于产生BCMA CART细胞的ARM过程比TM过程产生具有更高的CAR表达的T细胞。ARM-BCMA CAR在体外表现出BCMA特异性活化，并且如与TM-BCMA CAR相比分泌更高水平的IL-2，与其T干细胞表型相关。
ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR在异种移植模型中的功效
体内药理学研究用于指导ARM-BCMA CAR的开发。对于图46中描述的实验，ARM-BCMA CAR是用GMP材料生成的。并行地，使用相同批次的T细胞但使用TM制备TM-BCMA CAR。对于使用ARM-BCMA CAR的剂量计算，在产物解冻后72小时测量％CAR+用于计算剂量；而对于TM-BCMA CAR，使用第9天％CAR+TM产品计算剂量。在免疫缺陷型NSG小鼠(NOD-scidIL2Rg-null)中评估使用不同的过程产生的CAR-T细胞的功效，该小鼠用MM细胞系KMS-11-Luc接种。这种肿瘤细胞系在骨髓中移植。MM接种后8天，小鼠组接受单次输注CAR+ T细胞。将剂量标准化为匹配剂量组的总CAR-T细胞。类似地制备UTD T细胞并作为独立组给予以控制对肿瘤的同种异体反应。UTD剂量反映了我们可以为TM和ARM实现的相应过程的最高总T细胞剂量。
表26：不同剂量组的研究设计，以及血液药代动力学(PK)和血浆细胞因子测量的时间点的总结。
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图47是所有组的肿瘤回归曲线。BCMA CAR-T产品(ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR)均能够在测试剂量水平下消除肿瘤，即使在最低剂量组也是如此。以剂量依赖性方式诱导肿瘤消退。与高剂量组相比，低剂量组的肿瘤杀伤效果延迟了约一周。ARM-BCMA CAR在比TM-BCMA CAR低3-5倍的剂量下诱导相似的肿瘤消退，表明与肿瘤杀伤中的TM-BCMA CAR相比，ARM-BCMA CAR的效力是3-5倍。
此外，在该研究中，还评估了TM-BCMA CAR*的功效。TM-BCMA CAR*和ARM-BCMA CAR表达了相同的抗BCMA CAR，但是使用不同的过程制造：分别是TM过程和ARM过程。结果表明，ARM-BCMA CAR在比TM-BCMA CAR*低1-5倍的剂量下诱导相似的肿瘤消退。
在CAR-T疗法后第2、7、14和21天对所有小鼠放血以测量血浆IFN-γ(图48A-48C)。没有观察到早期峰值，并且所有组在第2天显示非常低水平的循环IFN-γ(<10pg/ml)。在CAR-T剂量后14天内观察到所有组的峰。然而，与TM-BCMA CAR相比，ARM-BCMA CAR的IFN-γ水平高3.5倍。ARM-UTD组在研究终止前第2天和第7天产生很少或不产生IFN-γ。当与ARM-BCMA CAR 1e4和TM-BCMA CAR 5e4组相比时，在第21天较高剂量组中IFN-γ下降，因为在这两组中CAR+T细胞仍在扩增，肿瘤抑制延迟。
体内ARM-BCMA CAR细胞动力学
作为评估NSG小鼠功效的该药理学研究的一部分，在输注后3周通过FACS分析外周血CAR-T细胞的扩增。在所有CAR-T处理组中均观察到CD3+ T细胞和CAR+ T细胞扩增。对于Cmax或AUC 0-21d，ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR没有明显的剂量依赖性扩增。ARM-BCMACAR或MTV273的细胞扩增峰值未在21天内达到。然而，剂量组为5e5的TM-BCMA CAR和剂量组为0.5e5的ARM-BCMA CAR在第14天达到明显的峰值扩增(图49)。比较ARM-BCMA CAR与TM-BCMA CAR在21天内的扩增，ARM-BCMA CAR的Cmax和AUC0-21d均高2至3倍。
实例14：使用IL-15或hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)使用活化快速制造(ARM)过程制造BCMA CART细胞
如表25所示，BCMA CART细胞的ARM过程随着培养基的制备而开始。
将冷冻保存的白细胞单采产物用作起始材料并加工用于T细胞富集。如果可行，利用单采文件来定义T细胞百分比。在单采文件上没有T细胞百分比数据的情况下，对进入的冷冻保存的白细胞单采产物进行哨兵小瓶测试以获得用于单采的T细胞百分比目标。T细胞百分比的结果确定了ARM过程第0天解冻的袋数。
将冷冻保存的白细胞单采解冻、洗涤，然后使用
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微珠技术进行T细胞选择和富集。用TransACT(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核细胞(VNC)，并用编码CAR的慢病毒载体转导。将用Miltenyi微珠选择的活细胞接种到
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上的中心室(centricult)中，其是非湿润的孵育室。在培养过程中，将细胞悬浮在快速培养基中，这是一种基于OpTmizerTM CTSTM的培养基，这种培养基在其成分中含有CTSTM补充剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-15或hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)和2％免疫细胞血清替代品，以促进T细胞活化和转导。在将TransACT添加到培养基中的稀释细胞后，在接种当天进行一次慢病毒转导。慢病毒载体将在接种当天使用前即刻解冻，在室温下最多30分钟。
从第0天的过程开始到培养物洗涤和收获的开始，将BCMA CART细胞从接种后培养20-28小时。培养后，细胞悬浮液在中心室(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))内进行两次培养洗涤和一次收获洗涤。
在第1天在
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上收获洗涤后，对细胞悬浮液进行取样以确定活细胞计数和活力。然后将细胞悬浮液转移到离心机中以手动沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于CS10(BioLife溶液)中，得到最终DMSO浓度为约10.0％的产物配置品。在收获结束时配制活细胞计数用于给药。然后将剂量分配到各个冷冻袋中并分析取样到冷冻瓶中。
冷冻保存的产品储存在受监控的安全、出入受限的区域的LN2储罐中直至最终释放和运输。
在一些实施例中，基于OpTmizerTM CTSTM的培养基中使用的IL-15或hetIL-15可以用IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。
实例15：使用活化快速制造(ARM)过程制造CD19 CART细胞
如表25所示，CD19 CART细胞的ARM过程随着培养基的制备而开始。
将冷冻保存的白细胞单采产物用作起始材料并加工用于T细胞富集。如果可行，利用单采文件来定义T细胞百分比。在单采文件上没有T细胞百分比数据的情况下，对进入的冷冻保存的白细胞单采产物进行哨兵小瓶测试以获得用于单采的T细胞百分比目标。T细胞百分比的结果确定了ARM过程第0天解冻的袋数。
将冷冻保存的白细胞单采解冻、洗涤，然后使用
Figure BDA0002952123060002852
微珠技术进行T细胞选择和富集。用TransACT(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核细胞(VNC)，并用编码CAR的慢病毒载体转导。将用Miltenyi微珠选择的活细胞接种到
Figure BDA0002952123060002853
上的中心室(centricult)中，其是非湿润的孵育室。在培养过程中，将细胞悬浮在快速培养基中，这是一种基于OpTmizerTM CTSTM的培养基，这种培养基在其成分中含有CTSTM补充剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-2和2％免疫细胞血清替代品，以促进T细胞活化和转导。在将TransACT添加到培养基中的稀释细胞后，在接种当天进行一次慢病毒转导。慢病毒载体将在接种当天使用前即刻解冻，在室温下最多30分钟。
从第0天的过程开始到培养物洗涤和收获的开始，将CD19 CART细胞从接种后培养20-28小时。培养后，细胞悬浮液在中心室(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))内进行两次培养洗涤和一次收获洗涤。
在第1天在
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上收获洗涤后，对细胞悬浮液进行取样以确定活细胞计数和活力。然后将细胞悬浮液转移到离心机中以手动沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于CS10(BioLife溶液)中，得到最终DMSO浓度为约10.0％的产物配置品。在收获结束时配制活细胞计数用于给药。然后将剂量分配到各个冷冻袋中并分析取样到冷冻瓶中。
冷冻保存的产品储存在受监控的安全、出入受限的区域的LN2储罐中直至最终释放和运输。
在一些实施例中，基于OpTmizerTM CTSTM的培养基中使用的IL-2可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6、或IL-6/sIL-6Ra代替。
等同物
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过援引以其全文并入本文。虽然已经参照某些实施例披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的另外的实施例以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类实施例以及等同变化。
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Claims (84)

1.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：
(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或与刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；
(ii)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码所述CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和
(iii)收获所述细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：
(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且
步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于30(例如26)小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时进行，
(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且
步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时进行，例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，或
(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；
任选地其中步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体，所述病毒载体包含编码所述CAR的核酸分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3(例如抗CD3抗体)的药剂，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226，或其任何组合的药剂；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂不包含珠；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂和所述刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中表达CAR的细胞的百分比，例如来自步骤(iii)的细胞群体显示更高百分比的表达CAR的细胞(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)，所述其他类似方法不包括步骤(i)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比增加例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；
(c)所述细胞群体中表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比在步骤(ii)持续时间的过程中增加，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间增加例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％；或
(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比不降低，或降低不超过5％或10％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中
(a)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的更高百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(b)与通过其他类似方法制备的细胞中初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(c)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(d)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的更高的百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；
(e)与通过其他类似方法制备的细胞中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；或
(f)与通过其他类似方法制备的细胞中表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；
(c)在步骤(ii)持续时间的过程中表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+细胞的百分比降低，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间降低例如至少8％、10％、12％、14％、16％、18％、或20％；或
(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比不增加或增加不超过5％或10％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中
(a)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞更低的百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(b)与在通过其他类似方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(c)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(d)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的更低百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；
(e)与通过其他类似方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；或
(f)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中
(a)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比增加；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比增加；
(c)与通过其他类似方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或
(d)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(e)与通过其他类似方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；或
(f)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；
(b)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与以下的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比更低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％、或300％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(c)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；
(d)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与以下的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比更低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(e)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；
(f)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与以下的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比更低(例如，至少低约50％、100％、或125％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(g)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；
(h)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与以下的中位数基因集评分(向上缺氧)相比更低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(j)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％；或
(k)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与以下的中位数基因集评分(向上自噬)相比更低(例如，至少低约20％、30％、或40％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中例如如使用在实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平上扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个表达CAR的活细胞的剂量)。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含血清替代物的无血清细胞培养基中进行。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前：
(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))，和
(v)从新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，如CD8+和/或CD4+T细胞)群体，任选地其中：
步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或
例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前：接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的从白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前：
(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))，和
(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)群体，任选地其中：
步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或
例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括步骤(vi)：
将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量在所述部分中的CAR表达水平(例如测量所述部分中表达CAR的活细胞的百分比)，任选地其中：
步骤(iii)包括收获和冷冻所述细胞(例如T细胞)群体，并且步骤(vi)包括将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分解冻，将所述部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量所述部分中的CAR表达水平(例如测量所述部分中表达CAR的活细胞的百分比)。
22.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：
(1)使细胞(例如T细胞，如从冷冻的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与细胞因子接触，所述细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合；
(2)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码所述CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述核酸分子的细胞(例如T细胞)群体；和
(3)收获所述细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：
(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行或在步骤(1)开始后不晚于5小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时进行，并且
步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时进行，或
(b)例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；
任选地其中步骤(2)中的核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体，所述病毒载体包含编码所述CAR的核酸分子。
23.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-2接触。
24.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7接触。
25.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。
26.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-21接触。
27.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。
28.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。
29.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-21接触。
30.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。
31.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、和IL-21接触。
32.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。
33.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-2个IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。
34.如权利要求22-33中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出在表达CAR的细胞中初始细胞的更高的百分比(例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括使所述细胞群体与例如抗CD3抗体接触。
35.如权利要求22-34中任一项所述的方法，其中来自步骤(3)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比：
(a)与在步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％，或
(b)如与在步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比增加，例如增加至少10％或20％。
36.如权利要求22-35中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的更高百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)，在所述其他类似方法中步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行，例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。
37.如权利要求22-36中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的更高百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如超过5、6、7、8、或9天。
38.如权利要求22-37中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平上扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)，在所述其他类似方法中步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行，例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行。
39.如权利要求22-38中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
40.如权利要求22-39中任一项所述的方法，例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(3)细胞群体中的活细胞数目较步骤(1)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
41.如权利要求22-40中任一项所述的方法，其中与在步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
42.如权利要求22-41中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触，或如果进行接触，接触步骤少于2小时，例如不超过1小时或1.5小时。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3(例如抗CD3抗体)的药剂，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂，任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。
44.如权利要求22-43中任一项所述的方法，其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，所述细胞培养基包含：
不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清，任选地其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，所述细胞培养基包含约2％血清，或
LSD1抑制剂或MALT1抑制剂。
45.如权利要求22-44中任一项所述的方法，所述方法还包括接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于50％、60％、或70％的表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的细胞培养基中进行。
49.如权利要求48所述的方法，其中例如10、15、20、或25天后，IL-15增加细胞群体扩增的能力。
50.如权利要求48所述的方法，其中IL-15增加细胞群体中表达IL6Rβ的细胞百分比。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
52.如权利要求51所述的方法，其中与抗原结合的抗原结合结构域选自：CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原的任一个的肽。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，任选地其中：
(a)所述抗原结合结构域与BCMA结合，并且包含在表3-15中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；
(b)所述抗原结合结构域与CD19结合，并且包含在表2中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；
(c)所述抗原结合结构域与CD20结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；或
(d)所述抗原结合结构域与CD22结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。
54.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含VH和VL，其中所述VH和所述VL通过接头连接，任选地其中所述接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。
55.如权利要求51-54中任一项所述的方法，其中
(a)所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域；
(b)所述跨膜结构域包含CD8的跨膜结构域；
(c)所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(d)所述核酸分子包含编码跨膜结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:17的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
56.如权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域通过铰链区与所述跨膜结构域连接，任选地其中：
(a)所述铰链区包含SEQ ID NO:2、3、或4的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(b)所述核酸分子包含编码所述铰链区的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:13、14、或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
57.如权利要求51-56中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域，任选地其中所述初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、或CD66d的功能性信号传导结构域，任选地其中：
(a)所述初级信号传导结构域包含源自CD3ζ的功能性信号传导结构域；
(b)所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(c)所述核酸分子包含编码所述初级信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
58.如权利要求51-57中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，任选地其中所述共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB、或与CD83特异性结合的配体的功能性信号传导结构域，任选地其中：
(a)所述共刺激信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域；
(b)所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(c)所述核酸分子包含编码所述共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:18的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
59.如权利要求51-58中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域和源自CD3ζ的功能性信号传导结构域，任选地其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列)和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列)，任选地其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。
60.如权利要求51-59中任一项所述的方法，其中所述CAR还包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的前导序列。
61.一种表达CAR的细胞(例如自体同源或同种异体表达CAR的T细胞或NK细胞)群体，所述群体通过如权利要求1-60中任一项所述的方法制备。
62.一种被工程化以表达CAR的细胞群体(“一种表达CAR的细胞群体”)，所述群体包含：
(a)如与在被工程化以表达CAR之前，在相同的细胞群体中初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，约相同百分比的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+T细胞；
(b)例如如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+T细胞；
(c)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，增加的百分比的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+T细胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；
(d)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，约相同百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞；
(e)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞；
(f)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，降低的百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞，例如降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；
(g)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，约相同百分比的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞；
(h)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞；或
(i)如与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，增加百分比的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞。
63.一种被工程化以表达CAR的细胞群体(“一种表达CAR的细胞群体”)，其中：
(a)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与在被工程化以表达CAR之前的相同细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；
(b)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；
(c)所述细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；
(d)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；或
(e)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与在被工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。
64.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求61-63中任一项所述的表达CAR的细胞群体，以及药学上可接受的运载体。
65.一种在受试者中增加免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求61-63中任一项所述的表达CAR的细胞群或如权利要求64所述的药物组合物，从而增加所述受试者中的免疫应答。
66.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求61-63中任一项所述的表达CAR的细胞群体或如权利要求64所述的药物组合物，从而治疗所述受试者的癌症。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述癌症是实体癌，例如选自：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)、子宫癌、肾癌、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌癌症、食道癌或膀胱癌，或其转移癌中的一种或多种。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述癌症是液体癌，例如选自：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、脾脏边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、骨单发性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
69.如权利要求65-68中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第二治疗剂是IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述第二治疗剂是依鲁替尼。
72.如权利要求71所述的方法，其中将依鲁替尼按以下剂量每日一次施用：约600mg、约550mg、约500mg、约480mg、约460mg、约440mg、约420mg、约400mg、约350mg、约300mg、约280mg、约250mg、约200mg、约190mg、约180mg、约170mg、约160mg、约150mg、约140mg、约130mg、约120mg或100mg。
73.如权利要求71所述的方法，其中将依鲁替尼按以下剂量每日一次施用：420mg、280mg、或140mg。
74.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其中将依鲁替尼在施用所述表达CAR的细胞群体之前、同时、或之后施用。
75.如权利要求65-74中任一项所述的方法，其中将所述表达CAR的细胞群体按基于权利要求21中测量的表达CAR的细胞百分比确定的剂量施用。
76.如权利要求65-75中任一项所述的方法，其中将所述表达CAR的细胞(例如表达CD19CAR的细胞)群体按约0.5x106至50x106个表达CAR的活细胞，例如约5x106个表达CAR的活细胞的剂量施用，任选地其中将所述表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)群体按5x106个表达CAR的活细胞的剂量施用。
77.如权利要求65-75中任一项所述的方法，其中将所述表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)群体按约2.5x106至2.5x108个表达CAR的活细胞，例如约2.5x107个表达CAR的活细胞的剂量施用，任选地其中将所述表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)群体按2.5x107个表达CAR的活细胞的剂量施用。
78.如权利要求65-75中任一项所述的方法，其中将所述表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)群体按约1.25x107至1.25x109个表达CAR的活细胞，例如约1.25x108个表达CAR的活细胞的剂量施用，任选地其中将所述表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)群体按1.25x108个表达CAR的活细胞的剂量施用。
79.如权利要求65-75中任一项所述的方法，其中将所述表达CAR的细胞(例如表达BCMACAR的细胞)群体按约2.5x106至2.5x108个表达CAR的活细胞，例如约1x107或5x107个表达CAR的活细胞的剂量施用。
80.如权利要求66-79中任一项所述的方法，其中所述受试者患有CLL或SLL。
81.如权利要求66-79中任一项所述的方法，其中所述受试者患有DLBCL，例如复发性和/或难治性DLBCL。
82.如权利要求65-81中任一项所述的方法，其中监测所述受试者的细胞因子释放综合征的迹象，例如持续至少2、2.5、3、3.5、或4天，例如持续约3天。
83.如权利要求61-63中任一项所述的表达CAR的细胞群体或如权利要求64所述的药物组合物用于在增加受试者免疫应答的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述表达CAR的细胞群体或有效量的所述药物组合物。
84.如权利要求61-63中任一项所述的表达CAR的细胞群体或如权利要求64所述的药物组合物用于在治疗受试者癌症的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述表达CAR的细胞群体或有效量的所述药物组合物。
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