KR20150130283A - 생체분자 보조제를 갖는 백신 - Google Patents

생체분자 보조제를 갖는 백신 Download PDF

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데이비드 웨이너
카루피아 무투마니
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

항원 및 하나 또는 그 이상의 2분자 보조제를 포함하는 백신이 본원에 제공된다. 대상체에서 면역 반응을 증가시키기 위한 방법이 또한 본원에 제공된다. 상기 방법은 백신을 필요로 하는 대상체에게 백신을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

생체분자 보조제를 갖는 백신{VACCINES WITH BIOMOLECULAR ADJUVANTS}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2013년 3월 15일자 출원된 미국의 가출원 번호 61/800,328호에 대한 우선권을 청구하고, 그의 모든 사항은 여기에 참고로 포함된다.
정부 이해관계의 언급
본 발명은 미국국립보건원에 의해 부여된 계약번호 5-P30-AI-045008-13 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
기술분야
본 발명은 항원 및 하나 또는 그 이상의 생체분자 보조제를 포함하는 백신과 그러한 백신을 투여하는 방법에 관한 것이다.
백신은 특정한 질병에 대한 보호 및/또는 치료를 제공하기 위해 개체에서 면역 반응을 촉진하기 위해 사용되었다. 일부 백신은 면역 반응을 유도하기 위한 항원을 포함한다. 일부 항원은 강력한 면역 반응을 이끌어 내는 반면 다른 항원은 약한 면역 반응을 이끌어 낸다. 항원에 대한 약한 면역 반응은 백신에 보조제를 포함함으로써 강화될 수 있다. 보조제는 알루미늄 염, 오일, 에멀젼, 박테리아 및/또는 병원체의 멸균성 구성 성분과 같은 많은 다른 형태로 된다.
DNA 백신 유도 면역성은 또한 합성 유전자 인코딩 분자 보조제의 공동-전달에 의해 증진될 수 있다. 많은 이들 보조제는 면역 반응 및/또는 보호적 효능의 크기 또는 유형을 증가시킴으로써 백신-유도 면역성을 증진하는 것이 입증된 사이토카인류 및 케모카인류를 포함했다. 분자 보조제의 사용을 통해, 면역 반응이 병원체 특정(즉, 감염성 제제) 또는 비-병원성(즉, 암) 항원에 대해 최상의 효능을 위해 고도로 맞춤화될 수 있고 기능적으로 재단(tailored)될 수 있다.
이들 분자 보조제에 부가하여, 백신은 또한 많은 상이한 방식(예를 들어, 주사, 구강으로, 등)으로 많은 상이한 조직(예를 들어, 근육 내로, 피내로, 등) 안으로 투여될 수 있다. 전달 방법이 개체의 집단 내에서 모두 동등하지 않고 그리고 보다 큰 준수를 요하지 않는 반면 다른 전달 방법이 백신의 면역원성 및/또는 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이 기술분야에 있어 병원체 및 비-병원성 항원에 대해 최상의 효능을 위해 맞춤화될 수 있고 기능적으로 재단된 백신접종을 제공하기 위한 특정한 전달 방법과 조합된 안전하고 보다 효과적인 보조제, 그리고 특별하게는 분자 보조제의 개발에 대한 요구가 여전하다.
본 발명은 항원 및 Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 보조제를 포함하는 백신에 관한 것이다. 백신의 항원은 제1 핵산에 의해 인코딩되고 보조제는 제2 핵산에 의해 인코딩된다. 백신의 제1 및 제2 핵산은 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 백신의 항원은 인간의 파필로마 바이러스 (HPV) 항원, HIV 항원, 인플루엔자 항원, 열대열원충 항원, 또는 이들의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. HPV 항원은 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. HIV 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, 및 이들의 어떤 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, BHA 항원 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 열대열원충 항원은 포자소체 (CS) 항원을 포함할 수 있다. 백신은 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 대상체에서 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 청구항 1의 백신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 백신을 투여하는 단계는 근육 내 투여 및 피하 투여 중 적어도 하나를 포함한다. 백신은 또한 전기천공을 통해 투여될 수 있다. 상기 방법은 대상체의 피부 조직 및 근육 조직 중 적어도 하나에서 면역 반응 발생을 증가시키고, 대상체에서 약 50% 내지 약 150%, 또는 90% 내지 130% 사이, 또는 105%로 면역 반응을 증가시킨다. 보조제 백신접종의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 적어도 약 0.5배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배 또는 4.0배로 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
도 1은 분자 보조제 구성과 발현 그리고 확인을 나타낸다. (A) 마우스 RelA 또는 T-bet 1차 서열은 유전적으로 최적화되고, 합성되고, 이후 개질된 pVax1 발현 벡터 안으로 서브클로닝된다. 최적화는 IgE 리더 펩티드 (IgE)의 함입을 수반하고, 코작(Kozak) 서열에 의해 선행되고, N-말단에서 융합된다. 이 도면은 서브클로닝을 하기 위해 사용된 제한 효소, 번역 개시 위치(정방향 화살표), IgE 리더 펩티드 (IgE; 빗금처리된 막대), 단백질 길이 (aa), 및 트랜스진(transgene)(백색 레터링을 갖는 흑색)를 나타낸다; (B) 핵의 추출물로부터 단백질 발현은 pRelA, pTbet, 또는 엠프티(empty) 벡터 대조군(pVax1)을 갖는 HEK 293T 세포의 형질감염에 따른 웨스턴 면역 블랏팅에 의해 분석된다. 단백질의 상대적 크기 (kDa)는 지시된 바와 같이 단백질-특이적 Abs를 사용하여 검출 분석에 의해 결정된다; (C) RelA의 과발현은 잠정적으로 κB 의존성 전사를 유도했다. HeLa 세포는 RelA/p65를 인코딩하는 발현 벡터와 함께 NF-κB-의존성 루시퍼라제 리포터 유전자로 일시적으로 형질감염되었다. 함께 형질감염된 세포는 48시간 동안 배양되고 그리고 루시퍼라제 활성은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 결정된다; (D). IFN-γ의 T-bet 자극된 생성의 과발현: 실시예 1에서 기술된 바와 같이 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의하여 IFN-γ 생성의 측정 이후, 비처리(naive) CD4 T 세포는 pT-bet 또는 pVax1 중 하나로 형질감염되고 항-CD3 및 항-CD28로 자극되었다. IFN-γ 준위는 ㎍/mL로 표시되었다
도 2는 전사 인자 보조제화된 항원 특이적 DNA 백신이 T 세포 면역성을 증진하는 것을 도시한다. (A) Balb/C 마우스(n= 4/그룹)가 HIV-1 pGag 또는 pEnv 단독으로, pRelA 또는 pTbet의 어느 하나의 공동 전달로 pGag 또는 pEnv로 2주 간격으로 3회 백신 접종되었다. 다른 대조군은 pRelA 또는 pTbet 단독, 또는 pVax1 대조군이었다. T-세포 반응 (CD8+ 및 CD4+)은 3차 면역화 이후 1주일간 IFN-γELISPOT에 의해 분석되었고, 106 MACS-정제된 T-세포 당 IFN-γ+ 스폿 형성 세포(SFC)에 대한 결과는 하위유형 B HIV-1 Env (B) 또는 Gag (C) 펩티드 풀로 재-자극 이후 나타난다. 표본은 3개(triplicate)로 수행되었고, 에러 바는 SEM으로 나타내고, 그리고 그래프에 제공된 지시된 백신접종 군들 사이에 비교를 참고로 하여 통계학적으로 유의성 있는 값은 다음과 같이 나타난다; ** p < 0.01, *** p < 0.001 및 **** p < 0.0001. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 2회 수행되었다.
도 3은 DNA 백신접종 및 pRelA의 공동-투여에 따른 증가된 T-세포 증식 가능성을 나타낸다. 증식 반응은 pEnv 또는 pGag 단독, pRelA 분자 보조제를 갖는 pEnv 또는 pGag, 또는 엠프티 벡터 대조군 pVax1 단독의 어느 하나로 3차 백신접종 이후 7일간 측정되었다. 비장세포가 다양한 농도: 0.5 (흰색 막대), 1.0 (밝은 회색 막대), 및 5.0 (어두운 회색 막대)에서 재조합 HIV-1 Env (A) 또는 Gag (B)로 배양되고, 그리고 차후에 24시간 동안 삼중수소화 (3H)-티미딘으로 펄싱되었다. 포함된 티미딘은 비-자극 웰의 평균 cpm(counts per minute;분당계수)로 Ag-자극 웰의 평균 cpm을 나눔으로써 계산된 자극 지수(SI)로 표시되었다. pRelA-보조제화된 마우스에 대한 SI에서의 배수 증가는 Env (A, 우측 판넬) 또는 Gag (B, 우측 판넬)의 각 농도에 대해 표시되었다. 표본은 3개로 시험되었다. 에러 바는 SEM을 나타내고, 그리고 통계학적으로 유의성 있는 값은 그래프에 도시된 지시된 군 비교에 대해 제공된다. **** p < 0.0001.
도 4는 pEnv 백신접종 및 공동-투여된 전사 분자 보조제로의 개선된 B-세포 반응을 도시한다. B-세포/항체 반응은 pEnv 단독, pRelA 또는 pTbet의 어느 하나와 조합한 pEnv, 각각의 분자 보조제 단독, 또는 엠프티 벡터 대조 플라스미드 (pVax1)로 3차 면역화 이후 7일간 백신 접종된 마우스(n = 4/그룹)의 혈청에서 분석되었다. 항-Env p120 항체-결합 역가는 ELISA에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 종료점 역가로서 나타난다. 통계학적으로 유의성 있는 값은 다음과 같이 나타난다; *** p < 0.001 (pEnv 단독과 pEnv + pRelA 또는 pEnv + pT-bet 사이의 비교) 및 **** p < 0.0001 (pRelA 단독과 pEnv + pRelA 또는 pT-bet 단독 그리고 pEnv + pT-bet 사이의 비교).
도 5는 분자 보조제가 면역화의 부위에서 B-세포의 증진된 집단을 유도하는 것을 나타낸다. 근육으로부터 세포 배양은 B220의 발현에 대해 유동 세포계수법에 의해 분석되었다. 단리된 세포는 3일 동안 배양 배지에서 배양되었고 그리고 이들 세포는 이후 단핵세포/수지상 세포, B-세포 및 T-세포를 각각 구별하기 위해 DC 서브세트 (CD11c+/CD11b+), B-세포 (B220+), T-세포 (CD4+ 및 CD8+ 서브세트)로 염색된다. 이러한 차등 염색은 B220 발현의 차후 분석으로부터 수지상 세포와 T-세포의 배제를 가능하게 했다. 히스토그램은 대조군으로서 이소유형-매칭된 비관련 mAb 뿐만 아니라 특정 mAb를 사용하여 배타적으로 B-세포 상에서의 B220+ 발현을 나타낸다. 대조군(음영된 영역)으로서 사용된 이소유형-매칭된 비관련 Ab의 프로필이 또한 패널(panel)에 나타난다. MFI = B220 발현 B 세포의 준위에 대한 비율인 평균 형광강도.
도 6은 RelA 단백질에 대한 형질감염된 세포의 면역염색을 도시한다.
도 7은 인터류킨-2 (IL-2) 농도 대 항원을 도시한 그래프를 나타낸다.
도 8은 RelA 보조제화된 마우스에서의 전체 IgG 생성(A, B); 및 T-bet 보조제화된 마우스에서의 전체 IgG 생성(C, D)을 도시한다.
도 9는 처리군 대 상대적인 발현(백분율로)을 도시한 그래프를 나타낸다.
도 10은 면역화 요법을 설명하는 개략도를 도시한다.
도 11은 처리군 대 106 비장세포 당 인터페론-감마(IFN-γ) 스폿 형성 콜로니(SFC)를 도시한 그래프를 나타낸다.
도 12는 처리군 대 106 비장세포 당 인터페론-감마(IFN-γ) 스폿 형성 콜로니(SFC)를 도시한 그래프를 나타낸다.
도 13은 레시프로컬(reciprocal) 역가 대 OD 450 nm를 도시한 그래프를 나타낸다.
도 14는 (A) 플라스미드 인코딩 Eomes의 개략도; 및 (B) 웨스턴 블랏의 이미지를 나타낸다.
도 15는 면역화 요법을 예시하는 개략도를 나타낸다.
도 16은 처리군 대 106 비장세포 당 인터페론-감마(IFN-γ) 스폿 형성 콜로니(SFC)를 도시한 그래프를 나타낸다.
도 17은 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 18은 면역화 요법을 예시하는 개략도를 나타낸다.
도 19는 펩티드 풀 대 106 비장세포 당 인터페론-감마(IFN-γ) 스폿 형성 콜로니(SFC)를 도시한 그래프를 나타낸다.
본 발명은 분자의 보조제로서 사용함으로써 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 백신에 관한 것이다. 분자 보조제는 전사 인자, 공-자극 분자, 케모카인 또는 사이토카인류일 수 있다. 이 분자 보조제는 Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL, STING 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 예에 있어서, Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 또는 STING가 보편적인 보조제로서 기능을 할 수 있는데 이는 항원 단독을 포함하는 백신에 비하여 항원의 원천 또는 투여의 경로에 관계없이 대상체에서 보다 큰 면역 반응이 유도되기 때문이다. Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 또는 STING는 추가로 바이러스 및 기생 항원 양자, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 항원 및 열대열원충 항원의 면역 반응을 각각 증가시킬 수 있다. 일부 예에 있어서, Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING은 추가로 증가된 인터페론-γ(IFN-γ) 생성에 의해 입증된 바와 같이 근육 및 피부 조직 양자에서 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 백신은 또한 놀랍게도 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위하여 에피토프 제시를 개질하거나 변경할 수 있다. 그러한 개질은 Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING에 따라 달라질 수 있다. 일부 예에 있어서, Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING는 Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING가 부재하는 면역계에 의해 인지된 에피토프에 부가하여 항원에 새로운 에피토프를 인지하기 위한 면역계에 관한 것일 수 있다. 다른 예에 있어서, Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING는 조직들에 걸쳐 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해 그리고 항원의 동일성 또는 원천과 무관하게 면역계에 의한 에피토프 인지의 형태를 재배치할 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충 시, 정의를 포함하여 본 문서가 우선이 될 것이다. 바람직한 방법 및 재료가 아래 기재되지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 평가에서 이용될 수 있다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참조로 도입된다. 본원에 제시된 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
본원에서 이용되는 용어 "포함한다", "포함된다", "갖는", "갖는다", "수 있다", "함유한다" 및 이들의 변형은 추가적인 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 전이 어구, 용어 또는 단어로 의도된다. 문맥 상 뚜렷이 달리 나타내지 않는 한, 단수 형태(“a,” “an” 및 “the”)에는 복수 참조물이 포함된다. 본 개시는 또한 명시적으로 나타내건 나타내지 않건, 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는", "이로 구성된" 및 "본질적으로 이로 구성된" 다른 구현예를 고려한다.
본원에서 사용된 “보조제"는 항원의 항원성을 개선하는 본원에 기술된 백신에 부가된 임의의 분자를 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 “코딩 서열” 또는 “인코딩 핵산”은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열에는 핵산이 투여되는 개체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호가 추가로 포함될 수 있다.
본원에서 이용되는 "상보체" 또는 "상보적인"은 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 간 왓슨-크릭(예로, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스텐 염기쌍 형성을 의미할 수 있음을 의미할 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "전기천공", "전기-투과화", 또는 "전기-역학 증강"("EP")은 생체막에서 미시적 경로(구멍)을 유도하기 위한 막통과 전기장 자극의 이용을 나타낼 수 있다; 이들의 존재는 생체분자, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한 쪽에서 다른 쪽으로 이동할 수 있게 한다.
본원에서 폴리펩티드 서열에 대해 사용된 바와 같은 “단편” 또는 “면역원성 단편”은 전장 야생성 균주 항원과 교차 반응하는 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 아래에 제시된 단백질 단편을 인코딩하는 다양한 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. 단편은 하기 개시된 핵산 서열의 하나 또는 그 이상의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 하기 제시된 핵산 서열 중 적어도 하나의 적어도 20개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 30개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 40개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 50개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 60개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 70개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 80개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 90개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 100개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 150개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 200개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 250개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 300개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 350개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 400개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 450개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 500개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 550개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 600개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 650개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 700개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 750개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 800개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 850개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 900개 이상의 뉴클레오티드, 적어도 950개 이상의 뉴클레오티드, 또는 적어도 1000개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 단편 또는 면역원성 단편은 또한 포유류에서 면역 반응을 야기 및/또는 증가시킬 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 그의 부분을 의미한다. 상기 단편은 하기 제시된 다양한 아미노산 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩티드 단편일 수 있다. 단편은 하기 개시된 단백질 중 하나 또는 그 이상의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 하기 제시된 단백질 중 적어도 하나의 적어도 20개 이상의 아미노산, 적어도 30개 이상의 아미노산, 적어도 40개 이상의 아미노산, 적어도 50개 이상의 아미노산, 적어도 60개 이상의 아미노산, 적어도 70개 이상의 아미노산, 적어도 80개 이상의 아미노산, 적어도 90개 이상의 아미노산, 적어도 100개 이상의 아미노산, 적어도 110개 이상의 아미노산, 적어도 120개 이상의 아미노산, 적어도 130개 이상의 아미노산, 적어도 140개 이상의 아미노산, 적어도 150개 이상의 아미노산, 적어도 160개 이상의 아미노산, 적어도 170개 이상의 아미노산, 적어도 180개 이상의 아미노산, 적어도 190개 이상의 아미노산, 적어도 200개 이상의 아미노산, 적어도 210개 이상의 아미노산, 적어도 220개 이상의 아미노산, 적어도 230개 이상의 아미노산, 또는 적어도 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 "유전적 작제물" 또는 "작제물"은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본원에서 이용되는 용어 "발현 가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우, 코딩 서열이 발현되도록 단백질을 인코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 나타낸다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에서 이용되는 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일한 명시된 잔기 백분율을 가짐을 의미할 수 있다. 백분율은 두 서열을 최적 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 나오는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 명시된 영역에서 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이이거나 정렬로 하나 또는 그 이상의 엇갈린 말단이 생성되고 명시된 비교 영역에 하나의 서열만 포함되는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교하는 경우, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 “면역 반응”은 항원의 도입에 대한 숙주, 예컨대 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응의 형태 또는 둘 다일 수 있다.
본원에서 이용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 서로 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 도시는 또한 상보 가닥의 서열을 정의한다. 따라서 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보 가닥을 포괄한다. 핵산의 여러 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 이용될 수 있다. 따라서 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이들의 상보체를 포괄한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포괄한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수도 있고, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열을 모두 일부 함유할 수도 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA, 또는 혼성체일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 이용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 그 제어 하 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 배치될 수 있다. 프로모터 및 유전자 간의 거리는 프로모터가 유래된 유전자에서 이것이 제어하는 프로모터 및 유전자 간의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 상기 거리의 변동은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본원에서 이용되는 "펩티드", "단백질", 또는 "폴리펩티드"는 아미노산의 결합된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 개질 또는 조합일 수 있다.
본원에서 이용되는 "프로모터"는 세포 내 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 증강시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 추가 증강시키고/시키거나 그 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 또는 그 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 억제유전자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위에서 수천 개 염기쌍만큼 떨어져 배치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 원천에서 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여 항상적으로 또는 차별적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표예에는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동유전자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 조기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 조기 프로모터 또는 SV SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터가 포함된다.
"신호 펩티드" 및 "리더 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 이용되며, 본원에 나타낸 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩티드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 위치선정을 지시한다. 본원에서 이용된 신호 펩티드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생성되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩티드/리더 서열은 종종 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩티드/리더 서열은 단백질의 N 말단에 결합된다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "대상체"는 본원에 기술된 백신으로 면역화되는 것을 원하거나 이를 필요로 하는 포유동물을 의미한다. 포유동물은 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 또는 래트일 수 있다.
본원에서 이용되는 "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예로, 프로브)이 제2 핵산 서열(예로, 표적)에, 예컨대 핵산의 복합 혼합물로 혼성화할 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존성이고 서로 다른 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5-10℃ 더 낮게 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, Tm에서 프로브의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예컨대 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01-1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예로 약 10-50개 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예로 약 50개 초과 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 60℃인 것들일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화 제제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건에는 하기가 포함된다: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션하거나, 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션하고, 65℃에서 0.2xSSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.
본원에서 이용되는 "실질적으로 상보적인"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화함을 의미할 수 있다.
본원에서 이용되는 "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 실질적으로 상보적인 경우, 제1 및 제2 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 그 이상의 아미노산 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함을 의미할 수 있다. "실질적으로 동일한"은 또한 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함을 의미할 수 있다.
본원에서 이용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거 수단을 통한 대상체의 질환으로부터의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방에는 질환의 개시 전에 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여를 포함한다. 질환의 억제에는 질환의 유도 후 그러나 그 임상적 출현 전에 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여를 포함한다. 질환의 진압에는 질환의 임상적 출현 후 대상체에 대한 본 발명의 백신 투여를 포함한다.
핵산에 대해 본원에서 이용되는 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 일부의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이들의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이들의 상보체, 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. "생물학적 활성"의 대표적인 예시는 특정 항체에 구속되거나 또는 면역 반응을 촉진하는 능력을 포함한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성 (예로, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산을 이용한 아미노산 대체는 당분야에서 전형적으로 작은 변화를 포함하는 것으로 인식된다. 이러한 작은 변화는, 부분적으로 당분야에 이해되는 바와 같이 아미노산의 수치 지수를 고려하여 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치 지수는 그 소수성 및 전하의 고려에 기반한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있음이 당분야에 공지되어 있다. 하나의 측면에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성할 치환을 드러내기 위해 이용될 수 있다. 펩티드의 맥락에서 아미노산의 친수성 고려는 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 해당 펩티드의 가장 큰 국소 평균 친수성 계산을 허용한다. 당분야에서 이해되는 바와 같은, 유사한 친수성값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩티드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 양자 모두는 아미노산의 특정 측쇄에 의하여 영향받는다. 그 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 아미노산의 상대적 유사성, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성으로 드러나는 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄에 따라 달라지는 것으로 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이들의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본원에서 이용되는 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드일 수 있다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산 서열을 함유 또는 포함할 수 있다.
본원에서 수치 범위의 언급에 있어서, 동일한 정도의 정밀도를 갖는 그 사이의 각각의 개입 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 있어서, 숫자 7 및 8은 6 및 9에 부가하여 고려되며, 범위 6.0-7.0에 있어서, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
2. 백신
항원 및 보조제를 포함하는 백신이 본원에 제공된다. 이 백신은 개체에서 항원에 대한 전반적인 면역 반응과 항원 제시를 증가시킬 수 있다. 항원 및 보조제의 조합은 항원 단독을 포함하는 백신에 비하여 보다 효율적으로 면역계를 유도한다. 백신은 추가로 항원 내에 에피토프 제시를 개질할 수 있어 항원 단독을 포함하는 백신보다 항원에 보다 큰 면역 반응을 유도한다. 백신은 추가로 근육 및 피부와 같은 다른 조직에 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다.
백신은 보조제를 포함하지 않는 백신에 비하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 그리고 적어도 약 10배로 IFN-γ 생성을 유도할 수 있다.
백신은 보조제가 없는 백신에 비하여 대상체에서 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 백신은 약 75% 내지 약 200%의 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 백신은 보조제가 없는 백신에 비하여 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 백신은 보조제가 없는 백신에 비하여 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 백신은 안전한 것과 같은 유효한 백신에 요구된 특성을 가질 수 있어서 백신 그 자체로는 질병 또는 죽음을 유발하지 않고; 바이러스나 박테리아와 같은 살아 있는 병원체에 대한 노출로부터 유래하는 질병에 대해 보호적이고; 세포의 감염을 방지하기 위해 항체를 중성화하는 것을 유도하고; 세포성 내의 병원체에 대한 보호적인 T 세포를 유도하고; 그리고 용이한 투여, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 복용량 당 낮은 비용을 제공한다. 백신은 아래에 기술하는 바와 같은 보조제와 항원을 조합함으로써 이들 특징의 일부 또는 전부를 달성할 수 있다.
a. 보조제
백신은 보조제를 포함할 수 있다. 분자 보조제는 전사 인자, 공-자극 분자, 케모카인 또는 사이토카인류일 수 있다. 이 분자 보조제는 Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL, STING 또는 이들의 조합일 수 있다.
보조제는 핵산 서열, 아미노산 서열, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이들의 변이체, 이들의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 또한 펩티드 결합에 의해 보조제에 결합되는 링커 또는 태그 서열을 인코딩하는 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩티드, 이들의 변이체, 이들의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다.
(1) REL-A
보조제는 전사 인자 Rel-A (RelA)일 수 있다. Rel-A 및 c-Rel은 전사의 활성화 능력을 보유한다. 특히, Rel-A는 염증 및 세포 생존에 있어 필수적인 구성 성분이다. 체외 실험에서 Rel-A가 κB-의존성 전사를 강력하게 활성화한다는 것이 나타난다. 이 필수적인 전사 인자는 증진된 적응성 면역성을 조정할 수 있는 다수의 염증성 인자 및 생존 인자의 유전자 발현을 조절한다. 또한 p65로 알려진 Rel-A는 인체에서 Rel-A 유전자에 의해 인코딩된다.
Rel-A는 NF-κB 착물의 일부이다. NF-kB1 (p50) 또는 NF-κB2 (p52)는 c-Rel, Rel-A (또한 p65로 알려짐), 또는 Rel-B에 결합되어 NF-κB 착물를 형성한다. 이러한 이량체는 그의 저해제 I-κB에 결합한 세포의 세포질 내에 존재한다. 외부의 자극은 26S 프로테아좀(Proteasome)에 의한 그의 유비퀴틴 매개 분해와 억제제의 인산화반응을 유도한다. 방출된 NF-κB는 이후 핵 안으로 이주하여 전사 유전자 활성화를 유도한다.
NF-κB는 DNA의 전사를 조절하는 이량체의 전사 인자이다. NF-κB는 거의 모든 동물 세포 유형에서 발견되고 그리고 스트레스, 사이토카인류, 유리 라디칼, 자외선 조사, 산화된 LDL, 및 박테리아 또는 바이러스의 항원과 같은 자극들에 대해 세포성 반응에 포함된다. NF-κB는 감염에 대한 면역 반응을 조절하는데 있어 핵심 역할을 한다(카파 광 사슬은 면역글로불린의 중요한 구성성분임). NF-κB의 부정확한 조절은 암, 염증 및 자가 면역 질환, 패혈성 쇼크, 바이러스 감염, 및 부적절한 면역 발달과 관련되어 왔다. NF-κB는 또한 시냅스 가소성 및 기억의 과정에 연루되어 왔다.
Rel-A는 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신에 Rel-A의 함입은 Rel-A를 포함하지 않는 백신에 비하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 그리고 적어도 약 10배의 IFN-γ 생성을 유도할 수 있다. 백신에 Rel-A의 함입은 Rel-A를 포함하지 않는 백신에 비하여 적어도 약 2배의 IFN-γ 생성을 유도할 수 있다. 백신에 Rel-A의 함입은 Rel-A를 포함하지 않는 백신에 비하여 적어도 약 3배의 IFN-γ 생성을 유도할 수 있다.
Rel-A는 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. Rel-A는 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
Rel-A는 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
Rel-A는 대상체에서 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, Rel-A는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, Rel-A는 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, Rel-A는 보조제가 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, Rel-A는 적어도 0.5배, 1.0배, 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10배로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, Rel-A는 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
Rel-A는 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
Rel-A를 인코딩하는 핵산은, 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. Rel-A를 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. Rel-A를 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Rel-A를 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. Rel-A를 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. Rel-A를 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 Rel-A에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Rel-A를 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
Rel-A는 서열 식별 번호: 2에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 1일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Rel-A는 서열 식별 번호: 1에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, Rel-A는 서열 식별 번호: 2에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. Rel-A는 서열 식별 번호: 2에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 1의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 1의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 1의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 1에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 2의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 2의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 2의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 2에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Rel-A 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
(2) T-bet
보조제는 전사 인자 T-bet일 수 있다. T-box 전사 인자 TBX21는 또한 T-bet, T-PET, TBET, 및 TBLYM으로 알려져 있으며, 인체에서 TBX21 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다. 이 유전자는 공통 DNA-결합 도메인인 T-box를 공유하는 유전자의 계통발생적으로 보존된 패밀리의 구성원이다.　T-box 유전자는 발달 과정의 조절에 포함된 전사 인자를 인코딩한다. T-bet는 마우스 Tbx21/Tbet 유전자의 인간 오르쏘로그(ortholog)이다. 마우스에서의 연구는 Tbx21 단백질이 홀마크 Th1 사이토킨, 인터페론-감마 (IFN-γ)의 발현을 제어하는 Th1 세포-특이적 전사 인자라는 것을 나타낸다. 오르쏘로그의 발현은 또한 Th1 및 중성 킬러 세포에서 IFN-γ 발현과 상호 연관되어, 비처리 Th1 전구체 세포로부터 Th1 계대 발달을 개시하는데 있어 이러한 유전자에 대해 역할을 제시한다. T-bet의 이소성 발현은 IFN-γ 유전자를 전사 활성화하고 그리고 내인성 IFN-γ 생성을 유도한다. T-bet는 Th1 유전적 프로그램을 활성화함으로써 그리고 대립 Th2 프로그램을 억압함으로써 비처리 Thp 세포로부터 Th1 계대 발달을 개시한다.
T-bet는 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신 내에 T-bet의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배로 유도할 수 있다. 백신 내에 T-bet의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 2배로 유도할 수 있다. 백신 내에 T-bet의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 3배로 유도할 수 있다.
T-bet는 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. T-bet는 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
T-bet는 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
T-bet는 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, T-bet는 항원에 대한 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, T-bet는 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, T-bet는 보조제 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, T-bet는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 0.5 배, 1.0 배, 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배로 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, T-bet는 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
T-bet는 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
T-bet을 인코딩하는 핵산은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. T-bet을 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. T-bet을 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, T-bet을 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. T-bet을 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. T-bet을 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 T-bet에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, T-bet을 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
T-bet는 서열 식별 번호: 4에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 3일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, T-bet는 서열 식별 번호: 3에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, T-bet는 서열 식별 번호: 4에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. T-bet는 서열 식별 번호: 4에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 3의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 3의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 3의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 3에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 4의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 4의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 4의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 4에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 T-bet 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
(3) 에오메소더민(Eomes)
보조제는 전사 인자 Eomes일 수 있다. Eomes는 전사 활성제 능력을 가진다. 특히, Eomes는 중간 전발생 세포 및 다양한 종으로 발달하는 동안의 이들의 자손의 증식에 있어 핵심 역할을 한다.
Eomes는 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 유도할 수 있다. 구체적으로, 생체내 실험에서 Eomes가 활성화된 CD8+ T-세포에서 항-바이러스 반응의 일부로서 발현되고, 그리고 차후에 성숙 및 효과기 작용을 조절한다는 것이 나타난다. Eomes는 또한 면역 반응 동안 CD8+ T-세포의 분화에 포함되고, 여기서 Eomes는 용해 효과기 세포의 발현을 조절한다. 특히, Eomes는 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 생성을 증가시킬 수 있다. 추가로, 다수의 연구는 IFN-γ 조절에 부가하여, Eomes는 세포융해성 효과기 계대의 특징을 끌어내는데 결정적이라는 것을 제시한다.
Eomes는 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신 내에 Eomes의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배로 유도할 수 있다. 백신 내에 Eomes의 함입은 Eomes를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 2배로 유도할 수 있다. 백신 내에 Eomes의 함입은 Eomes를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 3배로 유도할 수 있다.
Eomes는 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. Eomes는 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
Eomes는 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
Eomes는 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, Eomes는 항원에 대한 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, Eomes는 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, Eomes는 보조제 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, Eomes는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 0.5 배, 1.0 배, 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배로 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, Eomes는 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
Eomes는 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
Eomes를 인코딩하는 핵산은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. Eomes를 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. Eomes를 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Eomes를 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. Eomes를 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. Eomes를 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 Eomes에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Eomes를 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
Eomes는 서열 식별 번호: 6에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 5일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, Eomes는 서열 식별 번호: 5에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, Eomes는 서열 식별 번호: 6에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. Eomes는 서열 식별 번호: 6에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 5의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 5의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 5의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 5에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 6의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 6의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 6의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 6에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 Eomes 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
(4) FLT3L
보조제는 FLT3L일 수 있다. FLT3L은 조혈 사이토킨이다. FLT3L은 클래스 III 수용체 티로신 키나아제 패밀리의 구성원이다. FLT3L은 골수 스트로마 세포와 골수 세포에서 발현되고, 이들 양자는 B- 및 T-세포 유래이다.
FLT3L는 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응의 조절에 핵심적인 역할을 한다. 특히, FLT3L은 수지상 세포를 조절하는데 있어서의 역할로 선천적 및 후천적 면역성 사이의 연결에 있어서의 역할을 입증한다. 특히, FLT3L은 수지상 세포의 발달을 조절하고, 여기서 FLT3L은 형질세포양 수지상 세포와 CD8에 있어 중요하다. 추가로, FLT3L은 인간뿐만 아니라 마우스에서 골수 및 림프 수지상 세포 양자의 대량 팽창을 유도한다.
수지상 세포는 IFN-γ의 강력한 생성자이다. 따라서, FLT3L은 그의 수지상 세포의 조절에 의해 적어도 IFN-γ의 발현을 상향 조절할 수 있다.
FLT3L은 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 유도할 수 있다. 구체적으로, 생체내 실험에서 FLT3L이 활성화된 CD8+ T-세포에서 항-바이러스 반응의 일부로서 발현되고, 그리고 차후에 성숙 및 효과기 작용을 조절한다는 것이 나타난다. FLT3L은 또한 면역 반응 동안 CD8+ T-세포의 분화에 포함되고, 여기서 FLT3L은 용해 효과기 세포의 발현을 조절한다. 특히, FLT3L은 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 생성을 증가시킬 수 있다. 추가로, 다수의 연구는 IFN-γ 조절에 부가하여, FLT3L이 세포융해성 효과기 계대의 특징을 끌어내는데 결정적이라는 것을 제시한다.
FLT3L은 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신 내에 FLT3L의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배로 유도할 수 있다. 백신 내에 FLT3L의 함입은 FLT3L을 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 2배로 유도할 수 있다. 백신 내에 FLT3L의 함입은 FLT3L을 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 3배로 유도할 수 있다.
FLT3L은 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. FLT3L은 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
FLT3L은 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
FLT3L은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, FLT3L은 항원에 대한 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, FLT3L은 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, FLT3L은 보조제 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, FLT3L은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 0.5 배, 1.0 배, 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배로 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, FLT3L은 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
FLT3L은 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
FLT3L을 인코딩하는 핵산은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. FLT3L을 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. FLT3L을 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, FLT3L을 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. FLT3L을 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. FLT3L을 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 FLT3L에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, FLT3L을 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
FLT3L은 서열 식별 번호: 8에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 7일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, FLT3L은 서열 식별 번호: 7에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, FLT3L은 서열 식별 번호: 8에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. FLT3L은 서열 식별 번호: 8에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 7의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 7의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 7의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 7에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 8의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 8의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 8의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 8에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 FLT3L 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
(5) TWEAK
보조제는 TWEAK일 수 있다. TWEAK는 종양 괴사 패밀리의 구성원이다. TWEAK는 다중-기능성의 사이토킨이고 그리고 그의 신호화는 수용체 섬유아세포 성장 인자 유도가능한 14 kD단백질, Fn14/TWEAKR과 결합하는 그의 높은 친화성을 수반한다. 구체적으로, TWEAK는, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 세포 분화, 세포 운동성 (예를 들면 이동, 침입), 세포 영양, 세포 증식, 세포 생존 및 염증성 반응의 억제를 포함하는 세포성 기능과 연루된다.
TWEAK는 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응의 조절에서 핵심 역할을 한다. 특히, 선천적 및 후천적 면역 반응의 백혈구는 TWEAK를 방출한다. 차후에, TWEAK는 Fn14/TWEAKR에 결합하고, 이는 손상되고/되거나 병든 조직에서 상향 조절된다. TWEAK와 Fn14/TWEAKR의 착물은 이후 상기에 나열된 바와 같은 세포성 반응을 조절한다. 부가적으로, TWEAK는 수지상 세포 및 T-세포 활성화뿐만 아니라 수지상 세포 생존과 연루될 수 있다.
TWEAK는 IFN-γ에 의해 조절될 수 있다. 연구는 IFN-γ 자극된 단핵세포는 TWEAK 발현의 현저한 증가를 초래한다는 것을 보여준다.
TWEAK는 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 유도할 수 있다. 구체적으로, 생체내 실험에서 TWEAK가 활성화된 CD8+ T-세포에서 항-바이러스 반응의 일부로서 발현되고, 그리고 차후에 성숙 및 효과기 작용을 조절한다는 것이 나타난다. TWEAK는 또한 면역 반응 동안 CD8+ T-세포의 분화에 포함되고, 여기서 TWEAK는 용해 효과기 세포의 발현을 조절한다. 특히, TWEAK는 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 생성을 증가시킬 수 있다. 추가로, 다수의 연구는 IFN-γ 조절에 부가하여, TWEAK는 세포융해성 효과기 계대의 특징을 끌어내는데 결정적이라는 것을 제시한다.
TWEAK는 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신 내에 TWEAK의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배로 유도할 수 있다. 백신 내에 TWEAK의 함입은 TWEAK를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 2배로 유도할 수 있다. 백신 내에 TWEAK의 함입은 TWEAK를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 3배로 유도할 수 있다.
TWEAK는 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. TWEAK는 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
TWEAK는 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
TWEAK는 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, TWEAK는 항원에 대한 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, TWEAK는 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, TWEAK는 보조제 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, TWEAK는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 0.5 배, 1.0 배, 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배로 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, TWEAK는 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
TWEAK는 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
TWEAK을 인코딩하는 핵산은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. TWEAK을 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. TWEAK을 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TWEAK을 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. TWEAK을 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. TWEAK을 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 TWEAK에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TWEAK을 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
TWEAK는 서열 식별 번호: 10에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 9일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TWEAK는 서열 식별 번호: 9에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, TWEAK는 서열 식별 번호: 10에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. TWEAK는 서열 식별 번호: 10에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 9의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 9의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 9의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 9에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 10의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 10의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 10의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 10에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 TWEAK 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
(6) GITRL
보조제는 GITRL일 수 있다. GITRL은 자연적 및 획득된 면역 반응을 조절하는 종양 괴사 패밀리의 구성원이다. GITRL은 대식세포, 수지상 세포, 내피 세포 및 B 세포의 세포 표면 상에 발현된다. GITRL은 그의 동일계통의 수용체 GITR과 반응한다.
GITRL은 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응의 조절에서 핵심 역할을 한다. 구체적으로, GITRL은 T-세포 및 NK 세포 상에서 발현되어, 이것은 세포 활성화에 따라 상향 조절된다. GITRL 유도 신호화는 ERK1/2에 의해 매개되고, 이후 전사 인자 NF-κB의 활성화를 촉발한다. NF-κB는 케모카인류, MMP 및 사이토카인류를 포함하는 몇몇의 전-염증성 매개자의 발현을 제어한다.
GITRL은 IFN-γ의 발현을 상향 조절할 수 있다.
GITRL은 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 유도할 수 있다. 구체적으로, 생체내 실험에서 GITRL이 활성화된 CD8+ T-세포에서 항-바이러스 반응의 일부로서 발현되고, 그리고 차후에 성숙 및 효과기 작용을 조절한다는 것이 나타난다. GITRL은 또한 면역 반응 동안 CD8+ T-세포의 분화에 포함되고, 여기서 GITRL은 용해 효과기 세포의 발현을 조절한다. 특히, GITRL은 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 생성을 증가시킬 수 있다. 추가로, 다수의 연구는 IFN-γ 조절에 부가하여, GITRL은 세포융해성 효과기 계대의 특징을 끌어내는데 결정적이라는 것을 제시한다.
GITRL은 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신 내에 GITRL의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배로 유도할 수 있다. 백신 내에 GITRL의 함입은 GITRL을 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 2배로 유도할 수 있다. 백신 내에 GITRL의 함입은 GITRL을 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 3배로 유도할 수 있다.
GITRL은 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. GITRL은 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
GITRL은 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
GITRL은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, GITRL은 항원에 대한 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, GITRL은 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, GITRL은 보조제 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, GITRL은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 0.5 배, 1.0 배, 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배로 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, GITRL은 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
GITRL은 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
GITRL을 인코딩하는 핵산은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. GITRL을 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. GITRL을 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, GITRL을 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. GITRL을 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. GITRL을 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 GITRL에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, GITRL을 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
GITRL은 서열 식별 번호: 12에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 11일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, GITRL은 서열 식별 번호: 11에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, GITRL은 서열 식별 번호: 12에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. GITRL은 서열 식별 번호: 12에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 11의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 11의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 11의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 11에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 12의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 12의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 12의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 12에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 GITRL 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
(7) STING
보조제는 STING일 수 있다. STING은 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응에서 핵심 역할을 하는 막통과 단백질이다. STING은 세포가 dsDNA를 직면할 때 활성화되는 DNA 센서이며, 이는 TLR의 부재에서 유형 1 IFN의 상향조절을 초래한다. 유형 1 IFN은 최적의 DNA 백신-유도 면역성에 필수적인데 이는 이것이 항원-특이적 B-세포와 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 자극하기 때문이다. STING는 유형 1 IFN의 효과적인 생성에 필요하다는 것이 밝혀졌다.
STING는 IFN-γ의 발현을 상향 조절할 수 있다.
STING는 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 유도할 수 있다. 구체적으로, 생체내 실험에서 STING가 활성화된 CD8+ T-세포에서 항-바이러스 반응의 일부로서 발현되고, 그리고 차후에 성숙 및 효과기 작용을 조절한다는 것이 나타난다. STING는 또한 면역 반응 동안 CD8+ T-세포의 분화에 포함되고, 여기서 STING는 용해 효과기 세포의 발현을 조절한다. 특히, STING는 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 생성을 증가시킬 수 있다. 추가로, 다수의 연구는 IFN-γ 조절에 부가하여, STING는 세포융해성 효과기 계대의 특징을 끌어내는데 결정적이라는 것을 제시한다.
STING는 유형 I IFN, IFN-유도가능한 케모카인류, 및 전염증성 사이토카인류, 예컨대 뚜렷한 신호화 경로를 통한 종양 괴사성 인자-a (TNF-a)의 유전자 발현을 촉발할 수 있다. 백신 내에 STING의 함입은 T-bet를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배로 유도할 수 있다. 백신 내에 STING의 함입은 STING를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 2배로 유도할 수 있다. 백신 내에 STING의 함입은 STING를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 3배로 유도할 수 있다.
STING는 IL-2의 보다 높은 생성을 통해 T 세포 반응 경로를 자극할 수 있다. STING는 '효과기' T 세포로 되도록 T 세포의 성장, 증식 및 분화와 IL-2 수용체 IL-2R의 발현을 자극할 수 있다. IL-2/IL-2R 상호작용은 이후 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 성장, 분화 및 생존을 자극한다. IL-2를 자극함으로써, 자가 및 비-자가 세포 사이의 면역계 조절은, IL-2가 자가 및 비-자가 사이에서 식별되도록 요구되는 바와 같이, 실행된다.
STING는 IgG의 B-세포 생성을 증가시킴으로써 적응성 면역계를 더욱 자극할 수 있다.
STING는 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 일부 예에 있어서, STING는 항원에 대한 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, STING는 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에 있어서, STING는 보조제 없는 백신에 비하여 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
다른 구현예에 있어서, STING는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 백신으로부터 특정한 항원에 대한 면역 반응을 0.5 배, 1.0 배, 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배로 증가시키거나 제고할 수 있다.
다른 예에 있어서, STING는 개체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어 피부 조직 및 근육 조직 내 항원에 적어도 하나의 에피토프의 면역계 인지를 개질하거나 변경할 수 있다. 항원은 아래에 보다 자세하게 기술된다. 적어도 하나의 에피토프의 그러한 변경된 인지는 항원 단독에 상응하는 핵산을 포함하는 백신이 투여된 대상체에 비하여 본원에 기술된 백신이 투여된 대상체에서 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
STING는 또한, 예를 들어, 이전에는 인지되지 않은 에피토프가 면역계에 의해 인지되도록 함으로써 항원 내에 하나 또는 그 이상의 에피토프의 제시를 개질하거나 변경할 수 있고, 이에 의해 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 증가시킨다. 개질된 제시와 이로써 증가된 면역 반응은 대상체에서 임의의 수의 조직, 예를 들어, 피부조직 및 근육조직에서 일어날 수 있다.
STING을 인코딩하는 핵산은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 마우스 (Mus musculus), 마카크 (Macacac mulatta), 및 인간 (Homo sapiens)으로부터 유래할 수 있다. STING을 인코딩하는 핵산은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사물에 대해 최적화될 수 있다. STING을 인코딩하는 핵산은 발현에 대해 최적화된 RNA 및 코돈일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, STING을 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작 서열 (예를 들면, GCC ACC)를 포함할 수 있다. STING을 인코딩하는 핵산은 번역 종료의 효율을 증가시키기 위해 다수의 정지 코돈 (예를 들면, TGA TGA)을 포함할 수 있다. STING을 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 내 STING에 5'에 위치될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, STING을 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 함유하지 않을 수 있다.
STING는 서열 식별 번호: 14에 대해 인코딩하는 최적화된 핵산 서열 서열 식별 번호: 13일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, STING는 서열 식별 번호: 13에 제시된 핵산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, STING는 서열 식별 번호: 14에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. STING는 서열 식별 번호: 14에 제시된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
일부 구현예는 서열 식별 번호: 13의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 13의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 13의 단편에 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 13에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 STING 핵산 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 STING 핵산 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 STING 핵산 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 STING 핵산 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.
서열 식별 번호: 14의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 14의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
서열 식별 번호: 14의 단편에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 14에 95% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 STING 단백질 서열의 단편에 96% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 STING 단백질 서열의 단편에 97% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 STING 단백질 서열의 단편에 98% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 STING 단백질 서열의 단편에 99% 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 단편은 리더 서열이 없다.
b. 항원
백신은 항원 또는 이들의 단편이나 변이체를 포함할 수 있다. 항원은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 어떠한 것일 수 잇다. 정제된 항원은 그 자체로는 통상적으로 강력한 면역성이지 않고 그리고 따라서 상기 기술된 바와 같은 보조제와 조합된다. 항원에 의해 유도된 면역 반응은 보조제와 조합될 때 늘어나거나 또는 증가될 수 있다. 이러한 면역 반응은 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 보조제와 항원의 조합은 대상체에서 세포성 면역 반응을 늘어나거나 또는 증가시킬 수 있다.
항원은 핵산 서열, 아미노산 서열, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이들의 변이체, 이들의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 또한 펩티드 결합에 의해 보조제에 결합되는 링커 또는 태그 서열을 인코딩하는 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열 단백질, 펩티드, 이들의 변이체, 이들의 단편, 또는 이들의 조합일 수 있다.
항원은 임의의 수의 유기체, 예를 들어 바이러스, 기생충, 박테리아, 곰팡이, 또는 포유류로부터의 단백질, 핵산, 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체, 또는 이들의 조합에 함유될 수 있다. 항원은 자가면역 질환, 알러지 또는 천식과 연관될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 항원은 암, 포진, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 또는 인간 면역부전 바이러스 (HIV)와 연관될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인플루엔자 또는 HIV와 연관될 수 있다.
일부 항원은 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다. 기타 항원은 약한 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 상기한 바와 같은 보조제와 조합될 때 보다 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
(1) 바이러스성 항원
항원은 바이러스성 항원, 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체일 수 있다. 바이러스성 항원은 하기 패밀리 중 하나로부터의 바이러스로부터 유래할 수 있다: 아데노바이러스 패밀리, 아레나바이러스 패밀리, 부니야바이러스 패밀리, 칼리씨바이러스 패밀리, 코로나바이러스 패밀리, 필로바이러스 패밀리, 헤파드나바이러스 패밀리, 헤르페스바이러스 패밀리, 오르도마이쏘바이러스 패밀리, 파포바바이러스 패밀리, 파라마이쏘바이러스 패밀리, 파르보바이러스 패밀리, 피코르나바이러스 패밀리, 폭스바이러스 패밀리, 레오바이러스 패밀리, 레트로바이러스 패밀리, 라부도바이러스 패밀리 또는 토가바이러스 패밀리. 바이러스성 항원은 파필로마바이러스, 예를 들어, 인간 파필로모아 바이러스(HPV), 인간 면역부전 바이러스(HIV), 소아마비 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 스몰팍스 바이러스(대두창 및 소두창), 우두 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노 바이러스, 뎅기열 바이러스, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 노르워크 바이러스, 간염 A바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV-I), 모양 세포성 백혈병 바이러스(HTLV-II ), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스(출혈열), 광견병 바이러스, 에볼라 열 바이러스, 마르부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 단순 포진 1(구강 포진), 단순 포진 2(음부 포진), 대상 포진(수두-대상 포진, 일명 수두), 사이토메갈로 바이러스(CMV), 예를 들어 인간 CMV, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 플라비 바이러스, 구제역 바이러스, 치쿠니야 바이러스, 라사 바이러스, 아레나 바이러스, 또는 암 유발 바이러스로부터 유래할 수 있다.
(a) 간염 항원
보조제는 간염 바이러스 항원(즉, 간염 항원), 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. 간염 항원은 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), 및/또는 E형 간염 바이러스(HEV)로부터의 항원 또는 면역원일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HAV, HBV, HCV, HDV, 및 HEV로부터의 하나 또는 그 이상의 항원을 인코딩하는 이종성 핵산 분자(들), 예컨대 플라스미드(들)일 수 있다. 간염 항원은 전장 단백질의 전장 또는 면역원성 단편일 수 있다.
간염 항원은 공통 서열 및/또는 개선된 발현을 위한 하나 또는 그 이상의 개질을 포함할 수 있다. 작제물에 대한 면역원성을 증가시키기 위해 코돈 최적화, RNA 최적화 및 매우 효율적인 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함하는 유전적 변이가 개질된 공통 서열에 포함될 수 있다. 공통 간염 항원은 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함할 수 있고, 그리고 일부 구현예에 있어서, HA 태그를 포함할 수 있다. 면역원은 상응하는 코돈 최적화 면역원보다 강하고 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 설계될 수 있다.
간염 항원은 HAV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HAV 캡시드 단백질, HAV 비-구조 단백질, 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
간염 항원은 HCV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HCV 뉴클레오캡시드 단백질(즉, 코어 단백질), HCV 외막(envelope) 단백질(예를 들면, E1 및 E2), HCV 비-구조 단백질(예를 들면, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b), 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
간염 항원은 HDV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HDV 델타 항원, 이들의 단편, 또는 이들의 변이체일 수 있다.
간염 항원은 HEV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HEV 캡시드 단백질, 이들의 단편, 또는 이들의 변이체일 수 있다.
간염 항원은 HBV로부터의 항원일 수 있다. 간염 항원은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV DNA 폴리머라아제, 유전자 X에 의해 인코딩된 HBV 단백질, 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 간염 항원은 HBV 유전자형 A 코어 단백질, HBV 유전자형 B 코어 단백질, HBV 유전자형 C 코어 단백질, HBV 유전자형 D 코어 단백질, HBV 유전자형 E 코어 단백질, HBV 유전자형 F 코어 단백질, HBV 유전자형 G 코어 단백질, HBV 유전자형 H 코어 단백질, HBV 유전자형 A 표면 단백질, HBV 유전자형 B 표면 단백질, HBV 유전자형 C 표면 단백질, HBV 유전자형 D 표면 단백질, HBV 유전자형 E 표면 단백질, HBV 유전자형 F 표면 단백질, HBV 유전자형 G 표면 단백질, HBV 유전자형 H 표면 단백질, 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 간염 항원은 공통 HBV 코어 단백질, 또는 공통 HBV 표면 단백질일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 A 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 A 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 A 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 B 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 B 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 B 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 C 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 C 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 C 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 D 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 D 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 D 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 E 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 E 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 E 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 F 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 F 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 F 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 G 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 G 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 G 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 H 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 H 코어 단백질에 대한 공통 서열에 결합된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 H 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 A 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 A 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 A 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 B 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 B 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 B 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 C 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 C 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 C 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 D 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 D 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 D 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 E 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 E 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 E 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 F 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 F 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 F 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 G 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 G 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 G 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 간염 항원은 HBV 유전자형 H 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 H 표면 단백질을 위해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 H 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
(b) 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 항원
보조제는 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 항원, 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. HPV 항원은 뇌암, 직장암 및/또는 기타 암을 야기하는 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 및 58로부터 유래할 수 있다. HPV 항원은 생식기 혹을 야기하고 그리고 머리 및 목 암의 원인이 되는 것으로 알려진 HPV 유형 6 및 11로부터 유래할 수 있다.
HPV 항원은 각 HPV 유형으로부터의 HPV E6 또는 E7 영역일 수 있다. 예를 들어, HPV 유형 16(HPV16)에 대해서는, HPV16 항원은 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, 이들의 단편, 변이체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 유사하게, HPV 항원은 HPV 6 E6 및/또는 E7, HPV 11 E6 및/또는 E7, HPV 18 E6 및/또는 E7, HPV 31 E6 및/또는 E7, HPV 33 E6 및/또는 E7, HPV 52 E6 및/또는 E7, 또는 HPV 58 E6 및/또는 E7, 이들의 단편, 변이체 또는 이들의 조합일 수 있다.
(c) RSV 항원
보조제는 또한 RSV 항원 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 융합 단백질(또한 여기서 "RSV F", "RSV F 단백질" 및 "F 단백질"으로 언급됨), 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 인간 RSV 융합 단백질은 RSV 하위유형 A 및 B 사이에서 보존될 수 있다. RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주(GenBank AAX23994.1)으로부터의 RSV F 단백질,또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV A2 균주(GenBank AAB59858.1)으로부터의 RSV F 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV F 단백질의 단량체, 이량체 또는 삼량체, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 최적화된 아미노산 RSV F 아미노산 서열, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다.
RSV F의 후융합 형태는 면역화된 동물에서 높은 역가로 중화 항체를 유도하고 그리고 RSV 유발(challenge)로부터 동물을 보호한다. 본 발명은 청구된 백신에서 이러한 면역반응을 이용한다. 본 발명에 따르면, RSV F 단백질은 전융합 형태 또는 후융합 형태로 될 수 있다.
RSV 항원은 또한 인간 RSV 부착 당단백(또한 여기서 "RSV G", "RSV G 단백질" 및 "G 단백질"으로 언급됨), 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 인간 RSV G 단백질은 RSV 하위유형 A와 B 사이에서 달라진다. 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23993)으로부터의 RSV G 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV 하위유형 B 단리체 H5601, RSV 하위유형 B 단리체 H1068, RSV 하위유형 B 단리체 H5598, RSV 하위유형 B 단리체 H1123로부터의 RSV G 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 최적화된 아미노산 RSV G 아미노산 서열, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, RSV 항원은 인간 RSV 비-구조 단백질 1 ("NS1 단백질"), 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23987.1)으로부터의 RSV NS1 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원 인간은 또한 RSV 비-구조 단백질 2 ("NS2 단백질"), 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23988.1)으로부터의 RSV NS2 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 추가로 인간 RSV 뉴클레오캡시드("N") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23989.1)으로부터의 RSV N 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 포스포단백질("P") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23990.1)으로부터의 RSV P 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 또한 인간 RSV 매트릭스 단백질("M") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23991.1)으로부터의 RSV M 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, RSV 항원은 인간 RSV 스몰 하이드로포빅("SH") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23992.1)으로부터의 RSV SH 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 또한 인간 RSV 매트릭스 단백질2-1("M2-1") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23995.1)으로부터의 RSV M2-1 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 추가로 인간 RSV 매트릭스 단백질 2-2("M2-2") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23997.1)으로부터의 RSV M2-2 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 폴리머라제 L("L") 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 롱(Long) 균주 (GenBank AAX23996.1)으로부터의 RSV L 단백질, 또는 이들의 단편이나 변이체일 수 있다.
추가 구현예에 있어서, RSV 항원은 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2, 또는 L 단백질의 최적화된 아미노산 서열을 가질 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 단백질 또는 재조합 항원, 예컨대 인간 RSV 지놈에 의해 인코딩된 어느 하나의 단백질일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, RSV 항원은, 여기에 제한하는 것은 아니지만, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV F 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV G 단백질, 최적화된 아미노산 RSV G 아미노산 서열, RSV 롱(Long) 균주의 인간 RSV 지놈, 최적화된 아미노산 RSV F 아미노산 서열, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV NS1 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV NS2 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV N 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV P 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV M 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV SH 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV M2-1 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV M2-2 단백질, RSV 롱(Long) 균주으로부터의 RSV L 단백질, RSV 하위유형 B 단리 H5601로부터의 RSV G 단백질, RSV 하위유형 B 단리 H1068로부터의 RSV G 단백질, RSV 하위유형 B 단리 H5598로부터 RSV G 단백질, RSV 하위유형 B 단리 H1123으로부터 RSV G 단백질, 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체일 수 있다.
(d) 인플루엔자 항원
보조제는 인플루엔자 항원 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. 인플루엔자 항원은 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 혈청형에 대하여 포유류에서 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 것이다. 항원은 전장 번역 생성물 HA0, 하부단위 HA1, 하부단위 HA2, 이들의 변이체, 이들의 단편 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin) 항원은 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다수의 균주으로부터 유래된 공통 서열, 인플루엔자 A 혈청형 H2의 다수의 균주으로부터 유래된 공통 서열, 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다수의 균주의 다른 세트로부터 유래된 2개의 상이한 공통 서열의 부분을 포함하는 혼성 서열 또는 인플루엔자 B의 다수의 균주으로부터 유래된 공통 서열일 수 있다. 인플루엔자 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 B로부터 유래할 수 있다.
인플루엔자 항원은 또한 면역 반응이 유도될 수 있는 특정한 인플루엔자 면역원에 대하여 효과적일 수 있는 적어도 하나의 항원성 에피토프를 포함할 수 있다. 항원은 원래 인플루엔자 바이러스 내에 존재하는 에피토프 및 면역성 부위의 전체 레퍼토리를 제공할 수 있다. 항원은 혈청형 H1 또는 혈청형 H2의 다수의 인플루엔자 A 바이러스 균주과 같은 하나의 혈청형의 다수의 인플루엔자 A 바이러스 균주으로부터의 헤마글루티닌 항원 서열로부터 유래할 수 있는 공통 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다. 항원은 2개의 상이한 공통 헤마글루티닌 항원 서열 또는 이들의 일 부분을 조합하는 것으로부터 유래할 수 있는 혼성 공통 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다. 2개의 상이한 공통 헤마글루티닌 항원 서열 각각은 혈청형 H1의 다수의 인플루엔자 A 바이러스 균주과 같은 하나의 혈청형의 다수의 인플루엔자 A 바이러스 균주의 다른 세트로부터 유래할 수 있다. 항원은 다수의 인플루엔자 B 바이러스 균주으로부터의 헤마글루티닌 항원 서열로부터 유래할 수 있는 공통 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 인플루엔자 항원 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, 또는 BHA 항원일 수 있다. 대안적으로, 인플루엔자 항원은 공통 H1 아미노산 서열 또는 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 공통 헤마글루티닌 항원 단백질일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 각각 다른 것으로부터의 다른 서열 세트로부터 유래되는, 2개의 상이한 공통 H1 서열의 부분을 포함하는 합성적 혼성 공통 H1 서열일 수 있다. 합성적 혼성 공통 H1 단백질인 공통 HA 항원의 예는 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 공통 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 B 균주, 예컨대 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질으로부터의 헤마글루티닌 서열로부터 유래된 공통 헤마글루티닌 단백질일 수 있다.
공통 헤마글루티닌 항원은 추가로 하나 또는 그 이상의 부가적 아미노산 서열 요소를 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 추가로 그의 N-말단 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 추가로 용이하게 이용가능한 항체에 의해 검출될 수 있는 특이한 면역성의 에피토프인 면역성 태그를 포함할 수 있다. 이러한 면역성 태그의 예는 공통 헤마글루티닌 C 말단 상에 결합될 수 있는 9 아미노산 인플루엔자 HA 태그이다. 일부 구현예에 있어서, 공통 헤마글루티닌 항원은 추가로 그의 N-말단 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열 및 그의 C 말단 상에 HA 태그를 포함할 수 있다.
공통 헤마글루티닌 항원은 공통 인플루엔자 아미노산 서열 또는 이들의 단편 및 변이체로 작제된 공통 헤마글루티닌 단백질일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 비-인플루엔자 단백질 서열 및 인플루엔자 단백질 서열 또는 이들의 단편 및 변이체를 포함하는 공통 헤마글루티닌 단백질일 수 있다.
공통 H1 단백질의 예는 공통 H1 아미노산 서열로 작제될 수 있는 것들 , 또는 예컨대 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그 또는 IgE 리더 서열과 HA 태그 양자를 추가로 포함하는 것들을 포함한다.
공통 H2 단백질의 예는 공통 H2 아미노산 서열로 작제될 수 있는 것들 또는 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그 또는 IgE 리더 서열과 HA 태그 양자를 추가로 포함하는 것들을 포함한다.
혼성 공통 H1 단백질의 예는 공통 U2 아미노산 서열로 작제될 수 있는 것들 또는 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그 또는 IgE 리더 서열과 HA 태그 양자를 추가로 포함하는 것들을 포함한다..
혼성 공통 인플루엔자 B 헤마글루티닌 단백질의 예는 공통 BHA 아미노산 서열로 작제될 수 있는 것들을 포함하거나, 이는 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그 또는 IgE 리더 서열과 HA 태그 양자를 포함할 수 있는 것을 포함한다.
공통 헤마글루티닌 단백질은 공통 헤마글루티닌 핵산, 이들의 변이체 또는 이들의 단편에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 균주 및 변이체로부터 복수의 다른 헤마글루티닌 서열로부터 유래된 공통 서열일 수 있는 공통 헤마글루티닌 단백질과는 달리, 공통 헤마글루티닌 핵산은 공통 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 언급하고 그리고 사용된 코딩 서열은 공통 헤마글루티닌 단백질 서열이 유래되는 복수의 상이한 헤마글루티닌 서열 내의 특정한 아미노산 서열을 인코딩하기 위해 사용된 것과는 다를 수 있다. 공통 핵산 서열은 최적화된 코돈 및/또는 최적화된 RNA일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산 서열은 5' 비전사 영역 내에 코작 서열을 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산 서열은 리더 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. N 말단 리더 서열의 코딩 서열은 헤마글루티닌 코딩 서열의 5'이다. N-말단 리더는 분비를 용이하게 할 수 있다. N-말단 리더는 IgE 리더 또는 IgG 리더일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산 서열은 면역성 태그를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 면역성 태그는 단백질의 C 말단 상에 있을 수 있고 그리고 이것을 인코딩하는 서열은 HA 코딩 서열의 3'이다. 면역성 태그는 용이하게 이용가능한 항체가 있는 특이한 에피토프를 제공하며, 이로써 그러한 항체는 단백질의 발현을 검출하고 확인하기 위한 검정에서 사용될 수 있다. 면역원성 태그는 단백질의 C말단에서의 H 태그일 수 있다.
(e) 인간 면역부전 바이러스 (HIV) 항원
보조제는 HIV 항원 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. HIV 항원은 면역원에 대한 개질된 공통 서열을 포함할 수 있다. 작제물의 면역원성을 증가시키기 위해 코돈 최적화, RNA 최적화 및 높은 유효성 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함하는 유전적 개질이, 개질된 공통 서열에 포함될 수 있다. 신규한 면역원은 상응하는 코돈 최적화 면역원보다 보다 강하고 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 설계될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, HIV 항원은 하위유형 A 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 A 외막 단백질에 대해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 A 공통 외막 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, HIV 항원은 하위유형 B 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 B 외막 단백질에 대해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 B 공통 외막 단백질 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, HIV 항원은 하위유형 C 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 C 외막 단백질에 대해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 C 공통 외막 단백질 서열일 수 있다.
추가 구현예에 있어서, HIV 항원은 하위유형 D 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 D 외막 단백질에 대해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 D 공통 외막 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, HIV 항원은 하위유형 B Nef-Rev 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 B Nef-Rev 단백질에 대해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 B Nef-Rev 공통 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, HIV 항원은 하위유형 A, B, C 및 D DNA 서열 작제물의 Gag 공통 DNA 서열, Gag 공통 하위유형 A, B, C 및 D 단백질에 대해 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 공통 Gag 하위유형 A, B, C 및 D 단백질 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, HIV 항원은 MPol DNA 서열 또는 MPol 단백질 서열일 수 있다. HIV 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag의 핵산 또는 아미노산 서열, 또는 이들의 어떤 조합일 수 있다.
(2) 기생충 항원
보조제는 기생충 항원 또는 이들의 단편이나 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. 기생충은 원생동물, 윤충 또는 외부기생 생물일 수 있다. 윤충(즉, 벌레)은 편형 동물(예를 들면, 흡충과 촌충), 가시-머리 벌레, 또는 라운드 웜(예를 들면, 요충)일 수 있다. 외부기생 생물은 이, 벼룩, 후기문진드기류 및 진드기류일 수 있다.
기생충은 다음의 질병을 야기하는 어떤 기생충일 수 있다: 가시아메바 각막염, 아메바증, 회충증, 바베시아병, 대장섬모충증, 샤가스 병, 간흡충, 코클리오미아, 크립토스포리디움, 열두조충증, 용선촌증, 포충증, 상피병, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 필라리아증, 편모충증, 악구충증, 왜소조충증, 포자충증, 카타야마 발열, 슈만편모충증, 라임 병, 말라리아, 메타고니무스흡충증, 구더기증, 사상충증, 감염증, 옴, 주혈흡충증, 기면성 뇌염, 선충, 조충증, 톡소카라증, 톡소플라스마증, 선모충증 및 편충증.
기생충은 가시아메바, 아니사키스, 아스카리스 럼브리코이데스, 쇠파리, 발란티디움 콜리, 빈대, 세스토다(촌충), 양충, 코클리오미아 호미니보락스, 이질 아메바, 파스씨오라 헵파티카, 기알디아 람브리아, 십이지장충, 레이시마니아, 링구아튤라 세라타, 간 흡충, 로아사상충, 파라고니머스 - 폐 흡충, 요충, 열대열 원충, 주혈흡충, 스트롱기로이데스 스테르코라리스, 진드기, 촌충, 톡소플라즈마 곤디이, 트립파노소마, 편충, 또는 부케레리아 반크롭티일 수 있다.
(a) 말라리아 항원
보조제는 말라리아 항원(즉, PF 항원 또는 PF 면역원), 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. 항원은 말라리아를 야기하는 기생충으로부터 유래할 수 있다. 말라리아 야기 기생충은 열대열원충일 수 있다. 열대열원충 항원은 포자소체 (CS) 항원을 포함할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 말라리아 항원은 하나 또는 그 이상의 P. 팔씨파럼 (P. falciparum) 면역원 CS; LSA1; TRAP; CelTOS; 및 Ama1을 인코딩하는 핵산 분자 예컨대 플라스미드일 수 있다. 면역원은 전장 단백질의 전장 또는 면역성 단편일 수 있다. 면역원은 개선된 발현을 위하여 공통 서열 및/또는 개질을 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 말라리아 항원은 GenBank 데이터베이스 내에서 모두 전장 열대열원충 TRAP/SSP2 서열(전체 28 서열)의 모음으로부터 설계되고 또한 SSP2로서 언급되는 TRAP의 공통 서열일 수 있다. 공통 TRAP 면역원(즉, ConTRAP 면역원)은 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함할 수 있고 그리고 일부 구현예에 있어서는, HA 태그를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 말라리아 항원은 또한 Ag2로 언급되고 그리고 고도로 보존된 플라스모디움 항원인 CelTOS일 수 있다. 공통 CelTOS 항원(즉, ConCelTOS 면역원)은 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함할 수 있고 그리고 일부 구현예에 있어서는, HA 태그를 포함할 수 있다.
추가 구현예에 있어서, 말라리아 항원은 고도로 보존된 플라스모디움 항원인 Ama1일 수 있다. 말라리아 항원은 또한 일부 예에 있어서, 신호 펩티드 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함하는 Ama1의 공통 서열(즉, ConAmaI 면역원)일 수 있고 그리고 일부 구현예에 있어서, HA 태그를 포함할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 말라리아 항원은 일부 예에 있어서, 신호 펩티드 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함하는 공통 CS 항원(즉, 공통 CS 면역원)일 수 있고 그리고 일부 구현예에 있어서, HA 태그를 포함할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 말라리아 항원은 여기서 제시된 둘 또는 그 이상의 PF 단백질의 조합을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 상호에 대하여 직접적으로 인접하여 연결되거나 이들 사이에 공간이나 하나 또는 그 이상의 이미노산으로 연결된, 둘 또는 그 이상의 공통 CS 면역원, ConLSA1 면역원, ConTRAP 면역원, ConCelTOS 면역원 및 ConAma1 면역원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 융합 단백질은 두 개의 PF 면역원을 포함하고; 일부 구현예에 있어서 융합 단백질 세 개의 PF 면역원을 포함하고, 일부 구현예에 있어서 융합 단백질은 네 개의 PF 면역원을 포함하고, 그리고 일부 구현예에 있어서 융합 단백질은 다섯 개의 PF 면역원을 포함한다. 2개의 공통 PF 면역원을 갖는 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS 및 LSA1; CS 및 TRAP; CS 및 CelTOS; CS 및 Ama1; LSA1 및 TRAP; LSA1 및 CelTOS; LSA1 및 Ama1; TRAP 및 CelTOS; TRAP 및 Ama1; 또는 CelTOS 및 Ama1. 3개의 공통 PF 면역원을 갖는 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS, LSA1 및 TRAP; CS, LSA1 및 CelTOS; CS, LSA1 및 Ama1; LSA1, TRAP 및 CelTOS; LSA1, TRAP 및 Ama1; 또는 TRAP, CelTOS 및 Ama1. 4의 공통 PF 면역원을 갖는 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS, LSA1, TRAP 및 CelTOS; CS, LSA1, TRAP 및 Ama1; CS, LSA1, CelTOS 및 Ama1; CS, TRAP, CelTOS 및 Ama1; 또는 LSA1, TRAP, CelTOS 및 Ama1. 5개의 공통 PF 면역원을 갖는 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS 또는 CS-alt, LSA1, TRAP, CelTOS 및 Ama1.
일부 구현예에 있어서, 융합 단백질은 N 말단에 결합된 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 융합 단백질은 각 공통 PF 면역원의 N 말단에 결합된 다수의 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 융합 단백질의 PF 면역원 사이에 포함될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 융합 단백질의 PF 면역원 사이의 스페이서는 단백질분해성 절단 부위일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 백신이 투여되거나 및/또는 섭취되도록 의도된 세포에서 발견된 프로테아제에 의해 인지된 단백질분해성 절단 부위일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 스페이서는 융합 단백질의 PF 면역원 사이에 포함될 수 있고 여기서 스페이서는 백신이 투여되거나 및/또는 취해지도록 의도된 세포에서 발견된 프로테아제에 의해 인지된 단백질분해성 절단 부위일 수 있고, 융합 단백질은 각 공통 PF 면역원의 N 말단에 결합된 다중 신호 펩티드를 포함하여 절단 상에서 각 공통 PF 면역원의 신호 펩티드가 공통 PF 면역원을 세포가 외측으로 위치변경하도록 한다.
(3) 박테리아의 항원
보조제는 박테리아의 항원 또는 이들의 단편이나 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. 박테리아는 다음 문(phyla) 중 어느 하나로부터 유래할 수 있다: 아키도박테리아, 방선균, 산수균류, 박테로이데테스, 칼디세리카, 클라미디아균류, 클로로비, 클로로플렉시, 크리시오게네테스, 시아노박테리아, 탈철간균문, 다이노코커스-테르무스, 딕티오글로미, 엘루시미크로비아, 피브로박테레스, 피르미쿠테스, 푸소박테리아, 겜마티모나데테스, 렌티스파이라문, 니트로스피라, 플랑크토미세테스, 프로테오박테리아, 스피로헤타문, 시네르기스테스균문, 테네리쿠테스, 열탈유간균문, 열포균류 및 베루코마이크로비아.
박테리아는 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있다. 박테리아는 호기성균 또는 혐기성균일 수 있다. 박테리아는 독립영양세균 또는 종속영양세균일 수 있다. 박테리아는 중온성균, 호중구, 극한미생물, 호산성, 호염기성, 호열성, 호냉성, 호염성 또는 호삼투압성균일 수 있다.
박테리아는 탄저균 박테리아, 항생제 내성 박테리아, 질병 원인 세균, 식중독 박테리아, 감염성 박테리아, 살모넬라 박테리아, 황색 포도상 구균 박테리아, 연쇄상 구균 박테리아, 또는 파상풍 박테리아일 수 있다. 박테리아는 미코박테리아, 클로스트리디움 테타니, 흑사병, 바실러스 안트라시스, 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 또는 클로스트리디움 디피실레일 수 있다.
(a) 결핵균 항원
보조제는 미코박테리움 튜버큐로시스 항원 (즉, TB 항원 또는 TB 면역원), 또는 이들의 단편, 또는 이들의 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Ag85 과, 예를 들어, Ag85A 및 Ag85B로부터 유래할 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Esx 과, 예를 들어, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV, 및 EsxW로부터 유래할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, TB 항원은 Ag85 패밀리 및 Esx 패밀리로부터 하나 또는 그 이상의 미코박테리움 튜버큐로시스 면역원을 인코딩하는 이종성 핵산 분자 예컨대 플라스미드일 수 있다. 면역원은 전장 단백질의 전장 또는 면역성의 단편일 수 있다. 면역원은 개선된 발현을 위해 공통 서열 및/또는 개질체를 포함할 수 있다. 공통 면역원은 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함할 수 있고 그리고 일부 구현예에 있어서, HA 태그를 포함할 수 있다.
(4) 곰팡이 항원
보조제는 곰팡이의 항원 또는 이들의 단편이나 변이체와 연관되거나 조합될 수 있다. 곰팡이는 아스퍼길러스 종, 블라스토마이세스 더마티티디스, 칸디다 이스트(예를 들면, 칸디다 알비칸스), 콕시디오이데스, 크립토코커스 네오포르만스, 크립토코커스 가티, 피부사상균, 퓨사리움 종, 히스토플라스마 캡슐라튬, 털곰팡이아문, 뉴모시스티스 지로벡씨, 스포로트릭스 쉔키, 엑세로힐룸 또는 클라도스포리움일 수 있다.
c. 벡터
백신은 항원 및 보조제를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 벡터는 항원 및 보조제를 발현가능할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 벡터는 이종성 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 이용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내로 들어가면, 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 인코딩되는 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드가 세포-전사 및 번역 기전 리보솜 착물에 의해 생성된다. 플라스미드는 종종 인헨서와 프로모터 영역으로 작용하고 발현 백터 상에서 수행된 유전자의 효과적인 전사를 야기하는 조절 유전자를 함유하도록 설계된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 그리고 이에 따라 단백질을 발현한다.
벡터는 발현 신호, 예컨대 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터 및 클로닝된 유전자 사이의 거리 조정, 및 전사 종결 서열 및 PTIS (이동가능한 번역 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.
(1) 발현 벡터
벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 항원-인코딩 뉴클레오티드 서열 또는 보조제-인코딩 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있으며, 이는 종결 신호와 작동가능하게 연결될 수 있다. 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위하여 요구되는 서열을 또한 함유할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터는 키메라일 수 있다, 즉 그 성분의 적어도 하나가 그 다른 성분의 적어도 하나에 대해 이종성이라는 것을 의미한다. 발현 카세트에서의 뉴클레오티드 서열의 발현은 유도가능한 프로모터의 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 이는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출될 때만 전사를 개시한다. 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.
(2) 원형 및 선형 벡터
벡터는 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외(예로 복제 기원이 있는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다.
벡터는 WLV0009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 인코딩하는 이종성 DNA를 발현하거나 세포로 하여금 면역계 또는 보조제에 의하여 인식된 항원에 서열을 번역하도록 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
또한 전기 천공을 통하여 대상체에 효과적으로 전달되고, 하나 또는 그 이상의 바람직한 항원, 또는 하나 또는 그 이상의 바람직한 보조제를 발현할 수 있는 선형 핵산 백신, 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 또한 본원에 제공된다. LEC는 임의의 인산염 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 또는 그 이상의 항원, 또는 하나 또는 그 이상의 보조제를 인코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원, 보조제의 발현은 프로모터에 의해 제어될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 유전자 발현에 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드에서 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원 또는 보조제를 발현할 수 있다. 플라스미드는 보조제 Rel-A 및/또는 T-bet을 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP(Puerto Rico/34) 또는 pM2(New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 인코딩하는이종성 DNA를 발현하거나 세포로 하여금 면역계 또는 보조제에 의하여 인식된 항원에 서열을 번역하도록 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(Puerto Rico/34) 및 pM2(New Caledonia/99)에서 유래될 수 있다.
(3) 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 신호
벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 단리된 핵산의 유전자 발현을 유도하고 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 통해 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 유전자 발현을 지시하기 위해 이용된 프로모터의 선택은 구체적 용도에 따라 달라진다. 프로모터는 이것이 그 천연 설정에서 전사 개시 부위로부터 유래되므로, 전사 개시로부터 대략 동일한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 상기 거리의 변동이 프로모터의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
프로모터는 전사물, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결의 효과적인 폴리아데닐화에 필요한 항원 및 신호를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 전사물, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결에 필요한 보조제 및 신호를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
프로모터는 CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터일 수 있다.
벡터는 인헨서 및 기능적 스플라이스 공여체 및 수신체 부위를 갖는 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효과적인 종결을 제공하기 위하여 구조 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 상기 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있고, 또는 상이한 유전자로부터 수득될 수도 있다.
d. 백신의 부형제 및 다른 성분
상기 백신은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예컨대 운반체, Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING 외의 보조제, 담체, 또는 희석제일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 형질감염 촉진 제제일 수 있고, 여기에는 표면 활성 제제, 예컨대 면역 자극 착물(ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다수의 음이온, 다수의 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진 제제가 포함될 수 있다.
형질감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함하는, 다수의 음이온, 다수의 양이온, 또는 지질이다. 형질감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6mg/ml 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다. 형질감염 촉진 제제에는 또한 표면 활성 제제, 예컨대 면역-자극 착물(ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 소포체, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌이 포함될 수 있고, 히알루론산이 또한 조성물과 함께 투여되어 이용될 수 있다. DNA 플라스미드 백신은 또한 형질감염 촉진 제제, 예컨대 지질, 리포좀, 예컨대 레시틴 리포좀 또는 당분야에 공지된 다른 리포좀, 예컨대 DNA-리포좀 혼합물(예를 들어 WO9324640 참고), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다수의 음이온, 다수의 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진 제제가 포함될 수 있다. 형질감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함하는, 다수의 음이온, 다수의 양이온, 또는 지질이다. 백신 중 형질감염 제제의 농도는 4mg/ml 미만, 2mg/ml 미만, 1mg/ml 미만, 0.750mg/ml 미만, 0.500mg/ml 미만, 0.250mg/ml 미만, 0.100mg/ml 미만, 0.050mg/ml 미만, 또는 0.010mg/ml 미만이다.
약제학적으로 수용가능한 부형제는 Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING 외의 보조제일 수 있다. 추가적인 보조제는 동일한 플라스미드 또는 대안적인 플라스미드로부터 발현되거나, 백신 내의 상기 플라스미드와 조합된 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 보조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 결실된 신호 서열을 갖고 IgE로부터의 신호 펩티드를 임의로 포함하는 IL-15 포함하여, α-인터페론 (IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인 (TECK), 점막-연관된 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86. 보조제는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 그의 조합일 수 있다.
Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING 외의 보조제로서 유동할 수 있는 다른 유전자는 하기를 인코딩하는 것들을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, 돌연변이 형태의 IL-18, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유 아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, 아포-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, 아포-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 그의 기능적 단편.
상기 백신은 미국 출원 시리즈 번호 021,579 (1994년 4월 1일 출원)에 기재된 바와 같은 유전적 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 완전히 참고로 통합되어 있다.
상기 백신은 사용될 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 백신 약제학적 조성물은 멸균되고, 발열물질이 없고 미립자가 없을 수 있다. 등장성 제형물 또는 용액이 이용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제에는 나트륨 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스가 포함될 수 있다. 상기 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액에는 인산염 완충 식염수가 포함될 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다수의 양이온 또는 다수의 음이온을 포함하는 안정화제는 제형이 연장된 시기 동안 실온 또는 상온에서 안정하도록 할 수 있다.
2. 백신접종의 방법
본 발명은 또한 백신의 상이한 투여 경로에 의해 대상체에서 면역 반응을 증가하는 방법에 관한 것이다. 면역 반응을 증가하는 것은 대상체에서 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
상기 방법은 대상체에게 여기에 개시된 백신을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체는 항원 단독으로 투여된 대상체에 비하여 증가되거나 늘어난 면역 반응을 가질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응은 약 18% 내지 약 650% 증가될 수 있다. 대안적으로, 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응은 약 45% 내지 약 260% 증가될 수 있다. 다른 대안적인 구현예에 있어서, 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응은 약 93% 내지 약 130% 증가될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 투여된 백신은 대상체에서 면역 반응을 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10배 증가시키거나 제고할 수 있다.
본 백신은 보조제를 포함하지 않는 백신에 비하여 IFN-γ 생성을 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 8배, 및 적어도 약 10배 유도할 수 있다.
본 백신은 보조제를 포함하지 않는 백신에 비하여 대상체에서 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시키거나 제고할 수 있다. 본 백신은 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 약 75% 내지 약 200% 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 본 백신은 보조제를 포함하지 않는 백신에 비하여 약 90% 내지 약 130% 증가될 수 있는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 백신은 보조제를 포함하지 않는 백신에 비하여 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 또는 200% 증가될 수 있는 항원에 대한 세포성 및/또는 체액성의 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
백신 복용은 1 ㎍ 내지 10 mg 활성성분/kg 체중/시간 사이로 될 수 있고 그리고 20 ㎍ 내지 10 mg 활성성분/kg 체중/시간 사이로 될 수 있다. 백신은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일 간격으로 투여될 수 있다. 유효한 치료를 위한 백신 복용의 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10으로 될 수 있다.
a. 투여
백신은 약제학적 분야에서의 숙련가에게 잘 알려진 표준 기술에 따라 제형화될 수 있다. 그러한 조성물은 의학 분야에서의 숙련가에 잘 알려진 기술 및 용량으로, 특정 대상체의 나이, 성별, 체중 및 조건, 그리고 투여 경로를 고려하여 투여될 수 있다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간, 말, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 래트, 또는 마우스일 수 있다.
백신은 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 백신은 면역 반응을 야기하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 투여에서, 백신은 치료적 효과를 야기하기에 충분한 양으로 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 이것을 달성하기에 적합한 양은 "치료적으로 효과적인 용량"으로 정의된다. 이러한 용도를 위한 효과적인 양은 예를 들어, 투여된 백신 요법의 특정 조성물, 질병의 단계 및 심각성, 환자 건강의 일반적 단계, 및 처방한 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
백신은 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 투여될 수 있으며, 이는 Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner et al. (미국 특허 번호 5,580,859, 1996년 12월 3일 발행); Felgner (미국 특허 번호 5,703,055, 1997년 12월 30일 발행); 및 Carson et al. (미국 특허 번호 5,679,647, 1997년 10월 21일 발행)에 개시되어 있고, 이의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 백신의 DNA는 개체에 예를 들어 백신 건(gun)을 사용하여 투여될 수 있는 입자 또는 비드로 착화될 수 있다. 본 분야에서의 숙련가는 생리학적으로 수용가능한 화합물을 포함하는 약제학적으로 수용 가능한 담체의 선택은, 예를 들어, 발현 벡터의 투여 경로에 따라 달라질 것임을 알 것이다.
백신은 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로는, 비경구 투여, 예컨대 피내, 근육내, 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내, 및 질내 경로를 포함한다. 특히 백신의 DNA에 대하여, 백신은 개체 조직의 세포간 공간에 전달될 수 있다 (Felgner et al., 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,703,055, 이의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함). 백신은 근육에 투여될 수 있으며, 또는 예컨대 이온 도입법에 의하여, 피내 또는 피하 주사?z 통하여, 또는 경피로 투여될 수 있다. 백신의 상피 투여 또한 채용될 수 있다. 상피 투여는 자극제에 대하여 면역 반응을 자극하기 위하여 상피 체외층을 기계적으로 또는 화학적으로 자극하는 것을 포함할 수 있다 (Carson et al., 미국 특허 번호 5,679,647, 이의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함).
백신은 또한 비강 통로를 통한 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 담체가 고형일 때, 비강내 투여에 적절한 제형은, 스너프(snuff)의 방식이 취해질 수 있는, 즉 코에 가까이 위치한 분말 용기로부터 비강 통로를 통해 빠른 흡입에 의한 방신으로 투여된, 예를 들어 약 10 내지 약 500 마이크론의 범위의 입자 크기를 갖는 조분말을 포함할 수 있다. 상기 제형은 비강 스프레이, 비강 액적, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여일 수 있다. 상기 제형은 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
백신은 서스펜션, 시럽 또는 엘릭시르와 같은 액상 제조물일 수 있다. 백신은 또한 비경구, 피하, 피내, 근육내, 또는 정맥내 투여 (예를 들어 주사가능한 투여), 예컨대 무균성 서스펜션 또는 에멀전일 수 있다.
백신은 리포좀, 마이크로구체, 또는 다른 폴리머 매트리스일 수 있다 (Felgner et al., 미국 특허 번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 이의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 작제될 수 있으며, 비교적 제조와 투여가 단순한 비독성, 생리학적으로 수용가능하고 대사가능한 담체일 수 있다.
백신은 전기천공에 의하여, 이는 예컨대 미국 특허 번호 7,664,545에 개시된 바와 같은 방법에 의하여 투여될 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 전기천공은 미국 특허 번호 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에 개시된 방법 및/또는 장치에 의하여 수행될 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 전기천공은 최소 침습 장치를 통해 수행될 수 있다.
상기 최소 침습 전기천공 장치 (“MID”)는 상기 기술된 백신 및 관련 유체를 신체 조직에 주사하기 위한 장치일 수 있다. 상기 장치는 속이 빈 니들 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 상기 유체 전달 수단을 체조직에 니들을 삽입하는 동안 동시에 (예를 들어, 자동적으로) DNA를 체조직에 주사하기 위하여 유체 전달 수단을 사용되도록 구동하기 위하여 조정될 수 있다. 이는 DNA 및 관련 유체를, 상기 니들이 삽입되는 동안 서서히 주사하여 체조직을 통하여 유체가 더욱 골고루 분배되도록 하는 장점을 갖는다. 주사 동안 경험된 고통은 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사된 DNA의 분배로 인하여 감소할 수 있다.
MID는 니들의 사용 없이 조직에 백신을 주사할 수 있다. MID는 백신이 조직 표면을 관통하고 그 밑의 조직 및/또는 근육에 진입하는 그러한 힘으로 작은 스트림 또는 제트(jet)로서 백신을 주사할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트(jet) 뒤의 그 힘은 가압 기체, 예컨대 1초 단편내 미세-구멍을 통한 이산화탄소의 확장을 통하여 제공될 수 있다. 최소 침습 전기 천공의 예시, 및 그들을 사용하는 방법은 공표된 미국 특허 출원 번호 20080234655; 미국 특허 번호 6,520,950; 미국 특허 번호 7,171,264; 미국 특허 번호 6,208,893; 미국 특허 번호 6,009,347; 미국 특허 번호 6,120,493; 미국 특허 번호 7,245,963; 미국 특허 번호 7,328,064; 및 미국 특허 번호 6,763,264에 기술되며, 이들 각각의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.
MID는 조직을 고통없이 관통하는 액상의 고속 제트를 생성하는 주사기를 포함할 수 있다. 그러한 무침 주사기는 상업적으로 이용가능하다. 본원에서 사용될 수 있는 무침 주사기의 예시는 미국 특허 번호3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에 기술된 것들을 포함하며, 이들 각각의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.
직접 또는 간접 전기운반에 적합한 형태로의 바람직한 백신은 무침 주사기를 사용하여 처리될 조직내로 도입 (예를 들어, 주사)될 수 있으며, 이는 보통 제제의 제트의 전달을 구동하기 위하여 조직에 백신의 관통을 야기할 충분한 힘으로 조직 표면을 주사기에 접촉함으로써 행해진다. 예를 들어, 만약 처리될 조직이, 점막, 피부, 또는 근육일 경우, 상기 제제는 상기 제제가 각질층을 통하여 그리고 피부 층으로, 또는 그 밑의 조직 및 근육으로 각각 관통하는 것을 야기하기에 충분한 힘으로 상기 점막 또는 피부 표면에 투사된다.
무침 주사기는 조직의 모든 유형, 특히 피부 또는 점막에 백신을 전달하도록 잘 맞춰져 있다. 일부 구현예에서, 무침 주사기는 백신을 함유하는 액상을 표면으로 그리고 대상체의 피부 또는 점막으로 나아가게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 조직의 다양한 유형의 대표 예시는 췌장, 후두, 비인두, 아랫 인두, 인두 중앙부, 입술, 목구멍, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부, 점액성 조직, 난소, 혈관 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
MID는 조직을 전기천공하는 니들 전극을 가질 수 있다. 다수의 전극 어레이, 예를 들어 직사각 또는 사각 패턴으로의 설정 내에서 전극의 다수의 쌍 사이에서 펄싱(pulsing)함으로써, 전극 쌍 사이의 펄싱에 대한 개선된 결과가 제공된다. 예를 들어“약물 및 유전자의 매개된 전달을 위한 니들 전극”을 표제로 한 미국 특허 번호 5,702,359에서와 같이, 니들의 어레이가 개시되며, 여기서 니들의 다수의 쌍은 치료적 치료 동안 펄싱될 수 있다. 그 전체가 참고로 개시되어 본원의 포함된 출원에서, 니들은 원형 어레이에 배치되었으나, 니들 전극의 반대 쌍 사이에서 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 갖는다. 재조합 발현 벡터를 세포로 전달하기 위한 니들 전극 쌍이 사용될 수 있다. 그러한 장치 및 시스템은, 미국 특허 번호 6,763,264에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다. 대안적으로, DNA의 주사 및 정상 주사 니들과 유사한 단일 니들로의 전기 천공을 허용하고 현재 사용되는 장치에 의하여 전달되는 것들보다 더 낮은 펄스를 적용하여, 이로써 환자에 의하여 경험되는 전기적 느낌이 감소하는 단일 니들 장치가 사용될 수 있다.
MID는 하나 또는 그 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 상동한 직경 또는 상이한 직경의 2개 이상의 니들을 포함할 수 있다. 니들은 고르게 또는 고르지 않게 떨어져 있을 수 있다. 니들은 0.005 인치 및 0.03 인치 사이, 0.01 인치 및 0.025 인치 사이; 또는 0.015 인치 및 0.020 인치 사이일 수 있다. 니들은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 니들은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 그 이상 떨어져 있을 수 있다.
MID는 펄스 생성기 및 단일 단계에서 백신 및 전기천공 펄스를 전달하는 2 이상의 니들 백신 주사기로 작제될 수 있다. 펄스 생성기는 플래시 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통하여 펄스 및 주사 파라미터의 유연한 프로그래밍 뿐만 아니라, 전기천공 및 환자 데이터의 전체적인 기록 및 저장을 가능케할 수 있다. 펄스 생성기는 짧은 기간의 시간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 생성기는 100 ms의 기간 동안 15 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 그러한 MID의 예시는 Inovio Biomedical Corporation에 의한 엘젠(Elgen) 1000 시스템이며, 이는 미국 특허 번호 7,328,064에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다.
MID는 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA) 장치 및 시스템일 수 있으며, 이는 고분자, 예컨대 DNA를 인체 또는 식물 내의 선택된 조직의 세포로 도입을 촉진하는 모듈식 전극 시스템이다. 상기 모듈식 전극 시스템은 복수의 니들 전극; 피하 주사침; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 니들 전극까지 전도성 링크를 제공하는 전기적 커넥터; 및 전원 공급원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 올려진 복수의 니들 전극을 붙잡아 몸 또는 식물에서 선택된 조직 내로 이들을 단단하게 삽입할 수 있다. 고분자는 이후 선택된 조직 내로 피하 주사침을 통해 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 니들 전극에 적용된다. 상기 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 있는 세포 내로 고분자의 도입을 촉진한다. 세포 과열에 의한 세포 사멸은 일정-전류 펄스 덕분에 조직에서의 전력 소실을 제한함으로써 최소화된다. 셀렉트라(Cellectra) 장치 및 시스템은, 미국 특허 번호 7,245,963에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다.
MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 속이 빈 니들, 및 유체 전달 수단을 제공하는 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 상기 유체 전달 수단을 체조직에 니들을 삽입하는 동안 동시에 (예를 들어, 자동적으로) DNA를 체조직에 주사하기 위하여 유체 전달 수단을 사용되도록 구동하기 위하여 조정될 수 있다. 이는 상기 유체를, 상기 니들이 삽입되는 동안 서서히 주사하여 체조직을 통하여 유체가 더욱 골고루 분배되도록 하는 장점을 갖는다. 주사 동안 경험된 고통은 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사된 유체의 용적의 분배로 인하여 감소할 수 있다고 또한 알려져 있다.
또한, 유체의 자동 주사는 주사된 유체의 실제적 용량의 자동 모니터링 및 기록을 촉진한다. 이러한 데이터는 원한다면 기록 목적을 위한 제어 유닛에 의하여 저장될 수 있다.
주사의 비율은 선형 또는 비선형일 수 있으며, 주사는 니들이 치료받을 대상체의 피부를 통해 주사된 후, 그리고 그것이 추가로 체조직에 삽입되는 동안 수행될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
유체가 본 발명의 장치에 의하여 주사될 수 있는 적절한 조직은 종양 조직, 피부, 또는 폐 조직을 포함할 수 있으나, 근육 조직일 수 있다.
상기 장치는 추가로 체조직으로 니들을 삽입 인도하기 위한 니들 삽입 수단을 포함한다. 유체 주사 비율은 니들 삽입의 비율에 의하여 제어된다. 이는 유체의 니들 삽입 및 주사 둘 다가 삽입의 비율이 주사 비율에 원하는 바와 같이 매칭될 수 있도록 제어될 수 있다는 장점을 갖는다. 이는 또한 상기 장치를 사용자로 하여금 작동하기 더욱 쉽게 만든다. 원할 경우, 체조직으로 니들을 자동 삽입하기 위한 수단이 제공될 수 있다.
사용자는 언제 유체의 주사가 발생할지 선택할 수 있다. 이상적으로는 그러나, 주사는 니들의 끝이 근육 조직에 도달할 때 발생하고, 상기 장치는 상기 니들이 상기 유체의 주사가 발생하기에 충분한 깊이로 삽입될 때를 감지하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이는 유체의 주사가 니들이 원하는 깊이 (이는 보통 근육 조직이 시작되는 깊이일 것이다)에 도달할 때 자동적으로 발생하도록 촉진될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는 예를 들어 미리 설정된 니들 삽입 깊이, 예컨대 피부 층을 통하여 니들이 들어갈 수 있기에 충분하게 여겨질 깊이인 4 mm의 값으로 여겨질 수 있다.
감지 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 상기 감지 수단은 임피던스와 내성의 변화를 감지하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에서 상기 수단은 체조직에서 니들의 깊이를 기록하는 그러한 것을 하지 않을 수 있지만, 그 대신 니들이 상이한 유형의 체조직으로부터 근육으로 이동할 때 임피던스 또는 내성의 변화를 감지하도록 조정될 수 있다. 이러한 대안들 중 어느 하나는 주사가 발생할 수 있는 상대적으로 정확하고 간결하게 작동하는 감지 수단을 제공할 수 있다. 니들 삽입의 깊이는 원하다면 추가로 기록될 수 있으며, 주사될 유체의 부피가 니들 삽입의 깊이가 기록되는 바와 같이 결정되도록 유체의 주사를 제어하는데 사용될 수 있다.
상기 장치는 추가로: 니들을 지지하기 위한 베이스, 그 안에 베이스를 수용하기 위한 하우징을 포함하며, 여기서 상기 베이스는 상기 하우징에 대해 이동가능하여 상기 베이스가 상기 하우징에 대해 제1 후면 위치에 있을 때 상기 니들이 상기 하우징 내에서 후퇴하며, 상기 베이스가 하우징 내에서 제2 정면 위치에 있을 때 상기 하우징 밖으로 연장하도록 한다. 이는 상기 하우징이 환자의 피부 상에서 정렬될 수 있고, 상기 니들이 이후 상기 베이스에 대해 상기 하우징을 이동시킴으로써 상기 환자의 피부로 삽입될 수 있으므로 사용자에게 이롭다.
상기 기술한 바와 같이, 상기 유체가 피부에 삽입될 때 니들 길에에 걸쳐 고루 분배되로록 유체 주사의 제어된 비율을 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 제어된 비율에서 유체를 주사하도록 조절된 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 구동 수단은 예를 들어 서보 모터에 의하여 활성화될 수 있다. 그러나, 피스톤 구동 수단은 하우징에 대해 축방향으로 이동하는 베이스에 의하여 구동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적인 수단이 제공될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 그러므로, 예를 들어, 제어된 또는 비-제어된 비율로의 유체 전달을 위하여 스퀴징되는 밀폐 콘테이너가 주사기 및 피스톤 시스템의 위치에서 제공될 수 있다.
상기 기술된 장치는 주사의 임의의 유형을 위하여 사용될 수 있다. 이는 그러나 전기천공 분야에서 특이 유용한 것으로 구상될 것이며, 그러므로 이는 니들에 전압을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 상기 니들이 주사만을 위하여 사용되는 것이 아니라 또한 전기천공동안 전극으로서도 사용될 수 있도록 허용한다. 이는 전장이 주사된 유체와 같은 영역에 적용된다는 것을 의미하므로 특히 이롭다. 전통적으로 전기천공에 대해서 이것이 전극을 이전에 주사된 유체와 정확하게 배치하는 것이 매우 어렵다는 점과, 그러므로 사용자가 요구된 양에 비하여 더 많은 용적의 유체를 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사하고 더욱 높은 영역에 걸쳐 전장을 적용하여 주사된 물질 및 전장 사이의 겹침을 보장하도록 하는 경향이 있다는 문제가 있어 왔다. 본 발명을 사용하면서, 전장 및 유체 사이에 적합성을 달성하면서도 주사된 유체의 용적 및 적용된 전장의 크기 둘 다가 감소될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시되는 여러 측면을 갖는다.
4. 실시예들
실시예 1
실시예 2-4에 대한 재료 및 방법
플라스미드 백신 작제물. pRelA 플라스미드 DNA 작제물은 각각 전장 마우스 NF-κB 하부단위 p65/RelA (GenBank #TF65_MOUSE) 및 유형-1 전사촉진제 T-bet (GenBank #TBX21_MOUSE)를 인코딩한다. 추가적으로, Ig 중사슬 엡실론-1 신호 펩티드(GenBank#AAB59424)는 각 서열의 N-말단에 융합되어, N-말단 메티오닌을 대체하여, 발현을 용이하게 한다. 각 유전자는 단백질 발현을 증가시키기 위해 기타 독점 변이 중에서 코돈- 및 RNA-최적화를 포함하여, 마우스 내에서 발현을 위해 유전적으로 최적화된다(GenScript, Piscataway, NJ, USA). 최적화된 유전자는 이후 사이토메갈로 바이러스 급속-초기 (CMV) 프로모터의 조절 하에서 변이된 pVax1 포유동물 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 서브-클로닝된다. 이들 반응물은 이후 본 연구에서 분자 보조제로서 사용되었다. pGag 및 pEnv 플라스미드는 각각 HIV-1 단백질 Gag 및 Env를 발현한다.
형질감염 및 웨스턴 블랏 분석. 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포는 10% 열-비활성화된 송아지 태아혈청(FCS), mL 당 100 IU의 페니실린, mL 당 100 ㎍의 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에 유지되었다. 간략하게, 세포는 제작자의 프로토콜에 따라 TurboFection 8.0 (OriGene, Rockville, MD, USA)을 사용하여 형질감염되고 그리고 차후에 24-48 시간 동안 배양되었다. 세포는 얼음 냉각 PBS로 수확되었고, 원심분리되었고 그리고 수세되었고, 그런 다음 웨스턴 이뮤노블랏 분석을 위해 펠렛화되었다. 핵의 추출물 (107 세포)이 제작되었다. 형질감염된 세포로부터의 핵 단백질은 이후 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF 및 프로테아제 저해제의 칵테일(Promega Corp, Madison, WI, USA)을 함유하는 20 mM Hepes (pH 7.9) 내에 용해된다. 각 추출물의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 검정 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 측정되고, 추출물은 사용될 때까지 -70℃에서 분취량으로 보관된다. 표준 웨스턴 블랏팅 분석이 수행되었다. 세포는 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Protease Inhibitor Cocktail tablets; Roche, Indianapolis, IN, USA)로 보충된 단백질 융해 완충액(0.01 M Tris-HCl buffer pH 7.4, 1% Triton X-100, 1% 소디움 데옥시콜레이트, 0.1% SDS 함유)로 처리된다. 용융물 내의 단백질은 이후 12% SDS-PAGE를 사용하여 분리되었다. RelA 및 T-bet에 대한 단백질-특이적 검출 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)가 블랏으로 배양되었고 그리고 발현은 증진된 화학발광(ECL) 웨스턴 블랏 검출 시스템(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 가시화되었다.
IFN-감마 생성 및 루시퍼라제 리포터 검정에 의해 RelA/p65 및 T-bet의 전사 활성의 확인. 루시퍼라제를 함께 발현하는 RelA/p65 발현 벡터(pNF-κB-Luc)가 "보조제화된" 백신 연구에 사용되기 전에 필요한 RelA/p65의 기능성을 확인하기 위해 사용되었다. 루시퍼라제 리포터 검정이 수행되었다. 간략하게, 293T 세포(105 세포/웰)가 96-웰 플레이트에 24시간 동안 접종되었다. 세포는 이후 RelA/p65 Luc 발현 플라스미드로 형질감염되고 6시간 동안 배양되었다. 배양 후, 세포 배양 배지는 제거되고 그리고 새로운 배지로 대체되었다. 형질감염 세포가 6시간 동안 20ng/mL의 재조합 TNF-α로 처리되고 2일 후 마이크로루맷 플러스 루미노미터(Microlumat plus luminometer; LUMAT LB9501, Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA)를 사용함으로써 루시퍼라제 활성을 측정하였다. pT-bet 기능의 확인을 위해, pT-bet 형질감염된 CD4+ T 세포로부터 IFN-γ의 생성이 측정되었다. IFN-γ의 측정을 위한 자극은 T-bet와 IFN-γ 생성 사이의 직접적인 상관관계를 입증한 이미 공표된 연구에 기초된다. 간략하게, 이러한 분석에서 Balb/C 마우스의 비장으로부터 단리된 비처리 CD4+ T 세포가 CD4+ T 세포 단리 키트(Miltenyibiotec, San Diego, CA, USA)를 사용하여 정제되었다. 이들 세포는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 200㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에 유지되고 그리고 차후에 음성 대조군으로 pT-bet 또는 pVax1로 형질감염되었다. 형질감염 2일 후, 세포는 항-CD3 플러스 항-CD28 Abs (1 ㎍/mL)로 하룻밤 동안 자극된다. 배양된 CD4+ T 세포로부터 수집된 상청액에서 IFN-γ 준위는 차후에 표준 ELISA에 의해 측정되었다.
분석 및 백신접종 요법. 성숙 암컷 BALB/cJ (H-2d) 마우스가 "The Jackson Laboratory"(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입되었다. 마우스는 25μL의 PBS 내에 재현탁된 25㎍의 플라스미드로 좌측-허벅다리 사두근 근육 안으로 주사 바늘 주사에 의해 근육 내로 (i.m.) 면역화되었다. 백신접종은 바로, 동일한 부위에. 이후 EP에 의해 수행되었고, 2주 간격으로 반복되었다. EP 매개 전달을 위해, 이노비아 파마세티칼스 주식회사(Blue Bell, PA, USA)에 의해 공급되는 세-갈래의 "CELLECTRA® 적응성 정전류 최소 침습 장치 (MID)"가 사용되었다. 구체적으로, 구형파 펄스가 26-게이지 고체 스테인레스 스틸 전극으로 구성된 삼각형 3-전극 어레이(피내로 2 mm 삽입됨)를 통해 전달되고 그리고 0.1 Amps의 두 개의 정-전류 펄스가 1초 지연으로 단리된 52 마이크로초/펄스로 전달되었다. 백신접종/분자 보조제 투여 요법 동안 그리고 연구에 대한 종료를 통해, 모든 마우스는 잠재적인 역효과의 발달에 대해 매 3일 마다 모니터링되었다.
비장세포, T 세포 단리, 및 사이토킨 정량. 비장은 제3차 면역화 이후 7-8일간 수확되었다. 간략하게, 비장은 10% FBS, 1X 항생성-항진균성(Antibiotic-Antimycotic) (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 및 1×β-ME (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 보충된 RPMI 1640 배지 (Mediatech, Manassas, VA, USA)에 위치되었다. 비장세포는 스토마커(Stomacher) 장치(Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY, USA)을 사용하여 비장의 기계적 파괴에 의해 단리되었고, 그리고 얻어진 생성물은 40㎛ 셀 스트레이너(cell strainer) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 여과되었다. 세포는 이후 RBC의 용융을 위해 ACK 융해 완충액(Lonza, Walkersville, MD, USA)로 5분 동안 처리되고, PBS에 수세되고, 이후 ELISPOT 분석에 사용하기 위해 RPMI 배지에 재현탁되었다. CD4 비처리 T 세포는 비처리 CD4+ T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)를 사용하여 비장으로부터 정제된다. 이들 세포는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 200 ㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에 유지되고 그리고 항-CD3 플러스 항-CD28(각각 1㎍/mL)로 자극된다. 항-CD3 플러스 항-CD28 항체로 자극에 의해, 배양된 세포의 배양 상청액 내의 사이토킨 생성 준위가 효소결합 면역흡착검사(ELISA)에 의해 관찰되었다.
ELISPOT 분석. 표준 IFN-γELISPOT 분석이 본 연구에 사용되었다. 일시적으로, 96-웰 플레이트(Millipore, Billerica, MA, USA)가 항-마우스 IFN-γ 포획 항체로 코팅되고, 그리고 4℃에서 24시간 동안 배양되었다(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). 다음날에 플레이트는 PBS로 수세되고 이후 차단 완충액(PBS 내 1% BSA 및 5% 슈크로스)로 2시간 동안 배양되었다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포(5×105 세포/웰로 3개로 플레이팅됨)는 비장세포로부터 MACS-정제되고(Miltenyibiotec, San Diego, CA, USA) 그리고 차후에 HIV-1 Gag (공통 하위유형 B) 또는 Env (하위유형 B (MN)) 펩티드(11개 아미노산에 의하여 중복되고, 그들 각각의 단백질의 길이에 걸친 15-mers (NIH AIDS Reagent Program, Bethesda, MD, USA)로 자극되었다. 5% CO2 내에 37℃에서 하룻밤 동안 18-24시간 자극 후, 플레이트는 PBS 내에서 수세되고 그리고 차후에 R&D 시스템스(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입된 바이오티닐화된 항-마우스 IFN-γ 모노크로날 항체(mAb)로 4℃에서 추가로 24시간 동안 배양되었다. 이 플레이트는 이후 PBS 내에서 다시 수세되고, 그리고 스트렙트아비딘-알카린 포스파타제(MabTech, Nacka Strand, Sweden)가 각 웰에 부가되고 그리고 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 마지막으로, 플레이트는 PBS 에서 다시 수세되었고, 이후 BCIP/NBT 플러스 기질 (MabTech, Cincinnati, OH, USA)로 5-30분동안 배양되었다. 육안 검사에 기초된 스팟(spot) 발달의 완료에서, 플레이트는 증류수로 헹궈지고 이후 실온(RT)에서 하룻밤 동안 건조되었다. 스팟은 자동화된 ELISPOT 리더(Cellular Technology, Shaker Heights, OH, USA)를 사용하여 계수된다.
T 세포 증식 분석. 증식적 반응이 재조합 HIV-1 IIIB pr55 (Gag) (NIH AIDS Reagent Program, Bethesda, MD) 또는 HIV-1 MN IIIB gp160 (Env) (단백질 Sciences, Meriden, CT, USA)의 일련의 희석(5, 1, 및 0.1 ㎍/mL)의 존재 하에 96-웰 U-바닥 플레이트 안에 웰 당 배양 배지 내에 105 비장세포를 배양함으로써 생체 외에서 측정되었고, 그리고 37℃에서 5% CO2로 배양되었다. 삼중수소화(3H)-티미딘의 합체는 0-24 시간 간격 동안 1 μCi/웰의 (3H)-티미딘으로 펄싱함으로써 측정되었다. 플레이트는 이후 수확되고 그리고 합체된 3H-티미딘은 베타 플레이트 리더(Wallac, Waltham, MA, USA) 안에서 측정되었다. 증식적 반응은 Ag-자극 웰의 평균 cpm (counts per minute)을 비-자극 웰의 평균 cpm으로 나눔에 의해 계산된 자극 지수(SI)로 표시되었다.
ELISA. 제3차 백신접종 이후 7일간 수확된 백신 접종된 마우스로부터의 혈청이 ELISA에 의하여 재조합 HIV-1 Env (NIH AIDS 시약 프로그램)에 대한 항체 반응에 대해 시험되었다. 간략하게, 96-웰 ELISA 플레이트가 재조합 HIV-1 Env 단백질 (Protein Sciences)로 코팅되고, 그리고 4℃에서 배양되고 그리고 차후에 PBS 및 0.1% 트윈(Tween)-20으로 수세되었다. 플레이트는 이후 2시간 동안 PBS 및 0.2% 트윈(Tween)-20으로 차단되었다. 차단 용액의 제거 후, 100 μL의 미리 희석된(1:50, 1:100, 1:500, 1:1000) 마우스 혈청이 부가되고 그리고 1시간 동안 배양된다. 플레이트는 이후 4회 수세되고 그리고 퍼옥시다제-커플 항-마우스 IgG mAb (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 배양되었다. 마지막으로, 플레이트는 다시 수세되었고, 이후 웰 당 200μl의 기질 용액 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)이 부가되었다. 그 후에 (OD 405 nm)에서의 광학 밀도가 15분 배양 후 측정되었다. 모든 분석은 3개로 수행되었다.
유동 세포계수법. 근육 조직(즉, 주사/백신접종의 부위로부터)은 무균상태로 제거되고, HBSS(Hanks' balanced salt solution)(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 헹궈지고, 대략 1×2-mm 장방형으로 잘려지고, 그리고 45분 동안 37℃에서 때때로 교반하면서 20 mL의 콜라게나제 A (1 mg/mL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 소화되었다. 세포성 소화물은 멸균의 31㎛ 나이론 메쉬를 통해 여과되고, 10분 동안 400 g에서 원심단리되고, 그리고 10% FCS-DMEM 내에서 2회 수세되었다. 세포 펠렛은 이후 4 mL의 10% FCS-DMEM 안에 재현탁되었다.
유동 세포 분석을 위해, 면역화된 마우스 세포로부터 106 세포가 얼음-냉각 완충액 A (PBS/0.1% BSA/0.01% NaN3)로 현탁하여 수세되고 그리고 50 μL의 1:100 희석된 형광-표지된 특정 항체로 4℃에서 20분 동안 배양된다. 이용된 형광성 물질로 공액된 Abs는 FITC-CD11c, PE-CD4, PE-Cy7-CD45R (B220) (eBioscience, San Diego, CA, USA), Alexa Fluor-750-CD8α, 및 PerCP-Cy5.5-CD11b (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)이 었다. 세포는 2회 수세되었고 그리고 바로 유동 세포분석기 (Becton
Dickinson FACS, San Jose, CA, USA) 상에서 분석되었다. 모든 배양과 수세는 얼음 냉각 완충액 A로 4℃에서 수행되었다. 세포를 일중항 및 살아있는 세포 상에서 관문화하였다. 유동 세포분석 데이터는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)를 사용하여 분석되었다.
통계적 분석. 그룹 분석은 매칭된, 양쪽 검증의, 쌍을 이루지 않은 t-테스트에 의해 성취되어 모든 값은 평균±SEM으로 나타낸다. Mann-Whitney 분석이 통계적 차이를 결정하기 위해 사용되었다. 모든 데이터는 Prism 소프트웨어(GraphPad Prism5)(GraphPad Prism, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 분석되었다. 그룹 사이의 통계학적으로 유의성 있는 차이는 다음과 같이 정의된다: * p < 0.1, ** p < 0.01, *** p < 0.001, 및 **** p < 0.0001.
실시예 2
보조제 구성과 발현
pRelA 및 pTbet 플라스미드는 각각 전장의 마우스 NF-카파 B 하부단위 p65/RelA 및 유형-1 전사촉진제 T-bet을 인코딩한다. 각각은 유전적으로 최적화되고, 합성되고 그리고 변이된 pVax1 포유동물 발현 벡터로 서브클로닝된다(도 1A). 이들 플라스미드의 발현에 대해 시험하기 위해, HEK 293T 세포가 각각으로 형질감염되고 그리고 단백질 생성이 표준 웨스턴 면역 블랏팅에 의해 평가되었다. 특정 Ab를 사용하여, 형질감염 후 24시간과 48시간 양자에서 수확된 세포 용융물에서 RelA에 상응하는 대략적으로 65 kDa 단백질이 검출되었다(도 1B). 마찬가지로, T-bet는 항-T-bet Ab를 사용하여 대략적으로 56 kDa 단백질로서 검출되었다. 엠프티 벡터 대조 플라스미드 pVax1로 형질감염된 세포로부터의 용융물에 어느 것도 결합하지 않기 때문에 결합은 이들의 각 단백질에 대해 특이적이었다. 이들 데이터는 HEK 293T 세포의 체외 형질감염에서 분자 보조제 각각이 이들의 각각의 인코딩된 단백질을 발현하는 것을 입증하였다. IκB-의존성 전사는 RelA (p65)의 활성화를 확인하기 위해 HeLa 세포 루시퍼라제 발현 세포계(도 1C) 내에서 평가되었다. 상대적인 루시퍼라제 활성에 의해 측정된 RelA 발현에서의 증가는 복용량 의존 방식으로 관찰되었다. 즉, 3㎍에서 5㎍ 또는 10㎍으로의 플라스미드 증가는 대략적으로 1.5 또는 2.5 배로 상대적 루시퍼라제 활성에서의 증가를 초래한다. T-bet 발현은 T 세포 및 NK 세포에 있어서 IFN-γ 발현과 상호관련되고 그리고 따라서 이 분석에서 IFN-γ는 T-bet의 기능적 발현에 대한 대용물로서 작용한다(도 1D).
추가적으로, pRelA 플라스미드를 갖는 HeLa 세포의 형질감염 이후의, 그리고 항-NF-κB (p65) 항체로 염색된, RelA 단백질 발현의 하위-세포성의 국지화의 면역 형광 검사 분석(IFA)이 도 6에 도시되었다. 이러한 IFA는 pRelA 플라스미드로부터 RelA의 발현을 추가로 확인하였다.
실시예 3
증진된 세포성 면역
백신-유도 면역성을 증진하는 관점에서 pRelA 및 pTbet의 기여가 이후 평가되었다. Balb/C 마우스(n = 4/그룹)는 25㎍의 pRelA 또는 pTbet가 있거나 또는 없는 25㎍의 pEnv 또는 pGag, 25㎍의 pRelA 또는 pTbet 단독으로, 또는 25㎍의 대조 플라스미드 (pVax1; 도 2)로 3회 백신 접종되었다. 백신 및 보조제는 생체 내 EP에 의해 25μL의 PBS에서 전달되었다. 동물은 35일째(즉, 제3차 백신접종 후 7일)에 희생되었고, 이후 IFN-γ ELISpot에 의한 면역 분석을 위해 비장세포가 단리되었다. 이러한 검정에서, HIV-1 Env 또는 Gag 펩티드 풀이 MACS-정제 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 자극을 위해 사용되었고 그리고 IFN-γ ELISpot 결과는 도 2에 나타냈다. CD4+ 및 CD8+ T-세포 양자 반응은 pEnv 단독에 비하여 pEnv로 백신 접종되고 그리고 pRelA 함께 투여된 마우스에서 유의성 있게 증가되는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, pEnv 단독에 비하여 함께 투여된 pTbet을 갖는 pEnv으로 면역화가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응에서 유의성 있는 증가를 입증하였다(도 2B).
상이한 Ag에 대해 T 세포 IFN-γ 생성에 대한 이들 두 보조제의 증진 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 상기에서 수행된 바와 유사하게 pRelA 또는 pTbet을 갖거나 또는 갖지 않는 HIV-1Gag로 동물을 백신 접종하였다. pEnv 그룹에 유사하게, CD4+ T 세포 반응은 pGag 단독으로 면역화된 마우스와 비교할 때, pGag 및 공동-투여된 pRelA로 면역화된 마우스에서 증가하였다(도 2C). pGag 단독으로의 면역화에 비하여 pGag 및 공동-투여된 pRelA로 백신 접종된 마우스에서 CD8+ T 세포 반응의 보다 큰 증진이 있었다(도 2C). 추가로, pTbet의 동시적인 투여와 함께 HIV-1 Gag로의 면역화는 pGag 단독으로 면역화에 비하여 증가된 CD8+ T-세포 반응을 입증하였다(도 2C). 그러나, CD4+ T 세포 반응은 pRelA의 공동-전달로 관찰된 것만큼 유의성 있게 증가되지는 않았다. 또한, pRelA 또는 pTbet 어느 하나의 단독의 투여는 IFN-γ 생성에 의해 측정된 것으로 Gag 또는 Env에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 어느 하나를 현저하게 활성화하지는 않았다. 따라서, 이들 데이터는 백신-유도된 세포성 면역 반응의 범위를 확장하는 것이 면역 보조제의 투여에 의해 자극되었다는 것을 제시하는 데이터와 함께, 전사 인자 보조제의 공동-투여가 두 개의 별도 항원에 대한 증진된 T 세포 반응을 증강시킨다는 것을 입증한다.
RelA 분자 보조제가 특별하게는 T 세포 반응을 증진하는 것으로 관찰되었기 때문에, pRelA의 존재 또는 부재에서 면역화된 세포의 증식적 잠재성이 평가되었다. 백신 접종된 동물로부터의 비장세포는 제3차 면역화 후 7일간 수확되었고, 그리고 이후 이들의 동등한 Ag, 즉, HIV-1 Env 또는 Gag의 어느 하나로 자극되었다(도 3). pEnv-백신 접종된 마우스에서, 보조제화되지 않은 동물에 비하여 또한 pRelA 보조제를 수용한 마우스에서 모든 Ag 복용량에서 증진된 증식으로의 경향이 있었다 (도 3A). 이 경향은 또한 전반적인 자극 지수가 pRelA가 함께-전달될 때 보다 높게 되는 pGag-백신 접종된 동물에서 관찰되었다(도 3B). 게다가, 도 3A, B 양자에서, 전반적인 촉진 지수에 부가하여, 배수 값이 pEnv 또는 pGag 단독 그룹의 촉진 지수로 나누어진 pEnv + pRelA 또는 pGag + pRelA 그룹의 촉진 지수의 비율인, 배수 증가 그래프가 포함되었다. 따라서, pEnv 및 pGag 백신 접종된 동물에서 자극 지수는 시험된 모든 백신 복용량에서 pRelA 보조제의 함입에 의해 증가되었다. 최소한의 증식이 pRelA 보조제 단독을 수령한 동물로부터의 비장세포에서 관찰되었기 때문에, 이들 반응은 HIV Ags에 대해 특이적이었다. 이와 함께, 이들 결과는 pRelA DNA 보조제가 두 개의 개별 특이적 항원에 대해 Ag-특이적 T 세포 증식적 반응을 증진한다는 것을 입증하였다.
추가적으로, 도 7은 보조제 RelA를 포함하거나 또는 포함하지 않는 백신으로 면역화된 마우스로부터 pg/mL로 인터류킨-2 (IL-2)의 농도를 나타낸다. 이들 데이터는 백신에 RelA의 함입은 IL-2 생성을 약 3배로 유의성 있게 증가시켰다는 것을 입증하였다.
실시예 4
보조제화된 백신접종으로 증진된 항체 반응
T 세포 IFN-γ 및 증식적 반응에서 관찰된 보조제 매개 증가에 기초하여, B-세포 유도에 대한 이들 분자 보조제의 효과가 평가되었다. HIV-1 Env-특이적 IgG가 제3차 백신접종 이후 7일간 백신 접종된 동물의 혈청에서 측정되었다. 지시된 바와 같이, 마우스는 공동-투여된 pRelA 또는 pTbet를 갖거나 또는 갖지 않는 pEnv, pRelA 또는 pTbet 단독, 또는 pVax1 대조 플라스미드를 수용했다(도 4). 측정할 수 있는 IgG 반응은 1:50 내지 1:500의 범위로 되는 희석으로 pEnv 단독에 의해 유도되었지만, 1:1,000의 희석에서는 더 이상 측정할 수 없었다. 이들 반응은 pEnv 그룹 단독에 비교할 때 pRelA 또는 pTbet 보조제의 함입에 의해 모든 희석에서 증진되었다. 구체적으로, 차이는 pRelA 및 pTbet의 투여가 HIV-1 Env-특이적 IgG 반응의 유도를 유의성 있게 증진하는 1:50 혈청 희석에서 관찰되었다(각각, p = 0.0388 및 p = 0.0062). 최소한의 항체 반응이 pRelA 또는 pTbet 보조제 단독을 투여한 동물로부터의 혈청에서 관찰되었기 때문에, 증진된 IgG 반응은 Env에 대해 특이적이었다. 이들 데이터는 양 전사 인자 보조제가 pRelA 또는 pTbet로 백신접종에 따라 관찰된 상승된 IFN-γ 준위 및 T 세포 증식적 반응과 일치하고 유사한 증진된 체액성 면역 반응을 유도한다는 것을 제시한다.
도 8A는 pRelA로 공동 면역화된 Balb/C 마우스의 증진된 체액성 면역 반응을 나타낸다. 플라스미드 DNA 인코딩 pVax1, pEnv 또는 pEnv+pRelA로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 ELISA 분석. DNA-접종된 마우스로부터 혈청 내 gp120에 대한 IgG 항체 반응성이 ELISA에 의해 측정되었다. 마우스는 일단 3 면역화로 면역화되었다. 405nm에서의 광학 밀도, OD405. 도 8B는 IgG 서브클라스에 대해 스윗칭하는 이소유형에 대한 RelA의 차등 효과를 나타낸다. 전체 IgG1 및 IgG2를 발현하는 비장 Env 및 Env+RelA 세포가 측정되었다. 값은 다섯 번의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 나타난다. 값은 세 번의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 나타난다.
도 8C는 pRelA로 공동 면역화된 Balb/C 마우스의 증진된 체액성 면역 반응을 나타낸다. 플라스미드 DNA 인코딩 pVax1, pEnv 또는 pEnv+pT-bet로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 ELISA 분석. DNA-접종 마우스로부터의 혈청 내 gp120에 대한 IgG 항체 반응성이 ELISA에 의해 측정되었다. 마우스는 일단 3 면역화로 면역화되었다. 405nm에서의 광학 밀도, OD405. 도 8D는 IgG 서브클라스에 대해 스윗칭하는 이소유형에 대한 T-bet의 차등 효과를 나타낸다. 전체 IgG1 및 IgG2를 발현하는 비장 Env 및 Env+T-beT 세포가 측정되었다. 값은 다섯 번의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 나타난다. 값은 세 번의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 나타난다.
항체 반응을 증진하는 전사 인자의 능력에 대한 하나의 잠정적인 메카니즘은 철저히 활성화된 B-세포의 수에서의 증가를 통해서일 수 있다. 이것이 발생되는 지를 평가하기 위해, 백신접종의 부위에서 pRelA 투여된 근육이 함께-투여된 pRelA로 pEnv 면역화 후 3일간 생체 검사되었고, 이후 주사의 부위에서 B220+ B-세포의 수가 정량화되었다. 도 9는 상대적 발현을 (백분율로) 나타낸다. 이 결과는 pRelA 및 pEnv 단독은 pVax1 투여 단독에 비하여 주사의 부위에 B-세포 트래피킹(trafficking)에서 단지 완만한 증가만을 야기했다는 것을 나타냈다(도 5). 이것은 B220+ B 세포의 준위에 직접적으로 비례하는 개별 FACS 스캔에 도시된 MFI(mean fluorescent intensity; 평균 형광강도) 값에 의해 나타난다. 그러나, pEnv 백신과 조합하여 pRelA 보조제의 부가는 추가로 주사의 부위에서 B-세포의 수를 증진했다.
요약하면, 실시예 2-4에서의 데이터는 DNA 백신-유도 면역성을 증진하기 위한 분자 보조제로서 세포성 전사 인자 RelA 및 T-bet의 사용을 입증하였다. 생체 내 전기천공법(EP)에 의해 원형 DNA 백신과 함께-전달될 때, 이들 보조제의 어느 하나가 항체 준위에서 증가에 의해서뿐만 아니라 증가된 T 세포 수 및 IFN-γ 생성에 의해 나타난 바와 같이 고양된 항원-특이적 T 및 B 세포 반응을 자극했다. pEnv 또는 pGag 백신과 조합하여 pRelA 또는 pTbet 어느 하나의 공동-투여는 ELISpot 및 증식에 의한 INF-γ 생성에 의해 측정된 바와 같이 유의성 있게 T 세포 면역성을 증가시켰다. 또한, B-세포/항체 준위는 항원 특이적 항체 역가뿐만 아니라 B-세포 수에서의 증가에 의해 나타난 바와 같이 증진된다. 이들 발견과 일관되게, 혈청 내의 항원 특이적 IgG의 전체 양은 전사 인자를 발현하는 플라스미드의 공동-투여에 따라 증가되었다.
실시예 5
보조제로서 TWEAK 또는 GITRL로 세포성 반응
pTWEAK 플라스미드는 전장 TWEAK를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 사용을 최적화함으로써 작제되었다. 이 최적화된 뉴클레오티드 서열은 이후 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에서 pVAX1 발현 벡터 내로 클로닝되었다.
pGITRL 플라스미드는 전장 GITRL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 사용을 최적화함으로써 작제되었다. 이 최적화된 뉴클레오티드 서열은 이후 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에서 pVAX1 발현 내로 클로닝되었다.
10개 그룹 마우스가 이 연구에 포함되었다. 각 그룹은 4마리의 마우스가 있고 그리고 각 그룹 내의 마우스는 6-8 주령 암컷 Balb/c 마우스이다. 일 그룹은 항원 단독(즉, 15 ㎍의 DNA 인코딩 HIV-1 Env)로 면역화되고, 일 그룹은 15 ㎍의 DNA 인코딩 HIV-1 Env 및 7.5 ㎍의 pTWEAK ("T")로 면역화되고, 일 그룹은 15 ㎍의 DNA 인코딩 HIV-1 Env 및 10 ㎍의 pTWEAK ("T")로 면역화되고, 일 그룹은 15 ㎍의 DNA 인코딩 HIV-1 Env 및 7.5 ㎍의 pGITRL ("G")로 면역화되고, 일 그룹은 15 ㎍의 DNA 인코딩 HIV-1 Env 및 10 ㎍의 pGITRL ("G")로 면역화되었다.
면역화는 MID-EP 시스템으로 전기천공법에 따른 근육 내로(IM) 수행되었다. 구체적으로, 각 면역화를 위해, 25 ㎍의 DNA가 29-게이지 바늘을 갖는 인슐린 주사기를 사용하여 주사되었다. 각 면역화 일주일 후, 마우스는 레트로-오비탈(retro-orbital) 채혈에 의해 채혈되었다.
면역화 요법은 도 10에 개략적으로 도시되었다. 마우스는 0일에 프라이밍 면역화가 주어졌고, 이후 14일 및 28일에 부스터 면역화가 주어졌다. 마우스는 ELSspot 분석을 위해 비장세포와 ELISA 분석을 위해 최종 출혈을 수확하기 위해 35일째에 희생되었다.
ELISspot 분석의 결과는 각각 TWEAK 및 GITRL에 대해 도 11 및 12에 나타냈다. 이들 데이터는 TWEAK는 TWEAK를 결한 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응을 증가시켰다(증가된 IFN-γ 준위에 의해 입증된 바와 같음)는 것을 입증하였다. 이들 데이터는 또한 GITRL은 GITRL을 결한 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응을 증가시켰다(증가된 IFN-γ 준위에 의해 입증된 바와 같음)는 것을 입증하였다. 따라서, TWEAK 및 GITRL은 보조제로서 TWEAK 또는 GITRL을 결한 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응과 IFN-γ 준위를 증가하는 보조제로서 작용하였다.
실시예 6
보조제로서 TWEAK 또는 GITRL로 체액성 면역 반응
TWEAK 또는 GITRL이 백신에서 보조제로서 사용될 때 체액성 면역 반응이 마우스에서 시험되었다. 상기 실시예 5에 기술되고 도 10에 도시된 계획된 면역화가 본 연구에서 사용되었다. 체액성 반응은 ELISA를 통해 측정되었으며, 여기서 광학적 밀도는 OD 450에서 측정되었다. 모든 실험 그룹은 비처리에 비하여 대략적으로 158까지의 상호적 역가 희석에서 광학 밀도에 있어서의 현저한 증가를 보였다. 특히, 10 ㎍ 복용량 GITRL은 50의 상호적 역가 희석에서 광학 밀도의 3배 증가 이상으로 체액성 반응에 있어서의 가장 유의성 있는 증가를 보였다. 대조군에 대한 실험 그룹의 차이는 희석이 5000 이상으로 증가될 때 경감되었다.
실시예 7
보조제로서 EOMES로 체액성 면역 반응
pEOMES 플라스미드는 EOMES를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 사용을 최적화함으로써 작제되었다. 이 최적화된 뉴클레오티드 서열은 이후 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에서 pVAX1 발현 벡터 내로 클로닝되었다. IgE 리더 서열 및 코작 서열이 또한 EOMES를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치된다. 상기 구성의 개략도가 도 14A에 도시되었다.
pEOMES 플라스미드로부터 EOMES의 발현은 pEOMES 플라스미드 및 pVAX1 플라스미드(음성 대조군)로 세포를 형질감염함으로써 확인되었다. 도 14B에 도시된 바와 같이, EOMES는 pEOMES로 형질감염된 세포에서는 발현되었지만, pVAX1로 형질감염된 세포에서는 그렇지 않았다. 발현은 세포가 10 ㎍의 DNA로 형질감염된 것에서 형질감염-후 2일에 용융물의 웨스턴 블랏팅에 의해 분석되었다.
마우스의 그룹이 이 연구에 포함되었다. 각 그룹에는 5마리의 마우스가 있고 그리고 각 그룹 내의 마우스는 6-8 주령 암컷 Balb/c 마우스이다. 일 그룹은 pVAX1 (음성 대조군)로 면역화되고, 일 그룹은 항원 단독(즉, DNA 인코딩 HIV Env, pHIV-Env로 언급되는 플라스미드)으로 면역화되고, 그리고 일 그룹은 pHIV-Env 및 pEOMES로 면역화되었다.
면역화는 MID-EP 시스템으로 전기천공법에 따른 근육 내로(IM) 수행되었다. 구체적으로, 각 면역화를 위해, 25 ㎍의 DNA가 29-게이지 바늘을 갖는 인슐린 주사기를 사용하여 주사되었다. 각 면역화 일주일 후, 마우스는 레트로-오비탈 채혈에 의해 채혈되었다.
면역화 요법은 도 15에 개략적으로 도시되었다. 마우스는 0일에 프라이밍 면역화가 주어졌고, 이후 2주 및 4주에 부스터 면역화가 주어졌다. 마우스는 ELSspot 분석을 위해 비장세포를 수확하기 위해 5주째에 희생되었다.
ELISspot 분석의 결과는 도 16에 나타냈다. 이들 데이터는 EOMES는 EOMES를 결한 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응을 증가시켰다(증가된 IFN-γ 준위에 의해 입증된 바와 같음)는 것을 입증하였다. 따라서, EOMES는 보조제로서 EOMES를 결한 동일한 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응과 IFN-γ 준위를 증가하는 보조제로서 작용하였다.
실시예 8
보조제로서 STING로 세포성 반응
pSTING 플라스미드는 STING를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 사용을 최적화함으로써 작제되었다. 이 최적화된 뉴클레오티드 서열은 이후 pVAX1 발현 벡터 내로 클로닝되었다.
pSTING 플라스미드로부터 STING의 발현은 pSTING 플라스미드 및 pVAX1 플라스미드(음성 대조군)로 293T 세포를 형질감염함으로써 확인되었다. 도 17에 도시된 바와 같이, STING는 pSTING로 형질감염된 세포에서는 발현되었지만, pVAX1로 형질감염된 세포에서는 그렇지 않았다. 발현은 세포가 10 ㎍의 DNA로 형질감염된 것에서 형질감염-후 2일에 용융물의 웨스턴 블랏팅에 의해 분석되었다.
마우스의 그룹이 이 연구에 포함되었다. 각 그룹에는 4마리의 마우스가 있고 그리고 각 그룹 내의 마우스는 6-8 주령 암컷 Balb/c 마우스이다. 일 그룹은 pVAX1 (음성 대조군)로 면역화되고, 일 그룹은 항원 단독(즉, DNA 인코딩 HIV Env, pHIV-Env로 언급되는 플라스미드)으로 면역화되고, 일 그룹은 pHIV-Env 및 pSTING(20 ㎍)로 면역화되고, 그리고 일 그룹은 pHIV-Env 및 pSTING(50 ㎍)로 면역화되었다.
면역화는 MID-EP 시스템으로 전기천공법에 따른 근육 내로(IM) 수행되었다. 구체적으로, 각 면역화를 위해, DNA가 29-게이지 바늘을 갖는 인슐린 주사기를 사용하여 주사되었다. 각 면역화의 일주일 후, 마우스는 레트로-오비탈 채혈에 의해 채혈되었다.
면역화 요법은 도 18에 개략적으로 도시되었다. 마우스는 0일에 프라이밍 면역화가 주어졌고, 이후 2주 및 4주에 부스터 면역화가 주어졌다. 마우스는 ELSspot 분석을 위해 비장세포를 수확하기 위해 5주째에 희생되었다.
ELISspot 분석의 결과는 도 19에 나타냈다. 이들 데이터는 STING는 STING이 없는 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응을 증가시켰다(증가된 IFN-γ 준위에 의해 입증된 바와 같음)는 것을 입증하였다. 따라서, STING는 보조제로서 STING이 없는 동일한 백신에 비하여 항원에 대한 세포성 면역 반응과 IFN-γ 준위를 증가시키는 보조제로서 작용하였다.
상기 상세한 설명 및 동반 실시예는 단지 예시적인 것이며, 오로지 첨부된 특허청구범위 및 이들의 균등부에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 됨이 이해된다.
개시된 구현예에 대한 다양한 변경과 수정이 이 기술분야에서의 통상인에게 명백할 것이다. 비제한적으로 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형 또는 이용 방법에 관한 것들을 포함하는 이러한 변화 및 개질이 발명의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다.
<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA WEINER, David MUTHUMANI, Karuppiah <120> VACCINES WITH BIOMOLECULAR ADJUVANTS <130> UPVG0048WO <150> 61800328 <151> 2013-03-15 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rel-A <400> 1 atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctgacgat 60 ctgtttcccc tcatctttcc ctcagagcca gcccaggctt ctgggcctta tgtggagatc 120 atcgaacagc cgaagcaacg gggcatgcga ttccgctata aatgcgaggg gcgctcagcg 180 ggcagtattc ctggcgagag aagcacagat accaccaaga cacaccccac catcaagatc 240 aatggctaca caggaccagg aacagttcga atctccctgg tcaccaagga tccacctcac 300 cggcctcatc cacatgaact tgtggggaag gactgccggg atggctacta tgaggctgac 360 ctctgcccag accgcagtat ccatagcttc cagaacctgg ggatccagtg tgtgaagaag 420 cgagacctgg agcaagccat tagccagcga atccagacca acaataaccc ctttcacgtt 480 cctatagagg agcagcgcgg ggactatgac ttgaatgcag tgcgcctctg cttccaggtg 540 acagtgcggg acccagcagg caggcccctc ctcctgaccc ctgtcctctc acatccgatt 600 tttgataacc gggcccccaa cactgccgag ctcaagatct gccgagtaaa ccggaactct 660 gggagctgcc tcggtgggga tgagatcttc ttgctgtgcg acaaggtgca gaaagaagac 720 attgaggtgt atttcacggg accaggctgg gaggcacgag gctccttttc tcaagctgat 780 gtgcatcggc aagtggccat tgtgttccgg actcctccgt acgccgaccc cagcctccag 840 gctcctgttc gagtctccat gcagctacgg cggccttctg atcgcgagct cagtgagccc 900 atggagttcc agtacttgcc agacacagat gatcgccacc ggattgaaga gaagcgcaaa 960 aggacctatg agaccttcaa gagtatcatg aagaagagtc ctttcaatgg accaactgaa 1020 ccccggcctc caacccggcg tattgctgtg cctacccgaa actcaacttc tgtccccaag 1080 ccagccccgc agccctacac cttcccagca tccctcagca ccatcaactt tgatgagttt 1140 tcccccatgc tgttaccatc agggcagatc tcaaaccagg ccctggcctt agcaccgtcc 1200 tctgccccag tccttgccca gaccatggtc ccttcctcag ccatggtacc tctggctcag 1260 cccccagctc ctgccccagt tctaaccccg ggtcctcccc agtccctgtc tgcacctgtt 1320 ccaaagagca cccaggctgg ggaaggcacg ctgtcggaag ccctgctgca cctgcagttt 1380 gatgctgatg aagacttggg ggccttgctt ggcaacagca cagacccagg agtgttcaca 1440 gacctggcat ctgtggacaa ctcagagttt cagcagctcc tgaaccaggg tgtgtccatg 1500 tctcactcca cagctgagcc catgctgatg gagtaccctg aagctataac tcgcctggtg 1560 acagggtccc agaggccccc tgacccagct cccacacccc tggggacctc ggggcttccc 1620 aatggtctct ccggagatga agacttctcc tccattgcgg acatggactt ctctgctctt 1680 ttgagtcaga tcagctcctg ataa 1704 <210> 2 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rel-A <400> 2 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Asp Asp Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ser Glu Pro Ala Gln 20 25 30 Ala Ser Gly Pro Tyr Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly 35 40 45 Met Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro 50 55 60 Gly Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr Ile Lys Ile 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys 85 90 95 Asp Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys 100 105 110 Arg Asp Gly Tyr Tyr Glu Ala Asp Leu Cys Pro Asp Arg Ser Ile His 115 120 125 Ser Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln 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cccagatgat agtcttacaa tccttacaca aataccaacc ccgactgcat 1020 attgttgaag ttacagagga tggcgtggag gacttgaatg agccctcaaa gacccagact 1080 tttaccttct cagaaacgca attcattgca gtgactgcct accaaaacac cgatattact 1140 caactaaaga ttgatcataa cccctttgca aaaggcttca gagacaacta tgattcatcc 1200 catcagattg tccctggagg tcggtacggc gttcaatcct tcttcccgga gccctttgtc 1260 aacactttac ctcaagcccg ctattataat ggcgagagaa ccgtgccaca gaccaacggc 1320 ctcctttcac cccaacagag cgaagaggtg gccaaccctc cccagcggtg gcttgtcacg 1380 cctgtccagc aacctgggac caacaaacta gacatcagtt cctatgaatc tgaatatact 1440 tctagcacat tgctcccata tggcattaaa tccttgcccc ttcagacatc ccatgccctg 1500 gggtattacc cagacccaac ctttcctgca atggcagggt ggggaggtcg aggttcttac 1560 cagaggaaga tggcagctgg actaccatgg acctccagaa caagccccac tgtgttctct 1620 gaagatcagc tctccaagga gaaagtgaaa gaggaaattg gctcttcttg gatagagaca 1680 cccccttcca tcaaatctct agattccaat gattcaggag tatacaccag tgcttgtaag 1740 cgaaggcggc tgtctcctag caactccagt aatgaaaatt caccctccat aaagtgtgag 1800 gacattaatg 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Leu Tyr Gly Pro Tyr Pro Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ser Cys Gly 180 185 190 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Pro Gly Ser Gly Phe Arg Ala His Val 195 200 205 Tyr Leu Cys Asn Arg Pro Leu Trp Leu Lys Phe His Arg His Gln Thr 210 215 220 Glu Met Ile Ile Thr Lys Gln Gly Arg Arg Met Phe Pro Phe Leu Ser 225 230 235 240 Phe Asn Ile Asn Gly Leu Asn Pro Thr Ala His Tyr Asn Val Phe Val 245 250 255 Glu Val Val Leu Ala Asp Pro Asn His Trp Arg Phe Gln Gly Gly Lys 260 265 270 Trp Val Thr Cys Gly Lys Ala Asp Asn Asn Met Gln Gly Asn Lys Met 275 280 285 Tyr Val His Pro Glu Ser Pro Asn Thr Gly Ser His Trp Met Arg Gln 290 295 300 Glu Ile Ser Phe Gly Lys Leu Lys Leu Thr Asn Asn Lys Gly Ala Asn 305 310 315 320 Asn Asn Asn Thr Gln Met Ile Val Leu Gln Ser Leu His Lys Tyr Gln 325 330 335 Pro Arg Leu His Ile Val Glu Val Thr Glu Asp Gly Val Glu Asp Leu 340 345 350 Asn Glu Pro Ser Lys Thr Gln Thr Phe Thr Phe Ser Glu Thr Gln Phe 355 360 365 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Thr Asp Ile Thr Gln Leu Lys Ile 370 375 380 Asp His Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg Asp Asn Tyr Asp Ser Ser 385 390 395 400 His Gln Ile Val Pro Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gln Ser Phe Phe Pro 405 410 415 Glu Pro Phe Val Asn Thr Leu Pro Gln Ala Arg Tyr Tyr Asn Gly Glu 420 425 430 Arg Thr Val Pro Gln Thr Asn Gly Leu Leu Ser Pro Gln Gln Ser Glu 435 440 445 Glu Val Ala Asn Pro Pro Gln Arg Trp Leu Val Thr Pro Val Gln Gln 450 455 460 Pro Gly Thr Asn Lys Leu Asp Ile Ser Ser Tyr Glu Ser Glu Tyr Thr 465 470 475 480 Ser Ser Thr Leu Leu Pro Tyr Gly Ile Lys Ser Leu Pro Leu Gln Thr 485 490 495 Ser His Ala Leu Gly Tyr Tyr Pro Asp Pro Thr Phe Pro Ala Met Ala 500 505 510 Gly Trp Gly Gly Arg Gly Ser Tyr Gln Arg Lys Met Ala Ala Gly Leu 515 520 525 Pro Trp Thr Ser Arg Thr Ser Pro Thr Val Phe Ser Glu Asp Gln Leu 530 535 540 Ser Lys Glu Lys Val Lys Glu Glu Ile Gly Ser Ser Trp Ile Glu Thr 545 550 555 560 Pro Pro Ser Ile Lys Ser Leu Asp Ser Asn Asp Ser Gly Val Tyr Thr 565 570 575 Ser Ala Cys Lys Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser Asn Ser Ser Asn Glu 580 585 590 Asn Ser Pro Ser Ile Lys Cys Glu Asp Ile Asn Ala Glu Glu Tyr Ser 595 600 605 Lys Asp Thr Ser Lys Gly Met Gly Gly Tyr Tyr Ala Phe Tyr Thr Thr 610 615 620 Pro 625 <210> 7 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT3L <400> 7 atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctacggtc 60 ctcgcccctg cgtggtcgcc caactcgtca ctgctgttgc tccttctgtt gttgtcaccc 120 tgtttgcgag ggacaccgga ctgttatttc agccatagcc ccatctcgtc caacttcaaa 180 gtaaagtttc gggaactcac tgaccacctt ctcaaagatt accccgtcac agtggcggtg 240 aatcttcaag acgaaaagca ctgtaaggcc ctctggagcc tgtttctggc acagagatgg 300 atcgagcaac ttaaaacggt cgcgggttca aagatgcaga ccctcttgga agatgtgaat 360 acagagattc actttgtcac gtcatgcacc tttcagcctc tgcccgaatg cctcagattc 420 gtacaaacta atatctccca tctcctcaag gacacatgca cccagttgct cgcgttgaag 480 ccgtgcatcg ggaaagcatg tcagaacttc tcccgctgcc ttgaggtaca gtgccagccc 540 gattcctcga cgcttcttcc cccgagatcg cctattgcct tggaggccac ggagctgccc 600 gaacctcgac cgcgccagtt gctgctcctc ctgttgctct tgcttccgct tacactcgtg 660 ctgctggctg cagcgtgggg attgaggtgg cagagggcta ggcggagagg cgagctgcat 720 ccgggagtgc cattgccgtc gcacccatga taa 753 <210> 8 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT3L <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys 35 40 45 Tyr Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg 50 55 60 Glu Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val 65 70 75 80 Asn Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu 85 90 95 Ala Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met 100 105 110 Gln Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser 115 120 125 Cys Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn 130 135 140 Ile Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys 145 150 155 160 Pro Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val 165 170 175 Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile 180 185 190 Ala Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu 195 200 205 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala 210 215 220 Ala Trp Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His 225 230 235 240 Pro Gly Val Pro Leu Pro Ser His Pro 245 <210> 9 <211> 803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TWEAK <400> 9 atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctgccgca 60 agacggagtc agcgaagacg gggaagaagg ggagaacctg gcaccgcact gctggcacct 120 ctggtcctga gcctgggact ggctctggca tgcctggggc tgctgctggt ggtcgtgtct 180 ctgggcagtt gggcaactct gtcagcccag gagccaagcc aggaggaact gaccgccgaa 240 gacaggagag agccccctga actgaaccct cagaccgagg aatcccagga tgtcgtgcca 300 ttcctggagc agctggtccg accacggcgc tctgccccaa agggacgaaa agctcgaccc 360 cgaagggcaa tcgccgctca ctacgaggtg catccacgac caggacagga cggagcacag 420 gctggagtcg atggcaccgt gagcggatgg gaggaaacaa agattaacag ctcctctcct 480 ctgagatatg acagacagat cggcgagttc acagtgatta gagcaggact gtactatctg 540 tactgtcagg tccactttga cgaaggaaag gccgtgtacc tgaaactggt ctgctggtca 600 atggggtgct ggccctgcga tgcctggagg agttcagcgc cacagcagcc agttcacctg 660 gaccacagct gcgactgtgc caggtgtctg gactgctgcc actgcgacct gggagctccc 720 tgagaatccg gactctgccc tgggctcatc tgaaggctgc tccatttctg acatactttg 780 ggctgttcca ggtccactaa tga 803 <210> 10 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TWEAK <400> 10 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu 20 25 30 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Ala Pro Leu Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala 35 40 45 Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ser Leu Gly Ser Trp 50 55 60 Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ser Gln Glu Glu Leu Thr Ala Glu 65 70 75 80 Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln 85 90 95 Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala 100 105 110 Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr 115 120 125 Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp 130 135 140 Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr Lys Ile Asn Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Ile Gly Glu Phe Thr Val Ile Arg Ala Gly 165 170 175 Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val 180 185 190 Tyr Leu Lys Leu Val Cys Trp Ser Met Gly Cys Trp Pro Cys Asp Ala 195 200 205 Trp Arg Ser Ser Ala Pro Gln Gln Pro Val His Leu Asp His Ser Cys 210 215 220 Asp Cys Ala Arg Cys Leu Asp Cys Cys His Cys Asp Leu Gly Ala Pro 225 230 235 240 <210> 11 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GITRL <400> 11 atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctgaagaa 60 atgcccctga gagaatcaag tccccagaga gctgagaggt gtaagaagtc ctggctgctg 120 tgcatcgtcg ccctgctgct gatgctgctg tgcagtctgg gaactctgat ctacacctca 180 ctgaaaccta cagccattga gagctgtatg gtgaagttcg aactgagctc ctctaaatgg 240 cacatgacta gtcccaagcc tcattgcgtg aacaccacat ccgacgggaa gctgaaaatc 300 ctgcagtctg ggacctacct gatctatggc caggtcatcc cagtcgacaa gaaatacatc 360 aaggataatg cccccttcgt ggtccagatc tacaagaaaa acgacgtgct gcagacactg 420 atgaatgatt ttcagatcct gcccattggc ggagtctacg agctgcacgc tggcgacaac 480 atctatctga agtttaattc caaggatcat attcagaaaa caaacaccta ttgggggatt 540 atcctgatgc cagacctgcc cttcattagc taatga 576 <210> 12 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GITRL <400> 12 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Glu Glu Met Pro Leu Arg Glu Ser Ser Pro Gln Arg Ala Glu 20 25 30 Arg Cys Lys Lys Ser Trp Leu Leu Cys Ile Val Ala Leu Leu Leu Met 35 40 45 Leu Leu Cys Ser Leu Gly Thr Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Lys Pro Thr 50 55 60 Ala Ile Glu Ser Cys Met Val Lys Phe Glu Leu Ser Ser Ser Lys Trp 65 70 75 80 His Met Thr Ser Pro Lys Pro His Cys Val Asn Thr Thr Ser Asp Gly 85 90 95 Lys Leu Lys Ile Leu Gln Ser Gly Thr Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val 100 105 110 Ile Pro Val Asp Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Asn Ala Pro Phe Val Val 115 120 125 Gln Ile Tyr Lys Lys Asn Asp Val Leu Gln Thr Leu Met Asn Asp Phe 130 135 140 Gln Ile Leu Pro Ile Gly Gly Val Tyr Glu Leu His Ala Gly Asp Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Leu Lys Phe Asn Ser Lys Asp His Ile Gln Lys Thr Asn Thr 165 170 175 Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Met Pro Asp Leu Pro Phe Ile Ser 180 185 190 <210> 13 <211> 1209 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STING <400> 13 ggatccgcca ccatggactg gacctggatt ctgttcctgg tcgccgctgc cacccgcgtg 60 cattcacctt actcaaacct gcaccctgcc attccccgac ccagaggaca ccggtcaaag 120 tacgtggctc tgatcttcct ggtcgcaagc ctgatgattc tgtgggtggc taaggaccct 180 cccaaccata ccctgaaata tctggctctg cacctggcat cccatgagct ggggctgctg 240 ctgaagaatc tgtgctgtct ggccgaggaa ctgtgccacg tgcagagtag gtaccaggga 300 tcatattgga aagcagtcag agcctgcctg gggtgtccta tccattgtat ggcaatgatt 360 ctgctgagct cctacttcta ttttctgcag aacaccgccg atatctacct gtcctggatg 420 ttcggcctgc tggtgctgta taagtctctg agtatgctgc tgggactgca gagcctgaca 480 cctgccgagg tgtccgctgt ctgcgaggaa aagaaactga acgtggcaca cggactggcc 540 tggtcttact atatcgggta cctgcggctg attctgccag gcctgcaggc tcggattcgc 600 atgtttaatc agctgcataa caatatgctg tccggcgcag gatctaggag actgtatatc 660 ctgttcccac tggactgcgg ggtgcccgat aacctgtctg tggtcgaccc taatattagg 720 ttcagggata tgctgccaca gcagaacatc gaccgagccg gcattaagaa ccgcgtgtac 780 tcaaatagcg tctatgagat cctggaaaat gggcagcccg caggcgtgtg cattctggag 840 tacgccaccc ctctgcagac actgttcgct atgtctcagg acgccaaggc tggcttcagc 900 agggaggatc gactggaaca ggccaaactg ttctgccgca cactggagga aatcctggag 960 gacgtgccag aaagtcggaa caattgtcgc ctgattgtct accaggagcc cactgatggc 1020 aactcctttt ctctgagtca ggaagtgctg aggcacatca gacaggagga aaaagaggaa 1080 gtcactatga atgcaccaat gaccagcgtg gctccacccc cttcagtcct gagccaggaa 1140 ccacgcctgc tgattagcgg aatggaccag ccactgccac tgcgaactga cctgatttga 1200 taactcgag 1209 <210> 14 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STING <400> 14 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Pro Tyr Ser Asn Leu His Pro Ala Ile Pro Arg Pro Arg Gly 20 25 30 His Arg Ser Lys Tyr Val Ala Leu Ile Phe Leu Val Ala Ser Leu Met 35 40 45 Ile Leu Trp Val Ala Lys Asp Pro Pro Asn His Thr Leu Lys Tyr Leu 50 55 60 Ala Leu His Leu Ala Ser His Glu Leu Gly Leu Leu Leu Lys Asn Leu 65 70 75 80 Cys Cys Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val Gln Ser Arg Tyr Gln Gly 85 90 95 Ser Tyr Trp Lys Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile His Cys 100 105 110 Met Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Phe Leu Gln Asn Thr 115 120 125 Ala Asp Ile Tyr Leu Ser Trp Met Phe Gly Leu Leu Val Leu Tyr Lys 130 135 140 Ser Leu Ser Met Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Thr Pro Ala Glu Val 145 150 155 160 Ser Ala Val Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala 165 170 175 Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln 180 185 190 Ala Arg Ile Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly 195 200 205 Ala Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val 210 215 220 Pro Asp Asn Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met 225 230 235 240 Leu Pro Gln Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr 245 250 255 Ser Asn Ser Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val 260 265 270 Cys Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 275 280 285 Gln Asp Ala Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 290 295 300 Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu 305 310 315 320 Ser Arg Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly 325 330 335 Asn Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu 340 345 350 Glu Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro 355 360 365 Pro Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met 370 375 380 Asp Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile 385 390 395

Claims (23)

  1. 백신으로서, 상기 백신은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 항원 및 하나 또는 그 이상의 보조제를 포함하는, 백신:
    Rel-A, T-bet, Eomes, FLT3L, TWEAK, GITRL 및 STING.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 보조제는 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 5, 서열 식별 번호: 7, 서열 식별 번호: 9, 서열 식별 번호: 11, 서열 식별 번호: 13에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 조합에 의하여 인코딩되는, 백신.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 보조제는 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 6, 서열 식별 번호: 8, 서열 식별 번호: 10, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이들의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 백신.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항원은 제1 핵산에 의해 인코딩되고, 상기 보조제는 제2 핵산에 의해 인코딩되는, 백신.
  5. 제4항에 있어서, 청구항 4의 상기 항원과 동일하게 인코딩된 핵산 서열을 갖는 항원 펩티드 및 청구항 4의 상기 보조제와 동일하게 인코딩된 핵산 서열을 갖는 보조제 펩티드를 추가로 포함하는, 백신.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항원은 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 항원, HIV 항원, 인플루엔자 항원, 열대열원충 항원 및 이들의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 백신.
  7. 제6항에 있어서, 상기 HIV 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 백신.
  8. 제6항에 있어서, 상기 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, BHA 항원 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 백신.
  9. 제6항에 있어서, 상기 열대열원충 항원은 포자소체 (CS) 항원을 포함하는, 백신.
  10. 제6항에 있어서, 상기 HPV 항원은 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 백신.
  11. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 추가로 포함하는, 백신.
  12. 제4항에 있어서, 상기 제2 핵산은 발현 벡터를 추가로 포함하는, 백신.
  13. 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1, 2 또는 3 중 어느 하나의 백신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 백신을 투여하는 단계는 근육 내 투여 및 피내 투여 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 백신을 투여하는 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 대상체에서 약 50% 내지 약 150%로 증가되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 대상체에서 약 90% 내지 약 130%로 증가되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 대상체에서 약 105%로 증가되는, 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 대상체에서 적어도 약 2.5배로 증가되는, 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 대상체에서 적어도 약 1.5배로 증가되는, 방법.
  21. 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자:
    서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 5, 서열 식별 번호: 7, 서열 식별 번호: 9, 서열 식별 번호: 11, 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 1에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 3에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 5에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 7에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 9에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 11에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 13에 95% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 이들의 조합.
  22. 제21항에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드인, 핵산 분자.
  23. 제21항에 있어서, 상기 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 플라스미드인, 핵산 분자.
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