MXPA05012475A - Anticuerpos y moleculas relacionadas con el ligando para el receptor tnf inducido por glucorticoides (gitr) y el ligando (gitr) y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos y moleculas relacionadas con el ligando para el receptor tnf inducido por glucorticoides (gitr) y el ligando (gitr) y usos de los mismos.

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Abstract

La presente invencion proporciona polinucleotidos y polipeptidos aislados y purificados relacionados con un ligando novedoso para el receptor TNF inducido por glucocorticoides (GITR). La invencion tambien proporciona anticuerpos para el ligando GITR (GITRL). La presente invencion tambien se dirige a metodos novedosos para el diagnostico, prognosis, monitoreo del avance de, y tratamiento de trastornos que resultan de la desregulacion del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias y rechazo de transplantes, y canceres y enfermedades infecciosas) usando GITRL y/o moduladores de GITRL. La presente invencion se dirige ademas a terapeuticos novedosos y objetivos terapeuticos y a metodos de separacion por exclusion y evaluacion de compuestos de prueba para la intervencion (tratamiento) y prevencion de trastornos que resultan de la desregulacion del sistema inmune, cuando se relaciona con GITRL y GITR.

Description

ANTICUERPOS Y MOLECULAS RELACIONADAS CON EL LIGANDO PARA EL RECEPTOR TNP INDUCIDO POR GLUCORTICOIDES (GITR) Y EL LIGANDO (GITR) Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevos métodos para diagnosticar, pronosticar, monitorear el avance de, y tratar los trastornos que surgen de la desregulación del sistema inmunológico (por ejemplo, trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, rechazo a trasplantes, cáncer y enfermedades infecciosas) relacionado con el receptor TNF inducido por glucocorticoides (GITR) y el ligando asociado con GITR (GITRL) y moduladores relacionados con ellos. La presente invención se refiere además, a nuevos terapéuticos y objetivos terapéuticos, a métodos de separación por exclusión y a la evaluación de los compuestos de prueba para la intervención (tratamiento) y prevención de los trastornos que surgen de la desregulación del sistema inmunológico, relacionado con GITR y GITRL. Antecedentes de la Invención Generalmente, los linfocitos T son responsables de la inmunidad mediada por las células y juegan un papel regulador reforzando o suprimiendo las respuestas de otras células de los glóbulos blancos. Es bien conocido el concepto de que los linfocitos T juegan un papel importante en la supresión de la respuesta inmune (ver por ejemplo, Gershon et al. (1970) Ref . :168079 Immunology 18:723-35) . Sin embargo, los antígenos de direccionamiento para estas células supresoras y los mecanismos que controlan su función son aún materia de estudio . Una población de células T reguladoras que se genera en el timo es distinguible de las células T efectoras mediante la expresión de antígenos de membrana únicos . Estas células T reguladoras constituyen una subpoblación de células T CD4+ (es decir, células T que expresan al antígeno CD4) que coexpresan al antígeno CD25. El CD25 también se conoce como la cadena a (IL-2R) del receptor de interleucina 2. La cotransferencia de, o reconstitución con las células T CD25+ está asociada con la prevención de ambas, las lesiones inflamatorias y de autoinmunidad en varios modelos animales (ver S evach (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:423-49, y referencias de la misma) . Las células T CD4+CD25+ también han sido asociadas con la inhibición de la activación de las células T in vifcro, y supresión adoptiva de células T CD4+CD25" en el cultivo conjunto (Shevach, supra.) . Hace más de dos décadas se demostró que algunas de las células T autoreactivas escapan a los mecanismos de tolerancia central y existen en la periferia bajo el control de las células T reguladoras derivadas del timo. En 1995, Sakaguchi y colegas demostraron que una población pequeña de células T CD4+ que expresan naturalmente la cadena o de IL-2R (es decir, CD25) está involucrada en el control de las células T autoreactivas específicas de los órganos (Sakaguchi et al. (1995) J. -Immunol. 155: 1151-64). Específicamente, demostraron que la transferencia de las células T CD4+CD25" a las hospederas inmunodeficientes conducen a un espectro de enfermedades autoinmunes que podrían prevenirse mediante la cotransíerencia de células T CD4+CD25+ (Sakaguchi et al., supra) . Estudios subsecuentes han implicado a las células T reguladoras CD4+CD25+ en la supresión de las respuestas inmunes a las infecciones virales, bacterianas y protozoarias (Aseffa et al. (2002) J. Immunol . 169:3232-41; Belkaid et al. (2002) Nature 420: 502-07; Hisaeda et al. (2004) Nat . Med. 10:29-30; ursar et al. (2002) J. Exp. Med. 196:1585-92; Lundgren et al. (2003) Infect. Immun. 71:1755-62; Maloy et al. (2003) J. Exp. Med. 197:111-19). A la vez, estos estudios proporcionan la evidencia de que la remoción de las células T CD4+CD25+ mejora la respuesta inmune. Se han hecho muchos esfuerzos para definir la activación de, y supresión mediante estas células T CD4+CD25+. Estas células representan un único linaje de células derivadas del timo que suprimen potentemente ambas funciones de las células T efectoras in vitro e in vivo. Varios estudios in vitxo revelaron que las células CD4+CD25+ suprimen la proliferación de las células T CD4+ en respuesta a los mitógenos y antígenos al desactivar la transcripción de IL-2 (por ejemplo, Thornton y Shevach (1998) J. Exp. Med. 188: 287-96; Takahashi et al. (1998) Int. Immunol. 10: 1969-80). La cotransferencia de las células T CD4+CD25+ in vivo con células T CD4+ autoreactivas son suficientes para suprimir ambas, y la fase de la inducción y efector de la autoinmunidad específica de los órganos (Suri-Payer et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:669-77 ; Suri-Payer et al. (1998) J. Immunol. 160:1212-18). Otras propiedades de las células T CD4+CD25+ incluyen la hipersensibilidad a la estimulación del receptor de las células T (TCR) en ausencia del IL-2 exógeno, la inmunosupresión vía la interacción célula-célula, y un requisito para la señalización . del TCR para inducir su fenotipo supresor (una vez que han sido activados, sin embargo, su función supresora es independiente del estímulo antigénico) . También se ha demostrado que la mera adquisición de la expresión CD25, como puede lograrse mediante la estimulación de las células CD4+CD25" no induce al fenotipo supresor. Las células T CD4+CD25+ se conocen por existir en los humanos (Shevach (2001) J. Exp. Med. 193 :F1-F6) . ün estudio demostró que la selección tímica alterada se requiere para la generación de células T CD4+CD25+ reguladoras (Jordán et al. (2001) Nat . Immunol. 2:301-06). Además, estudios con ratones agénicos demostraron que se requieren moléculas involucradas en la sensibilidad y síntesis del IL-2 para la generación de estas células; los ratones genéticamente deficientes de IL2 o IL2Rp, o B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) , o CD28 tienen todos una reducción severa en células CD4+CD25+, lo que resulta en una linfadenopatía e hiperproliferación en la periferia de algunos de estos ratones (Papiernik et al. (1998) Int. Immunol. 10:371-78; Salomón et al . (2000) Immunity 12:431-40; Kumanogoh et al. (2001) J". Immunol. 166: 353-60). Hasta recientemente, el arte había fracasado en determinar los mecanismos involucrados en la supresión mediada por CD4+CD25+ del sistema inmunológico, por ejemplo, la especificidad del antígeno, las moléculas involucradas en la adquisición de una supresión y las moléculas de la superficie celular o citocinas de escasa acción involucradas en la fase efectora de la supresión; los objetivos moleculares de las células T CD25+ que modulan la autoinmunidad permanecen también ampliamente desconocidos. Se ha demostrado actualmente al examinar la expresión diferencial de los genes a través del uso del análisis del chip de un gen en las células CD4+CD25+ y células T CD4+CD25" que existen varios genes diferenciales CD25+ (McHugh et al . (2002) Immunity 16:311-23; ver también la Solicitud de patente 10/194,754, incorporada en la presente mediante la referencia en su totalidad) . Estos genes, determinados para ser expresados preferentemente en las células T CD4+CD25+, pueden servir como objetivos para la intervención terapéutica y los métodos de separación por exclusión para los trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias y rechazo a trasplantes, así como para el cáncer y enfermedades infecciosas. Significativamente, uno de los genes determinado para ser expresado diferencialmente en las células de CD25+ es el receptor TNF inducido por glucocorticoides (GITR) (McHugh et al., supra) . El GITR, un receptor de proteína de transmembrana de superficie celular es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) . Se ha demostrado que el GITR está constitutivamente presente en las células T no activadas (Gavin et al. (2002) Nat. Immunol. 3:33-41; McHugh et al., supra; Shimizu et al. (2002) Nat. Immunol. 3:135-42). El GITR enlaza a otra proteína de transmembrana referida como el ligando GITR (GITRL) . Los anticuerpos agonísticos para GITR han demostrado invalidar la actividad supresora de las células T CD4÷CD25+, demostrando un papel funcional para GITR regulando la actividad de estas células (McHugh et al., supra) . Otro estudio confirmó que la estimulación de GITR con un anticuerpo monoclonal específico invalida la supresión mediada por las células T CD4+CD25+ induciendo así, a una autoinmunidad (Shimizu et al., supra) . Estos estudios han conducido a la propuesta de que el GITR es el marcador más constante de las células T CD4+CD25+ (Uraushihara et al. (2003) «7. Imnol. 171:708-16); sin embargo, la expresión de GITR sola no distingue exclusivamente a este subconjunto ya que una sobreregulación de GITR también ocurre siguiendo la activación de las células T CD4+CD25 (McHugh et al., supra; Shimizu et al., supra) . Debido a que el GITR ha demostrado ser importante en la regulación de la actividad supresora de las células T CD4+CD25+ en las células T CD4+CD25", es deseable identificar y caracterizar nuevas moléculas que interactúan con GITR. Se describen en la presente nuevas moléculas que interactúen con GITR. Adicionalmente, se proporcionan moduladores de estas moléculas . Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona secuencias de los nucleótidos y los aminoácidos de un nuevo homólogo de GITRL humano. La presente invención también proporciona anticuerpos para el GITRL de ratón. La presente invención también proporciona métodos para invertir la supresión inmune induciendo el enlace GITR-GITRL agonístico, y restaurar o mejorar la supresión inmune mediante la antagonización del enlace GITR-GITRL, por ejemplo, a través del uso de anticuerpos de neutralización que inhiben la actividad de GITRL (por ejemplo, que bloquean la interacción entre GITR y GITRL) . Tal inversión o restauración/mejora de la supresión inmune es beneficiosa en el tratamiento de los trastornos d variados que son el resultado de las respuestas inmunes desreguladas tales como los trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias y rechazo a trasplantes, cáncer y enfermedades infecciosas. Los métodos de la presente invención se dirigen a la manipulación de GITRL y GITR, que incluyen pero no se limitan a GITRL y GITR de ratón y sus homólogos, se incluyen específicamente dentro de estos homólogos a GITRL humano y GITR humano. La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos purificados y aislados y polipéptidos relacionados con un nuevo ligando para GITR (GITRL) . La invención también proporciona anticuerpos del GITRL, asi como métodos para tratar, diagnosticar, pronosticar y raonitorear el avance de los trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias y rechazo a trasplantes, cánceres y enfermedades infecciosas. En una modalidad de la invención, los métodos y las moléculas descritos pueden usarse para manipular el resultado de una respuesta inmune durante el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que incluyen los trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias y rechazo a los trasplantes, así como cánceres y enfermedades infecciosas. En otra modalidad, los polinucleótidos descritos y polipéptidos de la invención que bloquean o inhiben la interacción entre GITR y GITRL, por ejemplo, mediante la subregulación de la expresión o actividad de GITRL o mediante el enlace de GITRL, pero que no inducen la señalización de GITR, pueden usarse para restaurar o mejorar la supresión del sistema inmunológico . En otra modalidad, la interacción entre GITR y GITRL puede bloquearse o inhibirse mediante una molécula pequeña. Se apreciará por un experto en el arte que estos tipos de regulación (es decir, estas modalidades) será muy beneficiosas en el tratamiento de los trastornos autoinmunes y algunas enfermedades inflamatorias, y trastornos similares o relacionados, así como en el tratamiento de rechazo a los transplantes. En otra modalidad, los polinucleótidos descritos y los polipéptidos de la invención que inducen la señalización de GITR, por ejemplo, mediante la sobreregulación de la expresión o actividad de GITRL o mediante el enlace agonístico de GITR, pueden usarse -para invertir, bloquear o invalidar la supresión del sistema inmunológico. En otra modalidad, la interacción entre GITR y GITRL puede mejorarse o imitarse por una molécula pequeña. Se apreciará por un experto en el arte que estos tipos de regulación serán muy benéficos en el tratamiento de cánceres y enfermedades similares, así como enfermedades infecciosas. Un experto en el arte también podría estar consciente ~ de los probables beneficios de combinar estas nuevas terapias con otras terapias establecidas. En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácidos nucleicos aislados que comprende la secuencia de los nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la molécula de los ácidos nucleicos se enlaza operativamente a por lo menos una secuencia que controla la expresión. En otra modalidad, se proporciona una célula hospedera transformada o transfectada con la molécula de los ácidos nucleicos. En otra modalidad, la invención proporciona un alelo aislado de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la invención proporciona un gen aislado que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula de los ácidos nucleicos aislada que hibridiza específicamente bajo condiciones altamente severas para la secuencia del nucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, o el complemento de ellas. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula de ácidos nucleicos aislada que codifica a una proteína que comprende la secuencia de los aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de ella que codifica a un fragmento activo de la proteína. En otra modalidad, la molécula de los ácidos nucleicos o fragmento de los mismos se ligan operativamente a por lo menos una secuencia que controla la expresión. En otra modalidad, se proporciona una célula hospedera transformada o transfectada con la molécula de los ácidos nucleicos aislada, o fragmentos de los mismos, enlazados operativamente a por lo menos una secuencia que controla la expresión. En otra modalidad, la invención proporciona un animal transgénico no humano en el que las células germinales y somáticas contienen la molécula de los ácidos nucleicos aislada o fragmenta de los mismos. En otra modalidad, la invención proporciona un animal transgénico no humano en el que las células germinales y somáticas contienen un ADN que comprende la secuencia de los nucleótidos de la SEQ ID N0:1 o la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la invención proporciona una proteína aislada que comprende la secuencia de los aminoácidos codificada mediante un ácido nucleico aislado que se hibridiza específicamente bajo condiciones altamente severas para la secuencia del nucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3, o 'el complemento de las mismas. En otra modalidad, la invención proporciona una proteína aislada que comprende la secuencia de los aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento activo de las mismas . En otra modalidad, la invención proporciona una molécula de los ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO:l o la SEQ ID NO: 3, o un fragmento de las mismas, en donde la expresión de la molécula de los ácidos nucleicos en una célula resulta en una producción disminuida de GITRL. En otra modalidad, la molécula de los ácidos nucleicos o fragmento de los mismos se enlaza operativamente a por lo menos una secuencia que controla la expresión. En otra modalidad, - se proporciona una célula hospedera transformada o transfectada con la molécula de los ácidos nucleicos aislada, o fragmentos de los mismos, enlazados operativamente a por lo menos una secuencia que controla la expresión. En otra modalidad, la invención proporciona un animal transgénico no humano en el que las células germinales y somáticas contienen la molécula de los ácidos nucleicos aislados o fragmentos de los mismos . En otra modalidad, la invención proporciona un oligonucleótido antisentido complementario a un ARNm que corresponde a una molécula de los ácidos nucleicos que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO : 3 , o un fragmento de las mismas , en donde el oligonucleótido inhibe la expresión de GITRL. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula del ARNsi que corresponde a una molécula de los ácidos nucleicos que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, o un fragmento de las mismas, en donde la molécula del ARNsi inhibe la expresión de GITRL. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado capaz de enlazar específicamente a una proteina aislada que comprende la secuencia del aminoácido codificado por un ácido nucleico aislado que se hibridiza específicamente bajo condiciones altamente severas a la secuencia del nucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, o el complemento de ellas. En otra modalidad, el anticuerpo neutraliza la actividad de GITRL. En otra modalidad, el anticuerpo es 5F1, que tiene ATCC número ???-5336 ó 10F12, que tiene ATCC número PTA-5337. En otra modalidad, el anticuerpo comprende el antígeno que enlaza a los fragmentos de 5F1 o 10F12. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado capaz de enlazar específicamente a una proteína aislada que comprende la secuencia del aminoácido de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento activo de la misma. En otra modalidad, el anticuerpo neutraliza la actividad de GITRL. En otra modalidad, el anticuerpo es 5F1, que tiene ATCC número PTA-5336, o 10F12, que tiene ATCC número PTA-5337. En otra modalidad, el anticuerpo comprende el antígeno los fragmentos que enlazan al antígeno de 5F1 o 10F12. En otra modalidad, la invención proporciona un método de separación por exclusión para los compuestos de prueba capaces de inhibir o bloquear la interacción de GITRL con GITR que comprende las etapas de poner en contacto una muestra que contiene GITRL y GITR con un compuesto de prueba y determinar si la interacción de GITRL con GITR en la muestra disminuye en relación con la interacción de GITRL con GITR en una muestra que no está en contacto con el compuesto, por medio de la cual una disminución en la interacción de GITRL con GITR en la muestra puesta en contacto con el compuesto identifica el compuesto como uno que inhibe o bloquea la interacción de GITRL con GITR. En otra modalidad, el compuesto identificado se usa en un método para tratar a un sujeto · con riesgo de, diagnosticado con, un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo a trasplantes, el método comprende las etapas de aislar a las células T del sujeto, tratar las células T aisladas con el compuesto identificado, y transferir las células T tratadas de vuelta al sujeto. En otra modalidad, el compuesto identificado se usa en un método para tratar a un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo a los trasplantes, el método comprende administrar al sujeto el compuesto identificado. En otra modalidad, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia del compuesto identificado en un sujeto que comprende las etapas de detectar un primer número de células T efecto previo a la administración del compuesto al sujeto, detectando un segundo número de células T efectoras del sujeto después de la administración del compuesto al sujeto, y comparar el primer número y el segundo número, por medio de una disminución significativa en el número de células T efectoras en el segundo número comparado al primer número indica que el compuesto es eficaz en el tratamiento de un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo a trasplantes en el sujeto. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, la invención proporciona un método de separación por exclusión para los compuestos de prueba capaces de mejorar o imitar la interacción de GITRL con GITR que comprende las etapas de poner en contacto a una muestra que contiene GITRL y GITR con un compuesto de prueba y determinar si la interacción de GITRL con GITR en la muestra se incrementa en relación con la interacción de GITRL con GITR en una muestra que no está en contacto con el compuesto, por medio del cual un incremento en la interacción de GITRL con GITR en la muestra puesta en contacto con el compuesto identifica el compuesto como uno que mejora o imita la interacción de GITRL con GITR. En otra modalidad, el compuesto identificado se usa en un método para tratar un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, cáncer o una enfermedad infecciosa, el método comprende las etapas de aislar las células T del sujeto, tratando las células T aisladas con el compuesto identificado, y transferir las células T tratadas anteriormente en el suj eto . En otra modalidad, el compuesto identificado se usa en un método para tratar un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, cáncer o una enfermedad infecciosa, el método comprende administrar al sujeto el compuesto identificado. En otra modalidad, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia del compuesto identificado en un sujeto que comprende las etapas de detectar un primer número de células T efectoras del sujeto previo a la administración del compuesto al sujeto, detectado un segundo número de células T del sujeto después de la administración del compuesto al sujetó, y comparar el primer número y el segundo número, por lo que un incremento significativo en el número de células T efectoras en el segundo número comparado con el primer número indica que el compuesto es eficaz en el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa en el sujeto. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo a los transplantes en un sujeto que comprende las etapas de detectar una cantidad de prueba de un producto del gen GITRL en una muestra del sujeto, y comparar la cantidad de la prueba con una cantidad normal del producto del gen GITRL en una muestra del control, en la que una cantidad de la prueba significativamente superior a la cantidad normal proporciona una indicación positiva en el diagnóstico de un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo a los transplantes. En otra modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar cáncer o una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende las etapas de detectar una cantidad de la prueba de un producto del · gen GITRL en una muestra del sujeto, y comparar la cantidad de la prueba con una cantidad normal del producto del gen GITRL en una muestra de control, por medio de la cual una cantidad de la prueba significati amente superior a la cantidad normal, proporciona una positiva en el diagnóstico del cáncer o una enfermedad infecciosa. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, un trastorno autoinmune, enfermedad inflamatoria, o rechazo a los trasplantes que comprende administrar al sujeto un antagonista del GITR. En otra modalidad, el método comprende administrar el GITR antagonista tal que se mantenga la susceptibilidad de las células T efectoras en el sujeto para la supresión mediante las células T reguladoras CD4+CD25+ (por ejemplo, en una cantidad efectiva para mantener tal susceptibilidad) . En otra modalidad, el GITR antagonista se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo anti-GITRL de neutralización, un anticuerpo anti-GITR de neutralización, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonística, una molécula de los ácidos nucleicos GITRL antisentido y una molécula de los ácidos nucleicos GITRL ARNsi. En otra modalidad, los trastornos autoinmunes o enfermedades inflamatorias se seleccionan del grupo que consiste de artritis reumatoide, encefalomielitis , osteoartritis , esclerosis múltiple, gastritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y otras dermatosis inflamatorias, diabetes tipo I, asma, alergia y enfermedades del intestino inflamatorio, que incluyen la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto con riesgo de, diagnosticado con, cáncer o un enfermedad infecciosa que comprende administrar al sujeto un agonista GITR. En otra modalidad, el método comprende administrar el agonista GITR tal que el agonista GITR proporciona una señal coestimuladora en las células T efectoras en el sujeto suministrándoles menos susceptibilidad a la supresión mediante las células T reguladoras CD4+CD25+ en el sujeto (por ejemplo, en una cantidad efectiva para proporcionar tal señal) . En otra modalidad, el agonista de GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, y un anticuerpo GITR antagónico. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inducir la proliferación de una población celular que contiene células T efectoras, que comprende administrar un GITR agonista a la población celular. En otra modalidad, el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteina de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, y un anticuerpo GITR agonístico. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la proliferación de una población celular que contiene células T efectoras, que comprende administrar un GITR antagonista a la población celular. En otra modalidad, el GITR antagonista se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-GITRL de neutralización, un anticuerpo anti-GITR de neutralización, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonística, una molécula de los ácidos nucleicos GITRL antisentido y una molécula de los ácidos nucleicos GITRL AR si. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, el GITR antagonista es 5F1 o 10F12. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir o bloquear la supresión de una población celular que comprende las células T efectoras en presencia de células T reguladoras CD4+CD25+, que comprende administrar un GITR agonista a la población celular. En otra modalidad, el método comprende administrar el GITR agonista tal que el GITR agonista proporciona una señal coestimuladora en las células T efectoras y suministra menos susceptibilidad a la supresión mediante las células T reguladoras CD4+CD25+ (por ejemplo, en una cantidad efectiva para proporcionar tal señal) . En otra modalidad, el GITR agonista se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL y un anticuerpo GITR agonísticos. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, la invención proporciona un método para suprimir una población celular que comprende células T efectoras en presencia de células T reguladoras CD4+CD25+' que comprende administrar un GITR antagonista a la población celular. En otra modalidad, el método comprende administrar el GITR antagonista tal que se mantenga la susceptibilidad de las células T efectoras para la supresión mediante las células T reguladoras CD4+CD25+ (por ejemplo, en una cantidad efectiva para mantener tal susceptibilidad) . En otra modalidad, el GITR antagonista se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-GITRL de neutralización, un anticuerpo anti-GITR de neutralización, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonística, una molécula de los ácidos nucleicos GITRL antisentido y una molécula de los ácidos nucleicos GITRL ARNsi. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, el GITR antagonista es 5F1 o 10F12. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de GITRL en un población celular, que comprende tratar la población celular con una molécula de los ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, o un fragmento de las mismas, en donde la expresión de_. la molécula de los ácidos nucleicos en una célula resulta en una producción disminuida de GITRL. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de GITRL en una población celular que comprende tratar la población celular con un oligonucleótido antisentido complementario a un ARNm que corresponde a una molécula de los ácidos nucleicos que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ NO:l o la SEQ NO: 3, o un fragmento de las mismas, en donde el oligonucleótido inhibe la expresión de GITRL. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de GITRL en una población celular que comprende tratar la población celular con una molécula de ARNsi dirigida a un ARNm correspondiente a una molécula de los ácidos nucleicos aislada que comprende la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO:l -e la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de GITRL en una población celular que comprende tratar la población celular con una molécula de ARNsi dirigida a un ARNm que corresponde a una molécula de los ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia del nucleótido complementaria a la secuencia del nucleótido de la SEQ ID N0:1 o la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de GITRL en una población celular que comprende tratar la población celular con un oligonucleótido antisentido a una molécula de los ácidos nucleicos que codifican GITRL. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de GITRL en una población celular que comprende tratar la población celular con una molécula de ARNsi dirigida a un ARNm que codifica GITRL. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inducir la expresión de GITRL en una población celular que comprende tratar la población celular transformando o transfectando la población celular con una molécula de los ácidos nucleicos aislada, que comprende la secuencia del nucleótido ' de la SEQ ID NO:l o la SEQ ID NO:3, o con una molécula de los ácidos nucleicos aislada, que codifica una proteína que comprende la secuencia del aminoácido de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la misma que codifica un fragmento activo de la proteína, en donde la molécula de los ácidos nucleicos se enlaza operativamente a por lo menos una secuencia que controla la expresión. En otra modalidad, la invención proporciona una población de células T efectoras que se han puesto en contacto in vitro o ex vivo con un agonista GITR. En otra modalidad, el GITR agonista se selecciona del grupo que consiste de GITRL, o un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula pequeña agonística y un anticuerpo anti-GITR agonístico. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa en un sujeto, el método comprende las etapas de obtener una población de células T efectoras, tratando la población con un GITR agonista, y administrar la población tratada al sujeto afligido con cáncer o una enfermedad infecciosa. En otra modalidad, el GITR agonista se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula pequeña agonística, y un anticuerpo anti-GITR agonístico. En otra modalidad, el sujeto padece de cáncer y la población tratada se usa como una vacuna del tumor. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un GITR agonista y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el GITR agonista se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula pequeña agonística, y un anticuerpo anti-GITR agonístico. En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un GITR antagonista y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el GITR antagonista se selecciona del grupo que consiste de de un anticuerpo anti-GITRL de neutralización, un anticuerpo anti-GITR de neutralización, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonística, una molécula de los ácidos nucleicos GITRL antisentido, y una molécula de los ácidos nucleicos GITRL ARNsi. En otra modalidad, el anticuerpo comprende los fragmentos que enlazan antíegno de 5F1 o 10F12. En otra modalidad, la invención proporciona un adyuvante de la vacuna que comprende un GITR agonista y un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno viral, un antigeno bacteriano, un antigeno de hongos, un antigeno parasitario, un antigeno de cáncer, un antigeno asociado con los tumores y fragmentos de los mismos. En otra modalidad, el GITR agonista se selecciona del grupo que consiste de GITRL, o un fragmento activo de GITRL, una proteina de fusión que contiene GITRL, una proteina de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula pequeña agonística, y un anticuerpo anti-GITR agonístico. En otra modalidad, la invención proporciona un adyuvante de la vacuna que comprende un GITR antagonista y un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un autoantígeno , proteína de un péptido amiloide, un aloantígeno, un transplante del antígeno, un alérgeno y fragmentos de los mismos. En otra modalidad, el GITR antagonista se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-GITRL de neutralización, un anticuerpo anti-GITR de neutralización, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonística, una molécula de los ácidos nucleicos GITRL antisentido, y una molécula de los ácidos nucleicos GITRL ARNsi. En otra modalidad, el anticuerpo comprende el antígeno que enlaza a los fragmentos de 5F1 o 10F12.
En otra modalidad, la invención proporciona un método de separación por exclusión para los compuestos de prueba capaces de neutralizar la actividad de GITRL, que comprende las etapas de poner en contacto una muestra que contiene GITRL y un anticuerpo de neutralización con el compuesto, y determinar si la interacción de GITRL con el anticuerpo de neutralización en la muestra disminuye en relación con la interacción de GITRL con el anticuerpo -de neutralización en una muestra que no está en contacto con el compuesto, por medio de lo cual, una disminución en la interacción de GITRL con el anticuerpo de neutralización en la muestra puesta en contacto con el compuesto identifica el compuesto como uno que inhibe o bloquea la interacción de GITRL con el anticuerpo de neutralización. En otra modalidad, el anticuerpo es 5F1 o 10F12. En otra modalidad, la invención proporciona un método para proporcionar una señal coestimuladora a una población celular que comprende las células T efectoras, el método comprende administrar un GITR agonista. En otra modalidad, el GITR agonista es una proteina seleccionada del grupo que consiste del grupo GITRL, o un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, y un anticuerpo anti-GITR agonístico. En otra modalidad, las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+.
Breve Descripción De Las Figuras La Figura 1 muestra la alineación (basada en la matriz de sustitución de los aminoácidos BLOSUM62 ; ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-19) de las secuencias de los aminoácidos para GITRL de ratón (m) y humano (h) . Las figuras 2A-2B muestran los resultados de experimentos en los efectos de GITRL: GITR que enlaza la proliferación de las células T CD4+CD25+. La incorporación de timidina se mide (CPM) como un medio para valorar la proliferación celular. Figura 2? muestra que un anticuerpo anti-GITR agonístico estimula la proliferación de las células T CD4+CD25+, pero no las células CD4+CD25-T. La Figura 2B muestra que las células YB2/0 que expresan GITRL estimulan la proliferación de las células CD4+CD25+. Las figuras 3A-3B muestran que GITRL expresado por las células de YB2/0 (-50,000), así como el anticuerpo anti-GITR agonístico (2 µg/ml) , invirtió la supresión (es decir, la supresión en porcentaje negativa) producida mediante las células T supresoras CD4+CD25+ aisladas recientemente (# supresores) . La Figura 3B muestra que las células GITRL-YB2/0 en números menores a 50,000 (es decir, ~3 , 000-25, 000) pudieron invertir parcialmente la supresión en una manera dependiente de la dosis. La figura 4 muestra que las células GITRL-YB2/0 (-50, 000) no invirtieron la supresión cuando las células T CD4+CD25+ activadas se usaron en lugar de las células T CD4+CD25+ aisladas recientemente se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo anti-GlTR agonístico. Las figuras 5A y 5B muestran que la inversión inducida por GITRL de la supresión producida por las células T CD4+CD25+ aisladas recientemente puede ser autoinvertida (es decir, restauración de la supresión) en presencia de un anticuerpo anti-GITRL ("anti-GITRL" = anticuerpo 5F1) . La figura 5B incluye un experimento adicional que muestra que un anticuerpo de control ("control Ig") no restaura la supresión. Las figuras 6A-6B muestran que el anticuerpo anti-GITRL puede mejorar sólo la supresión en presencia de células T CD4÷CD25+. La Figura 6A muestra la supresión de la proliferación de células de los ganglios linfáticos en presencia del anticuerpo anti-GITRL (5F1) . La figura 6B muestra la falta de actividad supresora de anticuerpo anti-GITRL cuando la población celular de ganglios linfáticos se vació de las células T CD4+CD254. Las figuras 7A-7F muestran la distribución de células que expresan GITRL en los tejidos linfoides. La Figura 7A: el análisis citométrico de flujo se realizó en células CDllc+ enriquecidas del bazo de ratones BALB/c con cuentas magnéticas, teñidas con los anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 y anti-GITRL. La expresión GITRL se determinó comparando la intensidad de fluorescencia de CD4+, CD8+, y subconjuntos de compuerta CD4" CD8" (paneles del histograma superior, medio, e inferior, respectivamente) teñidos con el anticuerpo anti-GITRL ( istogramas llenos) a la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con un anticuerpo de control de isotipo (los histogramas vacíos) . Figura 7B: Expresión de GITRL mediante las células dendríticas esplénicas (DCs) y las células B B-l fueron determinadas tiñendo las DC esplénicas BALB/c CDllc+ aisladas recientemente (panel del histograma superior) y las DC plasmacitoides CDllcbajoB220 (panel del histograma inferior) con el mAb del anti-GITRL (histogramas llenos) o un anticuerpo de control del isotipo (histogramas vacíos) y realizando el análisis citométrico de flujo. Figura 7C (panel del histograma superior) : Las intensidades de fluorescencia de las células B B220+ entre los esplenocitos totales (histograma lleno) , y las células B B-l (perC) peritoneal de compuerta CDllb+B220+ (línea sólida del histograma vacío) se tiñeron con el anticuerpo anti-GITRL y se compararon con la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con un control del isotipo (línea punteada del histograma vacío) . Figura 7C (panel del histograma inferior) : Se muestra una comparación de la intensidad de fluorescencia del anticuerpo GITRL teñido (histograma lleno) y anticuerpos del isotipo teñido (histograma vacío) macrófagos perC (células CDllb+B220~ ) . Figura 7D: Los timocitos se tiñeron para la expresión de CD4, CD8, y GITRL o un control del isotipo. Las intensidades de fluorescencia de las células CD4+CD8~ (cuadrante izquierdo superior) , CD4+CD8+ (cuadrante derecho superior) y CD4-CD8+ (cuadrante derecho inferior) teñidas con el anticuerpo anti-GITRL (histograraa lleno) se compararon con las intensidades de fluorescencia de las células teñidas con un anticuerpo de control del isotipo (histograma vacío) . Figura 7E: Expresión de GITRL mediante los precursores tímicos CD44+CD25" (Rl) , CD44+CD25+ (R2) , CD44-CD25+ (R3 ) Ó CD44-CD25" (R4) de compuerta se determinaron comparando la fluorescencia de las células teñidas con el anticuerpo anti-GITRL (histograma lleno) con la fluorescencia de las células teñidas con el anticuerpo de control del isotipo (histograma vacio) . Figura 7F: las células de los ganglios linfáticos no estimulados se tiñeron con los anticuerpos anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 y/o anti-GITRL. Las células CD4+CD8" (cuadrante izquierdo superior), y las células sin CD4~CD8+ (cuadrante derecho inferior) , se delinearon además con respecto a la expresión de CD25 mediante estas células. La expresión de GITRL por CD4+CD8"CD25 (el panel del histograma derecho superior) , CD4+CD8"CD25+ (panel del histograma derecho inferior) o células de los ganglios linfáticos de compuerta CD4"CD8+ (panel del histograma inferior (medio) ) se determinaron comparando la intensidad de fluorescencia de estas células teñidas con el anticuerpo anti-GITRL (histogramas llenos) con la fluorescencia de las células teñidas con un anticuerpo de control del isotipo (histogramas vacíos) . Los resultados son representativos de cinco experimentos independientes . Las figuras 8A-8D muestran la subregulación mediante APCs de GITRL siguiendo la estimulación. Figura 8A: Expresión de GITRL mediante células B B220+ esplénicas purificadas o células B B-l B220+CDllb+ (PerC) peritoneal totales se determinaron para distintos momentos de tiempo siguiendo el tratamiento con polyl : C (10 µg/ml) , LPS (0.5, µg/ml) , CpGs (ODN 1826, 1 µ?) , anti-CD40 y IL-4 (10 µg/ml y 20 ng/ml, respectivamente) y anti-Ig (F(ab')2 fragmento de cadena µ de cabra-anti-IgM, 1 µg/ml) . Se presentan las intensidades de fluorescencia de las células estimuladas teñidas con "anti-GITRL (histogramas llenos) , las células (medias) no estimuladas teñidas con anti-GITRL (histogramas vacíos " con líneas enteras) y las células teñidas con el anticuerpo de control del isotipo (histogramas vacíos con línea punteada) . Figura 8B: Expresión de GITRL mediante las células B 220+B (histograma lleno) presente entre los esplenocitos totales tratados con mAb anti-CD3 (0.5 µg/ml) después de un periodo de cultivo de 48 horas se comparó con la expresión de GITRL mediante las células B B220+ no estimuladas (histograma vacío con líneas completas) y células B B220+ teñidas con un anticuerpo de control del isotipo (histograma vacio con linea punteada) . Figura 8C: Expresión de GITRL (paneles del histograma superior) y B7.2 (es decir, CD86) (paneles del histograma inferior) mediante DCs CDllc+ purificadas continuando con un cultivo con o sin LPS (0.5 µg/ml) en los puntos de tiempo indicados. Figura 8D: Expresión de GITRL mediante los esplenocitos totales de compuerta en las células que expresan CD4+ o CD8+ después de 48 horas del periodo de cultivo en ausencia o presencia de mAb anti-CD3 soluble (0.5 µg/ml) . Los gráficos son representativos de dos de los cuatro experimentos independientes; todos los experimentos se llevaron a cabo con te idos aislados de los ratones BALB/c. Las figuras 9A-9C demuestran los efectos de bloquear las interacciones GITR/GITRL en la inhibición de la proliferación de los linfocitos. Para las figuras 9A y 9B, las barras indican los valores s. d. Figura 9A: Proliferación (eje y) de los ganglios linfáticos (LN; lxlO5) y células del bazo (Sp; 0.5x10s) con o sin células CD25+ (Total o ?25, respectivamente) se determinaron después del cultivo durante 72 horas con las distintas concentraciones de anti-CD3 soluble (eje x) . Las células se incubaron tanto en presencia de mAb anti-GITRL purificado (10 µg/ml; circuios cerrados) o un control del isotipo IgG2a de rata (10 µg/ml; círculos abiertos) . Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. Figura 9B: células T CD4+CD25~ o CD8+ se cultivaron en presencia de 5xl04 células irradiadas (3000R) APCs T- gotada y 5x1O4 células irradiadas (8000R) YB2/0-GITRL (círculos abiertos) o células control YB2/0 (círculos cerrados) . Los cultivos se activaron con diferentes concentraciones de mAb anti-CD3 soluble (eje x) , y proliferación (eje y) se midieron después de un periodo de cultivo de 72 horas. Figura 9C: la fluorescencia media (eje x) de células T CD4+CD25" purificadas teñidas con el anticuerpo anti-GITR se determinó en puntos de tiempo distintos continuando la activación con anti-CD3 soluble (0.5 µg/ml) en presencia de esplenocitos vacíos de T (3000R) irradiados . Los resultados son representativos de por lo menos dos experimentos independientes . Las figuras 10A-10C demuestran que la expresión GITR mediante células T CD25" se requiere para invertir la supresión. Figura 10A (paneles a-d) : Proliferación de cultivos conjuntos de células T CD4+CD25 (5 x 104) de varios ratones agénicos, y números variables de células T CD4+CD25+ (eje x) de varios ratones agénicos [ (Aa) CD4+CD25" : GITR+/+, CD4+CD25+: GITR+/+; (Ab) CD4+CD25": GI R*/*, CD4+CD25+: GITR''' ; (Ac) CD4+CD25": GITR' ', CD4+CD25+: GITR+/+; y (Ad) CD4+CD25": GITR ", CD4+CD25+: GITR~/~] , incubados con APCs irradiados de los ratones del tipo silvestre (5xl04) y con el anti-CD3 soluble (0.5 µg/ml) y 2 µg/ml de cualquier anticuerpo anti-GITR (circuios llenos) o un anticuerpo de control del isotipo (circuios abiertos) se determinó midiendo la absorción de 3H-timidina (cpm; eje y) . Figura 10B (paneles a-b) : la proliferación de cultivos conjuntos se realizó como arriba (Fig. 10A) con números variables de células T CD4+CD25+ de ratón (eje x) y cualquiera de las células T CD4+CD25~ de rata (Ba) o células T CD4+CD25" de ratón (Ba) en presencia de APCs de rata (3000R) irradiadas. Los cultivos se estimularon con un coctel de anticuerpos contra ambas, anti-CD3 del ratón y rata (0. 25^g/ml cada uno), y se trataron con 2 µg/ml de tanto un control del isotipo (IgG de rata; círculos abiertos) como de un anticuerpo anti-GITR (DTA-l; círculos llenos) . Las barras indican los valores s. d. calculados a partir de la proliferación en los cultivos por triplicado. Figura 10C: se describe la fluorescencia (eje x) de CD4+CD25+ de ratón teñidas con CFSE (paneles superiores) y células CD4+CD25-T de rata (paneles inferiores) cocultivados en un supresor 1:8 para una relación de respuesta con el control del isotipo (IgG de rata; paneles izquierdos) o anticuerpo anti-GITR (DTA-l; paneles derechos) . Los subconjuntos de células T de rata y ratón se distinguieron mediante el teñido con los anticuerpos anti~CD4 específicos. Los resultados son representativos de dos de cuatro experimentos independientes . Las figuras 11A-11C demuestra que las señales GITR se requieren para superar la supresión mediada por las células T reguladoras endógenas. Figura 11A (paneles a-d) : CFSE-células (LN) de los ganglios linfáticos (5 x 104) de B6 (tipo silvestre) , de ratones GITR÷/~ , CD28~/~ y GITR'^' se cultivaron durante 72 horas con distintas concentraciones de mAb anti-CD3 soluble (eje x) . Las células LN totales se cultivaron sin (Aa) o con (Ac) exógeno de IL-2 (50 U/ml) . Las células LN vacías de células CD25+ (LNA25) se cultivaron sin (Ab) o con (Ad) exógeno IL-2 (50 U/ml) . Barras que indican los valores s.d. se omitieron por claridad. Figura 11B: La valoración citométrica del flujo de dilución CFSE mediante las células T de los ganglios linfáticos de compuerta CD4+ y CD8+ aisladas de los animales CD28~/' , GITR'^', GITR+/+ o GITR+/' se realizó después de 72 horas de cultivo. Los resultados corresponden a la concentración de 0.63 tg/ml de anti-CD3 soluble (como en la Fig.llA) . Figura 11C: el análisis citométrico de flujo de la expresión CD25 se realizó en las células CD4+CD25~ positivas H-2D1> que permanecieron sin estimularse (línea punteada de los histogramas vacíos) , se obtuvieron de los ratones GITR'^' (histogramas vacíos con línea punteada) , o se obtuvieron a partir de los ratones GITR+/+ (histogramas llenos) . La expresión de CD25 mediante las células CD4+CD25" se obtuvieron a partir de los ratones GITR'/' o GITR+/+ se determinó después del cultivo durante 24 horas con APCs LN de ratones del tipo silvestre, en presencia de anti-CD3 (0.5 ig/ml) , en ausencia (paneles del histograma izquierdo) o presencia (paneles del histograma derecho) de células CD4+CD25+ de ratones BALB/c en una relación de respuesta 1:2 del supresor. La expresión CD25 se determinó también en ausencia (paneles del histograma superior) o presencia (paneles del histograma inferior) de rhIL-2 50 U/ml. Los resultados de arriba son representativos de tres experimentos independientes . Las figuras 12A-12C demuestran que la coestimulation dependiente de CD28 mejora la expresión de GIT y su sensibilidad. Figura 12?: Análisis citométrico de flujo de la expresión de GITR mediante la purificación de células T CD4+CD25~ o CD8+ (2. 5xl04) después de un cultivo de 72 horas con una unión de enlace de placa anti-CD3 y 2 g/ml de cualquier isotipo de hámster unido a la placa ("aCD3") o anti-CD28 unido a la placa ( "aCD3+aCD28 " ) . Figura 12B (panel del histograma izquierdo) : Teñido anti-GITR de células T CD4+CD25" cultivadas en presencia de esplenocitos vacías de células T irradiadas y anti-CD3 solubles (0.5 µg/ml) con o sin un coctel de anticuerpos anti-CD80/86 (10 g ml de cada) (es decir, anticuerpos anti-B7.1/7.2) durante 72 horas. Figura 12B (panel del histograma derecho) : Teñido anti-GITR de células T CD4+CD25~ cultivadas en presencia de esplenocitos vacíos de células T irradiadas y anti-CD3 soluble (0.5 µg/ml) con o sin un coctel de anticuerpos contra IL-2 e IL-2Roc.
Figura 12C: la proliferación se evaluó en la presencia o ausencia de mAbs anti-CD80/86 (10 ug/ml cada uno, "aB7") con la adición de ya sea mAb anti-GITR (2 µg/ml; "DTA-1" ) o un anticuerpo de control del isotipo (2 µg/ml "IgG de rata") . Las barras indican los valores s.d. Los resultados son representativos de dos de tres experimentos independientes. Las figuras 13A-13C demuestran que el GITRL que enlaza a GITR proporciona una señal coestimuladora de las células T efecto. Figura 13A: Proliferación de células T HT-2 GITR+/TCR+ (4xl04) solo (barras blancas) o cocultivadas con lxlO4 de células YB2/0 control (barras paralelas) o células YB2/0 que expresan GITRL (barras llenas) , en ausencia o presencia de una o dos perlas anti-CD3 pr célula HT-2, se determinaron midiendo la absorción de H-timidina (cpm; eje y) . Figura 13B: la proliferación de células HT-2 4xl04 cocultivadas con dos perlas anti-CD3 por célula, células de YB2/0 que expresan GITRL lxlO4 y concentraciones de incremento (ng/ml; eje x) de un anticuerpo anti-GITRL (5F1.1; círculos llenos) o un anticuerpo de control del isotipo (rlgGl; circuios abiertos) se determinaron midiendo la 3H-timidina (cpm; eje y) . Figura 13C: la proliferación de células HT-2 4x104 cocultivadas con dos perlas anti-CD3 por célula, células YB2/0 que expresan GITRL lxlO4 y concentraciones de incremento (ng/ml; eje x) de cuatro anticuerpos anti-GITRL diferentes: 5F1.1 (círculos llenos) , MGLT-10 (cuadrados llenos) , MGTL-15 (cuadrados abiertos) o un anticuerpo policlonal (círculos abiertos) se determinó midiendo la absorción de 3H-timidina (cpm; eje y) .
La figura 14 demuestra que el bloqueo del enlace GITR-GITRL con un anticuerpo anti-GITRL previene la transferencia adoptiva de la encefalomielitis autoinmune experimental inducida por PLP (EAE) . Se evaluó la incidencia de EAE en los ratones. Los ratones se inyectaron con 5xl06 esplenocitos que se aislaron de. los ratones SLJ hembras inmunizados con 150 ug del péptido PLP y reestimularon ex vivo durante 3 días en tres condiciones diferentes: solo 10 ug/ml PLP (círculos abiertos) , 10 µg/ml PLP y 10 µg/ml de un anticuerpo de control del isotipo (CKOl; círculos llenos) , o 10 µ /tt?1 PLP y anticuerpo anti-GITRL (5F1.1; cuadrados llenos) . Se monitoreó la incidencia de EAE durante 52 días (eje x) y se registraron en una escala de 0 a 5 (eje y) . Descripción Detallada de la Invención Debido a que los anticuerpos de GITR que producen una inversión de la actividad supresora parecen producir una señal agonística, se pronosticó que el acoplamiento de GITR mediante GITRL debe inhibir también la actividad supresora de células T reguladoras . La falta de reactivos adecuados ha impedido previamente un análisis funcional detallado de interacciones de GITR/GITRL bajo condiciones más fisiológicas. En la presente, se ha identificado el ortólogo del ratón GITRL y anticuerpos antagónicos que se enlazan específicamente al ortólogo de ratón de GITRL, es decir, no se ha generado uña . eacción transversalmente con GITRL humano. Usando este reactivo, se examinó la distribución del te ido y regulación de GITRL. Además, la habilidad de las interacciones de GITR/GITRL para regular la supresión de las células T se investigó usando ratones GITR'/' . Debido a que ambas células T CD25" y CD25+ expresan GITR a pesar de que varía en grados, los estudios ' previos demuestran una inhibición de la función del supresor en el tratamiento de los cultivos conjuntos con un anticuerpo anti-GITR agonístico produjo resultados equivocados con respecto a los objetivos celulares del acoplamiento de GITR. En la presente, usando combinaciones de células T CD4+CD25+ y CD4+CD25" del tipo silvestre y ratones GITR'/' en los experimentos del cultivo conjunto, se encontró que la ligación de GITR en las células T de respuesta CD4+CD25~, sin las células T supresoras CD4+CD25+ se requirió para invalidar la supresión. En ausencia de las células T CD4+CD25+, las células T GITR'/' llegaron a respuestas proliferativas similares a aquellas de los animales del tipo silvestre, a pesar de que se suprimieron totalmente en presencia de números fisiológicos de células T CD4+CD25+. Estos resultados sugieren, para la primera vez, que el acoplamiento de GITR/GITRL proporciona una señal indefinida que suministra células T efectoras resistentes a los efectos inhibidores de las células T CD4+CD25+. Así, la subregulación de la expresión GITRL subsecuente a las señales inflamatorias secundarias puede facilitar la supresión mediada por CD4+CD25+ y prevenir las consecuencias nocivas de una respuesta celular efecto exuberante. Esta investigación ha difundido nueva luz sobre los mecanismos que yacen en la interacción de GITR y sus ligandos GITRL, en especial con respecto a los efectos en las células T CD4+CD25", se entiende tradicionalmente que las células se dirigen a una actividad supresora. En resumen, usando los ratones GITR'/" , se demostró que la capacidad de mAb anti-GITR (anticuerpo del ratón agonístico a GITR) para invalidar la supresión media su acción en las células T CD4+CD25" sin CD4+CD25+ (como previamente se propusieron mediante varios estudios) . Las APCs (células que presentan antígenos) expresan constitutivamente GITRL, que se subregulan siguiendo la señalización del receptor tipo Toll. A pesar de que las células T CD4+CD25" de ratón GITR" " fueron capaces de llegar a respuestas proliferativas , fueron incapaces de proliferar en presencia de números fisiológicos de células T CD4+CD25+. Así, el GITRL proporciona una señal importante para las células T CD4"'"CD25~ y otras células T efectoras (por ejemplo, células T CD8+) , suministrándoles resistencia a la regulación mediada por CD4+CD25+ al inicio de la respuesta inmune. La subregulación de GITRL mediante los estímulos inflamatorios pueden mejorar la susceptibilidad de las células T efectoras (por ejemplo, las células T CD4+CD25~) a la actividad supresora durante el curso de por ejemplo, cáncer o un insulto infeccioso. Hasta este punto, la presente invención proporciona las secuencias de los nucleótidos y los aminoácidos de un nuevo homólogo de ratón de GITRL humano. Se ha identificado el GITRL humano (Kwon et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:6056-61; Gurney et al. (1999) Curr. Biol. 9:215-18); además, muy recientemente varios grupos también reportaron la clonación del ligando GITR murino (Kim et. al, 2003; Yu et al., 2003).
En un aspecto, la presente invención proporciona secuencias del nucleótido y secuencias del aminoácido, y fragmentos activos y/o proteínas de fusión de las mismas, de un nuevo homólogo de ratón de GITRL humano. Los polinucleótidos de GITRL de la invención incluyen polinucleótidos que modulan expresión de GITRL, por ejemplo, los vectores de expresión que comprenden polinucleótidos GITRL que puede sobreregular la expresión de GITRL, y/o antisentido y/o polinucleótidos GITRL ARNi que subregulan la expresión de GITRL. También se proporciona el uso de tales polinucleótidos para modular la expresión de GITRL en células y/o animales. Además de los polipéptidos de GITRL, la invención proporciona también otros polipéptidos agonísticos, por ejemplo, fragmentos activos de GITRL y/o proteínas de fusión GITRL que son capaces de imitar GITRL, es decir, que inducen actividad GITR en las células T efecto. Las células hospederas transíorinadas y animales transgénicos que contienen polinucleótidos GITRL también están se encuentran dentro del alcance de la invención. En otro aspecto, se proporcionan anticuerpos que enlazan específicamente a los nuevos polipéptidos GITRL de murino de la invención (es decir, no enlazan a GITRL humano) . En particular, se proporcionan anticuerpos de neutralización que inhiben la actividad de GITRL (por ejemplo, anticuerpos que previenen GITRL a partir del enlace de GITR) ; puede decirse que estos anticuerpos neutralizan la actividad de GITRL (es decir, suministran GITRL ineficaz) . Los anticuerpos de neutralización de la invención incluyen anticuerpos no humanos y humanos a GITRL que inhibe la actividad de GITRL, así como las versiones humanizadas y no humanizadas de la invención que inhibe la actividad de GITRL. También se incluyen dentro del alcance de la invención los anticuerpos antagonistas que pueden tener una o más mutaciones que pueden funcionar para mejorar la vida media, estabilidad o afinidad del anticuerpo, o pueden funcionar para modificar la función efecto del anticuerpo. Otro aspecto de la invención proporciona ensayos de separación por exclusión en los que los polinucleótidos y polipéptidos de GITRL incluyen pero no se limitan a homólogos humanos de los mismos, se usan para identificar los compuestos capaces de modular la actividad de GITR en una célula, organismo o sujeto. La invención también proporciona métodos para evaluar la eficacia de compuestos identificados por medio de los cuales el número de células T en un paciente se determinan antes y después de la administración del compuesto identificado. Adicionalmente, la invención proporciona métodos para tratar pacientes o sujetos que usan los compuestos identificados. Además de proporcionar los métodos de separación por exclusión de los compuestos de prueba capaces de modular la actividad de GITR, por ejemplo, agonistas de GITR o antagonistas de GITR., la invención- proporciona métodos para diagnosticar, pronosticar y monitorear el avance de trastornos relacionados con la desregulación del sistema inmunológico, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y rechazo a los transplantes, cáncer y enfermedades infecciosas . También se describen en la presente, métodos para usar GITRL y moléculas relacionadas de la invención, que incluyen moléculas GITR agonistas (es decir, polinucleótidos de GITRL, polipéptidos de GITRL, fragmentos activos de los mismos y/o proteínas de fusión de las mismos, moléculas pequeñas agonistas, anticuerpos agonísticos de GITR) , y moléculas GITR antagonistas (es decir, polinucleótidos inhibidores GITRL, anticuerpos de neutralización GITR, anticuerpos que neutraliza GITRL, moléculas pequeñas antagónicas y proteínas de fusión GITR) , para el tratamiento terapéutico de los trastornos relacionados con la desregulación del sistema inmunológico . Por ejemplo, los métodos para tratar un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, un trastorno autoinmune, rechazo a los transplantes, y/u otras enfermedades que comprenden administrar antagonistas GITR, por ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti-GITRL de neutralización al sujeto; también, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, cáncer o enfermedades infecciosas que comprenden administrar agonistas de GITR, por ejemplo, GITRL, o una proteína de fusión agonística de los mismos. Alternativamente, se proporcionan métodos para inducir o inhibir la proliferación de células T vía la administración de agonistas de GITR, por ejemplo, GITRL (que incluyen proteínas de fusión agonistas de las mismas) , o antagonistas de GITR, por ejemplo, anticuerpos anti-GITRL de neutralización o proteínas de fusión GITR antagonistas, respectivamente. Semejantemente, se proporcionan también métodos para bloquear o reforzar la supresión de células T en presencia de células T CD4+CD25+ que comprende la administración de agonistas de GITR, por ejemplo, GITRL (que incluyen proteínas de fusión agonísticos de los mismos) , o antagonistas de GITR, por ejemplo, anticuerpos anti-GITRL de neutralización, respectivamente. Las poblaciones de células T tratadas con los polipéptidos GITRL y las moléculas relacionadas (que incluyen las proteínas de fusión agonistas de las mismas) se encuentran dentro del alcance de la invención, y pueden administrarse a un sujeto en un método para el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa. Se proporcionan otros métodos de tratamiento, que incluye un método para tratar a un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con, un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo a los transplantes con un compuesto antagónico que disminuye la actividad de GITR, y métodos para tratar un sujeto con riesgo de, o diagnosticado con cáncer o una enfermedad infecciosa con un compuesto agonístico que incrementa la actividad de GITR. Las composiciones farmacéuticas, por ejemplo, adyuvantes de la vacuna, que comprenden polinucleótidos de GITRL, polipéptidos y moléculas relacionadas (que incluyen proteínas de fusión GITRL agonísticos y anticuerpos anti-GITRL antagonistas) de la invención también se encuentran dentro del alcance de la invención. Los métodos de la presente invención se refieren a GITRL y GITR, que incluyen pero no se limitan a, GITRL y GITR de ratón y sus homólogos; específicamente incluidos entre estos homólogos se encuentran el GITRL y GITR humano.
Polinucleotidos y Polipeptidos GITRL La presente invención proporciona nuevos polinucleotidos y polipéptidos purificados y aislados relacionados con un nuevo ligando para GITR (GITRL) . Los genes, polinucleotidos, proteínas y polipéptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, GITRL de ratón y sus homólogos . Por ejemplo, la invención proporciona polinucleótidos purificados y aislados que codifican GITRL murino. Las secuencias de ADN preferidas de la invención incluyen ADNc genómico y secuencias de ADN sintetizadas químicamente. La secuencia de los nucleótidos de un ADNc que codifica este nuevo ligando, el ADNc GITRL de ratón diseñado se establece en la SEQ ID NO:l. Los polinucleotidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones severas en la SEQ ID NO:l, o su complemento, y/o codifica los polipéptidos que retienen actividad biológica sustancial (es decir, fragmentos activos) de GITRL de ratón de longitud completa. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen porciones continuas de la secuencia establecida en la SEQ ID NO:l que comprende al menos 21 nucleótidos consecutivos . La secuencia del nucleótido de un ADN genómico que codifica a este nuevo ligando, designado el ADN genómico GITRL, se establece en la SEQ ID NO: 3. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones severas a la SEQ ID NO: 3, o su complemento, y/o codifica a los polipéptidos que retienen actividad biológica sustancial de GITRL de ratón de longitud completa. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen porciones continuas de la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 3 que comprende al menos 21 nucleótidos consecutivos . La secuencia de los aminoácidos de GITRL de ratón se establece en la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen porciones continuas de la secuencia establecida en la SEQ ID NO : 2 que comprende al menos 7 aminoácidos consecutivos . Un polipéptido preferido de la presente invención incluye cualquier porción continua de la secuencia establecida en la SEQ ID NO : 2 que retiene actividad biológica sustancial de GITRL de ratón de longitud completa. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen además de esos polinucleótidos de origen murino descritos arriba, polinucleótidos que codifican la secuencia de los aminoácidos establecidos en la SEQ ID NO: 2 o una porción continua de la misma, y que difiere de los polinucleótidos descrito arriba debido a la degeneración muy conocida del código genético.
Pueden usarse los polinucleótidos aislados de la presente invención como sondas de hibridación y cebadores para identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen las secuencias idénticas o similares a aquéllas que codifican a los polinucleótidos descritos . Los métodos de hibridación para identificar y aislar los ácidos nucleicos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , hibridaciones Southerm, hibridación in situ y la hibridación Northern que se conocen bien por aquellos expertos en el arte. Las reacciones de hibridación pueden realizarse bajo diferentes condiciones de severidad. La severidad de una reacción de hibridación incluye la dificultad de que cualquiera de dos moléculas de los ácidos ' nucleicos se hibridizarán entre sí. Preferentemente,- cada polinucleótido de hidridización hibridiza a su polinucleótido correspondiente bajo condiciones de severidad reducida, más preferentemente, condiciones severas, y .más preferentemente condiciones muy severas. Se muestran ejemplos de condiciones de severidad en la tabla 1 de abajo: condiciones muy severas son aquellas que son al menos tan severas como por ejemplo, condiciones A-F; condiciones severas son por lo menos tan severo como, por ejemplo, condiciones G-L; y condiciones de severidad reducidas son por lo menos tan severas como por ejemplo, las condiciones M-R.
TABLA 1 Condición Polinucleótido Longitud ' Temperatura Temperatura de híbrido del " de de lavado y severidad híbrido hibridización solución (bp)1 y solución amortiguadora2 amortiguadora2 A ADN: ADN >50 65°C, IX SSC 65°C, 0.3 X o 42°Cf IX SSC SSC, formamida al 50% B ADN: ADN <50 TB*, IX SSC TB*, IX SSC C ADN: ARN >50 67°C, IX SSC 67°C, 0.3 X O 45°C, IX SSC SSC, formamida al 50% D ADN: ARN <50 TD*, IX SSC TD*, IX SSC ? AR : ARN >50 70°C, IX SSC 70°C, 0.3 X o 50°C, IX SSC SSC, formamida al 50% F ARN: ARN <50 Tp* , IX SSC Tp* , IX SSC G ADNrADN >50 65°C, 4X SSC 65°C, IX SSC O 42°C, 4X SSC, formamida al 50% H ADN: A N <50 ??* I 4X SSC TH*, 4X SSC I ADN:A N >50 67°C, IX SSC 67°C, 1 X SSC O 42°C, IX SSC, formamida al 50% J ADN:AKN <50 Tj*, 4X SSC Tj*, 4X SSC K AKN:AKN >50 70°C, 4X SSC 67°C, IX SSC o 50°C, 4X SSC, formamida al 50% L AR :A5LN <50 TL*, 2X SSC Tj*, 2X SSC M ADN: ADN >50 50°C, 4X SSC 50°C, 2X SSC O 40°C, 6X ssc, formamida al 50% N ADN:ADN <50 TN*, 6X SSC TN*, 6X SSC 0 ADN:ARN >50 55°C, 4X SSC 55°C, 2 X SSC O 42°C, 6X SSC, formamida al 50% P ADN:A N <50 TP*, 6X SSC TP*, 6X SSC Q ARN-.ARN >50 60°C, 4X SSC 60°C, 2 X SSC o 45°C, 6X SSC, formamida al 50% ARN: ARN <50 TR*, 4X SSC TR* , 4X SSC xLa longitud del híbrido es la que se anticipa a las regiones hibridizadas de los polinucleótidos de hibridización. Cuando se hibridiza a un polinucleótido a un polinucleótido de direccionamiento de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido como aquella en la que se hibridiza al polinucleótido. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud híbrida puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad de la secuencia óptima. 2SSPE (el IxSSPE es NaCl 0.15M, lOmM NaH2P04, y 1.25mM EDTA, pH 7.4) puede sustituirse para SSC (el lxSSC es 0.15M NaCI y citrato de sodio 15mM) en la hibridización y las soluciones amortiguadoras de lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de que la hibridación está completa. TB*-TR* : La temperatura de hibridización para los híbridos se anticipa para ser de menos de 50 pares base en longitud debe ser de 5-10°C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo a las siguientes ecuaciones . Para los híbridos de menos de 18 pares base en longitud, Tm (°C)=2 (# de A + bases T) + 4 (# de bases C + G) . Para los híbridos entre 18 y 49 pares base en longitud, Tm (°C) =81.5 + 16.6 (logi0Na+)+ 0.41 (% G + C) - (600/N) , en donde N es el número de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de iones de sodio en la solución amortiguadora de hibridización (Na+ para IX SSC =0.165 M) . Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de severidad para la hibridación del polinucleótido en el Sambrook et al., Molecular Cloning: ? Laboratory Manual capítulos 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y Ausubel et al., eds . , Current Protocols in Molecular Biology, Sec 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, el Inc., (1995), incorporados en la presente mediante la referencia. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden usarse como sondas de hibridización y cebadores para identificar y aislar ADN que tiene secuencias que codifican variantes alélicas de los polinucleótidos descritos . Las variantes alélicas son formas alternativas que se presentan naturalmente en los polinucleótidos descritos, que codifican polipéptidos que son idénticos o que tienen una similitud significativa a los polipéptidos codificados mediante los polinucleótidos descritos. Preferentemente, las variantes alélicas tienen al menos una identidad de secuencia del 90% (más preferentemente, al menos una identidad del 95%; más preferentemente, al menos 99% de identidad) con los polinucleótidos descritos . Los polinucleótidos aislados de la presente invención también pueden usarse como sondas de hibridación y cebadores para identificar y aislar ADNs que tienen secuencias que codifican polipéptidos homólogos a los polinucleótidos descritos . Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados de una especie diferente a la de los polipéptidos y polinucleótidos descritos, o dentro de las mismas especies, pero con una similitud de la secuencia significativa a los polinucleótidos y polipéptidos descritos. Preferentemente, los homólogos de los polinucleótidos tienen al menos 50% de identidad de la secuencia (más preferentemente, al menos 75% de identidad; más preferentemente, al menos 90% de identidad) con los polinucleótidos descritos, considerando que los homólogos del polipéptido tienen al menos 30% de identidad de la secuencia (más preferentemente, al menos 45% de identidad; más preferentemente, al menos 60% de identidad) con los polipép idos descritos. Preferentemente, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos descritos son aquellos aislados de especies de mamíferos. Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden usarse también como sondas de hibridización y cebadores para identificar células y tejidos que expresan los polipéptidos de la presente invención y bajo las condiciones expresadas. Adicionalmente, pueden usarse los polinucleótidos aislados de la presente invención para alterar (es decir, mejorar, reducir o modificar) la expresión de los genes que corresponden a los polinucleótidos de la presente invención en una célula u organismo. Estos genes correspondientes son las secuencias de ADN genómicas de la presente invención (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3) que se transcriben para producir los A Nms a partir de los cuales se derivan los polinucleótidos del ADNc de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO:l) . La expresión alterada de los genes de la presente invención, que incluye pero no se limita a GITRL de ratón y sus homólogos, pueden obtenerse en una célula u organismo a través del uso de varios polinucleótidos inhibidores, tales como los polinucleótidos antisentido (por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos GITRL antisentido) y ribozimas que enlazan y/o desdoblan el AKNm transcrito a partir de los genes de la invención (ver por ejemplo, Galderisi et al. (1999) J. Cell Physiol. 181: 251-57; Sioud (2001) Curr. Mol. Med.l: 575-88). Tales polinucleótidos inhibidores pueden ser útiles previniendo o tratando los trastornos inmunes, enfermedades inflamatorias, rechazo a los transplantes, y trastornos similares o relacionados . Los polinucleótidos antisentido o ribozimas de la invención pueden ser complementarios a una hebra de codificación completa de un gen de la invención, o sólo una porción de la misma. Alternativamente, los polinucleótidos antisentido o ribozimas pueden ser complementarios a una región no codificante de la hebra de codificación de un gen de la invención. Los polinucleótidos antisentido o ribozimas puede construirse usando la síntesis química y las reacciones de ligación enzimáticas que usan procedimientos bien conocidos en el arte. Pueden modificarse los enlaces del nucleósido de los polinucleótidos sintetizados químicamente para mejorar su capacidad para resistir la degradación mediada por la nucleasa, así como para mejorar su especificidad de secuencia. Tales modificaciones de enlace incluyen pero no se limitan a, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoamidato, boranofosfato, morfolino y enlaces (PNA) de los ácidos nucleicos del péptido (Galderisi et al., supra; Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209-14; Micklefield (2001) Curr. ed. Chem. 8:1157-79). Alternativamente, estas moléculas.; pueden producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que un polinucleótido de la presente invención ha sido subclonado en una orientación antisentido (es decir, inversa) . Los polinucleótidos inhibidores de la presente invención también incluyen oligonucleótidos que forman un triplete (TFOs) que enlazan a la ranura principal del ADN duplo con especificidad y afinidad alta (Knauert y Glazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10: 2243-51). La expresión de los genes de la presente invención puede inhibirse mediante el direccionamiento de TFOs complementarios a las regiones reguladoras de los genes (es decir, el promotor y/o secuencias de mejora) para formar las estructuras de triple hélice que previenen la transcripción de los genes. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos inhibidores de la presente invención son moléculas de ARN de interferencia corta (ARNsi) (por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos GITRL ARNsi) . Las moléculas del ARNsi son cortas (preferentemente de 19-25 nucleótidos ; más preferentemente de 19 o 21 nucleótidos) , moléculas de ARN de doble hebra que provocan la degradación específica de las secuencias del ARNm de direccionamiento. Esta degradación se conoce como ARN de interferencia (ARNi) (por ejemplo, Bass (2001) Nature 411:428-29). Originalmente identificado en los organismos inferiores, el ARNi se ha aplicado eficazmente a las células de mamíferos y ha demostrado prevenir las hepatitis fulminantes en ratones tratados con moléculas ARNsi dirigidas al ARNm de Fas (Song et al., (2003) la naturaleza Med. 9:347-51) . Además, se ha reportado recientemente que los AR si suministrados intratecalmente bloquean las respuestas en los dos modelos (modelo de dolor inducido por los agonistas y el modelo del dolor neuropático) en la rata (Dorn et al. (2004) dúdele Acids Res. 32 (5) -.e49) . Las moléculas del ARNsi de la presente invención pueden ser generadas mediante la combinación de pares básicos de dos moléculas de ARN de hebra sencilla complementarias al mismo tiempo (uno que coincide con una porción del ARNm de direccionamiento) (FIRE et al., Patente norteamericana No. 6,506,559) o a través del uso de una sola molécula de ARN de horquilla sencilla que se pliega atrás a sí misma para producir el requisito de la porción de hebra doble (Yu et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 99:6047-52). Las moléculas del ARNsi pueden sintetizarse químicamente (Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-98) o producidas mediante la transcripción in vitro que usa plantillas de ADN de una hebra sencilla (Yu et al., supra) . Alternativamente, las moléculas del ARNsi pueden producirse biológicamente, ya sea temporalmente (Yu et al., supra; Sui et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 5515-20) o establemente (Paddison et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci . USA. 99:1443-48), usando un vector de la expresión que contiene las secuencias ARNsi sentido y antisentido. Recientemente, se demostró la reducción de los niveles del ARNm de direccionamiento en las células humanas primarias, de una manera eficaz y de secuencia específica, usando vectores adenovirales que expresan ARNs de horquilla, que se procesan además en el ARNsi (Arts et al. (2003) Genome Res. 13:2325-32). Las moléculas ARNsi dirigidas a los polinucleótidos de la presente invención pueden diseñarse en base al criterio conocido en el arte (por ejemplo, Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20: 6877-88). Por ejemplo, el segmento de direccionamiento del ARNm objetivo debe empezar preferentemente con AA (más-preferiblemente), TA, GA, o CA; la proporción de' GC de la molécula ARNsi debe ser preferentemente de 45-55%; la molécula del ARNsi no debe contener preferiblemente tres de los mismos nucleótidos en una fila; las molécula ARNsi no; deben contener preferentemente siete G/Cs mixtos en una fila;' y el segmento de direccionamiento debe estar preferentemente" en la región ORF del ARNm de direccionamiento y preferentemente debe ser por lo menos de 75 bp después de la iniciación ATG y por lo menos 75 bp antes del codón de detención. Basado en estos criterios, o en otros criterios conocidos (por ejemplo, Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnol . 22:326-30), las moléculas ARNsi de la presente invención, dirigidas a los polinucleótidos del AR m de la presente invención, pueden ser diseñadas por un experto en el arte . La expresión alterada de los genes de la presente invención en un organismo también puede lograrse a través de la creación de animales transgénicos no humanos en los que se han introducido los polinucleótidos a los genomas de la presente invención. Tales animales transgénicos incluyen animales que tienen copias múltiples de un gen (es decir, el transgen) de la presente invención. Una secuencia reguladora del tejido específica puede ser enlazada operativamente a los transgenes para dirigir la expresión de un polipéptido de la presente invención a las células particulares o una fase de desarrollo particular. Los métodos para generar animales transgénicos vía la manipulación del embrión y microinyección, particularmente los animales tales como los ratones, se ha vuelto convencional y son bien conocidos en el arte (por ejemplo, Bockamp et al., Physiol Genomics, 11:115-32 (2002) ) . La expresión alterada de los genes de la presente invención en un organismo también puede obtenerse a través de la creación de animales cuyos genes endógenos que corresponden a los polinucleótidos de la presente invención se han interrumpido a través de la inserción de secuencias del polinucleótidos extrañas (es decir, un animal agénico) .
La región de codificación del gen endógeno puede interrumpirse, mientras se genera una proteína no funcional. Alternativamente, la región reguladora en la dirección ascendente del gen endógeno puede interrumpirse o reemplazarse con los elementos reguladores diferentes, resultando en la expresión alterada de la proteína aún funcional . Los métodos para generar animales agénicos incluyen la recombinación homologa y son bien conocidos en el arte (por ejemplo, Wolfer et al., Trends Neurosci., 25: 336-40 (2002) ) . Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden ser ligados operativamente para una secuencia que controla la expresión y/o ligada en un vector de la expresión para la producción recombinante de los polipéptidos de la presente invención. Los métodos generales para expresar las proteínas recombinantes son bien conocidos en el arte . Tales proteínas recombinantes pueden expresarse en forma soluble para usarse en el tratamiento de los trastornos que resultan de la desregulación del sistema inmunológico; tales trastornos incluyen por ejemplo, cánceres y enfermedades infecciosas y trastornos autoinmunes y enfermedades inflamatorias y rechazo a los transplantes. Los trastornos autoinmunes y las enfermedades inflamatorias incluyen pero no se limitan a, la artritis reumatoide, encefalomielitis , osteoartritis , esclerosis múltiple, gastritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y otras dermatosis inflamatoria., diabetes;"tipo- 1, asma, alergia, y enfermedades del intestino inflamatorio que incluyen la enfermedad de Cronn y la colitis ulcerativa. Un vector de la expresión, como se usa en la presente, pretende referirse a una molécula de los ácidos nucleicos capaz de transportar otros ácidos nucleicos que han sido enlazados . Un tipo de vector es un plásmido que se refiere a un rizo de ADN de hebra doble circular en los que los segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedera en los que se introducen (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamífero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedera luego de la introducción en la célula hospedera, y por medio de la cual se replica a lo largo del genoma hospedador. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes que se ligan operativamente . Tales vectores se refieren en la presente como vectores de expresión recombinantes (o simplemente, vectores de la expresión) . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas del ADN recombinante son a menudo en la forma de los plásmidos . En la especificación presente, el plásmido y el vector pueden usarse indistintamente como el plásmido que es la forma normalmente usada del vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales (por ejemplo, replicación de los retrovirus defectivos, adenovirus y virus asociados con el adeno) que sirven como funciones equivalentes. En una modalidad, los polinucleótidos de la presente invención se usan para crear agonistas GITR, por ejemplo, polipéptidos ¦ GITRL, que incluyen fragmentos activos y/o polipéptidos de fusión de los mismos, que también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un polipéptido de GITRL o fragmentos activos de los mismos puede fusionarse a una porción secundaria, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento que enlaza Fe del mismo) . En algunas modalidades, el primer polipéptido incluye un polipéptido de GITRL de longitud completa. Alternativamente, el primer polipéptido puede comprender menos polipéptidos GITRL de longitud completa. Adicionalmente, las formas solubles de GITRL pueden fusionarse a través de las secuencias "de ligado" a la porción Fe de una inmunoglobulina. Otras proteínas de fusiones, tales como aquellas con glutation-S-transferasa (GST) , Lex-A, tioredoxin (TRX) o la proteína que enlaza maltosa (MBP) , también puede usarse.
Las proteínas de fusión pueden incluir además una secuencia de ligadura que une al fragmento GITRL o GITRL a la porción secundaria. El uso de tales secuencias de ligadura son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir un enlazador del péptido, por ejemplo, un enlazador del péptido de aproximadamente 2 a 20, más preferentemente de menos de 10 aminoácidos en la longitud. En una modalidad, el enlazador del péptido puede ser de 2 aminoácidos en la longitud. En otra modalidad, la proteína de fusión incluye una secuencia de señal heteróloga (es decir, una secuencia del polipéptido que no está presente en un polipéptido codificado por un ácido nucleico GITRL) en su término N. Por. ejemplo, una secuencia de señal de otra proteína puede fundirse con un polipéptido de GITRL, que incluye fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos. En ciertas células hospederas (por ejemplo, las células hospederas de mamífero) , pueden mejorarse la expresión y/o secreción de GITRL a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. Un péptido de señal que puede ser incluido en la proteína de fusión es MKFLWVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO: 11). Si se desea, pueden insertarse uno o más aminoácidos adicionalmente entre la primera porción del polipéptido que comprende la porción GITRL y la segunda porción del polipéptido. El segundo polipéptido es preferentemente soluble. En algunas modalidades, el segundo polipéptido mejora la vida media, (por ejemplo, la vida media del suero) del polipéptido vinculado. En algunas modalidades, el segundo polipéptido incluye una secuencia que facilita la asociación del polipéptido de fusión con un segundo polipéptido de GITRL. En las modalidades preferidas, el segundo polipéptido incluye al menos una última región de un polipéptido de inmunoglobulina. El polipéptido de fusión de inmunoglobulina se conoce en el arte y se describen en por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,516,964, 5,225,538, 5,428,130, 5,514,582, 5,714,147, y 5,455,165 todas incorporadas en la presente incorporadas mediante la referencia. Una proteína de fusión o quimérica de la invención puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos del ADN que codifican a las secuencias del polipéptido diferentes se ligan entre sí en la estructura de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminaciones con extremos romos o extremos escalonados para la ligación, digestión de la enzima de restricción para mantener las terminaciones apropiadas, relleno de extremos cohesivos apropiados, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable y una ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados.
Alternativamente, la amplificación de PCR de los fragmentos del gen puede llevarse a cabo usando cebadores de ancla que dan lugar a las colgaduras complementarias entre dos fragmentos del gen consecutivos que pueden formar pares básicos posteriormente y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérico (ver por ejemplo, Ausubel et al. (Eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992) . Por otra parte, muchos vectores de expresión se encuentran comercialmente disponibles, que codifican a una porción de la fusión (por ejemplo, una región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina) . Un ácido nucleico que codifica GITRL puede clonarse en tal vector de expresión en el cual la porción de la fusión se enlaza a la estructura a la proteína de la inmunoglobulina. En algunas modalidades, los polipéptidos de fusión GITRL existen como oligómeros tales como dímeros o trímeros . Una variedad de líneas celulares pueden actuar como células hospederas adecuadas para la expresión recombinante de los polipéptidos de la presente invención. Las líneas celulares hospederas de mamífero incluyen por ejemplo, células COS, células CHO, células T 293, células A431, células 3T3, células CV-1, células HeLa, células L, células BHK21, células HL-60, células U937, células HaK, células Jurkat, así como las cepas celulares derivadas de un cultivo in vitro del tejido primario y explantos primarios.
Alternativamente, puede ser posible producir recombinantemente los polipépti-dos de la presente invención en eucariotas inferiores tales como la levadura o en procariotas. Las cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen Saccharcrmyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas Kluyveromyces y cepas Candida. Las cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis y Sal onella typhi urium. Si los polipéptidos de la presente invención son elaborados en las levaduras o bacterias, puede ser necesario modificarlos mediante por ejemplo, fosforilación o glicosilación de sitios apropiados para obtener la funcionalidad. Tales uniones covalentes pueden realizarse usando métodos químicos y enzimáticos bien conocidos . La expresión en las bacterias puede resultar en la formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína recombinante . Así, el replegado de la proteína recombinante puede requerirse para producir el material activo o más activo. Varios métodos para obtener correctamente las proteínas heterólogas plegadas de los cuerpos de inclusión bacterianos son conocidos en el arte. Estos métodos generalmente involucran solubilizar la proteína de los cuerpos de inclusión, desnaturalizando entonces la proteína completamente usando un agente del caotrópico. Cuando los residuos de cisterna están presentes en la secuencia de los aminoácidos primaria de la proteína, es frecuentemente necesario lograr el replegado en un ambiente que permite la formación correcta de los enlaces disulfuro (un sistema de reducción) . Se describen los métodos generales de replegado en Kohno (1990) Meth. Enzymol. 185:187-95. La EP 0433225, y la solicitud de patente ü. S. Ser. No .08/163 , 877 describen otros métodos apropiados . Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser producidos recombinantemente ligando operativamente los polinucleótidos aislados de la presente invención a las secuencias de control en uno o más vectores de expresión de insectos, tales como los vectores del baculovirus, empleando un sistema de la expresión celular de insectos. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de baculovirus/Sf9 están comercialmente disponibles en la forma de un kit (por ejemplo, el kit MaxBac®, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los agonistas GITR, por ejemplo, la proteína GITRL, fragmentos activos y/o proteína de fusión de los mismos, puede prepararse haciendo crecer un cultivo de células hospederas transformadas bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína deseada. Siguiendo la expresión recombinante en las células hospedera apropiadas, pueden purificarse los polipéptidos de la presente invención a partir del medio de cultivo o los extractos celulares que usan procesos de purificación conocidos, tales como la filtración de gel y cromatografía de intercambio iónico. Las formas solubles de agonistas GITR, por ejemplo, proteína de GITRL, fragmentos activos y/o proteína de fusión de las mismas, puede purificarse a partir de los medios acondicionados. Las formas en las que se une a la membrana, por ejemplo, una proteína GITRL de la invención puede purificarse preparando una fracción de la membrana total de la expresión celular y la extracción de las membranas con un detergente no iónico tal como Tritón X-100. La purificación también puede incluir cromatografía de afinidad con agentes conocidos para enlazar a los polipéptidos de la presente invención. Estos procesos de purificación también pueden usarse para purificar los polipéptidos de la presente invención a partir de otras fuentes, que incluyen fuentes naturales. Como se describió previamente, los agonistas GITR, por ejemplo, proteína de GITRL, fragmentos activos y/o proteína de fusión de los mismos también pueden expresarse como un producto de animales transgénicos , por ejemplo, como un componente de la leche de vacas transgénicas , cabras, cerdos u ovejas que se caracterizan por células germinales o somáticas que contienen una secuencia del polinucleótido que codifica a los agonistas GITR. Los métodos que pueden usarse para purificar los agonistas GITR, por ejemplo, proteína GITRL, fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos, se conocen por aquellos expertos en el arte. Por ejemplo, una proteína GITRL de la invención puede concentrarse usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore. Siguiendo la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración por gel . Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio de anión, por ejemplo, una matriz o substrato que tenga los grupos dietilaminoetil colgantes (DEAE) o polietilenimina (PEI) . Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados normalmente en la purificación de la proteína. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio de catión. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices xnsolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo (por ejemplo, Columnas de S-Sefaróse® ) . La purificación de los agonistas GITR, por ejemplo, la proteína G1TRL, fragmentos activos y/o proteína de fusión de los mismos del sobrenadante del cultivo puede incluir también uno o más etapas de la columna sobre tales resinas de afinidad como la concanavalin A-agarosa, heparin-toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sep arose® o por cromatografía de interacción hidrofóbica usando tales resinas como fenil éter, butil éter o propil éter o mediante cromatografí de inmunoafinidad. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios RP-HPLC hidrofóbicos , por ejemplo, gel de silicio que tiene grupos colgantes u otros grupos alifáticos, puede emplearse para purificar adicionalmente la proteína GITRL. Las .columnas- de afinidad que incluyen anticuerpos para la proteína GITRL también pueden usarse en la purificación de acuerda con los métodos conocidos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores en varias combinaciones o con otros métodos conocidos también pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada substancialmente purificada. Preferentemente, la proteína GITRL aislada se . purifica de manera que esté sustancialmente libre de otras proteínas de mamíferos . Alternativamente, los agonistas G TR, por ejemplo, la proteína GITRL, fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos, también puede ser expresados recombinantemente en una forma que facilite la purificación. Por ejemplo, los polipéptidos pueden expresarse como fusiones con proteínas tales como la proteína que enlaza maltosa (MBP) , glutation-S-transferasa (GST) , o tioredoxina (TRX) . Los kits para la expresión y purificación de tales proteínas de fusión están comercialmente disponibles en New England BioLabs (Beverly, ??) , Pharmacia (Piscataway, NJ) , e Invitrogen, respectivamente. Los agonistas GITR, por ejemplo, la proteína GITRL, fragmentos activos y/o proteínas- de fusión de los mismos, también pueden etiquetarse con un epítopo pequeño y posteriormente identificarse o purificarse usando un anticuerpo específico del epítopo. Un epítopo preferido es el epítopo FLAG que se encuentra comercialmente disponible por Eastman Kodak (Nuevo Haven, CT) . Los agonistas GITR, por ejemplo, la proteína GITRL, fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos, también puede producirse mediante la síntesis química convencional conocida. Los métodos para sintetizar químicamente tales polipéptidos se conocen bien por aquellos expertos en el arte. Tales polipéptidos químicamente sintéticos pueden poseer propiedades biológicas en común con los polipéptidos naturales, purificados, y que pueden emplearse como sustitutos inmunológicos o biológicamente activos para los polipéptidos naturales . Los agonistas GITR, por ejemplo, la proteína GITRL, fragmentos activos y/o proteína de fusión de los mismos, también abarcan moléculas que son estructuralmente diferentes a los polipéptidos descritos (por ejemplo, que tienen una secuencia ligeramente alterada) , pero que tienen substancialmente las mismas propiedades bioquímicas como los polipéptidos descritos (por ejemplo, se cambia sólo en residuos de aminoácidos funcionalmente no esenciales) . Tales moléculas incluyen variantes alélicas que se presentan naturalmente y - variantes diseñadas deliberadamente que contienen alteraciones, substituciones, reemplazos, inserciones, o supresiones. Las técnicas para tales alteraciones, substituciones, reemplazos, inserciones, o eliminaciones se conocen bien por aquellos expertos en el arte. En algunas modalidades, la porción del polipéptido GITRL proporciona como un polipéptido de GITRL variante que tiene mutaciones en la secuencia de GITRL que se presenta naturalmente (tipo silvestre) que resulta en una secuencia GITRL más resistente a la proteólisis (relativo a la secuencia no mutada) . Los métodos descritos en la presente para la generación de agonistas GITR, por ejemplo, GITRL, fragmentos activos de los mismos y/o proteínas de fusión de los mismos, pueden usarse para generar antagonistas GITR, especialmente las proteínas GITR solubles, fragmentos activos de los mismos y/o proteínas de fusión de los mismos. Un experto en el arte reconocerá que para generar antagonistas GITR, por ejemplo, GITR soluble, los fragmentos activos de los mismos, y/o proteínas de fusión de los mismos, se requeriría la secuencia de los ácidos nucleicos o la secuencia de los aminoácidos de GITR, ambas conocidas. Usando estas secuencias, los antagonistas GITR, por ejemplo, GITR soluble, fragmentos activos de los mismos y/o proteínas de fusión de los mismos, puede generarse usando técnicas de ADN recombinantes y/o síntesis química como se describió anteriormente. Anticuerpos anti-GITRL En otras modalidades, la invención proporciona antagonistas GITR como los anticuerpos, o fragmentos que enlazan antígenos de los mismos, que enlazan específicamente a GITRL, preferentemente, GITRL mamífero (por ejemplo, murino) , y actividad GITR de neutralización. Un experto en el arte reconocerá que como se usa en la presente, él término "anticuerpo" se refiere a una proteína que comprende al menos uno, y preferentemente dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviadas en la presente como VH) , y por lo menos uno y preferentemente dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviadas en la presente como VL) . Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de ipervariabilidad llamada "regiones que determinan la complementariedad" ("CDR"), esparcidas con las regiones que son más conservadas llamadas "regiones de andamiaje" ("FR") . La magnitud de los FRs y CDRs se ha definido precisamente (ver, abat, ?.,?., et. al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta Edición, U.S. Departamento de Salud y Servicios Humanos, Publicación NIH No. 91-3242, y Chothia, C. , et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, que están en la presente incorporadas mediante la referencia) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, configurados a partir del término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. El anticuerpo puede incluir además una región constante de cadena pesada y ligera formando así una cadena de inmunoglobulina ligera y pesada, respectivamente. En una modalidad, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en donde las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras se interconectan mediante por ejemplo, enlaces disulfuro. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera comprende un dominio CL. La región variable de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente el enlace del anticuerpo a los factores o tejidos hospedadores, que incluyen varias células del sistema inmunológico (por ejemplo, las células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. La inmunoglobulina se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgAl y IgA2) , gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) , delta, epsilon y mu, así como los genes de región variable de inmunoglobulina miriada. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 d, o 214 aminoácidos) se codifican mediante un gen de región variable en el término NH2 (aproximadamente · de 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el término COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 Kd, o 446 aminoácidos) , se codifican igualmente por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo, gama (que codifican aproximadamente a 330 aminoácidos) . Los genes de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina codificados para la clase del anticuerpo, es decir, el isotipo (por ejemplo, IgM o igGl) . El fragmento que enlaza al antígeno de un anticuerpo (o simplemente "porción del anticuerpo" o "fragmento"), como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad para enlazar específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD3) . Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término '"fragmento que enlaza antígenos" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de VL, VH, CL y dominios de CH1; (ii) un fragmento F (ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados mediante un puente disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento de Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-46) que consiste de un dominio VH; y (vi) una región que determina la complementariedad aislada que determina la región (CDR) .' Además, a pesar de que dos dominios de los fragmentos Fv, VL y VH, son codificados mediante genes separados, pueden unirse usando métodos recombinantes , por medio de un enlazador sintético que les permite que sean elaborados como una cadena de proteina simple en donde el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como una cadena Fv sencilla (scFv) ; ver por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85:5879-83). Tales anticuerpos de cadena sencilla se pretenden abarcar también dentro del término "fragmento que enlaza antlgenos" de un anticuerpo. Estos fragmentos del anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el arte y los fragmentos se separan por exclusión para la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos . Un experto en el arte reconocerá que los métodos descritos en la presente para la generación de moléculas del anticuerpo en los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, GITRL murino, también pueden usarse para generar moléculas del anticuerpo para otras proteínas, por ejemplo, GITR o GITRL humano. Por consiguiente, los métodos para generar moléculas del anticuerpo no sólo aplican a los polipéptidos de la presente invención como se describió, sino también para por ejemplo, el GITR o GITRL humano. Las moléculas del anticuerpo de los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, los anticuerpos de neutralización del GITRL murino incluyen pero no se limitan a GITRL de ratón, y sus homólogos, pueden ser útiles en la prevención o tratamiento de trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, rechazo a los transplantes, y trastornos similares o relacionados . Otras moléculas del anticuerpo por ejemplo, los anticuerpos GITR agonísticos pueden ser útiles en los métodos de la invención para tratar el cáncer, enfermedades infecciosas y trastornos similares y relacionados . Tales moléculas del anticuerpo pueden ser producidas mediante métodos conocidos por aquellos expertos en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos mediante la generación de hibridomas de acuerdo con los métodos conocidos . Los hibridomas formados de esta manera se separan por exclusión usando métodos estándar tales como el ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzimas (ELISA) para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se enlaza específicamente con los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, también pueden usarse proteínas GITRL de la invención para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con la proteína GITRL y que puede inhibir el enlace de los ligandos al receptor, es decir, GITR. Semejantemente, también pueden usarse las proteínas GITR para obtener los anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con GITR. Los inmunógenos del péptido pueden contener además un residuo de cisteína en el término carboxilo, y se conjuga a un hapteno tal como una hemocianina de una variedad de lapa ( LH) . Los inmunógenos del péptido adicionales pueden ser generados reemplazando los residuos de la tirosina con los residuos de tirosina sulfatados. Los métodos por sintetizar tales péptidos son conocidos en el arte, por ejemplo, como en errifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54; Krstenansky et al. (1987) FEBSLett. 211: 10. Un polipéptido de longitud completa de la presente invención puede usarse como el inmunógeno, o, alternativamente, pueden usarse los fragmentos del péptido antigénico de los polipéptidos. Un péptido antigénico de un polipéptido de la presente invención comprende al menos 7 residuos de los aminoácidos continuos y abarca un epítopo tal que un anticuerpo surgido contra el péptido forma un complejo inmune específico con el polipéptido. Preferentemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 residuos del aminoácido, más preferentemente por lo menos 15 residuos del aminoácido, más aun preferentemente, por lo menos 20 residuos del aminoácido, y más preferentemente por lo menos 30 residuos del aminoácido. Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados por otros métodos conocidos por aquellos expertos en el arte de la tecnología de ADN recombinante . Como una alternativa para preparar los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal de un polipéptido de la presente invención puede identificarse y puede aislarse mediante la separación por exclusión de una colección de inmunoglobulina combinatorial (por ejemplo, un fago del anticuerpo que exhibe la colección) con un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, GITRL) o con GITR, para aislar así, miembros de la colección de inmunoglobulina que enlazan a los polipéptidos de la presente invención, o a GITR, respectivamente. Las técnicas y los kits disponibles comercialmente para generar y separar por exclusión las colecciones de despliegue de fagos que son bien conocidas por un experto en el arte. Adicionalmente , ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para usarse en la generación y separación por exclusión de las colecciones de despliegue de anticuerpos pueden encontrarse en la literatura. Por ejemplo, el método "despliegue de anticuerpos combinatoria!" se ha desarrollado para identificar y aislar los fragmentos del anticuerpo que tienen una especificidad de antígenos particulares, y que puede utilizarse para producir los anticuerpos monoclonales (para las descripciones de despliegue de anticuerpos combinatorial, ver por ejemplo, Sastry et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5728; Huse et al. (1989) Science 246:1275; Orlandi et al. 1989 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833) . Después de inmunizar un animal con un inmunógeno como se describió anteriormente, se clona el repertorio del anticuerpo del acumulado de células B resultantes . Los métodos son generalmente conocidos para obtener la secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina usando una mezcla de cebadores de oligómeros y PCR. Por ejemplo, los cebadores del oligonucleótido mixtos que corresponden a las secuencias líder 5' (péptido de señal) y/o las secuencias de la estructura 1 (FR1) asi como los cebadores para una región constante 3' conservada puede usarse para la .amplificación PCR de las regiones variables de cadena pesada y ligera a partir de una variedad de anticuerpos murino (Larrick et al. (1991) Biotechniques 11:152-56). Una estrategia similar puede también usarse para amplificar las regiones variables de cadena ligera y pesada a partir de los anticuerpos humanos (Larrick et al. (1991) Methods : Companion to Methods in Enzymology 2 106-TO) .
Los sueros policlonales y los anticuerpos pueden ser producidos inmunizando convenientemente a un sujeto -con un polipéptido de la presente invención. La concentración del anticuerpo en el sujeto inmunizado puede ser supervisada con el tiempo mediante técnicas estándar tales como ELISA que usan una proteína marcadora inmovilizada. Si se desea, las moléculas del anticuerpo dirigidas contra un polipéptido de la presente invención pueden aislarse del sujeto o el medio de cultivo y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como la cromatografía de la proteína A para obtener un fragmento IgG. Los fragmentos de los anticuerpos a los polipéptidos de la presente invención pueden ser producidos por el desdoblamiento de los anticuerpos de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 inmunológicamente activos pueden ser generados tratando los anticuerpos con una enzima tal como la pepsina.
Adicionalmente, los anticuerpos de cadena sencilla, humanizada, quimérica de los polipéptidos de la presente invención, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas pueden ser producidas usando técnicas de ADN recombinante y/o una colección de inmunoglobulina combinatorial recombinante . Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina endógenos pero que pueden expresar genes de cadena ligera y pesada humanos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) dirigidos contra GITRL pueden generarse usando ratones transgénicos que llevan los genes de inmunoglobulina humanos en lugar de los genes de inmunoglobulina de murino. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés puede usarse para · roducir hibridomas que secretan mAbs humano con afinidades especificas para los epítopos de una proteína humana (ver por ejemplo, ood et al., WO 91/00906; ucherlapati et al., WO 91/10741; Lonberg et al. WO 92/03918; Kay et al, WO 92/03917; Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-59; Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Morrison et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-55; Bruggeman (1993) Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90:3720-24; Bruggeman et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1323-26) . Los anticuerpos quiméricos que incluyen las cadenas de inmunoglobulina quiméricas pueden producirse mediante las técnicas del ADN recombinantes conocidas en el arte. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fe de una molécula del anticuerpo monoclonal murino (u otras especies) se digieren con las enzimas de restricción para remover la región que codifica al Fe murino y se sustituye la porción equivalente de un gen que codifica a una región constante Fe humana (ver Robinson et al . , Publicación Internacional de Patente PCT/US86/02269 ; Akira, et al., Solicitud de Patente Europea 171,496; Taniguchi, Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al., WO 86/01533; Cabilly et al., patente norteamericana No. 4,816,567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al., (1988) Science 240: 1041-43; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 84: 3439-43; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-26; Sun et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 84:214-18; Nishimura et al. (1987) Cáncer Res. 47:999-1005; Wood et al., (1985) Nature 314:446-49; y Shaw et al. (1988) J. .Nati. Cáncer Inst. 80: 1553-59). Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina puede humanizarse mediante métodos conocidos en el arte. Los anticuerpos humanizados que incluyen cadenas de inmunoglobulina humanizadas pueden generarse reemplazando las secuencias de la región variable Fv que no se involucra directamente en el enlace del antigeno con las secuencias equivalentes de las regiones variables Fv humanas. Los métodos generales por generar los anticuerpos humanizados son proporcionados por Morrison (1985) Science 229: 1202-07; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Queen et al., Patentes norteamericanas Nos. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762, los contenidos de estas se incorporan en la presente mediante la referencia. Aquellos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican todos o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de por lo menos una cadena pesada o ligera. Las fuentes de tales secuencias de los ácidos nucleicos se conocen bien por aquellos expertos en el arte y por ejemplo, puede obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un objetivo predeterminado. El ADN recombinante que codifica al anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, puede clonarse en un vector apropiado de la expresión. Las inmunoglobulinas o moléculas del anticuerpo injertado con CDR o humanizadas pueden ser producidas mediante la sustitución de CDR o injerto de CDR, en donde uno, dos, o todos los CDRs de una cadena de inmunoglobulina puede reemplazarse. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,225,539; Jones et al (1986J Wature 321: 552-25; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J: Immunol. 141: 4053-60; Winter, patente norteamericana No. 5,225, 539, los contenidos de las anteriores se incorporan en la presente mediante la referencia. Winter describe un método para injertar CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de patente del Reino Unido GB 2188638A; Winter, Patente norteamericana No. 5,225,539), los contenidos de las anteriores se incorporan en la presente mediante la referencia. Todos los CDRs de un anticuerpo humano particular puede reemplazarse con al menos una porción de CDR no humano, o sólo algunos CDRs que pueden reemplazarse con los CDRs no humanos . Sólo es necesario reemplazar el número de CDRs requerido para enlazar el anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado. Los anticuerpos monoclonales, quiméricos y humanizados que han sido modificados mediante por ejemplo, supresión, adición o sustitución de otras porciones del anticuerpo, por ejemplo, la región constante, también se encuentran dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo puede modificarse como sigue: (i) eliminado la región constante; (ii) reemplazando la región constante con otra región constante, por ejemplo, una región constante significa incrementar la vida media, estabilidad, o afinidad del anticuerpo, o una región constante de otras especies o clases de anticuerpos; o (iii) modificando uno o más aminoácidos en la región constante para alterar por ejemplo, el número de sitios de glicosilación, función celular efecto, enlace del receptor Fe (FcR) , fijación del complemento, etc., Los métodos para alterar la región constante a un anticuerpo son conocidos en el arte. Los anticuerpos con la función alterada, por ejemplo, afinidad alterada para un ligando efecto, tal como FcR en una célula, o un componente Cl del complemento, puede producirse reemplazando al menos un residuo del aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver por ejemplo, EP 388,151 Al, ü. , S. 5,624, 821 y la patente norteamericana 5,648,260, los contenidos de estas se incorporan en la presente mediante la referencia) . Tipos similares de alteraciones al murino (u otras especie) pueden aplicarse para reducir o eliminar estas funciones. Tales alteraciones son conocidas en el arte. Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fe de un anticuerpo (por ejemplo, un IgG, tal como un IgG humano) para un FcR (por ejemplo, Fe gamma Rl) , o el enlace de Clq al reemplazar los residuos específicos con un residuo que tenga una funcionalidad adecuada en su cadena lateral, o al introducir un grupo funcional cargado tal como glutamato o aspartato, o un residuo no polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptofano o alanina (ver por ejemplo patente E.U.A. 5,624,821). Los anticuerpos anti-GITRL de la invención pueden ser útiles para aislar, purificar y/o detectar polipéptidos GITRL en sobrenadante, lisado celular o en la superficie celular. Los anticuerpos descritos en esta invención también se pueden usar de diagnóstico para observar los niveles de proteína GITRL como parte de un procedimiento de prueba clínico, o dirigir clínicamente un modulador terapéutico a una célula o tejido que comprenda el antígeno del anticuerpo GITRL. Por ejemplo, un terapéutico tal como una molécula pequeña, u otro terapéutico de la invención se puede ligar al anticuerpo GITRL con objeto de dirigir el terapéutico a al célula o tejido que expresa GITRL. Los anticuerpos neutralizantes o no neutralizantes (preferiblemente anticuerpos monoclonales) que se enlazan a la proteina GITRL también pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones que involucran la desregulación del sistema inmune, por ejemplo, enfermedades autoinmunes. Estos anticuerpos monoclonales neutralizantes pueden ser capaces de bloquear GITRL al enlazarse a GITRL. La presente invención proporciona ademas composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con GITRL. Similarmente, los anticuerpos GITR pueden ser útiles en el aislamiento, purificación y/o detección GITR, monitorias por diagnóstico los niveles de GITR, o dirigir clínicamente un modulador terapéutico a una célula o tejido que comprende GITR. Los anticuerpos agonistas para GITR (preferiblemente anticuerpos monoclonales) también pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones que involucran la desregulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o enfermedades infecciosas. Estos anticuerpos agonistas pueden ser capaces de inducir la actividad de GITR. Así, la presente invención proporciona además composiciones que comprende un anticuerpo para GITR. Ensayos de separación por exclusión de GITRL Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar en ensayos de separación por exclusión para identificar agentes farmacológicos o compuestos líderes para agentes que pueden modular la actividad de GITRL y con ello GITR en una célula u organismo, y son por lo tanto reguladores potenciales de las respuestas inmunes. Por ejemplo, las muestras que contienen GITRL (ya sea natural o recombinante) pueden hacer contacto con una de una pluralidad de compuestos de prueba (ya sea agentes biológicos o moléculas orgánicas pequeñas) y la actividad de GITRL en cada una de las muestras tratadas se puede comparar con la actividad de GITRL en las muestras sin tratar o en muestras que hacen contacto con diferentes compuesto de prueba. Tales comparaciones deterrninarn si alguno de los compuestos de prueba resulta en: 1) un nivel substancialmente disminuido de expresión o actividad de GITRL, con lo cual indica un inhibidor de GITRL (por ejemplo, un compuesto que reestablece o mejora la supresión inmune) , o 2) un nivel substancialmente mejorado de expresión o actividad de GITRL, con lo cual indica un activador de GITRL (por ejemplo, un compuesto que invierte la supresión inmune) . En una modalidad, la identificación de los compuestos de prueba que pueden modular la actividad GITRL se lleva a cabo utilizando ensayos de separación por exclusión de alta producción tales como BIACORE® (Biacore International AB, Uppsala, Suecia) , BRET (transferencia de energía de resonancia por bioluminiscencia) y FRET (transferencia de energía de resonancia por fluorescencia) , así como los ensayos ELISA y los ensayos basados en células.
Moléculas pequeñas La actividad disminuida de GITR en un organismo - o sujeto) que padece (o está en riesgo) de trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios o rechazos de transplantes, o en una célula a partir de tal organismo (o sujeto) involucrado en tales trastornos, se puede también lograr a través del uso de moléculas pequeñas (usualmente moléculas orgánicas pequeñas) que antagonizan, esto es., inhiben la actividad de GITR. Se pueden identificar moléculas novedosas pequeñas antagonistas por métodos de separación por exclusión arriba descritos y se pueden usar en los métodos de tratamiento de la presente invención abajo descritos. De manera inversa, la actividad aumentada de GITR en un organismo (o sujeto) que padece (o esta en riesgo de) cáncer o enfermedad infecciosa, o en una célula a partir de tal organismo (o sujeto) involucrado en tales trastornos, también se puede lograr a través del uso de moléculas pequeñas (usualmente moléculas pequeñas orgánicas) que agonizan, esto es, mejoran la actividad de GITR. Se pueden identificar las moléculas pequeñas agonistas novedosas por los métodos de separación por exclusión antes descritos y se pueden usar en los métodos de tratamiento del cáncer y/o de enfermedad infecciosa como se describen a continuación.
Métodos para el diagnóstico, prognosis y monitoreo del avance de trastornos autoinmunes y cánceres Es bien conocido en el arte que los mecanismos inmunológicos estudiados en modelos animales, particularmente modelos murinos pueden ser y a menudo se traducen al sistema inmune humano. Como tales, aunque los ejemplos aquí descritos muestran el papel de GITR en la supresión inmune por las células reguladoras CD4+CD25+ en un modelo murino, los métodos descritos para el diagnóstico, prognosis y monitoreo de trastornos relacionados con la desregulación del sistema inmune, por ejemplo, trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios y rechazo dé transplantes y cáncer y enfermedad infecciosa, serán particularmente útiles para el diagnóstico, prognosis y monitoreo de tales trastornos en humanos. Al practicar los métodos descritos, un técnico experimentado reconocerá que los homólogos humanos de GITR y GITRL, asi como los agonistas y antagonistas humanos de GITR, se pueden usar en los método reivindicados de diagnóstico, prognosis y monitoreo de tales trastornos en humanos . La presente invención proporciona métodos para el diagnóstico, prognosis y monitoreo del avance de trastornos autoinmunes en un sujeto (por ejemplo, que involucran directamente o indirectamente incrementos en los niveles de GITRL) al detectar una sobreregulación de la actividad de GITR, por ejemplo, al detectar la sobreregulación de GITRL, incluyendo pero no limitado al uso de tales métodos en sujetos humanos Alguien experto en la técnica reconocerá que estos métodos, se pueden aplicar a enfermedades inflamatorias y también a rechazo de transplantes . Estos métodos se pueden efectuar al utilizar kits de diagnóstico preempacados que comprenden al menos uno del grupo que comprende el polinucleótido GITRL o fragmentos del mismo, polipéptido GITRL o porciones del mismo (incluyendo proteínas de fusión del mismo) , o anticuerpos para los polipéptidos GITRL o derivados de los mismos, o moduladores de los polinucleótidos y/o polipéptidos GITRL como se describen en la presente, que se pueden utilizar convenientemente por ejemplo en un entorno clínico. Además, alguien de experiencia en la técnica reconocería que la sobreregulación de GITRL también se puede detectar por métodos indirectos tales como conteo del número de células inmunes . "Diagnóstico" o "Diagnosticar" significa la identificación de la presencia o ausencia de una condición patológica. Los métodos de diagnóstico incluyen la detección de la sobreregulación de GITRL al determinar una cantidad de prueba del producto de genes GITRL (por ejemplo, AR m, ADNc, o polipéptido, incluyendo fragmentos del mismo) , en una muestra biológica a partir de un sujeto (humano o mamífero no humano) y comparando la cantidad de prueba con una cantidad normal o intervalo (esto es, en una cantidad o intervalo a partir de un individuo que se sabe que no padece de trastornos autoinmunes) para el producto de genes GITRL. Aunque un método de diagnóstico en particular puede no suministrar un diagnóstico definitivo de los trastornos autoinmunes, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayude en el diagnóstico. La presente invención también proporciona métodos para la prognosis tales como trastornos autoinmunes al detectar la sobreregulación de la actividad de GITR, por ejemplo al detectar la sobreregulación de GITRL. De "prognosis" o "pronóstico" significa predecir el desarrollo probable y/o severidad de una condición patológica. Los métodos de prognosis incluyen determinar la cantidad de prueba de un producto de genes GITRL en una muestra biológica a partir de un sujeto, y comparar la cantidad de prueba a una cantidad o intervalo de prognosis (esto es, una cantidad o intervalo a partir del individuo con severidades variables de trastornos autoinmunes) para el producto de genes GITRL. Diversas cantidades del producto de genes GITRL en una muestra de prueba son consistentes con ciertas prognosis para trastornos autoinmunes . La detección de una cantidad del producto de genes GITRL en un nivel de prognosis en particular proporciona una prognosis para el sujeto. La presente invención también proporciona métodos para el monitoreo del avance o el curso de tales trastornos autoinraunes, al detectar la sobreregulación de la actividad GITR, por ejemplo, al detectar la sobreregulación de GITRL. Los métodos de monitoreo incluyen la determinación de las cantidades de prueba de un producto de genes GITRL en muestras biológicas tomadas a partir de un sujeto en un primer y segundo momento y comparar las cantidades . Un cambio en la cantidad del producto de genes GITRL entre el primero y segundo momentos, indica un cambio en el curso de los trastornos autoinmunes con una disminución en la cantidad del producto de genes GITRL entre el primero y segundo momentos, indica un cambio en el curso de los trastornos autoinmunes con una disminución en la cantidad que indica la remisión de los trastornos autoinmunes y un incremento en la cantidad que indica el avance de los trastornos autoinmunes. Tales ensayos de monitoreo también son útiles para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica en particular en pacientes tratados por trastornos autoinmunes . La expresión mejorada de GITRL en los métodos antes señalados se puede detectar en una diversidad de muestras biológicas, que incluyen fluidos corporales (por ejemplo, sangre entera, plasma y orina) , células (por ejemplo, células enteras, fracciones de células, y extractos de células) y tejidos. Las muestras biológicas, también incluyen secciones tales como biopsias, y secciones congeladas tomadas para propósitos histológicos. Las muestras biológicas preferidas incluyen sangre, plasma, linfa, biopsias de tejido, orina, CSF (fluido cerebroespinal) , fluido sinovial y BAL (lavado broncoalveolar) . Se apreciará que el análisis de una muestra biológica no necesariamente requiere la eliminación de las células o te ido del sujeto. Por ejemplo, los agentes adecuadamente etiquetados que se enlazan a los productos de genes GITRL (por ejemplo, anticuerpos, ácidos nucleicos) se pueden administrar a un sujeto y visualizarse (cuando se enlazan al objetivo) usando tecnología estándar de formación de imágenes (por ejemplo, CAT, RN (MRI) y PET) . En los ensayos de diagnóstico y de prognosis de la presente invención, el producto de genes GITRL se detecta y cuantifica para producir una cantidad de pruebas . Luego se compara la cantidad de prueba con una cantidad o intervalo normal . Una cantidad significativamente arriba de la cantidad o intervalo normal es un signo positivo en el diagnóstico de trastornos autoinmunes. Los métodos particulares de detección y cuantificación de los productos de genes GITRL se describe a continuación. Las cantidades normales o niveles en la línea base de los productos de genes GITRL se pueden determinar para cualquier tipo y población de muestra en particular. Generalmente, los niveles en la línea base (normales) de la proteína GITRL o AR m se determinan al medir la cantidad de proteína GITRL o ARNm en un tipo de muestra biológica a partir de sujetos normales (esto es, saludable) . Alternativamente, los valores normales del producto de genes GITRL se pueden determinar al medir la cantidad en células o tejidos saludables que se toman del mismo sujeto a partir del cual se tomaron las células o tejidos de prueba enfermos (o posiblemente enfermos) la cantidad del producto de genes GITRL (ya sea la cantidad normal o cantidad de prueba) se puede determinar o expresar en - una base por célula por proteína total o por volumen. Para determinar la cantidad de células de una muestra, se puede medir el nivel de un producto de genes constitutivamente ..expresado u otro producto de genes expresado en niveles conocidos en células del tipo a partir del cual se toma la muestra biológica. Se apreciará que los métodos de ensayo de la presente invención no necesariamente requieren de la medición de valores absolutos del producto de genes GITRL debido a que son suficientes los valores- relativos para muchas aplicaciones de estos métodos . También se apreciará que además de la cantidad o abundancia de los productos de genes GITRL, los productos de genes GITRL -variantes o anormales o sus patrones de expresión (por ejemplo, transcritos mutados, polipéptidos truncados) se pueden identificar por comparación con productos de genes normales y patrones de expresión. Los ensayos de diagnóstico, prognosis y monitoreo de la presente invención, involucran la detección y cuantificación de los productos de genes GITRL en muestras biológicas . Los productos de genes GITRL incluyen GITRL ARNm y el polipéptido GITRL y se pueden medir usando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, el ARNm de GITRL se puede detectar directamente y cuantificar utilizando ensayos basados en hibridación tales como hibridación Northern, hibridación in situ, manchados de ranura y de punto y configuraciones de oligonucleótido . Los ensayos basados en hibridación se refieren a ensayos en los cuales se hibridiza un ácido nucleico de sonda a un ácido nucleico objetivo. En algunos formatos, el objetivo, la sonda o ambos se inmovilizan. El ácido nucleico inmovilizado puede ser ADN, ARN, u otro oligonucleótido o polinucleótido y puede comprenden nucleótidos que no se presentan o que no se presentan naturalmente, análogos de nucleótidos o columnas. Los métodos de selección de las secuencias de sonda de ácido nucleico para su uso en la presente invención, se basan en la secuencia de ácido nucleico de GITRL y son bien conocidos en el arte. Alternativamente, el ARNm de GITRL se puede amplificar antes de la detección y cuantificació . Tales ensayos basados en amplificación son bien conocidos en el arte e incluyen la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , transcripción inversa PCR (RT-PCR) , ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas por PCR (PCR-ELISA) y reacción en cadena de ligasa (LCR) . Los cebadores y sondas para producir y detectar producto de genes GITRL amplificados (por ejemplo, ARNm o ADNc) se pueden diseñar o producir fácilmente sin experimentación indebida por aquellos expertos en la técnica con base en la secuencia de ácidos nucleidos de GITRL. Los productos de genes GITRL amplificados se pueden analizar directamente por ejemplo, por electroforesis de gel, por hibridación a un ácidos nucleico de sonda; por formación de secuencias; por detección de una señal fluorescente, fosforescente o radioactiva; o por cualquiera de una diversidad de métodos bien conocida. Además, se conocen métodos por aquellos expertos en la técnica para incrementar la señal producida por amplificación de secuencias objetivo de ácido nucleico. Alguien experto en la técnica reconocerá que cualquiera que sea el método de amplificación, se pueden usar una diversidad de métodos cuantitativos conocidos en el arte (por ejemplo, PCR cuantitativa) sin se desea la cuantificación de los productos de genes GITRL. El polipéptido GITRL (o fragmentos del mismo) se puede detectar utilizando diversos ensayos inmunológicos bien conocidos que emplean los anticuerpos anti-GITRL antes descritos. Los ensayos inmunológicos se refieren a ensayos que utilizan un anticuerpo (por ejemplo, policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado, scFv y fragmentos del mismo) que se enlaza específicamente al polipéptido GITRL (o fragmento del mismo) . Tales ensayos inmunológicos bien conocidos adecuados para la práctica de la presente invención incluyen ELISA, radioinmunoensayo (RIA) , inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, selección de células activadas por fluorescencia (FACS) , y manchado Western. También se puede detectar el polipéptido GITRL utilizando GITR etiquetado. Alguien de experiencia en la técnica entenderá que se pueden aplicar los métodos antes mencionados a trastornos autoinmunes y a otros trastornos (tales como enfermedades inflamatorias) , incluyendo pero no limitado a, artritis reumatoide, osteoartritis, esclerosis múltiple, gastritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y otras dermatosis inflamatorias, diabetes de tipo I, asma, alergia y enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerante. Alguien de experiencia en la técnica también reconocerá que los métodos antes mencionados o variaciones en los mismos también se pueden usar para el diagnóstico, prognosis y monitoreo . del avance de diversos cánceres y enfermedades infecciosas en un sujeto (por ejemplo, que involucran directa o indirectamente disminuciones en los niveles de GITRL) al detectar una subregulación de la actividad GITRL, por ejemplo, al detectar la subregulación de GITRL, incluyendo pero no limitado al uso de tales métodos en sujeto humanos.
Uso de GITRL y moléculas relacionadas en terapia Los solicitantes consideran que son los primeros en reconocer que el enlace de GITR en las células T efectoras por GITRL, u otros agonistas GITR, proporciona una señal coestimuladora a las células T efectoras en donde tal señal produce las células T efectoras menos susceptibles a la supresión por las células T reguladoras CD4+CD25+, e incrementa la capacidad de las células T efectoras para proliferar en respuesta a anti-CD3 u otras señales activadoras. Aunque se utilizó el modelo murino para descubrir el mecanismo, es bien conocido en el arte que los mecanismos inmunológicos estudiados en modelos murinos, pueden ser y a menudo se traducen al sistema inmune humano. Como tal, los métodos descritos para utilizar GITRL y moléculas relacionadas, esto es, agonistas GITR o antagonistas GITR, para tratar trastornos relacionados a la desregulación del sistema inmune por ejemplo, trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios y rechazo de transplantes y cáncer y enfermedad infecciosa, serán particularmente útiles para el tratamiento de tales trastornos en humanos . En la práctica de los métodos descritos, un técnico experimentado reconocerá que los homólogos humanos de GITR y GITRL, asi como los agonistas o antagonistas humanos GITR, pueden usarse en los métodos revindicados de uso de las proteínas relacionadas con GITRL y GITRL, esto es, agonistas y antagonistas GITR, en el tratamiento de trastornos autoinmunes , trastornos inflamatorios, y rechazo de transplantes y cáncer y enfermedades infecciosas en humanos . Las moléculas relacionadas con GITRL aquí descritas, esto es, agonistas o antagonistas de GITR, incluyendo moduladores del polinucleótido y/o polipéptido GITRL en su actividad identificado usando los métodos antes descritos, se pueden usar in vitro, ex vivo, o incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a individuos in vivo para tratar por ejemplo trastornos autoinmunes por la administración de un antagonista GITR · (por y ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, moléculas antagonistas pequeñas, anticuerpos neutralizantes ant-i-GITR y/o anticuerpos neutralizantes GITRL) o, por ejemplo, cánceres por la administración de un agonista GITR- (por ejemplo, polinucleótidos GITRL, polipéptido GITRL, o proteínas de fusión de los mismos, moléculas pequeñas agonistas y/o anticuerpos agonistas anti-GITR) . Tales moléculas GITRL y/o moléculas relacionadas (incluyendo moduladores) , incluyen pero no se limitan a GITRL de ratón y sus homólogos (y anticuerpos para tales moléculas) y tales homólogos que incluyen pero no se limitan a GITRL humano. Diversos métodos farmacogenómicos a considerarse en la determinación de si se administran GITRL y/o moléculas relacionadas con GITRL, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen asociación amplia del genoma, métodos del -gen "candidato, y perfiles de expresión de genes. Se -formula una composición farmacéutica de la invención para ser compatible con su vía pretendida de administración (por ejemplo, las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente o un portador comestible) . Otros ejemplos no limitativos de vías de administración incluyen administración parenteral (por ejemplo, intravenosa) , intradermal, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación) , transdermal (tópica) , transmucosal y administración rectal . Las composiciones farmacéuticas compatibles con cada vía pretendida son bien conocidas en el arte . Los agonistas o antagonistas GITR se pueden usar como composiciones farmacéuticas cuando - se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede contener además de los agonistas o antagonistas GITR y el portador, diversos diluyentes, rellenos, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en el arte. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos . Las características del portador dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL2-, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, factor de células madre y eritropoyetinas . La composición farmacéutica también puede incluir anticuerpos anticitocina como se describen en mayor detalle a continuación. La composición farmacéutica puede contener factores trombolíticos o antitrombóticos tales como activador de plasminógeno y factor VIII. La composición farmacéutica puede además contener otros agentes antiinflamatorios como se describen en mayor detalle a continuación. Tales factores y/o agentes adicionales se pueden incluir en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico como los agonistas o antagonistas GITR o para minimizar los efectos colaterales provocados por los agonistas o antagonistas GITR. De manera inversa los agonistas o antagonistas GITR se pueden incluir . en formulaciones de la citocina en particular, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico, o agente anti-inflamatorio, para - minimizar los efectos laterales de la citosina, linfocina, otros factores hematopoyéticos , factor trombolítico o antitrombótico, o agente anti-inflamatorio . La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de una liposoma en la cual los agonistas o antagonistas GITR se combinan, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes antipáticos tales como lí-pidos que existen en forma agregada como micelos, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares en solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formación liposomal incluyen sin limitación monoglicéridos, diglicéridos , sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, etc. La preparación de tales formulaciones de liposomas está dentro del nivel de experiencia en la técnica como se describe por ejemplo en las patentes de EUA No. 4,235,871; Patente de EUA No. 4,501,728; Patente d EUA No. 4,837,028; y Patente de EUA No. 4,737,323, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa, la cantidad total de cada compuesto activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente por ejemplo, la mejora de los síntomas de curación de o incremento en la velocidad de curación de tales condiciones. Cuando se aplica a un individuo el ingrediente activo administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidad combinadas de los ingredientes activos que resulten en el efecto terapéutico ya sea que se administren en combinación, en serie o simultáneamente.
En la práctica el método de tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista GITR (por ejemplo un polinucleótido GITRL o un polipéptido GITRL expresado del mismo) o un antagonista GITR (por ejemplo un anticuerpo neutralizante anti-GITRL o anticuerpo neutralizante anti-GITR) se administra a un sujeto por ejemplo un mamífero (por ejemplo un humano) . Un agonista o antagonista GITR se puede administrar de acuerdo con el método de la invención ya sea solo o en combinación con otras terapias tales como tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos o agentes antiinflamatorios. Cuando se coadministra con uno o más agentes, los agonistas o antagonistas GITR se pueden administrar simultáneamente con el segundo agente o secuencialmente . Si se administran secuencialmente, el médico que atiende decidirá la secuencia adecuada de administración por ejemplo, un polipéptido GITRL (o proteína de fusión del mismo) o anticuerpo neutralizante anti-GITRL en combinación con otros agentes . Cuando se administra oralmente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista o antagonista GITR, el agente de enlace estará en forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de tabletas, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un portador sólido tal como una gelatina o una adyuvante. La tableta, cápsula o polvo contiene desde alrededor de 5 hasta alrededor de 95% de agente de enlace y preferiblemente desde alrededor de 25 hasta 90% de agente de enlace. Cuando se administra en forma líquida, un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o de plantas tales como aceite de cacahuate, aceite- mineral, aceite de soya o aceite de ajonjolí, o aceites sintéticos se pueden agregar. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como el etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol . Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica tiene desde alrededor de 0.5 hasta 90% de peso del agente de enlace, y preferiblemente desde alrededor de 1 hasta 50% en peso del agente de enlace. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista o antagonista GITR se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agonista o antagonista de GITR estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones y proteína parenteralmente aceptables que tienen una referencia debida al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está dentro de la experiencia de aquellos en -la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener además del agonista o antagonista GITR un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro de sodio , inyección de .Ringer,' inyección de dextrosa, inyección de cloruro de sodio y dextrosa, inyección de Ringer lactada y otro vehículo como se conozca en el arte . Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener estabilizadores, conservadores, soluciones amortiguadoras, antioxidantes u otros aditivos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. La cantidad de un agonista o antagonista GITR en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición a tratarse, y de la naturaleza de los tratamientos previos a que se haya sometido el paciente . Finalmente , el médico que atiende decidirá la cantidad del agonista o antagonista GITR con la cual tratar a cada paciente en lo individual . Inicialmente , el médico que atiende administrará dosis baj as del agonista o antagonista GITR y observará la respuesta del paciente . Se pueden administrar mayores dosis del agonista o antagonista GITR hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente , y en ese punto la dosis no se incrementa generalmente más . Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar el método de la presente invención deban contener alrededor de 0 . 1 µg hasta alrededor de 100 mg de , por ej emplo, polipéptido GITR o el anticuerpo neutralizante anti -GITRL por kilogramo de peso corporal .
La duración de la terapia intravenosa (i. v.) utilizando una composición farmacéutica de la presente invención variará, dependiendo de la severidad de la enfermedad a tratarse y la condición y la respuesta idiosincrática potencial de cada paciente en lo individual . Se contempla que la duración de cada aplicación del agonista o antagonista GITR puede estar en el intervalo de 12 hasta 24 horas de administración intravenosa continua. También se contempla la terapia subcutánea (s.c.) usando una composición farmacéutica de- la presente invención. Estas terapias se pueden administrar diariamente, semanalmente, o de manera más preferida, bisemanalmente o mensualmente . También se contempla en donde el agonista o antagonista GITR es una molécula pequeña, se puedan administrar las terapias diariamente, 2 veces al día, 3 veces día la día, etc. Finalmente el médico que te atiene decidirá la duración adecuada de la terapia i.v. o s.c o la terapia con una molécula pequeña y el tiempo de administración de la terapia utilizando la composición farmacéutica de la presente invención. Los polinucleótidos y proteínas de la presente invención se espera que muestren uno o más de los usos o actividades biológicas (incluyendo aquellos asociados con los ensayos aquí citados) identificados a continuación. Los usos o actividades descritas para las proteínas de la presente invención se pueden suministrar por la administración o uso de tales proteínas o por la administración o uso de los polinucleótidos que codifican tales proteínas (tales como por ejemplo en terapias de genes o vectores adecuados para la intrucción del ADN) . Uso de los agonistas GITRL y otros agonistas GITR para mejorar una respuesta inmune En una aspecto, la presente invención proporciona métodos para incrementar las células inmunes por ejemplo células T (por ejemplo una célula T efectora) proliferación por contacto de una célula inmune o una población de células inmunes con un agonista GITR, por ejemplo un polinucleótido o polipéptido GITRL de la invención (por ejemplo una proteína de fusión del mismo) y/o un anticuerpo anti-GITR agonista el cual potencia o mejora la actividad de GITR. Estos métodos se basan al menos en parte en el hallazgo de que un anticuerpo anti-GITR agonista que invierte la supresión mediada por células T CD4+CD25+ de la proliferación celular CD4+CD25~ (ejemplo 5) . Los métodos también se basan en parte en el hallazgo de que el enlace GITR mediante por ejemplo GITRL o un anticuerpo agonista anti-GITR induce la proliferación de las células T efectoras (por ejemplo las células CD4+CD25" y CD8+) (ejemplo 9 y ejemplo 13) . Los solicitantes también mostraron que el enlace de GITR por GITRL proporciona una señal coestimuladora a las células T efectoras (por ejemplo células T CD4+ y CD8+) , con lo cual se incrementan las capacidades de las células T efectoras para vencer la supresión mediada por las células T reguladoras por CD4+CD25+ y proliferar en respuesta a anti-CD3 (ejemplos 11 y 13); esto es el enlace de GITR expresado en las células T efectoras por los agonistas GITR (por ejemplo polipéptido GITRL, fragmentos activos del mismo y/o anticuerpo antagonista anti-GITR) hace a las células efectoras T menos susceptibles a la supresión por células T reguladoras CD4+CD25+. De esta manera los agonistas GITR que estimulan la actividad de GITR en las células T efectoras se pueden usar por sí mismos o en combinación con un antígeno por ejemplo, como un adyuvante (por ejemplo un adyuvante de vacuna) para sobreregular una respuesta inmune in vivo, por ejemplo para usarse en el tratamiento del cáncer y de trastornos infecciosos . En una modalidad, los agonistas GITR (por ejemplo polinucleótidos GITR, polipéptidos , fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos, moléculas agonistas pequeñas y/o anticuerpos agonistas anti-GITR) pueden ser útiles en el tratamiento de diversas deficiencias y trastornos inmunes (incluyendo inmunodeficiencia combinada severa (SCID) ) , por ejemplo al sobreregular el crecimiento y proliferación de células T. Estas deficiencias inmunes pueden ser genéticas o provocarse por infecciones virales (por ejemplo VIH) así como bacterianas o por hongos o pueden resultar de trastornos autoinmunes . Mas específicamente, las enfermedades infecciosas provocadas por infección viral, bacteriana, de hongos o por otra infección se pueden tratar utilizando una proteína de la presente invención, incluyendo infecciones por VIH, virus de hepatitis, virus del herpes micobacterias , especies de Leishmania, especies de malaria, y diversas infecciones por hongos tales como candidiasis . Por supuesto a este respecto, una proteína de la presente invención puede ser también útil en donde puede ser deseable un refuerzo generalmente al sistema inmune, esto es en el tratamiento del cáncer. Las sobreregulación de los antígenos de células que presentan antígenos (APC) (por ejemplo la sobreregulación de B7.1, B7.2 y B7.3), como un medio de respuestas inmunes sobrereguladoras , también puede ser útil en terapias. La sobreregulación de las respuestas inmunes puede estar en forma de mejora de una respuesta inmune existente u obtener una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, la mejora de una respuesta inmune a través de la estimulación de funciones que presentan antígenos de células dendríticas puede ser útil en los casos de infección viral. Además, las enfermedades virales sistémicas tales como la influenza, el resfriado, y la encefalitis pudieran aliviarse por la administración de formas estimuladoras de moléculas que presentan antígenos, sistémicamente, por ejemplo, antígenos de células dendríticas.
Alternativamente , las respuestas inmunes antivirales se pueden mej orar en el paciente infectado al retirar las células T del paciente , coestimular las células T ex vivo con APCs profesionales pulsados por antígenos virales (por ej emplo células B , macrófagos y/o células dendrí icas ) y los agonistas GITR (por ej emplo polinucleótidos GITRL, polipéptidos , fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos , moléculas pequeñas agonistas y/o anticuerpos agonistas anti -GITR) . Los agonistas GITR (por ej emplo polinucleótidos GITRL, polipéptidos, fragmentos activos y/o proteínas de fusión de los mismos y/o anticuerpos agonistas anti-GITR) se pueden suministrar como una proteína soluble o como se expresan por los ASPCs . Otro método de mejora de las respuestas inmunes antivirales sería aislar células infectadas de un paciente, transfectarlas con un cido nucleico que codifique la proteína GITRL de la presente invención como se describe en la presente, de manera tal que las células expresen todo o una porción de la proteína en su superficie, y volver a introducir las células transfectadas en el paciente. Las células infectadas podrían ahora suministrar una señal coestimuladora a las células T efectoras in vivo , esto es la expresión de la proteína GITRL o un fragmento activo de la misma por la célula infectada y enlazar tal proteína GITRL a GITR en las células T efectoras puede hacer a las células T efectoras menos susceptibles a la supresión por células T reguladoras CD4+CD25+ .
En otra aplicación, la sobreregulación o mejora de una función de antígenos APC puede ser útil en la inducción de la inmunidad de tumores. Las células de tumores (por ejemplo sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma y carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que codifica al menos un péptido de la presente invención, se pueden administrar a un sujeto para vencer la tolerancia específica de tumores en el sujeto. Si se desea, la célula de tumor se puede transfectar para expresar una combinación de péptidos . Por ejemplo, las células de tumor Obtenidas de un paciente pueden transfectarse ex vi o..con un vector de expresión que dirija la expresión - de un .agonista GITR (por ejemplo polipéptidos GITR, . fragmentos activos y/o proteínas de fusión del mismo y/o anticuerpos anti-GITR agonistas) solos o en combinación con un péptido que tiene la actividad del tipo B7.2 sola o en conjunto con un péptido que tiene la actividad del tipo B7.1, etc.. Las células de tumor transfectadas se regresan al paciente para resultar en la expresión de los péptidos en la superficie de la célula transfectada. Alternativamente, se pueden usar técnicas de terapia de genes para direccionar una . célula de tumor para transfección in vivo . La presencia de un agonista GITR (por ejemplo un polipéptido GITRL, fragmentos activos y/o proteínas de fusión del mismo, una molécula pequeña agonista y/o un anticuerpo agonista anti-GITR) en combinación con un péptido que tiene la actividad de. -un ~antigeno APC (por ejemplo B7.1, B7.2, etc.) en la superficie de la célula de tumor proporciona las señales coestimuladoras necesarias para las células T para inducir una respuesta inmune mediada por células T contra las células de tumor transfectadas . Además, las células de tumor que carecen de moléculas de clase 1 MHC o de clase II MHC o que fallan en reexpresar cantidades suficientes de la clase 1 MHC o moléculas de clase II MHC se pueden transfectar con ácidos nucleicos que codifican todo o una porción (por ejemplo una porción truncada por un dominio citoplásmico) de una proteina de cadena a de clase I MHC y una proteína de microglobulina ß2 o una proteína de cadena a de clase II MHC y una proteína de cadena ß de clase II MHC (o los ácidos nucleicos HLA humanos correspondientes) para expresar con ello las proteínas de clase I MHC o de clase II MHC (o las moléculas correspondientes de HLA) en la superficie celular. La expresión del MHC adecuado de clase I o de clase II en conjunto con un agonista GITR (por ejemplo un polipéptido GITRL, fragmentos activos t/o proteínas de fusión del mismo y/o un anticuerpo anti-GITR agonista) , y/o un péptido que tiene la actividad de un antígeno APC (por ejemplo B7.1, B7.2, etc.) induce una repuesta mediada por células T contra la célula de tumor transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica un constructo antisentido el cual bloquea la expresión de una proteina asociada MHC de clase II tal como la cadena no variante, también se puede cotransfectar con un ADN que codifica un agonista GITR (por ejemplo un polipéptido GITRL, fragmento activo del mismo, una proteína de fusión del mismo y/o un anticuerpo agonista anti-GITR) y/o un péptido que tiene la actividad de un antígeno APC para promover la presentación de antígenos asociados al tumor e inducir la inmunidad específica de tumor. Así la inducción de una respuesta inmune mediada por células T en un sujeto humano, puede ser suficiente para superar la tolerancia específica al tumor en el sujeto. En otras modalidades, los agonistas GITR (por ejemplo un polipéptido GITRL, fragmentos activos y/o proteínas de fusión del mismo, proteínas de fusión del mismo, moléculas pequeñas agonistas y/o anticuerpos agonistas anti-GITR) de la invención se puede usar como adyuvantes de vacunas . Los adyuvantes son compuestos moduladores inmunes que tiene la capacidad de mejorar y/o encauzar el desarrollo y perfil de las respuestas inmunes contra diversos antígenos que son en sí mismos pobremente inmunogénicos . Las citocinas y/o linfocinas se pueden usar como adyuvantes . La selección adecuada de adyuvantes puede inducir buenas respuestas inmunes, humorales y celulares que no se desarrollarían en ausencia del adyuvante. En particular, los adyuvantes tienen efectos importantes en la mejora de la respuesta inmune para la su unidad y antígenos de péptidos en vacuna. Su actividad estimuladora también es benéfica en el desarrollo de respuesta inmunes específicas de antígenos dirigidas contra antígenos de proteínas. Para una diversidad de antígenos que requieren fuertes respuestas mucosales, altas concentraciones del suero, la inducción de CTL (linfocitos T citotóxicos) y respuestas celulares vigorosas, las combinaciones de citocina/linfocina y adyuvante proporcionan estímulos que no se suministran por la mayoría de las preparaciones de antígeno.
Como se usa en la presente, la frase "adyuvante de vacuna" o "terapia de vacuna" pretende significar el uso de un agonista GITR (por ejemplo un polinucleótido GITRL, polipéptido GITR, un fragmento activo del mismo, una proteína de fusión del mismo y/o un anticuerpos agonista anti-GITR) en combinación con un antígeno (por ejemplo polipéptidos, proteínas o péptidos virales, parásitos y bacterianos) u otros antígenos (por ejemplo polipéptidos, proteínas o péptidos de células de cáncer o de tumor) o polinucleótidos que codifican al antígeno para mejorar, suprimir o modular de otra manera una respuesta inmune al antígeno. Para el propósito de esta definición, la "combinación" deberá significar el uso en conjunto, simultáneo con (combinado o sin combinar) o secuencialmente con un antígeno. El término "composición adyuvante de vacuna" se refiere a un adyuvante de vacuna que incluye adicionalmente diluyentes o portadores inmunológicamente aceptables en una forma convencional para preparar soluciones o suspensiones líquidas inyectables. La composición adyuvante de vacuna puede incluir adicionalmente agentes que mejoran además una respuesta inmune producida por úñ"agonista GITR. Por ejemplo, la composición adyuvante de vacuna puede incluir adicionalmente el lípido de monofosforilo 3-0-desacilado A ( Pl ,- Corixa Corporation, Seattle, A) o el lípido A de monofosforilo y derivados y análogos del mismo. PL* se puede usar en un intervalo de 1-100 g/dosis. Los antígenos usados para terapia de vacunas incluyen proteínas, péptidos o polipéptidos derivados de proteínas inmunogénicas y no inmunogénicas , así como cualquiera de los siguientes: sacáridos, proteínas, polinucleótidos u oligonucleotidos u otros componentes macromoleculares o fragmentos de los mismos . Como se usa en esta sección un péptido comprende una serie de al menos 6 aminoácidos y contiene al menos un determinante antigénico, mientras que un polipéptido es una molécula mas extensa que un péptido pero no constituye a un proteína de longitud completa. Como se usa en la presente un fragmento comprende una porción pero menos que todo un sacárido, proteína, polinucleótidos u oligonucleotidos u otros componentes macromoleculares. Como se usa en la presente, el término "cantidad adyuvante efectiva", significa una dosis de la composición de adyuvantes aguí descritos que es adecuada para producir una respuesta inmune mejorada en un hospedador vertebrado. La dosis particular dependerá en parte de la edad, peso y condición médica del hospedador, así como el método de administración y el antígeno. La composición adyuvante de vacuna de la invención se puede administrar a un vertebrado humano o no humano por una diversidad de vías que incluyen, pero no se limitan a intranasal, oral, vaginal, rectal, parenteral, intradermal, transdermal (ver por ejemplo Solicitud internacional WO 98/20732, que se incorpora en la presente como referencia), intramuscular, intraperitoneal , subcutánea, intravenosa e intrarterial . La cantidad del- componente o componentes de antígeno de la composición antigénica variarán dependiendo en parte de la identidad del antígeno, así como de la edad, peso y condición médica del sujeto así como del método de administración. De nuevo las dosis adecuadas se determinan fácilmente por personas expertas en la ..técnica. Se prefiere aunque no se requiere que el antígeno y la combinación de adyuvantes se administren al mismo tiempo. El número de dosis y el régimen de dosis para la composición antigénica también se determinan fácilmente por personas expertas en la técnica. En algunos casos las propiedades adyuvantes de la combinación de adyuvantes, pueden reducir el número de dosis necesaria o el curso de tiempo de régimen de dosificación.
Las combinaciones de adyuvantes de esta invención son adecuadas para su uso en combinació con una amplia variedad de antígenos a partir de una amplia variedad de microorganismos patogénicos que incluyen, pero no se limitan a aquellos a partir de virus, ¦ bacterias, hongos o microorganismos parásitos que infectan a vertebrados humanos y no humanos, o a partir de una célula de cáncer o célula de tumor (por ejemplo sarcoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, y carcinoma) . El antígeno puede comprender péptidos o polipéptidos derivados de proteínas, así como fragmentos de cualquiera de los siguientes: sacáridos, proteínas, polinucleótidos u oligonucleótidos , células de tumor o de cáncer u otros componentes macromoleculares . En algunos casos se incluyen más de un antígeno en la composición antigénica. . La vacunas virales deseables que contienen las combinaciones adyuvantes de esta invención, incluyen aquellas dirigidas a la prevención y/o tratamiento de enfermedades provocadas sin limitación, por el virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia de simios, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza de tipos 1-3, virus de influenza, virus de Herpes, citomegalovirus humano, virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calicivirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola, adenovirus, virus de la rabia, virus del moquillo canino, virus de la ictericia hematúrica, coronavirus, parvovirus, virus de rinotraqueitis infecciosa, virus de leucemia de felinos, virus de peritonitis infecciosa de felinos, virus de enfermedad bursal infecciosa de las aves, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino, virus de arteritis equina y diversos virus de encefalitis . Las vacunas bacterianas deseables que contienen las combinaciones de adyuvantes de esta invención incluyen aquellas dirigidas a la prevención y/o tratamiento de enfermedad provocada sin limitación por: Haemophilus influenzae - (de tipo y sin tipo) , Haemophilus sonnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria weningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachwatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salnonella typhi, Salmonella typhiinurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, complejo intracelular de Mycobacterium avium-Mycobacterium, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetará, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae y Micoplasma gallisepticum.
Las vacunas deseables contra patógenos de hongos que contienen las combinaciones adyuvantes de esta invención incluyen aquellas dirigidas a la prevención y/o tratamiento de enfermedad provocada por, sin limitación, Aspergillis, Blastomyces, candida, Coccidiodes, Cryptococcus e Histoplasma . Las vacunas deseables contra parásitos que contienen las ' combinaciones adyuvantes de esta invención incluyen aquellas dirigidas a la prevención y/o tratamiento de enfermedad provocada sin limitación por Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Tricomonas, Toxoplasma gondii y Pneumocystis carinii. Las vacunas deseables para producir un efecto anticáncer profiláctico o terapéutico en un hospedador vertebrado las cuales contienen las combinaciones adyuvantes de esta invención, incluyen aquellas que utilizan un antígeno de cáncer o antígeno asociado al tumor que incluye sin limitación, antígeno específico de la próstata (PSA) , antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) , antígeno carcino-embriónico (CEA), MUC-1, Her2 , CA-125, MAGE-3, EGFR, HELP, GCC, CD66-C, prostasina, TMPRSS3 , TADG 12 y TADG 15. En el caso del VIH y el SIV, las composiciones antigénicas comprenden al menos una proteína, polipéptido, péptido o fragmento derivado del virus. En algunos casos las proteínas múltiples de VIH o SIV, polipéptidos, péptidos y/o fragmentos se incluyen en las composiciones antigénicas . Las formulaciones de combinación adyuvante de esta invención también son adecuadas para la inclusión como un adyuvante en vacunas de polinucleótidos (también conocidas como vacunas de ADN) . Tales vacunas pueden además incluir agentes facilitadores tales como la bupivicaina (ver Patente de EU No. 5,593,972, que se incorpora en la presente como referencia) . Los métodos de 1) estimular la función celular presente en antígenos, por ejemplo, funciones celulares dendríticas ; 2) retirar células T del paciente, coestimularlas ex vivo y reintroducirlas en el sujeto; 3) transfectar células de tumor para inducir la inmunidad del tumor y 4) usar adyuvantes de vacuna son bien conocidos en el arte (ver por ejemplo Cerundolo et al. (2004) Dendritic cell; a journey from laboratory to clinic . Nat. I munol . 5 (1) : 7-10 ;Ko et al. (2003) Immunotherapy of malignant diseases. Int. Arch. Allergy Immunol. 132:294-309; Valmori et al. (1999) An antigen-targeted approach to adoptive transfer therapy of cáncer. Cáncer Res. 59:2167-73). Uso de antagonistas GITR para disminuir la actividad celular inmune Todavía en otro aspecto la invención caracteriza un método para mantener la susceptibilidad de las células T efectoras por ejemplo células T CD4+ y CD8+ o una población de las mismas a la supresión de las células T reguladoras CD4+CD25+. El método puede comprender poner en contacto una población de células T con un antagonista GITR (por ejemplo polinucleótidos inhibidores GITRL, una molécula pequeña antagonista, un anticuerpo anti-GITR neutralizador y/o un anticuerpo neutralizador anti-GITRL) - en,- una cantidad suficiente para inhibir la actividad de la .célula o población inmune. Los antagonistas de GITR también se pueden administrar a sujetos para quienes la supresión de una respuesta inmune se desea. Estas condiciones incluyen por ejemplo trastornos autoinmunes (por ejemplo trastornos artríticos), enfermedades inflamatorias o ·: "transplante de órganos . Estos métodos se basan al menos en parte, en el hallazgo en que la reducción de la actividad GITR por ejemplo al usar un anticuerpo neutralizante anti-GITR, reestablece la supresión mediada por CD4+CD25+ (ejemplo. - 13 ), -esto es, un anticuerpo anti-GITRL neutralizador mantiene la susceptibilidad de las células T efectoras, por ejemplo células T CD4+ y CD8+ para la supresión para la célula T reguladora CD4+CD25+. Adicionalmente, los solicitantes han demostrado que la incubación de las células T efectoras con un anticuerpo anti-GITRL neutralizante aminora la enfermedad en encefalitis autoinmune experimental murina (EAE) (ejemplo 14) . De esta manera los antagonistas GIT esto es, las moléculas que inhiben la actividad "GITR (por ejemplo anticuerpos anti-GITRL) se pueden usar para mantener la susceptibilidad de las células T efectoras a la supresión de células T CD4+CD25+ in vivo, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de patologías asociadas con células . inmunes incluyendo rechazos de transplantes, enfermedades inflamatorias y trastornos autoinmunes. Los métodos de uso de los antagonistas GITR también se pueden usar para inhibir la actividad (por ejemplo proliferación, diferenciación, supervivencia) de una célula T efectora y así, se pueden usar para tratar o prevenir una diversidad de trastornos inmunes. Los ejemplos no limitativos de los trastornos que se pueden tratar o prevenir incluyen, pero no se limitan a rechazos de transplantes, enfermedades autoinmunes (incluyendo por ejemplo diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática) , esclerosis múltiple, encefalomielitis , miastemia gravis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis de eczema) , soriasis, síndrome de Sjógren, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis , colitis ulcerante, espondioartropatía, espondilitis anquilosante, asma intrínseca, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, erupciones de fármacos, reacciones inversas de la lepra, eritema nodosum leprosum, uveitis autoinmune, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de la audición sensorineural progresiva bilateral idiopática, anemia aplástica, anemia de glóbulos rojos puros, trombocitopenia idiopática, policondritis , granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Steven- Johnson, estomatitis tropical idiopática, liguen planus, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior y fibrosis intersticial de pulmón) , enfermedad de injerto contra hospedador y alergia tal como alergia atópica. Los trastornos preferidos que se pueden tratar utilizando los métodos que comprenden la administración de antagonistas GITR por ejemplo un anticuerpo neutralizante " GITRL, incluyen trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis , artritis psoriática y espondilitis anquilosante (preferiblemente, artritis reumatoide)), esclerosis múltiple, diabetes de tipo 1, lupus (SLE) , IBD, enfermedad de Crohn, asma, vasculitis, alergia, escleroderma y psoriasis. En otra modalidad, los antagonistas de GITR solos o en combinación con otros agentes terapéuticos como se describen en la presente (por ejemplo antagonistas TNF) se pueden usar para tratar malignidades múltiples de mieloma y linfoclticas B relacionadas (Brenne, A. et al. (2002) Blood 99 (10) :3756-62) . Al usar los antagonistas GITR (por ejemplo polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas, y/o anticuerpos nuetralizantes para GITR y/o GITRL) , es posible modular respuestas inmunes en diversas formas . La subreregulación puede estar en forma de inhibir o bloquear una respuesta inmune que este en progreso o puede involucrar evitar la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de las células T activadas se pueden inhibir al mejorar la supresión de las respuestas de células T, o al inducir la tolerancia específica en las células T o ambas . La inmunosupresión de las respuestas de las células T es generalmente un proceso activo específico que no es de antígenos que requiere la exposición continua de las células T al agente supresor. La tolerancia que involucra inducir la no respuesta o anergia en las células T, se distingue de la inmunosupresión en que es generalmente específica del antígeno y persiste después de que ha cesado la exposición al agente tolerante . Operativamente la tolerancia se puede demostrar por una falta de respuestas de células T con la reexposición al antígeno específico en ausencia del agente tolerante.
La subregulacion o prevención de una o más funciones del antígeno de células que presentan antígenos (por ejemplo B7.1) y así la prevención de la síntesis de linfocina de alto nivel por células T activadas, será útil en situaciones de transplante de tejidos, piel y órganos y en enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) . Por ejemplo, el bloqueo de función de células T debe resultar en una destrucción reducida de tejido en el transplante de tejido. Típicamente, en los transplantes de tejido, el rechazo de transplantes se inicia a través de su reconocimiento como extemo por células T, seguido por una reacción inmune que destruye el transplante. La administración de un antagonista GITR (por ejemplo polinucleótidos inhibidores de GITRL, una molécula pequeña antagonista, un anticuerpo neutralizante anti-GITR y/o un anticuerpo neutralizante anti-GITRL) , en combinación con una molécula que inhibe o bloquea la interacción de un antígeno de linfocito B7 con sus ligandos naturales en las células inmunes (tal como una forma monomérica soluble de un péptido que tiene actividad B7.2 solo o en conjunto con la forma monomérica de un péptido que tiene una actividad de otro antígeno de linfocito B (por ejemplo B7.1) o anticuerpo de bloqueo) , previo al transplante puede conducir al enlace de la molécula a los ligandos naturales en las células inmunes sin transmitir la señal coestimuladora correspondiente. El bloqueo de la función del antígeno de linfocito B7 de esta manera, evita la síntesis de citocinas por células inmunes tales como las células T efectoras, y así actúa como un inmunosupresor. Por otro lado, la falta de coestimulación puede también ser suficiente para anergizar las células t con lo cual se induce la tolerancia en un sujeto. La inducción de una tolerancia de largo plazo por los reactivos de bloqueo del antígeno de linfocito B7 puede evitar la necesidad de una administración" repetida de -estos reactivos de bloqueo. Para lograr una inmunosupresión suficiente o tolerancia en un sujeto, también puede ser necesario bloquear la función de una combinación de antígenos de linfocitos B. ..
La eficacia de los reactivos de bloque en particular en la prevención del rechazo de transplantes de órganos c GVHD, se puede evaluar al usar modelos animales que - sean predictivos de la eficacia en humanos. Los ejemplos de los sistemas adecuados que se pueden usar incluyen injertos cardiacos alog nicos en ratas e injertos de células de isleta pancreáticas xenogénicas en ratones, ambas de las cuales se han utilizado para examinar los efectos inmunosupresores de las proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo como se describe en Lenschow et al. (1992) Science 257:789-92 y Turka et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:11102-05. Además, los modelos de murina de GVHD (ver por ejemplo Paul, ed. , Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-47) se pueden usar para determinar el efecto de bloqueo de la función del antígeno de linfocitos B in vivo en el 'desarrollo de esta enfermedad. El bloqueo de la función de un antígeno APC también puede ser terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de una activación inadecuada de las células T que son reactivas contra el mismo tejido y las cuales promueven la producción de citocinas y auto-anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. Evitar la activación de las células T auto-reactivas puede reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. La administración de antagonistas GIT (por ejemplo, polinucleótidos , inhibidores, GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) en combinación con los reactivos que bloquean la coestimulación de células T al romper las interacciones del ligando al receptor de los antígenos APC se puede usar para inhibir la activación de las células T y evitar la producción de auto-anticuerpo o citocinas derivadas de células T que puedan estar involucradas en los procesos de enfermedad. Adicionalmente, los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) en combinación con los reactivos de bloqueo pueden inducir una tolerancia específica de antlgenos de células T autoreactivas lo cual puede conducir a un alivio de largo plazo de la enfermedad. La eficacia de estos agentes en la prevención o mejora de los trastornos autoinmunes se puede determinar al usar diversos modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental murina (EAE) , lupus eritematoso sistémico de ratones MRL/lpr/lpr o en ratones híbridos NZB, artritis de colágeno autoinmune murina, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB y miastemia gravis murina experimental (ver por ejemplo, Paul, ed. , Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-56) . En una modalidad los antagonistas GITR (por ejemplo polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) , que incluyen composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran en terapia de combinación, esto es, se combinan con otros agentes , por ejemplo, agentes terapéuticos que son útiles para el tratamiento de condiciones patológicas o trastornos tales como trastornos inmunes y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto, significa que los agentes se dan substancialmente de forma contemporánea ya sea simultánea o secuencialmente . Si se dan secuencialmente al comienzo de la administración del segundo compuesto, los primeros de los dos compuestos preferiblemente son todavía detectables a concentraciones efectivas en el sitio . de tratamiento. Por. ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos , inhibidores ¦ GITR, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) , coformulados y/o coadministrados con uno o más agentes terapéuticos adicionales por ejemplo, uno o más inhibidores del factor de crecimiento y de citocina, inmunodepresores , agentes anti-inflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas y/o agentes citotóxicos o citoestáticos como se describen en mayor detalle a continuación. Además, uno o más de los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas antagonistas pequeñas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) descritos en la presente se pueden usar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos aquí descritos . Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis inferiores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así las toxicidades o complicaciones posibles asociadas con las diversas monoterapias . Por otro lado, los agentes terapéuticos aquí descritos actúan en las trayectorias que difieren de la trayectoria del receptor GITRL, y se espera así que mejoren y/o hagan sinergia con los efectos de los antagonistas GITR, esto es, en donde las células T efectoras mantienen su susceptibilidad a la supresión por células T reguladoras de CD4+ CD25+. Los agentes terapéuticos preferidos utilizados en combinación con un antagonista GITRL son aquellos agentes que interfieren en etapas diferentes en la respuesta inflamatoria autoinmune y posterior. En una modalidad, uno o más antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) descritos en la presente se pueden coformular con y/o coadministrar con uno o más agentes adicionales tales como otras citocinas o antagonistas del factor del crecimiento (por ejemplo, receptores solubles, inhibidores de péptidos, moléculas pequeñas, fusiones de ligando) ; o anticuerpos o fragmentos de enlace a antígenos de los mismos que se enlazan a otros objetivos (por ejemplo anticuerpos que se enlazan a otras citocinas o factores de crecimiento, sus receptores u otras moléculas de superficie celular) y citocinas anti-inflamatorias o agonistas de las mismas. Los ejemplos no limitativos de los agentes que se pueden usar en combinación con los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) descritos en la presente incluyen pero no se limitan a antagonistas de una o más interleucinas (ILs) o sus receptores, por ejemplo, antagonistas de IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, y IL-22; antagonistas de la citocina o factores de crecimiento o sus receptores tales como factor de necrosis de tumor (TNF) , EMA.P-II, GM-CSF, FGF y PDGF. Los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) también se pueden combinar con inhibidores de por ejemplo, anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3 , CD4 , CD8, CD25, CD28, CD30, CD45, CD69, CD80, (B7.1) CD86, (B7.2) CD90, o sus ligandos que incluyen CD154 (gp39 o CD40L) , o LFA-l/lCAM-1 y VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med. Res. Rev. 22:146-67). Los antagonistas preferidos que se pueden usar en combinación -con los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) aquí descritos incluyen antagonistas de IL-l, IL-12, TNFa, IL-15, IL-17, IL-18, y IL-22. Ejemplos de esos agentes incluyen los antagonistas IL-12 tales como anticuerpos generados in vitro o humanos, humanizados, quiméricos (o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos) que se enlazan a IL-12 (preferiblemente IL-12) humano), por ejemplo el anticuerpo descrito en WO 00/56772; IL-12; inhibidores del receptor IL-12, por ejemplo, anticuerpos para el receptor humano IL-12 y fragmentos solubles del receptor IL-12 por ejemplo, receptor humano IL-12. Los ejemplos de los antagonistas IL-15 incluyen anticuerpos (o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos) contra IL-15 o su receptor por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro para IL-15 humano o su receptor, fragmentos solubles del receptor IL-15 y proteínas de enlace de IL-15. Los ejemplos de los antagonistas IL-18 incluyen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos humanizados humanos o generados in vitro (o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos) a los fragmentos solubles humanos IL-18 del receptor IL-18 y las proteínas de enlace (IL-18BP, allet et al. (2001) Circ . Res 28) . Ejemplos de los antagonistas IL-1 incluyen inhibidores de la enzima convertidora de interleucina 1 (tales como (ICE) , antagonistas IL-1 por ejemplo Vx740, y anticuerpos del receptor IL-1RA (Anikinra, Amgen) , SILIRII (Immunex) , y antiIL-1 (o fragmentos de enlace antígenos de los mismo) . Ejemplos de los antagonistas TNF incluyen anticuerpos quiméricos humanizados humanos o generados in vitro (o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos) para el TNF (por ejemplo, TNFa humano) , tal como D2E7, (anticuerpo TNFa humano patente E.U.A. 6,258,562), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpo humanizado TNFa; Celltech/Pharmacia) , cA2 (anticuerpo quimérico TNFa; Remicade™, Centocor) ; fragmentos de anticuerpos TNF (por ejemplo, CPD870) ; fragmentos solubles de los receptores TNF, por ejemplo, receptores TNF humanos p55 o p75 o derivados de los mismos por ejemplo, 75 kdTNFR-IgG(75 D TNF proteína de fusión IgG del receptor Enbrel™; Immunex; ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) 37;S295; J. Invest . Med. (1966) 44:235 A), p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión IgG del receptor TNF 55 KD (Lenercept) ) ; antagonistas de enzimas por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE) (por ejemplo, un derivado del ácido alfa sulfonilo hidroxámico, WOOl/55112, y el inhibidor TACE N-hidroxiformamida GW 3333, -005, o -022); y TNF-bp/s-TNFR (proteína de enlace TNF soluble ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) 39 (9) (complemento) : S284; Amer. J. Physiol . -Heart y Circulatory Physiology (1995 ) 268 : 37-42 ) . Los antagonistas TNF preferidos son fragmentos solubles de los receptores TNF por ejemplo receptores TNF humanos p55 o p75 o derivados de los- mismos, por ejemplo, 75 kdTNFR-IgG, y TNFa e inhibidores de la enzima convertidora de (TACE) . En otras modalidades, los antagonistas GITR aquí descritos se pueden administrar en combinación con uno o más de los siguientes: antagonistas IL-13 por ejemplo receptores solubles IL-13 (aIL-13) y/o anticuerpos contra IL-13; antagonistas IL-2 por ejemplo DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL2 (proteínas de fusión IL-2; Seragen; ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) 36:1223), y/o anticuerpos para IL-2R, por ejemplo anti-Tac (anti-IL2R humanizada; Protein Design Labs, Cáncer Eess. (1990) 50 (5) : 1495-502) . Todavía otra combinación incluye antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de . GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) en combinación con inhibidores no supresores anti-CD4 (IDEC-CE9. l/SB 210396; anticuerpo anti-CD4 primatizado no supresor; IDEC/SmithKline) . Todavía otras combinaciones preferidas incluyen antagonistas de la trayectoria coestimuladora CD80 (B7.1) o CD86(B7.2), incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas, así como el ligando de glicoproteína de p-selectina (PSSGL) , citocinas anti-inflamatorias por ejemplo IL-4 (DNAX/Schering) ; IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante DNAX/Schering) ; IL-13 y GFP y agonistas de las mismas (por ejemplo anticuerpos agonistas). En otras modalidades, uno ó más de los antagonistas GITR se puede coformular con y/o coadministrar con uno o más fármacos anti-inflamatorios inmunosupresores o inhibidores metabólicos o enzimáticos . Los ejemplos no limitativos de los fármacos o inhibidores que se pueden usar en combinación con los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) descritos en la presente incluyen pero no se limitan a uno o más de los fármacos no esteroidales anti-inflamatorios (NSAIDs, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) 39 (9) (complemento) :S280) ) , naproxeno(ver por ejemplo, Neutro. Report (1996) 7:1209-13), meloxicam, proxicam, diclofenaco, e indometacina; sulfasalazina (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) 39 (9) (complemento) : S281) ; corticosteroides tales como prednisolona; fármacos anti-inflamatorios supresores de la citocina (CSAIDs) ; inhibidores de la biosíntesis de nucleótidos por ejemplo, inhibidores de la biosíntesis de purina, antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato ácido (N- [4- [ [ (2 , 4-diamino~6-pteridinil) metil] metilamino] benzoil] -L-glutámico) ; e inhibidores de la biosíntesis de pirimidina por ejemplo inhibidores de dihidroorotato hidrogenasa (DHODH) (por ejemplo, leflunomida (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (complemento), S131; Inflammation Research (1996) 45:103-07). Los agentes terapéuticos preferidos para su uso en combinación con los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) incluyen inhibidores NSAIDs, CSAIDs, (DHODH) (por ejemplo, leflunomida), y antagonistas de folat (por ejemplo metotrexato) . Ejemplos de inhibidores adicionales incluyen uno o más de corticosteroides (oral, inhalados y de inyección local) ; inmunosupresores por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506) ; e inhibidores mTOR por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados solubles de rapamicina (por ejemplo derivados del éster de rapamicina por ejemplo CCI-779 (Elit (2002) Current Opinión Investig. Drugs 3 (8) : 1249-53 ; Huamg et al. (2002) Current Opinión Investig. Drugs 3 (2) : 295-304) ; agentes que interfieren con la señalización por citocinas por inflamatorias tales como TNFcx o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de la MAP cinasa) ; inhibidores COX2 , por ejemplo, celecoxib, rofecoxbib y variantes de los mismos ver por ejemplo, Artritis & Rheumatism (1996) Vol . 39, No. 9 (suplemento), S81) ; inhibidores de la fosfodiesterasa, por ejemplo, R973401 (inhibidor de tipo IV de fosfodiesterasa, ver por ejemplo, Artritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) ) ; inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de la fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona (patente E.U.A. 6,350,892)); inhibidores del factor de crecimiento celular endotelial vascular o receptor del factor de crecimiento por ejemplo, inhibidor VEGF y/o inhibidor VEGF-R; e inhibidores de la angiogénesis . Los agentes terapéuticos preferidos para su uso en combinación con los antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) son inmunodepresores , por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506) ; inhibidores mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) . o derivados de la rapamicina, por ejemplo, derivado solubles de rapamicina (por ejemplo, derivados de éster de rapamicina, por ejemplo, CCI-779) ; inhibidores C0X2, por ejemplo, celecoxib y variantes de los mismos; e inhibidores de la fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa 2 citosolica (cPLA2) , por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona. Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden combinar con un antagonista GITRL incluyen uno o más de: 6-mercaptopurinas (6- P) ; azatioprina sulfasalazina; mesalazina; olsalazina clorquinina/hidroxicloroquina; pencilamina aurotriornalato (intramuscular y oral) ; azatioprina; coquicina; agonistas de beta-2 adrenoreceptor (salbutamol, tertbutalina, salmeteral) ; xantinas (teofilina, aminofilina) ; cromoglicato; nedocromil; cetotifen; ipratropium y oxitropium; mofetil microfenolato; agonista de adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento; y agentes adrenérgicos . El uso de los antagonistas GITR aquí descritos en combinación con otros agentes terapéuticos para tratar o prevenir trastornos inmunes específicos se discute en mayor detalle a continuación. Los ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento o prevención de trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis psoriática) , con los cuales se pueden combinar los antagonistas GITR incluyen uno o más de los siguientes : antagonistas IL-12 como se describen en la presente, NSAlDs; CSAIDs, TNFs, por ejemplo, antagonistas TNFa como se describen en la presente; anticuerpos no supresores anti-CD4 como se describen en la presente;. antagonistas IL-2 como se describen en la presente; citocinas anti-inflamatorias, por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGFa, o agonistas de los mismos; antagonistas del receptor IL-1 ó IL-1 como se describe en la presente; inhibidor-es de fosfodiesterasa como se describen en la presente;-¦¦-¦"inhibidores COX-2 como se describe en la presente; iloprost (ver por ejemplo, Arthritis Se Rheumatism (1996), Vol . 39, No. 9 (suplemento), S82) ; metotrexato; talidomida (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con talidomina (por ejemplo, Celgen) ; leflunomida; inhibidor de la activación de plasminogeno, por ejemplo, ácido tranexámico; ver por ejemplo, ¦ Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284) ; inhibidor de citocina, por ejemplo, T-614; ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento) , S282) ; prostaglandina El (ver por e emplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) ; azatioprina (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento) 7 ¦ ;-S281) ; un inhibidor de la enzima convertidora de interleucina 1 (ICE) ; zap-70 y/o inhibidor lck (inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o lck) ; un inhibidor del factor de crecimiento celular endotelial vascular o receptor del factor de crecimiento celular endotelial vascular como se describe en la presente; un inhibidor de la angiogénesis como se describe en la presente; fármacos corticosteroides anti-inflamatorios (por ejemplo, SB203580) ; inhibidores de la TNF-convertasa; IL-11 (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento) , S296) ; IL-13 (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, NO. 9 (suplemento) , S308) ; inhibidores IL-17 (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S120) ; oro, penicilamina; cloroquina; hidroxicloroquina,- clorambucilo; ciclofosfamida; ciclosporina; irradiación total linfoide; globulina antitimocitos ; toxinas CD5; péptidos administrados oralmente y colágeno; lobenzarit de disodio; agentes reguladores de citocina (CRAs) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals , Inc.); oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido (ISIS 2302; Isis Pharmacueticals , Inc.); receptor 1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.), prednisona; orgoteina; polisulfato de glicosaminoglicano; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; lipidos marinos y botánicos (ácidos grasos de semillas de plantas y peces; ver por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis . Clin. North Am. 21: 759-77); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; globulina inmune intravenosa; zileuton; ácido micofenólico (RS-61443) ; tacrolimus (FK-506) ; sirolimus (rapamicina) ; amiprilosa (terafectina) ; cladribina (2-clorodesoxiadenosina) ; y azaribina. Las combinaciones preferidas incluyen uno o más antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITR, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) en combinación con el metotrexato o leflunomida y en casos moderados o severos de artritis reumatoide, ciclosporina . Los ejemplos preferidos de inhibidores para usarse en combinación con antagonistas GITR para tratar trastornos artríticos incluyen antagonistas TNF (por ejemplo, anticuerpos quiméricos humanizados, humanos o generados in vitro, o fragmentos de enlace a antígenos del mismo, que se enlazan a TNF; fragmentos solubles de un receptor TNF, por ejemplo, el receptor TNF humano p55 ó p75 o derivados del mismo, por ejemplo, 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión IgG del receptor- 75 kD TNF, Enbrel™) , proteína de fusión IgG de receptor p55 kD TNF; antagonistas de la enzima TNF, por ejemplo, enzima convertidora TNFa (inhibidores TACE) ; antagonistas de IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-22; y agentes supresores de células B y células T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22) ; inhibidores de moléculas pequeñas, por ejemplo, metotrexato y leflunomida; sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos, por ejemplo, CCI-779; cox-2 e inhibidores cPLA2; NSAIDs; inhibidores p38, inhibidores TPL-2, Mk-2 y NFkb; RAGE o RAGE solubles; P-selectina o inhibidores PSGL-l (por ejemplo, inhibidores de moléculas pequeñas, anticuerpos para los mismos, por ejemplo, anticuerpos para P-selectina) ; agonistas beta receptores de estrógenos (ERB) o antagonistas ERB-NFkb. Los agentes terapéuticos adicionales más preferidos que se pueden coadministrar y/o coformular con uno o más antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, moléculas pequeñas antagonistas, y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) incluyen uno o más de: un fragmento soluble de un receptor TNF, por ejemplo, el receptor TNF humano p55 ó p75 o derivados del mismo, por ejemplo, 75 kdTNFR-IgG (proteina de fusión 75 kD TNF del receptor IgG, Enbrel™) ; metotrexato, leflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, por ejemplo CCI-779. Los ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento o prevención de esclerosis múltiple con la cual se puede combinar un antagonista GITR incluye los siguiente: interferones, por ejemplo, interferon-alfa la (por ejemplo, Avonex™; Biogen) e interferon-Ib (Betaseron™; Chiron/Berlex) ; copolímero 1 (Cop-1; Capoxone ; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxigeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa; cladribina; antagonistas TNF como se describe en la presente; corticosteroides ; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina y tizanidina. Los antagonistas adicionales que se pueden usar en combinación con antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) incluyen anticuerpos para o antagonistas de citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-7, L-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, G -CSF, FGF y PDGF . Los antagonistas GITR (por ejemplo, polinuclóetidos inhibidores de GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) como se describen en la presente se pueden combinar con anticuerpos para otras moléculas de la superficie celular tales como CD2 , CD3 , CD , CD8 , CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los antagonistas GITR (por ejemplo, GITRL polinucleótidos inhibidores, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) también se pueden combinar con agentes tales como el metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos , agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias como se describen en la presente, inhibidores de enzimas que convierten IL-lb (por ejemplo, Vx740) , anti-P7s, PSGL, inhibidores TACE, inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de la loproteinasa de metal, sulfasalazina, azatloprina, 6-mercaprtopurina, inhibidores de enzima convertidora de angiotensina, receptores de citosina solubles y derivados de los mismos , como se describen en la presente y citocinas anti-inflamatorias (Por ejemplo,. IL-4, IL-10, IL-13 y TGF) . Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiples con los cuales "los antagonistas GITR (Por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos neutralizantes para GITR y/o GITRL) se pueden combinar incluyen interferon-b, por ejemplo, IFNb-la y IFNb-lb; copaxona, corticosteroides, inhibidores IL-1, inhibidores TNF, anticuerpos para el ligando CD40 y CD80 y antagonistas IL-12. Los ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento o prevención de enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante) con los cuales un antagonista GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores de GITRL, una molécula pequeña antagonistas, un anticuerpo anti-GITR- neutralizante y/o un anticuerpo anti-GITRL neutralizante) se pueden combinar incluyen los siguientes: budenosido, factor de crecimiento epidemial, corticosteriodes, ciclosporina," sulfasalizina; aminosalicilatos ; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; antagonistas TNF como se describen en la presente; citocinas de IL-4, IL-10, IL-13 y/o TGFb o agonistas de los mismos (por ejemplo, anticuerpos agonistas) ; IL-11; profármacos conjugados con dextrano o glucurónido de prednisolona, dexametasona o budesónido; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido de ICA -1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals , Inc.), receptor 1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.), mesalazina de liberación lenta; metotrexato, antagonistas del factor activador de plaquetas (PAF) ; ciprofloxacina; y lignocaina. En una modalidad, un antagonista GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, una molécula pequeña antagonista, un anticuerpo anti-GITR y/o anticuerpo neutralizante anti-GIT L) se pueden usar en combinación con uno o más anticuerpos dirigidos a otros objetivos involucrados en la regulación de respuestas inmunes, por ejemplo, rechazo de transplantes o enfermedad de injerto contra hospedador. Los ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento o prevención de respuestas inmunes con los cuales un antagonista GITRL (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, una molécula pequeña antagonista, un anticuerpo neutralizador anti-GITR y/o anticuerpo neutralizador anti-GITRL) de la invención se pueden combinar, incluyen los siguientes: anticuerpos contra otras moléculas de superficie celular, que incluyen pero no se limitan a CD25 (un receptor de interleucina 2) , CDlla (LFA-1) , CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7.1) y/o CD86 (B7.2). Todavía en otra modalidad, un antagonista GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, una molécula pequeña antagonista, un anticuerpo neutralizador anti-GITR y/o anticuerpo neutralizador anti-GITRL) se usa en combinación con uno o más agentes inmunodepresores más generales tales como ciclosporina A o F 506. En otras modalidades, los agonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, una molécula pequeña antagonista, y/o anticuerpo neutralizador anti-GITRL) se usan como adyuvantes de vacunas contra trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias o rechazo al transplante. La combinación de adyuvantes para el tratamiento de estos tipos de trastornos son adecuados para su uso en combinación con una amplia variedad de antigenos a partir de antígenos autodirigidos , esto es, auto-antígenos , involucrados en la auto-inmunidad, por ejemplo, protelna de base de mielina; auto-antígenos inflamatorios por ejemplo, proteína de péptido amiloide o antígenos de transplante, por ejemplo, aloantígenos . El antígeno puede comprender péptidos o polipéptidos derivados de proteína así como fragmentos de cualquiera de los siguientes: sacáridos, proteínas, polinucleótidos , u oligonucleótidos , auto-antígenos, proteína de péptido amiloide, antígenos de transplante, alérgenos u otros componentes macromoleculares . En algunos casos , se incluye más de un antígeno en la composición antigénica. Por ejemplo, las vacunas deseables para moderar las respuestas a los alérgenos en un hospedador vertebrado, las cuales contienen las combinaciones adyuvantes de esta invención, incluyen aquellas que contienen un alérgeno o fragmento del mismo. Ejemplos de tales alérgenos se describen en la patente de E.U.A. no. 5,830,877 y la solicitud internacional de patente publicada No. WO 99/51259, las cuales se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades e incluyen polen, veneno de insectos, caspa de animales, esporas de hongos y fármacos (tales como penicilina) . Las vacunas interfieren con la producción de anticuerpos IgE, una causa conocida de reacciones alérgicas. En otro ejemplo, las vacunas deseables para prevenir o tratar la enfermedad caracterizada por la deposición amiloide en un hospedador vertebrado el cual contiene las combinaciones adyuvantes de esta invención, incluyen aquellas porciones que contienen la protelna de péptido amiloide (APP) . Esta enfermedad se refiere diversamente con enfermedad de Alzheimer, amiloidosis o enfermedad amiloidogénica. Así, las vacunas de esta invención incluyen las combinaciones adyuvantes de esta invención más el péptido ?ß, así como fragmentos del péptido ?ß y anticuerpos para el péptido ?ß o fragmentos del mismo. Los métodos de 1) subregulación de la función celular que presenta antígenos; y 2) terapia de combinación para administrar la inmunosupresión son bien conocidos en el arte (ver por ejemplo, Xiao et al. (2003) Dendritic cell vaccine desing: strategies for eliciting peripheral tolerance therapy of autoimmune diseases . Bio Drugs 17: 103-11; uwana (2002) Induction of anergic and regulatory T cells by plasmacytoid dendritic cells and other dendritic cell subsets. Hum. Immunol. 63: 1156-63; Lu et al . · (2002) Manipulation of dendritic cells for tolerance induction in transplantation and autoimmune disease. Transplantation 73: S19-S22; Rifle et al. (2002 (Dendritic cells and second signal blockade; a step toward allograft tolerance. Transplantation 73: S1-S2; Manzini et al. (2004) The management of immunosuppression: the art and science. Crit. Care . Nurs . Q. 27:61-64). Otro aspecto de la presente invención de esta menara se refiere a kits para llevar a cabo la administración combinada de antagonistas GITR (por ejemplo, polinucleótidos inhibidores GITRL, moléculas pequeñas antagonistas,. y/o anticuerpos neutralizadores para GITR y/o GITRL) , con otros compuestos terapéuticos . En una modalidad, el. kit comprende uno o más agentes de enlace formulados en un portador farmacéutico y al menos un agente, por ejemplo, agente terapéutico formulado como sea adecuado en una o más preparaciones farmacéuticas por separado. ¦ · ·- La presente invención se ilustra por los .siguientes ejemplos con relación al ADNc de ratón novedoso- designado como ADNc de GITRL de ratón, que codifica un polipéptido de ligando novedoso designado GITRL de ratón, así como anticuerpos novedosos para GITRL. Alguien experto; -en la técnica entendería las enseñanzas de los ejemplos para -ser aplicables a todos los homólogos del GITRL de ratón. EJEMPLOS Los ejemplos que siguen se establecen para ayudar en el entendimiento de la invención pero no se pretenden y no se deben constituir como limitantes de su alcance de ninguna manera. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de los métodos convencionales tales como citometría de flujo (por ejemplo, FACS) , PCR, Northern e hibridación in situ, o aquellos métodos empleados en la construcción de. ectores, la inserción de genes que codifican los polipéptidos dentro de tales vectores y plásmidos, la introducción de tales vectores y plásmidos en las células hospederas, y la expresión de polipéptidos a partir de tales vectores y plásmidos en las células hospederas. Tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos, ordinarios en la técnica. EJEMPLO 1 Identificación de las secuencias de ADN de GITRL Ejemplo 1.1 Identificación del ADNc de GITRL de ratón y secuencias genómicas . Se tomaron dos métodos para identificar el homólogo murino GITRL. En un método, la secuencia de aminoácidos del GITRL humano (del Número de acceso al GenBank AX077015) se uso en una búsqueda Tblastn contra divl; di 2 ; div3 ; div4 ; dbdiv_cu; ratón celera (cm) ; y bases de datos de ratón-adn de ratón en borrador. La secuencia genómica ga_69772862. cm_4 se identificó como uno de los aciertos posibles para investigar. Se identificaron las secuencias faltantes de aminoácidos en una búsqueda Tblastn con la secuencia de aminoácido de GITRL humano (Número de acceso al GenBank AX077015) contra el ensamble genómico de ratón Celera sin ocultar (cm) usando el valor de expectativa (E)=10 (omisión), 100 y 1000. La secuencia genómica ga_x5j 8b7 7wj 5_041. cm_aa_2 se identificó como la secuencia genómica que contiene las secuencias f ltantes de aminoácidos . En otro método las secuencias de aminoácido de GITRL (del número de acceso al GenBank NM_005092) se usó en una búsqueda Tblastn contra el ensamble genómico de ratón Celera sin ocultar (cm) usando el valor de expectativa de omisión (E)=10 y 1000. Se identificó la secuencia genómica ga_x5j8b7w7wj5_041.cm_aa_2 como la secuencia genómica que contiene las tres regiones de pares de alta calificación (HSP) . Se construyó una secuencia de ADNc de ratón supuesta con base en tres regiones HSP obtenidas en la búsqueda Tblastn antes descrita. Esta secuencia de ADNc se editó con base en la comparación entre las alineaciones de las tres secuencias humanas de exones con la secuencia genómica humana correspondiente de Celera (ga_x2htbl3vud5_66. ch_r25h_l) y las tres secuencias de exón supuestas derivadas de ratón con la secuencia genómica de ratón correspondiente de Celera ( ga_x5j 8b7 7 j 5_041. cm_aa_2 ) . Esta edición tomó en cuenta las uniones de empalme para la secuencia humana. La secuencia de ADNc GITRL de ratón editada contenia una estructura de lectura abierta de 519 bp (secuencia de codificación de 522 bp) , correspondiente a una proteína de 173 aminoácidos.
Se diseñaron cebadores con base en los exones supuestos;." de la secuencia genómica de ratón GITRL y se usaron para aislar el clon ADNc físico correspondiente a partir de una colección de ADNc de timo de murina por PCR. Las secuencias de los cebadores PCR delanteros (SEQ ID NO: ) e inversos (SEQ ID NO: 5) fueron: 5 ' ATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG3 ' (cebador delantero) y 5 ' GAATGGTAGATCAGGCATTAAGATG3 ' (cebador inverso). El fragmento resultante se subclonó y la secuencia de ADN se determinó utilizando los métodos estándar. El fragmento resultante confirmó la existencia de un ADNc GITRL de ratón que comprende todos los tres exones predichos (ver a continuación) . Este fragmento se extendió para incluir el segmento final de codificación (dos aminoácidos) del ADNc por la amplificación del CPR de este clon resultante de ADNc . Las secuencias de los cebadores PCR delanteros (SED ID NO: 6) e inversos (SEQ ID NO: 7) para esta etapa fueron: 5 ' TTTAAAGTCGACCCACCATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG3 ' (cebador delantero) y 5 ' TTAAAGAATTCTCATTAAGAGATGAATGGTAGATCAGGCAT3 ' (cebador inverso) . El cebador delantero por PCR contenía un sitio Salí, una secuencia Kozak para el inicio de la traducción y el ATG que codifica la metionina de inicio. El cebador inverso contenía un sitio EcoRI. Se utilizaron los sitios Salí y EcoRI para una subclonación direccional y la determinación de secuencia para el clon final de ADNc se llevó a cabo. La secuencia de ADNc de GITRL de ratón de longitud completa y su secuencia de aminoácido deducida se establecen en SEQ ID N0:1 y SEQ ID B0:2, respectivamente. La alineación de las secuencias de ADNc humanas GITRL (SEQ ID NO: 8) y de ADNc de ratón GITRL revelaron un 69.6% de identidad. La alineación de las secuencias de aminoácidos humanos GITRL (SEQ ID NO: 9) y de ratón GITRL (figura 1) revelaron 54.1% de identidad y 60.0% de similitud. Este grado de identidad de aminoácidos es similar a aquel que existe en general entre los homólogos humanos y de ratón de otros ligandos TNFR (Oshima et al. (1998) Int. Immunol. 10:517-26). La comparación de la secuencia de ADNc GITRL de ratón clonada (SEQ ID NO:l) con las bases de datos murina públicamente disponibles reveló un polimorfismo de nucleótido sencillo (SNP) en la región de codificación de GITRL (una transversión A/C en la posición de nucleótido 470 de SEQ ID NO : 1 en el exón 3, la cual resulta en un cambio de asparagina a treonina en la posición de aminoácidos 157 de SEQ ID NO : 2 ) . La comparación de la secuencia de ADNc de ratón GITRL con la secuencia genómica del ratón de Celera (ga_x5j 8b7w7wj 5_04l . cm_aa_2) descrita anteriormente, reveló que el lugar cromosomal GITRL de ratón contiene tres exones y dos nitrones (ver tabla 2 a continuación) , con un tamaño exónico y posicionico observado entre el GITRL humano y de ratón. La secuencia de ADN genómico GITRL de ratón se establece en SEQ ID NO: 3. TABLA 2 Una comparación de la estructura genómica del GTRL de ratón (tabla 2) con la estructura genómica del GITRL humano (ver tabla 3 a continuación) muestra que el tamaño exónico y la posición intrónica están bien conservadas entre la secuencia de ADN genómicas GITRL humana y de ratón. La secuencia de ADN genómico GITRL humano se establece en SEQ ID NO: 10.
TABLA 3 Ejemplo 1.2 Perfil de idrofobicidad del GITRL de ratón El perfil de hidrofobicidad del GITRL de ratón se determina por TopPred (Claros and von Heijne (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:685-6). Una gráfica del registro de hidrofobicidad contra los residuos de aminoácidos de GITRL de ratón (SEQ ID NO: 2) reveló una región sencilla hidrofóbica supuesta localizada aproximadamente entre los aminoácidos 25- 50, similar al GITRL humano. Este segmento hidrofóbico corresponde a la región predicha de transmembrana para las proteínas de transmembrana de tipo II .
EJEMPLO 2 Expresión de tejidos del GITRL de ratón Las sondas de oligonucleótidos basadas en la secuencia de ADNc GITRL de ratón (SEQ ID.N0:1) se usaron para probar diversas muestras de tejido murino para la expresión GITRL por hibridación Northern, hibridación in situ, y PCR en tiempo real (por ejemplo, Heid et al. (1996) Genome Res. 6:986-94; Mullab et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:1026-31; Giulietti et al. (2001) Methods 25:386-401) . La hibridación Northern reveló transcritos escasamente detectables en el corazón, bazo, pulmón, ganglio linfático, riñon e hígado, la hibridación subsecuente in situ reveló la expresión de GITRL en el corazón, bazo, ganglio linfático y el timo. La expresión GITRL en estos tejidos se limitó generalmente a las células del pericardio y el endocardio del corazón, la pulpa blanca del bazo, las zonas cortical, paracortical y medulares de ganglios linfáticos y las zonas corticales y medulares del timo. La expresión de GITRL en el timo, bazo y ganglio linfático se confirmo además por un análisis PCR en tiempo real. GITRL se expresó a los niveles más elevados en células de bazo estimuladas por (LPS) lipopolisacáridos y bazo, que son principalmente linfocitos B. Los bajos niveles que se desvanecen de la expresión GITRL se detectaron en el estómago, cerebro, y riñon. El análisis de PCR en tiempo real también reveló los transcritos de GITRL en el hígado, células activadas CD25", células activadas CD25+, y células de ganglio linfático activados por concanavalina A, aunque en un menor grado que en el bazo y en los blastos de LPS . No se detectó expresión de GITRL en las células CD25" ó CD25+ en reposo. El análisis por PCR en tiempo real de las células dendríticas derivadas de médula ósea estimuladas por LPS e inmaduras (DC) también demostró la expresión GITRL en línea base por DC maduro que se incrementó con la estimulación LPS durante 24 horas, pero disminuyó debajo de la línea base después de 48 horas de estimulación LPS. También se detectó la expresión de GITRL a grados variables en todas las líneas celulares endoteliales probadas (bEND3 , C166, EOMA, MSI y SVEC4-10) y se demostró que permanecía relativamente sin cambio cuando se estimulaban las líneas celulares con LPS. En contraste, no se detectó ADNc de GITRL por PCR en las siguientes líneas celulares murinas sin estimular de origen específico: línea celular T E10, línea de timo fetal T2 , plasmacitoma TIO, timoma EL4 , líneas celulares pre-B BAF3 y PREB , hibridoma de células B9 B, monocítico DA1G, monocítico MI, médula ósea fetal FBMD-1, carcinoma embriónico P19, hígado MDF, y línea de célula madre embriónica E14.
EJEMPLO 3 Expresión funcional del GITRL de ratón recombxnante Ejemplo 3.1 Enlace de GITRL a la superficie celular de GITR Para determinar si el ADNc de ratón aislado en el ejemplo 1 codificó un ligando funcional GITR (GITRL) , células Cos que expresan GITRL de ratón se fusionaron a un epitopo FLAG (G TRL-Flag-Cos) o el receptor IL-21 de ratón de control se fusiono al epitopo FLAG (IL-21R-Flag-Cos) se incubaron para diversas duraciones de tiempo con células 293T que expresan GITR (GITR-293T) de ratón. Se detectó la interacción de célula a célula por citometría de flujo usando un anticuerpo anti-Flag etiquetado con ficoeritrina (PE-FLAG) y un anti-GITR etiquetado con isotiocianato de fluoresceina (FITC) . Aun 1 minuto después de la co-centrifugación de las células GITR-293T y GITRL-Flag-Cos, alrededor del 90% de las células GITR-293T (como se detecta por fluorescencia FITC) teñidas en conjunto por FLAG (como se detecta por fluorescencia PE) , indica que las células GITR-293T se enlazaron a las células GITRL-Flag-Cos, y que esta interacción persistió a lo largo de los 60 minutos totales del experimento. En contraste, las células GITR-293T incubadas con las células IL-21R-Flag-Cos no se co-tiñeron significativamente por FLAG, aun 60 minutos después de la centrifugación conjunta. Estos datos demuestran que el ADNc de ratón aislado en el ejemplo 1 codifica un GITRL funcional que puede enlazarse al GITR de la superficie celular .
Ej emplo 3.2 Enlace de GITRL al GITR soluble La capacidad del GITRL de ratón para enlazarse a GITR se confirmó al incubar células Cos que expresan GITRL de ratón (GITRL-Cos) o células Cos transíectadas de imitación con GITR recombinante fusionado a la porción Fe de IgG humano (GITR-Fc) o IgG humano de control (HigG) . El enlace de GITR-Fe a GITRL se determinó por citómetría de flujo usando un anticuerpo antihumano de burro conjugado a FITC (FITC-Ab) . La incubación de las células- GITRL-Cos con GITR-Fe resultó en un incremento de 3.6 veces en el enlace de FITC-Ab (28.8%) en comparación con la incubación de las células GITRL-Cos con el HigC (7.9%) de control. Las células GITRL-Cos sin teñir, células GITRL-Cos incubadas con las proteínas de fusión CTLA-4: Fe y FITC-Ab y las células GITRL-Cos incubadas con FITC-Ab solas no mostraron fluorescencia. Ni las células tratadas ni tampoco las células Cos transfectadas de imitación sin tratar mostraron ninguna fluorescencia apreciable. Estos datos demuestran que el ADNc de ratón aislado en el ejemplo 1 codifica un GITRL funcional capaz de enlazar a un GITR soluble .
EJEMPLO 4 Enlace del GITRL de ratón a GITR resulta en la proliferación de células CD4+CD25+ El efecto del enlace GITRL : GITR en la proliferación celular se determinó al estimular células T murinas alrededor de -50,000 con -50,000 de - esplenocitos suprimidos de células T irradiadas y ~100 IU/ml IL-2 durante 65-72 hrs en ausencia o presencia de concentraciones variables de una proteína de enlace de GITR. Dos proteínas de enlace GITR se usaron en estos ensayos: ya sea un anticuerpo anti-GITR agonista (ver por ejemplo, McHugh et al. (2002) Immunity 16:· 311-23; ver también solicitud de patente de E". U~. . 10/194,754) o en GITRL murino expresado en la superficie de' células YB2/0 de rata modificadas (GITRL-YB2 / 0 ) . Se ensayó la proliferación celular por células pulsantes con ?µ?? 3H-timidina por las últimas 6-12 hr de . cultivo y luego se midió la incorporación de 3H-timidina por medio 'de conteo por escintilació . Como se muestra en la figura 2A, las células T CD4+CD25" no respondieron a ninguna concentración del anticuerpo anti-GITR. En contraste, el anticuerpo anti-GITR estimuló la proliferación de células T CD4+CD25+ a todas las concentraciones probadas. Por ejemplo, el cultivo de las células T CD4+CD25+ en la presencia de la concentración más baja del anticuerpo anti-GITR probado (-0.02 g/ml) resultó en un incremento de alrededor de ~3 veces en la incorporación de 3H-timidina (-15,000) sobre las células cultivadas en ausencia de un anticuerpo anti-GITR. La capacidad del anticuerpo anti-GITR para estimular la proliferación de células T CD4+CD25+ alcanzó un plano de -45,000 cpm a una concentración de anticuerpos de -0.3 µ9/p?1, que corresponde a un incremento de aproximadamente 9 veces en la incorporación de 3H-timidina sobre las células cultivadas en ausencia de un · anticuerpo anti-GITR. Similar a los resultados obtenidos con el anticuerpo anti-GITR, las células GITRL-YB2/0 no estimularon la proliferación de células T CD4+CD25+ (Figura 2B) . En contraste, las células GITRL-YB2/0 estimularon notablemente la proliferación de células T CD4+CD25+. Por ejemplo, el cultivo de células T CD4+CD25+ en presencia de -10,000 células GITRL-YB2/0 resultó en un incremento de -4-5 veces en la incorporación de 3H-timidina sobre las células cultivadas en presencia de un número igual de células YB2/0 no modificadas. Al incrementar el número de células YB2/0 hasta -50,000 resultó en un incremento de aproximadamente 15 veces en la incorporación de 3H-timidina sobre las células cultivadas en presencia de número igual de células YB2/0 no modificadas (Figura 2B) .
EJEMPLO 5 Enlace de GITRL de ratón a GITR invierte la supresión mediada por células T de CD4+CD25+ de las células T CD4+CD25+. El ensayo supresor de célula T utilizado en estos ejemplos se ha descrito previamente (ver por ejemplo, Thornton and Shevach (2000) J. Immunol . 164:183-90; McHugh et al. (2000) Immunity 16:311-23; ambas incorporadas en la presente como referencia) . Brevemente, alrededor de 50,000 células T con respuesta a CD4+CD25" se cultivaron en presencia de alrededor de 50,000 esplenocitos suprimidos de célula T irradiados, 0.5 76g/ml de anticuerpo anti-CD3, y diversos números de células T CD4+CD25+ supresoras recientemente aisladas. La capacidad, de las alrededor de 50,000 células GITR-YB2/0 irradiadas o 2 µg/ml del anticuerpo agonista GITR para invertir la supresión de la proliferación de CD4+CD25~ luego se evalúo al medir la incorporación de 3H-timidina por medio de un conteo de escintilación . Como se muestra en la figura 3A las células CD4+CD25+ redujeron la proliferación de células CD4+CD25" de una forma dependiente de la dosis. Tanto el anticuerpo anti-GITR y las células GITRL-YB2 / 0 pudieron invertir por completo la supresión de la proliferación CD4+CD25" sobre el intervalo completo del número de células supresoras CD4+CD25+ probadas. Así, el enlace de GITRL a su receptor GITR como el enlace del anticuerpo anti-GITR agonista a GITR, bloqueó la función supresora de las células CD4+CD25+. La capacidad de las células GITR-YB2/0 para invertir la supresión sucedió en una forma dependiente de la dosis, con tan pocas como alrededor de 3,000 células GITRL-YB2/0 que invierten al menos parcialmente o disminuyen la supresión en este ensayo (Figura 3B) : ni las células YB2/0 sin modificar ni las células YB2/0 que expresan GITR tuvieron un efecto apreciable en la supresión mediada por células T CD4+CD25+ (Figura 3A) . En contraste con los resultados obtenidos con las células T CD4+CD25+ recientemente aisladas, el enlace de GITRL:GITR tuvo poco a ningún efecto en la supresión mediada por las células T CD4+CD25+ activadas con un anticuerpo anti-CD3 , esplenocitos suprimidos de células T e IL-2 (Figura 4). Ni la adición del anticuerpo anti-GITR ni las 50,000 células GITRL-YB2/0 pudieron invertir la supresión mediada por alrededor de 25,000 células T activadas de CD4+CD25+" Cuando se agregaron menores células T activadas CD4+CD25+ al ensayo (por ejemplo ~1, 500-12, 500 células), sin embargo el anticuerpo anti-GITR y las células GITR-YB2/0 pudieron disminuir parcialmente pero no suspender completamente la supresión.
' EJEMPLO 6 Anticuerpo GITRL anti-ratón reestablece la supresión mediada por células T CD4+CD25+ Ejemplo 6.1 Aislamiento de anticuerpos anti-ratón GITRL Se produjeron anticuerpos específicos para GITRL de ratón al inmunizar ratas con células de rata YB2/0 que expresan el ADNc de GITRL de ratón (GITRL-YB2/0) . Al usar métodos bien conocidos en el arte, se crearon hibridomas de anticuerpos y se separaron por exclusión contra células Phoenix que expresan el GITRL de ratón usando citómetría de flujo. Se identificaron 2 anticuerpos 5F1 y 10F12, que se enlazan específicamente a las células GITRL-Phoenix y no a las células de control Phoenix transfectadas imitadas . Estos hibridomas de anticuerpo se depositaron con la American Type Culture Collection (ATCC) el 22 de Julio de 2003; número asignado ATCC PTA-5336 para el hibridoma 5F1, y el número PTA-5337 para el hibridoma 10F12. Ejemplo 6.2 Anticuerpos GITRL anti-ratón bloquean los efectos de GITRL en la actividad supresora de las células T CD4+CD25+ Como se describe en el ejemplo 5 anterior, las células YB2/0 que expresan GITRL en su superficie celular, pudieron invertir la supresión de la proliferación de células T CD4+CD25" mediada por células T CD4+CD25+ recientemente aisladas. Para determinar si los anticuerpos anti-GITRL pudieran reestablecer la supresión mediada por células T CD4+CD25+ el ensayo supresor de células T como se describe en el ejemplo 5, se efectúo en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-GITRL 5F1 y 10F12 o anticuerpos de control. Como se observa en el ejemplo 5, el cultivo de células T de respuesta CD4+CD25" y células T supresoras CD4+CD25+ recientemente aisladas en presencia de células GITRL-YB2/0, resultó en la inversión completa de la supresión de la proliferación de células CD4+CD25~ (Figuras 5A y 5B) . La adición de sobrenadantes de cultivo de hibridoma al 10% que contiene el anticuerpo 5F1 anti-GITRL para el ensayo resultó en un restablecimiento parcial (Figura 5B) a casi completo (Figura 5A) de la supresión mediada por CD4+CD25+. La adición del anticuerpo 10F12 anti-GITRL dio resultados similares. Como se esperaba, la presencia de anticuerpos de control ("control Ig" ) no tuvo un efecto apreciable en la capacidad de las células GITRL-YB2/0 para invertir la supresión (Figura 5B) . Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-GITRL bloquean la capacidad de GITRL para apagar la actividad del supresor de las células CD4+CD25+. Ejemplo 6.3 Anticuerpos GITRL anti-ratón suprimen las respuestas de células T solamente en presencia de células T CD4+CD25+ Se estimularon cultivos de células de ganglios linfáticos en presencia de concentraciones variables del anticuerpo agonista anti-CD3 previo a (Figura 6A) o después de la supresión de (Figura 6B) células T CD4+CD25+ y se- midió la proliferación al determinar la incorporación de 3H-timidina por medio de un conteo de escintilación. Para determinar los efectos del anticuerpo anti-GITRL en la proliferación, se agregaron sobrenadantes de cultivo de hibridoma al 10% que contiene 5F1 anti-GITRL a cultivos en paralelo. Como se muestra en la figura 6A, la adición del anticuerpo anti-GITRL suprimión la proliferación de células de ganglio linfáticos que contienen células T CD4+CD25+ cuando las células se estimularon con -0.075 µg/ml a -0.75 µg/ml de anticuerpo anti-CD3. No se observó la supresión en presencia del anticuerpo anti-GITRL cuando las células de ganglio linfático que contienen las células T CD4+CD25+ se estimularon con 1.0 µg/ml de anticuerpo anti-CD3. En contraste con los resultados obtenidos con los cultivos de células de ganglios linfáticos que contienen células T CD4+CD25+, la adición del anticuerpo anti-GITRL no tuvo generalmente efectos supresores en los cultivos de células de ganglios linfáticos que habían sido suprimidos de las células T CD4+CD25+ (Figura 6B) . Al tomarse en cojunto, estos datos sugieren que el anticuerpo anti-GITRL bloquea la interacción entre el GITR expresado en las células T CD4+CD25+ y GITRL expresado en otras células y que el bloqueo de esta interacción mejora la función reguladora de las células T CD4+CD25+ para reestablecer la inmunosupresión.
EJEMPLO 7 Distribución de células que expresan GITRL en tejidos linfoides El anticuerpo GITRL agonista se usó para examinar la expresión de GITRL en tejidos de ratón por citometria de flujo. Los subconjuntos de células dendríticas esplénicas CDllc+ recientemente aisladas (DC) que expresan solamente CD4, solamente CD8 o ambos CD4 y CD8, expresaron constitutivamente niveles bajos de GITRL (Figura 7A) . Sin embargo, la expresión de superficie de GITRL fue notablemente superior entre las células dendríticas plasmacitoides CDllcbajoB220+ (Nakano et al., 2001). En la Figura 7B, la tinción con anti-GITRL mAb o un control de isotipo se hizo en los subconjuntos indicados de Des esplénicas CDllc4 recientemente aisladas a partir de ratones BALB/c. De manera similar, las células B esplénicas B220+ recientemente aisladas que expresan constitutivamente GITRL como lo hicieron las células peritoneales B-l B (perC CDllb+B220+) aunque a mayores niveles (Figura 7C, superior) . Los macrófagos en peritoneo en reposo (perC CDllb+B220~) también se encontró que expresaron este ligando (Figura 7C, fondo) .
Los subconjuntos de timocitos que se someten a la selección ñor-expresaron cantidades medibles de GITRL (Figura 7D) . En contraste, como se muestra en la figura 7E, la expresión de GITRL fue detectable en todos los subconjuntos de los precursores tlmicos CD4"CD8" con los subconjuntos CD44+CD25+ (R2) y CD44"CD25+ (R3) expresan los mayores niveles . El GITRL fue indetectable en las células de ganglio linfático sin estimular (Figura 7F) . GITRL también fue indetectable en las células T esplénicas sin estimular (no se muestran los datos). Estos datos demuestran la expresión de GITRL por células que presentan antígeno profesionales (DCs, células B y macrófagos, Figuras 7A-7C) y células precursoras CD4"CD8~ timicas (Figura 7E) pero no las células T que se someten a selección (Figura 7D) o las células T en reposo en la periferia (ganglio linfático no estimulado y células esplénicas, Figura 7F y no se muestran los datos) . Estos datos se correlacionan con los datos obtenidos por hibridación Northern, hibridación in situ y PCR en tiempo real como se describe en el Ejemplo 2 anterior.
EJEMPLO 8 Los APC subregulan a GITRL que sigue a la estimulación de TLR Los efectos de la activación de células B en la expresión de GITRL se examinaron a partir del tratamiento con los ligandos del receptor del tipo Toll (TLR) o anti-CD40 y IL-4, o anti-IgM. La estimulación de las células B esplénicas (esplenocitos B220+ ) o las células B de peritoneo B-l (B220+CDllb+ PerC) resultaron en una sobreregulac ión rápida pero transitoria de GITRL, lo cual fue evidente después de 4 horas con la mayoría de los tratamientos (Fig. 8A) . Después de 48-60 horas de estimulación, la expresión declinó hasta niveles debajo de la prestimulación en donde se estabilizó. Una excepción fueron las células B B-l tratadas con polyl : C a partir de la cavidad de peritoneo, lo cual no desplegó esta subregulación durante los puntos de tiempo examinados. Como se esperaba, los niveles de CD86 se incrementaron durante el curso del experimento en todos los grupos, indicando que la subregulación observada de GITRL no fue secundaria a la muestra de muerte celular (no se muestran los datos ) . La reducción de GITRL expresada por células B después del tratamiento con anti-CD40 y IL-4, sugiere que la expresión se puede modular siguiendo la disposición de ayuda de células T. La expresión de GITRL por células B entre los esplenocitos totales se evalúo después del cultivo con anticuerpo anti-CD3. Bajo estas condiciones de cultivo, la expresión de GITRL en los esplenocitos B220+ también se subreguló después de 48 horas (Figura 8B) . Asi, los niveles fisiológicos de la actividad de células T también condujo a una reducción en la expresión de GITRL por células B esplénicas . Las DC esplénicas CDllc+ se enriquecieron con perlas magnéticas y se examinaron para la expresión de GITRL después de 12 y 36 horas de cultivo en presencia de LPS . Las DC cultivadas en medio o en LPS expresaron GITRL durante las 12 horas iniciales, con una modesta sobreregulacion inducida por LPS. Sin embargo por 36 horas, la expresión de GITRL fue indetectable en las DC tratadas con LPS así como aquellas cultivados solamente en medio. La figura 8C muestra la expresión de GITRL (paneles de histograma superior) y CD86 (B7.2) (paneles de histograma inferior) por los DC purificados CDllc+ después del cultivo con o sin LPS (0.5 g/ml) en los puntos de tiempo indicados. Como se muestra, la expresión CD86 (B7.2) se sobrereguló como se espera (Banchereau and Steinman, 1998) . La reducción en la expresión de GITRL por los DC esplénicos cultivados en el medio, sugiere que la maduración DC espontánea que sucede durante el cultivo in vitro (Vremec and Shorman, 1997) es suficiente para subregular la expresión de GITRL. Por esta razón, solamente los resultados que siguen a la estimulación de LPS se muestran, aunque las DC se sometieron a los mismos tratamientos mostrados para las células B. Similar a los resultados de otro informe publicado (Tone et al., 2003) se encontró que las DC derivadas de medula ósea expresan constitutivamente GITRL y que tal expresión fue solamente reducida marginalmente después del tratamiento con diversos ligandos TLR (no se muestran los datos) . Ambas células T de CD4 y CD8 expresaron niveles medibles de GITRL después de un cultivo de 48 horas de esplenocitos en ausencia ("+Med.") o presencia ("+aCD3") de un anticuerpo anti-CD3 soluble (Figura 8D) , lo que confirma la PCR previa de tiempo real (ver también el ejemplo 2) .
EJEMPLO 9 Bloqueo de la interacción GITR/GITRL inhibe la proliferación de linfocitos Debido a que GITRL se expresa constitutivamente por APC y debido a que se propusieron interacciones GITR/GITRL para retirar las funciones supresoras de las células T CD4+CD25+, la capacidad del anticuerpo anti-GITRL para mejorar la supresión mediada por la población endógena de las células T CD4+CD25+ residente en órganos linfoides secundarios se probó. Se hizo una comparación de las respuestas proliferativas de las células totales de ganglios linfáticos (LN) , esplenocitos (Sp) y LN o SP suspendidos de células CD25+ (?25) cada uno de los cuales se cultivaron con anticuerpo anti-GITRL (círculos llenos) o un anticuerpo de control (IgG de rata; círculos abiertos) . La adición del anticuerpo anti-GITRL redujo la respuesta proliferativa de las células totales de ganglio linfático (Figura 9A, izquierda superior) y en un menor grado los esplenocitos totales (Fig. 9A, izquierda inferior) . Sin embargo, el efecto inhibidor también fue evidente en cultivos suprimidos de células CD25+ (Figura 9A, superior derecho (LN) ; inferior derecho (Sp) ) , elevando la posibilidad de que las interacciones ¦-.· GITR/GITRL proporcionen señales coestimuladoras para las células T CD25" . Para probar directamente esta posibilidad, las respuestas proliferativas de las células T CD4+CD25+ y CD8+ purificadas se examinaron en .presencia de APC y YB2/0 que expresan células GITRL. ..La proliferación de las células T CD4+CD25+ y CD8+ se mejoró substancialmente en presencia de células que expresan - GITRL (Figura 9B) , lo cual fue particularmente evidente a concentraciones bajas de anti-CD3 para las células T CD4+CD25~.. Puede parecer discrepante que el anticuerpo anti-GITR medie sus efectos por la acción en las células T CD4+CD25" ya que las células T en reposo expresan solamente niveles bajos de GITR. Sin embargo, se resuelve la discrepancia por la demostración de que la expresión de GITR se sobreregula rápidamente después de la activación de células T (Figura 9C) alcanzando niveles máximos entre 48 y 72 horas después de la activación. Estos resultados apoyan la posibilidad de interacción GITR/GITRL que puede influenciar la activación de células T CD4+CD25~ independientemente de células T CD4+CD25+ reguladoras .
EJEMPLO 10 Inversión de la supresión requiere la expresión de GITR por células T CD25" Los estudios previos sugirieron que el ligamiento de GITR en células T CD4+CD25+ inhibió sus capacidades supresoras (McHugh et al., 200; Shimizu et al., 2002). Sin embargo, debido a que las células T activadas también expresan GITR, se buscó determinar los objetivos celulares relevantes del acoplamiento GITR lo que resulta en la eliminación de la supresión. Se midió la proliferación ya sea en presencia o ausencia de anti-GITR mAb (DTA-1) en cultivos conjuntos utilizando combinaciones de células T CD4+CD25+ y CD4+CD25" a partir de ratones GITR+/+ y GITR"7" (Figura 10A-10C) . Como se informó previamente (Shimizu et al., 202) cuando las células CD4+CD25+ como las células T CD4+CD25" expresaban GITR, la adición de anti-GITR mAb a los cultivos conjuntos resultó en un incremento en la respuesta proliferativa en comparación con los cultivos conjuntos reciben el anticuerpo del isotipo (Figura.10A, panel a). Cuando CD4+CD25~ pero no CD4+CD25+, las células T expresan GITR en los cultivos conjuntos, la adición del anticuerpo anti-GITR condujo a una mejora en la proliferación de células T similar aquella que se observa cuando las células T CD4+CD25+ expresan GITR (Figura 10A, panel b) . Sin embargo en los cultivos conjuntos de CD4+CD25" GITR"7" y las células T CD4+CD25+ GITR+/+, la adición del anticuerpo anti-GITR no tuvo efecto en la proliferación (Figura 10A, panel c) . como se espera, la adición del anticuerpo anti-GITR a los cultivos conjuntos de CD4+CD25~ GITR_/" y las células T de CD4+CD25+ GITR+ + tampoco tuvo efecto en la proliferación de células T (Figura 10A, panel d) . Se obtuvieron resultados similares a aquellos antes descritos con una preparación de anticuerpo anti-mGITR policlonal obtenido comercialmente (no se muestran los datos) . La evidencia fuerte en el apoyo de la hipótesis de que la eliminación de la supresión fue una consecuencia de ligamiento de GITR expresado por células T CD4+CD25+, se obtuvo en un estudio previo, el cual utilizó combinaciones de células T reguladoras CD4+CD25+ de ratón y de respuesta a rata (Shimizu et al., 2002). El anti-GITR mAb (DTA-1) se utilizó en estos estudios y se generó en una rata, y consecuentemente no se enlazó a células de rata (id) . Los experimentos análogos a aquellos antes descritos se efectuaron usando cultivos conjuntos de respuestas de rata CD4+CD25", supresores de ratón CD4+CD25+ y APC de rata irradiada (Figura 10B, panel b) . Las respuestas de ratón CD4+CD25~ de cultivo conjunto, supresores de ratón CD4+CD25+ y APC de rata irradiados se incluyeron como un control (Figura 10B, panel a) . Similar a los datos obtenidos de los ratones GITR"/" no sucedió suspensión de la supresión mediada por CD4+CD25+ (Figura 10B, panel b) , a menos que GITR se pudiera reticular en la población de respuesta CD25" (Figura 10B, panel a) . Un análisis adicional del sistema rata- y ratón se efectúo al examinar la dilución de CFSE por células T CD4+CD25" de rata y CD4+CD25+ de ratón en cultivo conjunto por citometría de flujo. En presencia del anticuerpo de control de isotipo, las células T CD4+CD25" en rata solamente se suprimieron parcialmente por las células de CD4+CD25+ de ratón cuando se cultivaron a una relación 1:8 de supresor a respuesta (Figura 10C, paneles del histograma izquierdo) . Sin embargo, la adición del anticuerpo anti-GITR condujo a una expansión adicional de las células T CD4+CD25+ de ratón y a un incremento consecuente en la supresión de las células T de rata (Figura 10C, paneles del histograma derecho) . La dilución creciente de CFSE de células T de ratón CD4+CD25+ que siguen al ligamiento de GITR, se puede inhibir parcialmente por la adición de anticuerpos de bloqueo anti-CD25, lo que sugiere que IL-2 hecho inicialmente por las células T de respuesta también se requiere para esta expansión (no se muestran los datos) . En conjunto, estos resultados demuestran inequívocamente que el acoplamiento de GITR en las células T CD4+CD25~ de respuesta se requiere para vencer la supresión mediada por células T de CD4+CD25+. EJEMPLO 11 Expresión de las señales GITR se requiere para regular y vencer la supresión mediada por células T reguladoras endógenas . Ya que ambos CD28 y GITR parecen proporcionar señales coestimuladoras durante la activación de las células T, se buscó determinar si juegan roles diferentes durante la respuesta primaria. Se comparó la capacidad de GITR y CD28 para promover la proliferación de células T en presencia o ausencia de células T CD4+CD25+ de ganglio linfático endógeno, y en presencia o ausencia de IL-2 (Figura 11) . Las mismas muestras usadas para los estudios de proliferación se evaluaron simultáneamente para la dilución CFSE que sigue un periodo de cultivo de 72 horas. En ausencia de las células T IL-2, CD4+ y CD8+ exógenas de ambos animales con GITR- ~ y CD28+ fallaron al proliferar (Figura 11A, panel a) . las células LN de los animales GITR+/" desplegaron un fenotipo intermediario entre aquellos animales de tipo silvestre y GITR" _ (Figura 11A, panel a) . La respuesta de las células T de los ratones de tipo silvestre se mejoró significativamente después de la supresión de las células T CD25+, lo que indica que la supresión bajo esas condiciones de cultivo estaba mediada por las células T CD25+ residentes en los ganglios linfáticos normales (Figura 11A, comparar los paneles a y b) . De manera más importante en ausencia de las células T CD4+CD25+, las respuestas de célula T de ganglio linfático CD4+ y CD8+ a partir de ratones GITR~/_ fueron comparables con aquellas de ratones de tipo silvestre cuando se evalúan por la incorporación de 3H-timidina (Figura 11A, panel b) y la dilución CSFE (Figura 11B, conjunto superior de paneles) . Sin embargo, después de 72 horas las células T CD4+ y CD8+ a partir de los animales CD28~/~ no estuvieron proliferando aún en ausencia de células de CD4+CD25+ (Figura 11A, panel b) . Se observó un patrón muy diferente de respuesta cuando el IL-2 exógeno se agregó a los cultivos de células intactas de ganglios linfáticos. La proliferación de células T CD4+ y CD8+ se inhibió completamente en ausencia de GITR cuando se ensaya por absorción de 3H-timidina (Figura 11A, panel c) o por la falta de dilución CFSE (Figura 11B, conjunto medio de paneles) . En contraste, la proliferación medible de las células T a partir de animales CD28"/_ se detectó por la incorporación de 3H-timidina (Figura 11A, panel c) , aunque el perfil de CFSE demostró que las células T CD8+ eran ampliamente responsables de la proliferación medida (Figura 11B) . En presencia de IL-2 (50U/ml) , los ganglios linfáticos suprimieron las células T CD4+CD25+ de todos los animales que desplegaron niveles similares de proliferación cuando se evalúan por la incorporación de 3H-timidina (Figura 11A, panel c) y la dilución CFSE . (Figura..1IB, conjunto inferior de paneles) . Al tomarse en conjunto, estos resultados indican que los defectos en la activación de células T en los ratones GITR~/_ y CD28+ son diferentes. La incapacidad de las células T totales presentes en los ganglios linfáticos de los ratones GITR~/_ para proliferar en presencia de IL-2 exógeno, sugiere que la expresión del receptor IL-2 de alta afinidad pudiera estar afectada en estos animales. Ya que la expresión de la cadena IL-2Rcc se induce principalmente por su ligando (Depper et al., 1985; Malek and As well, 1985) , la capacidad de las células T anti-CD3 activadas CD4+CD25+ de los ratones GITR" " para expresar esta cadena se examina en presencia o ausencia de las células T CD4+CD25+ y en presencia o en ausencia de IL-2 (Figura 11C) . en presencia de las células T reguladoras, la adición de IL-2 a los cultivos conjuntos resultó en una expresión de CD25 por GITR+ + pero no por GITR_ ", las células T CD4+CD25~ después de 24 horas (Figura 11C, panel del histograma inferior derecho) . Sin embargo, la capacidad de las células T de GITR_/" CD4+CD2'5" para someterse a una expresión CD25 inducida por IL-2 se puede reestablecer fácilmente al retirar las células T CD4+CD25+ (Figura 11C, panel del histograma inferior izquierdo) . Así, la imposibilidad en la respuesta IL-2 por las células T GITR_/" en presencia de células T CD4+CD25+ se debe al menos en parte, a su incapacidad para expresar el receptor IL-2 de alta afinidad en presencia de concentraciones de IL-2 exógeno suficientes para inducir la expresión de CD25 en células de tipo silvestre.
EJEMPLO 12 Coestimulación dependiente de CD28 mejora la expresión y respuesta de GITR. Aunque los datos antes presentados sugieren que el acoplamiento de las células T GITR o CD28 sobre CD25 proporcionan una señal que permite a las células T de respuesta escapar a la supresión, permanece poco clara la naturaleza de las señales involucradas en este proceso. El rescate parcial de las respuestas proliferativas de las células T CD28_ " CD8+ por IL-2 en presencia de células T CD4+CD25+ sugiere que la señalización CD28/B7 pudiera regular la sensibilidad de células T a las interacciones GITR/GITRL. Además , estudios previos han demostrado que las interacciones de CD28-CD80/CD86 pueden mejorar la expresión de algunos miembros de la familia TNFR (Gilfillan et al., 1998; Rogers et al., 2001). Así, se examinó esta posibilidad con respecto a GITR. Las células T CD4+ CD25+ y CD8+ purificadas de CD28" _ o de ratones de tipo silvestre, permanecieron sin estimular o se activaron con concentraciones bajas de anticuerpos anti-CD3 enlazados a las placas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CD28 enlazado a las placas (Figura 12A) . Aunque las células T de tipo silvestre expuestas al anti-CD3 solo solamente sobreregularon manera ligera al GITR, la expresión de GITR por ambas células T CD4+CD25+ y CD8+ se mejoró ampliamente por la inclusión de anti-CD28. Similarmente la sobreregulacion de la expresión de GITR en las células T de CD4+CD25~, se inhibió notablemente por la adición de anti-CD80/CD86 (anti-B7.1/7.2) (Figura 12B, panel del histograma izquierdo) . La inhibición de la expresión de GITR en cultivos que contienen anti-CD80/CD86 no fue secundaria a la producción reducida de IL-2 ya que la sobreregulacion de GITR por células T CD4+CD25" no se evitó en cultivos que contienen anti-IL-2/IL-2R mAbs (Figura 12B (panel del histograma derecho) ) . La expresión mejorada de GITR inducida por señales coestimuladoras derivadas de CD28 estuvo en paralelo con una respuesta mejorada a la señalización de GITR (Figura 12C) . La adición del anticuerpo anti-GITR mejoró substancialmente la proliferación de ambas células T efectoras CD4+ y CD8+ a partir de ratones de tipo silvestre (Figura 12C, paneles izquierdos) . Sin embargo, cuando se agregó anti-CD80/CD86 a estos cultivos, la presencia del anticuerpo anti-GITR de manera marginal la proliferación de las células T GITR+/+ CD4+CD25+ (Figura 12C, GITR+/+, izquierda superior, GITR"7" derecha superior) y células T GITR+/+ CD8+ (Figura 12C, GITR+ +, izquierda inferior, GITR"'" derecha inferior) sobre el intervalo de concentración probadas de anti-CD3. El tratamiento con anti-GITR no afectó las respuestas de las células T CD4+CD25+ y CD8+ purificadas a partir de ratones GITR"''" (Figura 12C, paneles derechos) . Estos datos sugieren que las señales mediadas por CD28 diferentes de la coestimulación de la producción IL-2, mejoran la expresión de GITR y facilitan la señalización mediada por GITR.
EJEMPLO 13 Enlace de GITRL a GITR proporciona una señal coestimuladora a las células T efectoras. Cuarenta mil células de ayuda T HT-2 efectoras (GITR+/TCR+) se cultivaron en ausencia o presencia de los siguientes reactivos: 1) perlas recubiertas anti-CD3 a una relación de 1:1 o 1:2, 2) 10,000 células YB/2 que no se modificaron para expresar GITR (YB2(0 parenteral) o se modificaron para expresar GITRL (YB2/0 muGITRL) y 3) concentraciones crecientes de un anticuerpo de control de isotipo o cuatro diferentes anticuerpos anti-GITR (5F1, MGTL-10, MGTL-15 , o un anticuerpo policlonal anti-GITRL) . Se midió la proliferación por la incorporación de 3H-timidina durante las últimas 5 horas de un periodo de cultivo de 44 horas . La figura 13A demuestra que GITRL mejora la proliferación de células T estimuladas con anti-CD3. Adicionalmente, la mejora mediada por GITRL de la proliferación de células T se puede bloquear con el anticuerpo 5F1, pero no el anticuerpo de control de isotipo (Figura 13B) y el MGTL-10, MGTL-15 comercialmente disponible y los anticuerpos anti-GITRL policlonales (Figura 13C) . Estos datos proporcionan evidencia adicional de que GITRL proporciona una señal, coestimuladora y también que 5F1 es un anticuerpo neutralizante para GITRL.
EJEMPLO 14 Bloqueo del enlace GITR-GITRL con un anticuerpo anti-GITRL evita la transferencia activa de encefalomielitis autoinmune experimental inducida por PLP. Ratons SJL hembra de 9 semanas de edad se inmunizaron con péptido 150 µg PLP (aminoácidos 139-151) [HSLGKWLGHPDKF (SEQ ID NO: 12) en adyuvante completo de Freund. Diez días después de la inmunización los esplenocitos se cosecharon y se volvieron a estimular ex vivo durante 3 días con 10 µg/ml PLP (aminoácidos 139-151) en ausencia (sin tratamiento) o presencia de anticuerpo 10 g/ml (anticuerpo GITRL o anticuerpo de control) . Después de la reestimulación, se transfirieron de forma adoptiva los SxlO6 esplenocitos en ratones SJL nuevos de 10 semanas de edad y los ratones se monitorearon durante 52 días para una encefalomielitis autoinmune experimental (??) cuando se mide en una escala de 0 a 5. La EAE se desarrolló en 40% y 80% de los ratones que reciben esplenocitos reestimulados en ausencia de cualquier anticuerpo (sin tratamiento) y ratones que reciben esplenocitos se reestimularon en presencia de anticuerpo de control (CK01) (Figura 14) respectivamente. Adicionalmente, no hubo una diferencia importante en la escala de enfermedad entre los animales que reciben esplenocitos sin tratamiento y los animales que reciben esplenocitos tratados con anticuerpo de control. Significativamente, ninguno de los ratones que recibieron esplenocitos que se volvieron a estimular en presencia del anticuerpo anti-GITRL (5F1) desarrollaron EAE (p = 0.0023 contra el tratamiento del anticuerpo de control) (Figura 14) . Estos datos sugieren que el bloqueo de la trayectoria de GITR/GITRL limitará la capacidad de las células T CD25" para superar la supresión, con lo cual se submodula su capacidad para efectuar respuestas autoinmunes .
EJEMPLO 15 Procedimientos experimentales Ejemplo 15.1: Anticuerpos y reactivos Todos los anticuerpos usados para citometría de flujo o estudios funcionales fueron de BD-Pharmingen, excepto: aCD4 (clon CT-CD4) etiquetado tricolor y aB220 (clon RA3-6B2) que se adquirieron de Caltag (Burlingame, CA) y MGTL-10, MGTL-15 y anticuerpos policlonales anti-GITRL que se adquirieron de Alexis Biochemicals (San Diego, CA) . El fragmento purificado de F(ab' )2 de cadena anti-IgM µ de cabra se adquirió de Jackson Immunoresearch (West Grove, PA) . Anti-IL-2 (clon S4B6) se usó como fluido de ascitos. El IL-2 recombinante humano se obtuvo del National Cáncer Institute (Frederick, MS) . Las columnas enriquecedores de células T y de IL-4, IFN-?, IL-12 se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis , MN) . Se adquirieron Poly l:C y LPS a partir de Sigma. CpGs se adquirieron de Invivo Gen (San Diego, CA) . Anti-GITRL (clon 5F1; también el clon 10F12) y anti-GITR (clon DTA-1) y el péptido PLP se produjeron internamente. Se adquirieron las perlas magnéticas anti-B220, -CDllc, -CDllb - CD8, CD4 y -PE de Miltenyi (Auburn, CA) .
Ejemplo 15:2 Ratones Los ratones BALB/c y C57B1/6 (hembras de 6-8 semanas de edad) se adquirieron de la instalación animal de NCI Frederick (Frederick, MD) . Los ratones CD28_/" se administraron por el Dr. Alfred Singer (NIH/NCI) . Los embriones GITR+/" (Svl29 x B6) se suministraron por C. Ricarrdi (Perugia University Medical School, Italia) (Ronchetti et al., 2002). Los ratones GITR+ " vueltos a derivar se cruzaron de nuevo una vez con ratones C57BL/6 y la progenia resultante se seleccionó para un alelo mutante por PCR. La progenie identificada GITR+/" donde luego se entrecruza para generar ratones GITR'1' . Todos los ratones se alimentan y alojan en instalaciones NIH/NIAID bajo condiciones SPF (siglas en inglés de libre de patógeno específico) . Ejemplo 15.3: Clonado y expresión de ADNc. La secuencia de aminoácidos para GITRL humano (GenBank Acc. No. N _005092) se usó para buscar la base de datos Celera para el mGITRL. La secuencia genómica ga_x5j 8b7w7wj 5_0 1. cm_aa_2 contiene tres regiones pares de alta calificación (HSP) . Con base en la suposición de que estas regiones corresponden a los exones para GITRL de ratón, los cebadores se diseñaron para amplificación PCR. El cebador delantero (5 ' -ATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG-3 ' ) (SEQ ID NO: ) y el cebador inverso (5 ' -GAATGGTAGATCAGGCATTAAGATG-3 ' ) (SEQ ID NO: 5) amplifican un clon de ADNc de una colección de timo de ratón. El fragmento resultante se subclonó y la secuencia de ADN se determina. Un clon de longitud completa posterior se amplificó por PCR del constructo previo usando cebadores 5'-TTTAAAGTCGACCCACCATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG-3 ' (delantero) (SEQ ID NO : 6) y 5 ' -TTTAAAGAATTCTCATTAAGAGATGAATGGTAGATCAGGCAT-3 ' (inverso) (SEQ ID NO: 7) . El fragmento PCR resultante se subclonó en el vector retroviral GFP-RV (Ouyang et al., 1998) , y la determinación de secuencia del clon ANDc final se realiza. Este vector se transfiere entonces en la línea celular P oenix. Los sobrenadantes de las células Phoenix transfectadas se usan para transducxr la línea celular YB2/0.
Las células YB2/0 que expresan GFP luego se calificaron FACS y se mantienen en cultivo. La secuencia de aminoácidos mGITRL predicha es idéntica a la del otro grupo (Kim et al., 2003), excepto para la substitución de una alanina por una valina en la posición 48 de aminoácidos en su secuencia.
Ejemplo 15.4: Producción y purificación de anticuerpos monoclonales Se inmunizan ratas Lewis una vez s.q. con 100x10s células YB2/0-GITRL en CFA. Dos semanas más tarde, estas ratas se inmunizan s.q. con lOOxlO6 células YB2/0-GITRL en IFA. Dos semanas más tarde, las ratas se refuerzan con 50x10s células YB2/0-GITRL en PBS. Cuatro días más tarde, el bazo se cosecha y la fusión celular se realiza como se describe previamente (Coligan et al., 2003). Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se separan por exclusión por citometría de flujo usando Phoenix-GITRL y células Phoenix. Los anticuerpos se purificaron de sobrenadantes de cultivo celular usando columnas cargadas con proteína G, y los anticuerpos eluidos se dializan contra PBS..
Ejemplo 15.5: Purificación celular Se purifican células T de ganglios linfáticos periféricos de ratones. Se etiquetan células CD25+ T con perlas magnéticas y se purifican en un autoMACS (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La pureza de las células CD25+ está típicamente entre 97 hasta 99 por ciento. Las células restantes en la fracción negativa se cargan posteriormente ya sea con microperlas anti-CD4 o anti-CD8 y se purifican usando el procedimiento de selección positiva en el auto ACS. La pureza fue rutinariamente del 90-95 por ciento. Se prepararon suspensiones de bazo disminuidas en células T a partir de suspensiones lisadas con eritrocitos a partir de células Thyl .2+ dismunuidas usando el autoMACS . Las células B220+ se purificaron de los esplenocitos en una forma similar usando las microperlas anti-B220 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) , y la pureza de las ' preparaciones resultantes son rutinariamente mayores al 90%. Se preparan células peritoneales al mojar la cavidad peritoneal (PerC) con 10ml de HBSS frió-. - Para DC esplénicos, se preparan suspensiones de esplenocitos en una manera similar a la que se describe (Vremec et al . , 2000) . Los DC esplénicos se purifican entonces de las suspensiones usando microperlas anti-CDllc (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) . Las suspensiones DC resultantes rutinariamente son del 85 hasta 90 por ciento puras. Se generan células CD4+CD25 de rata por esplenocitos de rata disminuidos de células CD25+ usando anticuerpo CD25 de rata anti PE (OX-39) seguido por microperlas anti-PE. Después de la disminución, las células CD4+ se seleccionan entonces de la fracción disminuida usando microperlas CD4 anti-rata.
Ejemplo 15.6: Ensayos de proliferación in vitro Se realizan ensayos de supresión como se describe (Thornton and Shevach, 1998) . Brevemente, las células (5x104) se cocultivan en RPMI 1640 complementado con FBS (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA) con esplenocitos disminuidos en célula T, irradiados (3000R) , (5xl04) en presencia de 0.5µg/ml de anti-CD3 mAb (2C11) en placas de fondo plano de 96 pozos. Para algunos cultivos, se agregan anticuerpos específicos para GITR o un isotipo Ig de rata a una concentración final de 2µg/ml. Se agregan números titulados de células CD4+CD25+ a un supresor final para responder relaciones de 0:1, 1:2, 1:4, o 1:8. Los cultivos se pulsan con ?µ?? de 3H-timidina para las 5-8 horas finales del cultivo de 72 horas, y se realizaron en triplicado salvo que se indique de otra manera. Los cocultivos de células T de rata y ratón se agrupan en una manera similar excepto que se usan esplenocitos de rata disminuidos en CD4 rradiados (3000R) como APCs, y las células T de rata y ratón se estimulan usando un cóctel de CD3 anti-rata ( 0.25µg/ml) y CD3 anti-ratón (0.25µg/ml) mAbs .
Ejemplo 15.7: Cultivo in vitro de células de ganglio linfático y CFSE etiquetado Se prepararon suspensiones de células de ganglio linfático disminuidas en CD25+ en el autoMACS como se describe arriba. Las células se etiquetaron con CFSE a una concentración de 2µ? durante 8 minutos en un baño de agua a 37°C. Las células se lavan entonces en RPMI 1640 completo. Se cultivan entonces células (5xl0 /pozo) en placas de 96 pozos en presencia o ausencia de rhIL-2 (50U/ml) . Se pulsan pozos duplicados ya sea con ?µ?? de 3H-timidina para las 5-8 horas finales de un cultivo de 72 horas o se usan para el análisis de dilución CFSE.
EJEMPLO 16 Discusión El papel de GITR en la función de células CD4+CD25+ T se deduce de la demostración que los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales para GITR invierten los efectos supresores de las células CD4+CD25+ T cuando se agregan a cocultivos de células CD25+ y CD25" T (McHugh et al., 2002; Shimizu et al., 2002). Las células CD4+CD25+ T parece que posiblemente son el objetivo para los reactivos anti-GITR debido a que células CD25+ T recientemente explantadas expresan GITR a niveles más altos que las células CD25" T restantes y debido a que el anticuerpo anti-GITR junto con IL-2 detonan la proliferación de células T CD25+, pero no CD25",.en ausencia de una señal TCR. Adicionalmente, cuando Shimizu et al agrega un anti-mGITR mAb de rata, que fue no reactivo con células de rata, a cocultivos de células T supresoras - de CD25+ de ratón y de respuesta de rata, se observa una inversión de la supresión. Estos estudios llevan a la hipótesis de que el compromiso de GITR por el anticuerpo anti-GITR agonistas y, presumiblemente, por su ligando fisiológico, genera una señal que tanto inhibe la actividad supresora de las células CD4+CD25+ T e invierte la no respuesta de las células CD25+ T para el IL-2 exógeno. Los experimentos se diseñaron para intentar una extensión y confirmar estos estudios por clonado de GITRL de ratón, analizando la distribución de tejido, y definitivamente determina el objetivo para los anticuerpos anti-GITR agonistas al usar mezclas de células CD25+ y CD25" T del tipo silvestre y GITR'1' de ratones. Colectivamente, los estudios demuestran que los anticuerpo anti-GITR y GITRL anulan los efectos supresores de las células CD4+CD25+ T al proporcionar células CD25"T de señal única que elevan su umbral para la supresión por células CD4+CD25+ T. Los estudios indican que GITRL se expresa selectivamente en la superficie celular de APC, con el nivel más alto de expresión en linfocitos B-l B; niveles intermedios en linfocitos B-2 B convencionales, macrófagos, y DC B220+; y niveles más bajos en subconjuntos B220-DC. El GITRL es único entre los miembros de la superfamilia TNF en que se expresa en el APC restante, y su expresión se subregula al accionar el receptor de célula B, CD40, o receptores tipo Toll diferentes. Otros miembros de la superfamilia TNF (4-1BB-L, OX40-L, LIGHT, CD70, CD30-L) no se detectan en el APC restante, y su expresión se sobreregula por la activación del APC por medio de la estimulación del receptor tipo Toll (Croft, 2003) . Los estudios actuales no atienden si la subregulación de la expresión GITRL de la superficie celular se realiza por la secreción de GITRL soluble, pero Tone et al. (2003) reporta que la estimulación LPS de DC, macrófagos y células B que resulta en la subregulación del ARNm GITRL. La expresión de GITRL en el APC restante sugiere fuertemente que funciona tempranamente en el proceso de la activación de célula T. Otros tipos de células, incluyendo células endoteliales (Gurney et al., 1939; Kwon et al., 1999), células T activadas, y ciertos subconjuntos de timocitos DN también se muestran que expresan GITRL, y la función de esta molécula en estos últimos tipos de células queda para ser determinada. La capacidad de tanto los anticuerpos anti-GITRL como las células que expresan GITRL para potenciar la activación de las células CD25" T solas, así como la capacidad de anti-GITRL para inhibir parcialmente la activación de las células CD25" T en ausencia de células CD25+ T, impulsan una reexaminación cuidadosa de los objetivos celulares de estos reactivos. La adición de anti-GITR a los cocultivos de células CD25+ y CD25" T del tipo silvestre y ratones GITR'1' demuestran que el objetivo de la inversión de supresión mediada por el anticuerpo fue la célula CD25" T. Esto se soporta además por los experimentos usando células T de respuesta CD25" y supresora CD25+ de ratón en cocultivos, que desmuestra concluyentemente el ligado GITR en el subconjunto de células CD25÷ T no anulan su función supresora. De hecho, un examen de la dilución CFSE demuestra que la ligadura GITR promueve la expansión de células CD25+ T en cocultivos, que por último aumentan la supresión de las CD25" de respuesta de -rata. Por lo tanto, es posible que el aumento en lá proliferación en cocultivos de rata/ratón tratados con anti-GITR reportados por Shimizu et al (2002) , que se presume que se deben a las células T de rata, actualmente reflejan la proliferación de las células supresoras CD25+ de ratón. Esto no será aparente al medir la incorporación de 3H-timidina sola. Un reporte previo sugiere que las células T deficientes en GITR son hiperreactivas a la estimulación TCR (Ronchetti et al., 2002) . Sin embargo, la extrapolación de aquelas observaciones de las presentes observaciones son difíciles como que tal reporte no analiza las respuestas de linfocitos CD4+, CD8+ T purificados, ni evalúan el papel de células CD4+CD25+ T. En los presentes estudios, las respuestas de células CD4+CD25~ y CD8+ T altamente purificadas de ratones GITR'1' son comparables a aquellos de controles. Sin embargo, en presencia de números fisiológicos de células T reguladoras, tanto células CD4+ como CD8+ T de animales GITR'1' son completamente sin respuesta a ligadura cruzada CD3. Este resultado demuestra claramente que en ausencia de interacciones GITR/GITRL la supresión es dominante. Verdaderamente, la supresión de la activación de células CD4+CD25~ T de ratones GITR'1' fue tan fuerte que no se vencerá por la adición de una alta concentración de IL-2 exógeno, que normalmente anula los efectos supresores de números mucho mayores de células CD25+ T en las respuestas de células CD4+CD25" T de tipo silvestre (Takahashi et al., 1998; T ornton and Shevach, 1998) . Los efectos supresores de las CD4+CD25+ se median por la inhibición de tanto producción y expresión de IL-2 de CD25 por la población de respuesta CD4+CD25" GITR'1', que parece los que se ha descrito previamente para los efectos de células CD4+CD25+ T en respuestas a célula CD8+ T normales (Piccxrillo and Shevach, 2001) . Las señales coestimuladoras entregadas por GITR y CD28 parecen ser distintas, pero interrelacionadas . En ausencia de células T reguladoras, las respuestas de células tanto CD4+ como CD8+ T de ratones GITR'1' son idénticas a aquellas de células de ratones tipo silvestre. En contraste, bajo las condiciones de cultivo usadas en este estudio, las células CD4+ y CD8+ T de ratones CD28'1' no son de respuesta. Al contrario, cuando IL-2 se agrega a los cultivos que contienen células T reguladoras, las respuestas de células CD4+ y CD8+ T de los ratones GITR'1' .no se restauran, aunque las respuestas de células CD8+ de los ratones CD28'1' se restauran parcialmente. Por otro - lado, una relación cooperativa potencial y participación en la señalización jerárquica entre CD28 y GITR se soporta por la demostración de que (1) las células CD4+CD25~ y CD8 T fallan para sobreregular GITR en ausencia de reticulación CD28 y (2) los anticuerpos anti-CD80/CD86 inhiben marcadamente tanto la sobreregulación de la expresión GITR y la respuesta a los anticuerpos anti-GITR. De esta manera, los resultados sugieren que una función importante adicional de la trayectoria de señalización CD28-CD80/CD86 durante la activación de célula T es para autorizar la resistencia de célula -T a supresión mediada por CD25+ al aumentar la expresión y función de GITR. De forma similar a los resultados sugeridos por otros estudios publicados (Shimizu et al., 2002; Tone et al., 2003) , estos estudios indican que el ligado de GITR en células CD25" T, en ausencia de células T reguladoras, proporcionan algún grado de coestimulación. Sin embargo, el ligado de GITR no se requiere para coestimular células CD25" de la misma manera como CD28, como células CD4+CD25" y CD8 T de ratones GITR'1'.: responden de forma similar a las células T de tipo silvestre. Se apreciará la observación de que la obligación de GITR en células T tanto CD4+CD25" como CD8+ efectoras por GITRL tempranamente durante el curso de una respuesta inmune sirve primariamente para volver la población efectora resitente, por ejemplo, menos susceptible, a los efectos supresores de las células CD4+CD25+ T. Durante el curso de la respuesta, las señales inflamatorias resultan en la subregulación de la expresión GITRL, por ello incrementando la susceptibilidad de las células efectoras para supresión mediada por CD25+. No obstante que sólo están disponibles datos limitados como para cuando la supresión mediada por CD25+ de respuestas inmunes a agentes infecciosos se presenta in vivo, algunos estudios sugieren que opera como una contracción, en vez de el inicio, la fase de respuesta para prevenir el daño de tejido secundario a la inflamación exuberante (Suvas et al., 2003). Se debe señalra que el acoplamiento de GITR en las células CD25+ T en presencia de IL-2 induce su expansión (McHugh et al., 2002) . Se mantiene como posibilidad que el acoplamiento in vivo de GITR en células CD25+ T por GITRL en APC restante resulta en la expansión no especifica de las células T reguladoras en presencia de IL-2 secretada por células T efectoras tempranamente en el curso de la respuesta inmune. Esta expansión no específica puede ser critica para la generación posterior de un conjunto de células supresoras específicas del antígeno que funcionan para inhibir la actividad de célula efectora tardía en la respuesta. Se ha propuesto previamente que la manipulación de interacciones GITR/GITRL pueden probarse para ser una vía efectiva de manipulación de células T reguladoras in vivo (McHugh and Shevach, 2002). No obstante este concepto se basa en los datos que sugieren que las células CD4+CD25+ T son el objetivo del anticuerpo anti-GITR, todavía es el caso que la interacción GITR/GITRL representa un agente terapéutico importante. De esta manera, el tratamiento con un anticuerpo anti-GITR agonista o un GITRL-Fc agonista volvería a las células efectoras resistentes, por ejemplo, menos susceptibles, a los efectos supresores de las células CD4+CD25+ T y proporcionaría efectividad para tratar cánceres y enfermedades infecciosas, para aumento de respuestas inmunes al cáncer (usado solo o en combinación con otras terpia de tumor, tales como vacunas de tumor) , y para el aumento de respuestas inmunes a patógenos infecciosos, incluyendo virus, bacterias, etc (usados solos o en combinación con otras terapia para patógenos infecciosos, tales como adyuvantes de vacunas para vacunas débiles por agentes infecciosos) . Similarmente, la inhibición de las interacciones GITR/GITRL con un agonista GITR, por ejemplo, a través del uso de un anticuerpo anti-GITRL neutralizante o GITR-Fc, sería menor el umbral de las células T efectoras para la supresión y de esta manera es útil para la prevención y/o tratamiento de trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, rechazo al transplante (o injerto) , y enfermedad injerto contra hospedador. Referencias Las siguientes referencias son citas completas para varias citas de autor/año en la especificación: Aseffa, A., Gumy, A., Launois, P., MacDonald, H. R. , Louis, J. A., and Tacchini - Cottier , F. (2002). The early IL-4 response to Leishmania maj or and the resulting Th2 cell maturation steering progressive disease in BALB/c mice are subject to the control of regulatory CD4+CD25+ T cells . J Immunol 169, 3232-3241. Banchereau, J., and Steinman, R. M. (1998).
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Claims (54)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .
1. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 3.
2. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se liga operativamente a al menos una secuencia de control de expresión.
3. Una célula hospedera caracterizada porque es transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico dé conformidad con la reivindicación 2.
4. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque se hibridiza específicamente bajo condiciones altamente severas a la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO:3, o el complemento de ella.
5. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
6. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación" - 5 , caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se liga operativamente a al menos una secuencia de control de expresión.
7. Una célula hospedera caracterizada porque es transformada o transfectada con la molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6.
8. Un animal transgénico no humano caracterizado porque las células germinales o somáticas contienen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 3.
9. Una proteína aislada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 4.
10. Una proteína aislada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2 , o un fragmento activo del mismo.
11. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos complementa ia a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 3 , o un fragmento del mismo, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula resulta en una producción disminuida de GITRL.
12. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11, carac erizada porque la molécula de ácido nucleico se liga operativamente a al menos una secuencia de control de expresión . ¦
13. Un oligonucleotido antisentido complementario a un ARNm que corresponde a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 3 , o un fragmento del mismo, caracterizado porque el oligonucleotido inhibe la expresión de GITRL.
14. Una molécula de ARNsi que corresponde a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 3 , o un fragmento del mismo, caracterizada porque la molécula de ARNsi inhibe la expresión de GITRL.
15. Un anticuerpo aislado caracterizado porque puede enlazarse específicamente a la proteina de conformidad con la reivindicación 10.
16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo neutraliza la actividad de GITRL.
17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es 5F1, que tiene el número ATCC PTA-5336, o 10F12, que tiene el número ATCC PTA-5337.
18. Un método para separar por exclusión los compuestos de prueba que pueden inhibir la interacción de GITRL con GITR caracterizado porque comprende las etapas de : poner en contacto una muestra que contiene GITRL y GITR con el compuesto; y determinar si la interacción de GITRL con GITR en la muestra disminuye con relación a la interacción de GITRL con GITR en una muestra que no hace contacto con el compuesto, por lo cual una disminución en la interacción de GITRL con GITR en una muestra que hace contacto con el compuesto identifica el compuesto como uno que inhibe la interacción de GITRL con GITR.
19. Un método para separar por exclusión compuestos de prueba capaces de mejorar o imitar la interacción de GITRL con GITR caracterizado porque comprende las etapas de: poner en contacto una muestra que contiene GITRL y GITR con el compuesto; y determinar si la interacción de GITRL con GITR en la muestra se incrementa con relación a la interacción de GITRL con GITR en una muestra que no hace contacto con el compuesto, por lo cual un incremento en la interacción de GITRL con GITR en la muestra que hace contacto con el compuesto identifica el compuesto como uno que mejora o imita la interacción de GITRL con GITR.
20. Un método para el diagnóstico de un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo de transplante en un sujeto, caracterizado porque comprende las etapas de: detectar una cantidad de prueba de un producto de genes de GITRL en una muestra del sujeto; y comparar la cantidad de prueba con una cantidad normal del producto de genes de GITRL en una muestra de control, por lo cual una cantidad de prueba significativamente arriba de la cantidad normal proporciona una indicación positiva en el diagnóstico de un trastorno autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o rechazo de transplante.
21. Un método para diagnóstico del cáncer o una enfermedad infecciosa en un sujeto, caracterizado porque comprende las etapas de: detectar una cantidad de prueba de un producto de genes de GITRL en una muestra del sujeto; y comparar la cantidad de prueba con una cantidad normal del producto de genes de GITRL en una muestra de control, Por lo cual una cantidad de prueba significativamente debajo de la cantidad normal proporciona una indicación positiva en el diagnóstico del cáncer o una enfermedad infecciosa.
22. Un método para tratar a un sujeto en riesgo de, o diagnosticado con, un trastorno auto-inmune, enfermedad inflamatoria, o rechazo de transplantes caracterizado porque comprende administrar al sujeto un antagonista GITR.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método comprende administrar el antagonista GITR de manera que se mantiene la susceptibilidad a las células T efectoras en el sujeto a la supresión por las células T reguladoras CD4+CD25+.
24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque " el antagonista GITR se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo neutralizante anti-GITRL, un anticuerpo neutralizante anti-GITR, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonista, una molécula de ácido nucleico GITRL antisentido, y una molécula de ácido nucleico GITRL de AR si.
25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porgue el trastorno autoinmune o enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, encefalomielitis , osteoartritis , esclerosis múltiple, gastritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y otras dermatosis inflamatorias, diabetes tipo I, asma, alergia, y enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo la enfermedad de Crohn y colitis ulcerante.
26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el trastorno autoinmune es esclerosis múltiple .
27. Un método para tratar a un sujeto en riesgo de, o diagnosticado con, cáncer o una enfermedad infecciosa caracterizado porque comprende administrar al sujeto un agonista GITR.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el método comprende administrar el agonista GITR de manera que el agonista GITR proporciona una señal coestimuladora a las células T efectoras en el sujeto y las hace menos susceptibles a la supresión por las células T reguladoras CD4+CD25+ en el sujeto.
29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, y un anticuerpo agonista GITR.
30. Un método para inducir la proliferación de una población celular que contiene células T efectoras, caracterizado porque comprende administrar un agonista GITR a la población celular.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una protelna de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, y un anticuerpo agonista GITR.
32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+.
33. Un método para inhibir la proliferación de una población celular que contiene células T efectoras caracterizado porque comprende administrar un antagonista GITR a la población celular.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el antagonista GITR se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo neutralizante anti-GITRL, un anticuerpo neutralizante anti-GITR, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonista, una -molécula de ácido nucleico GITRL antisentido, y una molécula de ácido nucleico GITRL de ARNsi.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+.
36. Un método para bloquear la supresión de una población celular que incluye células T efectoras en presencia de células T reguladoras CD4+CD25+ caracterizado porque comprende administrar un agonista GITR a la población celular .
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el método comprende administrar el agonista GITR tal que el agonista GITR proporciona una señal coestimuladora a las células T efectoras y las hace menos susceptibles a supresión por las células T reguladoras CD4+CD25+.
38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteina de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, y un anticuerpo agonista GITR.
39. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+.
40. Un método para suprimir a una población celular que incluye células T efectoras en presencia de células T reguladoras . CD4+CD25+ caracterizado porque comprende administrar un antagonista GITR a la población celular.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el método comprende administrar el antagonista GITR tal que se mantiene la susceptibilidad de las células T efectoras a la supresión por las células T reguladoras CD4+CD25+.
42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el antagonista GITR se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo neutralizante anti-GITRL, un anticuerpo neutralizante anti-GITR, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonista, una molécula de ácido nucleico GITRL antisentido, y una molécula de ácido nucleico GITRL de ARNsi.
43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque las células T efectoras son células T CD4+ o células T CD8+.
44. Un método para tratar el cáncer o uña enfermedad infecciosa en un sujeto, el método caracterizado porque comprende las etapas de obtener una población de células T efectoras, tratar la población con un agonista GITR, y administrar la población tratada al sujeto que padece de cáncer o una enfermedad infecciosa.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteina de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula agonista pequeña, y un anticuerpo agonista anti-GITR.
46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el sujeto padece de cáncer, y en donde la población tratada se usa como una vacuna de tumor.
47. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un agonista GITR y un portador farmacéuticamente aceptable.
48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula agonista pequeña, y un anticuerpo agonista anti-GITR.
49. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un antagonista GITR y un portador f rmacéuticamente aceptable .
50. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porgue el antagonista GITR se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo neutralizante anti-GITRL, un anticuerpo neutralizante anti-GITR, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonista, una molécula de ácido nucleico GITRL antisentido, y una molécula de ácido nucleico GITRL de ARNsi.
51. Un adyuvante de vacuna caracterizado porque comprende un agonista GITR y un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fungal, un antígeno parásito, un antígeno de cáncer, un antígeno asociado al tumor y fragmentos del mismo.
52. El adyuvante de vacuna de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el agonista GITR se selecciona del grupo que consiste de GITRL, o un fragmento activo de GITRL, una proteína de fusión que contiene GITRL, una proteína de fusión que contiene un fragmento activo de GITRL, una molécula agonista pequeña, y un anticuerpo agonista anti-GITR.
53. Un adyuvante de vacuna caracterizado porque comprende un antagonista GITR y un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un autoantígeno, proteína péptida amiloide, un aloantígeno, un antígeno de transplante, un alérgeno y fragmentos de los mismos .
54. El adyuvante de vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el antagonista GITR se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo neutralizante anti-GITRL, un anticuerpo neutralizante anti-GITR, una proteína de fusión que contiene GITR, una proteina de fusión que contiene un fragmento activo de GITR, una molécula pequeña antagonista, una molécula de ácido nucleico GITRL antisentido, y una molécula de ácido nucleico GITRL de AR si.
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