CN102949733A - 一种复合型治疗性乙肝基因疫苗及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合型治疗性乙肝基因疫苗及其构建方法。该DNA疫苗含有pIRES质粒、T-bet基因和HBV-L基因，T-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒的IRES元件两侧的多克隆位点上，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上，T-bet基因和HBV-L基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和No.2所示，该DNA疫苗可用于预防和治疗乙型病毒性肝炎。
Description
所属技术领域：
本发明涉及一种乙肝疫苗，具体是指一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，同时本发明也涉及这种疫苗的构建方法。
背景技术：
据统计，全球已有20多亿人经历HBV感染。疫苗接种是控制和预防乙型肝炎及其长期严重后遗症最有效的措施。自1997年世界卫生组织(WHO)推荐实施乙肝疫苗计划免疫以来，大范围的疫苗接种有效降低了HBV感染率，然而HBV持续感染者仍超过3.7亿，每年甚至有100多万患者死于急性或慢性HBV感染导致的肝硬化、肝功能衰竭和原发性肝细胞癌。预防和治疗HBV感染迫在眉睫。
目前，治疗乙型肝炎感染者两个难以解决的难题：①肝内HBV长期存在并有不同程度复制，现有的抗病毒药物难以根除HBV；②绝大部分病人对HBV及其抗原呈免疫耐受状态，使肝内HBV免受免疫杀伤，从而有利于病毒在肝内持续存在并复制。
治疗性疫苗与传统意义上的预防性疫苗显著不同。预防性疫苗主要诱导机体产生体液免疫反应，而对病毒性疾病的研究发现，体液免疫并不能彻底清除细胞内感染病毒，只有细胞介导免疫反应，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫反应才能发挥最根本的作用。进一步的研究表明细胞免疫所产生的CTL将在清除被感染细胞的过程中起到十分重要的作用。
DNA疫苗作为20世纪90年代出现的一种新型治疗性疫苗，是一种含抗原基因的表达质粒，能全面地诱导特异性体液和细胞免疫应答。HBV DNA疫苗更是能打破其对HBsAg的免疫耐受，激发特异性CTL反应，有效地清除HBV，中止感染。
Davis HL等研究证实，对小鼠和黑猩猩免疫接种PCMV-S2-S疫苗都能诱导产生抗-HBs、抗pre-S2抗体，还能产生对HBsAg的细胞免疫应答。MasanoriIsogawa等研究表明，用表达HBsAg抗原的质粒DNA直接免疫小鼠，可有效诱导特异性血清抗体产生以及MHC I类限制性CTL应答，且该CTL应答在体内是由CD4+、CD8+效应细胞介导的。
HBV DNA疫苗在注射部位被原位细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节相应靶蛋白的合成。靶蛋白被分解为肽段，肽段表位与β2微球蛋白和主要组织相容性复合体(MHC)I类分子形成三聚体.递呈并激活CD8+T效应细胞；或靶蛋白通过血运和(或)淋巴循环系统汇集于淋巴结或脾脏中，为“专业”抗原递呈细胞(APC)所吞噬，经与MHC II类分子结合.激活CD4+和Th细胞，Th细胞激活B效应细胞(Be)和B记忆细胞(Bm)，Be将在骨髓中形成生发中心，长期生成特异性抗体，Bm可诱导T记忆细胞(Tm)的产生，而Tm则作为潜在的CTL，保存在循环库中。由于DNA疫苗表达的蛋白质可作为内源性抗原被递呈，故具有传统疫苗所不具备的优势，即能够有效地诱导机体CTL的细胞免疫应答。
研究表明，DNA疫苗诱生的CTL可识别和溶解体内感染HBV的细胞，特别是此种CTL可分泌IFN-γ，并可抑制感染细胞内的病毒复制或清除病毒而不引发细胞损伤。此外.HBV DNA疫苗因可启动有效的抗原提呈途径.促进机体合成内源性抗原，提呈相关表位。大量产生CD8+CTL细胞，所以这类疫苗也可以作为治疗慢性乙型肝炎患者的候选物。
T-bet，也称Tbx21，系2000年哈佛大学Szabo等发现的一种重要的Th1细胞转录因子，为T-box家族的新成员，是IFN-γ基因强有力的转录激活剂，又能诱导并保持IL-12Rβ2的表达，且能将分化中的效应性Th2和已完全分化的Th2逆转为Th1，伴随产生大量的IFN-γ，并抑制IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的产生，从而影响机体的免疫应答。
发明内容：
本发明的目的是提供一种可在pIRES中共表达乙肝表面抗原大蛋白HBV-L和免疫佐剂T-bet蛋白的基因疫苗及其构建方法。
本发明采用的技术方案为：一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，含有pIRES质粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中T-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件的两侧；其中，pIRES为商业性的质粒，含有多克隆位点A(MCSA)，多克隆位点B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分别位于IRES元件的两侧，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上。
所述复合型治疗性乙肝基因疫苗构建方法包括以下步骤：
(1)RT-PCR法克隆人T-bet基因，人T-bet基因与pMD18-T Simple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/T-bet，然后用Nhe I、EcoR I从pMD18-T/T-bet载体上切下T-bet目的片段基因，与载体pIRES连接构建pIRES/T-bet。
(2)以pCDNA3.1(-)/HBV-L为模板PCR扩增出HBV-L基因，HBV-L基因与pMD18-T Simple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/HBV-L，然后用Sal I、Not I从pMD18-T/HBV-L载体上切下HBV-L基因片段，与构建完成的pIRES/T-bet连接，得到复合型治疗性乙肝基因疫苗。
本发明与现有的技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)采用pIRES双顺反子真核表达载体，两段基因各自表达，不影响彼此空间结构。
(2)首次采用转录因子T-bet作为免疫佐剂，T-bet是Th1细胞特异性的转录因子，促使Th0细胞向Th1细胞分化，并且能逆转Th2细胞向Th1细胞转化，所产生的Th1型免疫应答，能更好的清除胞内病毒。
(3)采用HBV-L作为抗原基因，由于乙肝病毒表面抗原基因的易突变性，采用传统的乙肝疫苗即乙肝表面抗原小蛋白进行免疫时，部分人群不能产生保护性的抗体。由于pres1抗原、pres2抗原在HBV与肝细胞相应受体的粘附中起重要作用，但是包含pres1抗原、pres2抗原的乙肝表面抗原大蛋白免疫机体时，就可以产生针对pres1抗原、pres2抗原的特性抗体，这些抗体具有良好的中和病毒的作用，并且乙肝表面抗原大蛋白相比乙肝表面抗原小蛋白，具有更多抗原表位，降低了免疫后不产生保护性抗体的几率。
以下将结合附图和实施详例说明本发明，应当说明的是，实施例是对本发明的技术方案的进一步说明，但并不表明本发明仅限于这些实施例。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1复合型治疗性乙肝基因疫苗pIRES-T-L构建流程图
图2T-bet、HBV-L基因扩增产物电泳图
图3亚克隆载体pMD18-T/T-bet、pMD18-T/HBV-L限制性酶谱分析
图4复合型治疗性乙肝基因疫苗限制性酶谱分析
具体实施方式：
1.PCR引物设计与合成
设计2对引物，分别作为扩增T-bet、HBV-L的引物序列，引物序列和酶切位点见表1。扩增的T-bet、HBV-L基因片段大小分别为1608bp，1203bp。引物均由invitrogen公司合成。
目的基因扩增引物序列
2.目的基因的PCR扩增
2.1RT-PCR法克隆人T-bet基因
2.1.1人外周血淋巴细胞总RNA提取
(1)用采血管取健康人抗凝血5ml，3000rpm离心5min，吸出血清。
(2)取一15ml离心管加入2ml Ficoll。
(3)在采血管中加1ml PBS重悬细胞，45度贴壁加入装有Ficoll的离心管中，3000rpm离心15min分层。
(4)另取一15ml离心管加入5mlPBS，取雾层到PBS中，3000rpm离心5min，弃上清。
(5)细胞加1ml Trizol室温裂解5min。
(6)加0.2ml氯仿，盖紧EP管上下颠倒混匀15s，室温静置2～3min。
(7)4℃，12000g离心15min。
(8)EP管内分三层，取上层液相于EP管内。
(9)加0.5ml异丙醇，室温静置10min。
(10)4℃，12000g离心10min。
(11)弃上清，加1ml 75％乙醇清洗沉淀。
(12)4℃，7500g离心5min。
(13)去上清，干燥RNA，DEPC水溶解。
2.1.2通过逆转录反应获取cDNA
(1)在0.2ml PCR管内加入下列组分后充分混匀：
(2)65℃孵育样品5min。
(3)孵育结束后立即将样品置于冰上，冷却2min。
(4)在上述PCR管中依次加入下列成分后，充分混匀：
(5)42℃扩增60min。
(6)70℃，5min将逆转录酶灭活。
2.1.3PCR扩增人T-bet基因
(1)在0.2mlPCR管中加入下列组分后，充分混匀：
(2)循环参数：94℃预变性4min 30sec，94℃ 45sec，51℃ 30sec，72℃ 2min，共35个循环，72℃再延伸10min。
2.1.4PCR产物的切胶回收
(1)将电泳槽、制胶模具、梳子全部用自来水洗净，超纯水冲洗，之后用吹风机吹干，将梳子插到模具上。
(2)称取0.5g琼脂糖到50ml1×TAE缓冲液中，煮沸后冷却到60℃左右，加入2.5μlEB，沿着制胶模具边缘将胶液缓慢的倒入制胶模具中。
(3)待胶冷凝约30min后，轻轻拔出梳子，将胶放入电泳槽中，向电泳槽中倒入1×TAE缓冲液至高出胶面1～2mm。
(4)加样，PCR产物每孔加50μl，marker加5μl。
(5)110V恒压电泳30min。
(6)取1.5mlEP管并称重。
(7)用新的盖玻片，将目的片段切下，放入1.5ml EP管中，标记并称重。
(8)按胶重1mg＝1ml计算，加入XP2溶液，放入55℃-60℃水浴中加热，期间混匀2-3次。
(9)胶溶期间，活化柱子，加200μl GPS，室温静置3-5min，12000g离心2min，弃管中液体，加入700μl的灭菌水至柱子中，12000g离心2min，备用。
(10)将溶化后的液体倒入柱子中，10000g离心1min。
(11)弃管中液体，加入300μl XP2，10000g离心1min。
(12)加入700μl SPW Wash Buffer，10000g离心1min。
(13)重复步骤12。
(14)弃液体，17000g离心2min。
(15)将柱子置于干净的1.5ml EP管中，加入30μl dd H2O到膜中央，37℃孵育10min，13000g离心2min。
2.2PCR扩增HBV-L基因
(1)在0.2mlPCR管中加入下列组分后，充分混匀：
(2)循环参数：94℃预变性4min 30sec，94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 1min，共30个循环，72℃再延伸10min。
(3)按上述步骤进行切胶回收。
(4)将切胶回收的T-bet和HBV-L产物各取1μl，在1.0％的琼脂糖胶上进行电泳，凝胶成像系统下观察结果并拍照，结果见图2。
3.人T-bet基因与
18-T Simple Vector的连接反应
在0.2mlPCR管中加入下列组分后，充分混匀：
16℃连接过夜，连接产物用于转化。
4.转化
4.1感受态DH5a菌的制备
(1)从新鲜平皿培养基挑取单个菌落接种于5ml LB中，37℃培养过夜。
(2)过夜培养的菌液1∶100转接于5ml LB中，37℃，200rpm培养至OD＝0.3～0.4。
(3)将上述OD＝0.3～0.4的菌液以及新鲜LB、TSS液在冰中遇冷5～10min。
(4)取1m菌液到灭菌EP管中，4℃，1500g离心5min去上清。
(5)吸净上清液，加入50μl预冷的新鲜LB，轻轻重悬。
(6)加入50μl 2×TSS液，快速轻柔混匀，勿吹打，冰上放置30min，再转化或直接冻于-80℃。
4.2连接产物转化感受态DH5a菌
(1)取10μl连接产物加入到已经制备好的100μl感受态DH5a菌中，轻轻混匀，冰上放置30min。
(2)42℃热击2min，勿晃动。
(3)立即取出，冰上放置10min，加入900μl LB培养基，37℃轻摇1h。
(4)在此期间，用40μl 0.1mol/L的IPTG，4μl 5mg/ml的X-Gal铺氨苄青霉素平板。
(5)取100μl转化产物涂于氨苄青霉素平板上，待液体吸收后，37℃培养过夜。
(6)随机挑取白色菌落10个，接种于5ml氨苄青霉素LB培养基，37℃160rpm振摇过夜。
(7)取1μl菌液用于菌液PCR，菌液PCR的体系及循环参数同上述T-bet的扩增，菌液PCR阳性的用于抽提质粒。
5.抽提质粒
(1)取菌液1.5ml到1.5ml EP管中，10000g离心1min，去上清。
(2)重复步骤(1)，其间活化柱子，同胶回收。
(3)加入250μl solution I含RNase A，反复吹打，混匀。
(4)加入250μl SolutionII，轻轻上下颠倒混匀，至溶液变澄清。
(5)加入350μl SolutionIII，轻轻上下颠倒混匀，可见有白色絮状沉淀，17000g离心10min。
(6)将上清液转移至柱子中，切勿混入白色沉淀，10000g离心1min。
(7)弃收集管中液体，加入500μl HB，10000g离心1min。
(8)加入700μl DNA wash Buffer，10000g离心1min。
(9)重复上面步骤。
(10)弃液体，17000g空转2min。
(11)将柱子放入新的1.5mlEP管中，加入40μl dd H2O，37℃孵育10min，13000g离心2min。
6.双酶切鉴定
在0.2ml PCR管中加入下列组分后，充分混匀：
37℃条件下，酶切3h，取上述10μl酶切产物在1.0％的琼脂糖胶上进行电泳，凝胶成像系统下观察结果并拍照结果见图3，酶切结果正确的质粒命名为pMD 18-T/T-bet。
7.HBV-L基因与pMD18-T Simple Vector的连接，转化，质粒抽提，酶切鉴定都同人T-bet基因，酶切结果正确的质粒命名为pMD18-T/HBV-L。
8.人T-bet基因与双顺反子真核表达载体pIRES的连接
(1)将已构建完成的质粒pMD18-T/T-bet与载体pIRES分别用Nhe I、EcoR I双酶切，酶切体系参照上述酶切鉴定时的体系，酶切之后切胶回收目的片段用于连接，在10μl的总连接体系里，加入0.03pmol的载体，按照3～10倍于载体的摩尔比加入目的片段进行连接，16℃反应过夜，连接产物用于转化。
(2)连接产物转化感受态DH5a菌。
(3)随机挑取单克隆菌落10个，接种于5ml氨苄青霉素LB培养基，37℃160rpm振摇过夜。
(4)取过夜培养的菌液做PCR鉴定。
(5)菌液PCR阳性的用于抽提质粒。
(6)Nhe I、EcoR I双酶切鉴定质粒，酶切鉴定正确的质粒命名为pIRES/T-bet。
9.HBV-L基因与pIRES/T-bet的连接
(1)将已构建完成的质粒pMD18-T/HBV-L与质粒pIRES/T-bet分别用Sal I、Not I双酶切，酶切体系参照上述酶切鉴定时的体系，酶切之后切胶回收目的片段用于连接，在10μl的总连接体系里，加入0.03pmol的载体，按照3～10倍于载体的摩尔比加入目的片段进行连接，16℃反应过夜，连接产物用于转化。
(2)连接产物转化感受态DH5a菌。
(3)随机挑取单克隆菌落10个，接种于5ml氨苄青霉素LB培养基，37℃160rpm振摇过夜。
(4)取过夜培养的菌液做PCR鉴定。
(5)菌液PCR阳性的用于抽提质粒。
(6)Not I、Sal I双酶切鉴定质粒，酶切鉴定正确的质粒命名为pIRES-T-L，酶切鉴定结果见图4。
Claims (6)
1.一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，其特征在于含有pIRES质粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中T-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件的两侧；其中，pIRES为商业性的质粒，含有多克隆位点A(MCSA)，多克隆位点B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分别位于IRES元件的两侧，
T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上；
所述T-bet基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述HBV-L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述复合型治疗性乙肝基因疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)RT-PCR法克隆人T-bet基因，人T-bet基因与pMD18-T Simple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/T-bet，然后用Nhe I、EcoR I从pMD18-T/T-bet载体上切下T-bet目的片段基因，与载体pIRES连接构建pIRES/T-bet。
(2)以pCDNA3.1(-)/HBV-L为模板PCR扩增出HBV-L基因，HBV-L基因与pMD 18-T Simple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/HBV-L，然后用Sal I、Not I从pMD18-T/HBV-L载体上切下HBV-L基因片段，与构建完成的pIRES/T-bet连接，得到复合型治疗性乙肝基因疫苗。
3.权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取健康人外周血单个核细胞的RNA通过逆转录合成cDNA；将得到的cDNA为模板，通过引物P1和P2进行PCR扩增，得到长度为1608bp的T-bet片段；
所述的引物P1：5’-ATA
ATGGGCATCGTGGAGC-3’；
所述的引物P2：5’-CCGCCGT
TCAGTTGGGA AAATAG-3’；
斜体下划线所述的GCTAGC为Nhe I酶切位点；
斜体下划线所述的GAATTC为EcoR I酶切位点；
(2)以质粒pCDNA3.1(-)/HBV-L(北京地坛医院成军教授惠赠)为模板，通过引物P3和P4进行PCR扩增，得到长度为1203bp的HBV-L基因片段；
所述的引物P3：5’-GC
AGCATGGGAGGTTGGTCTT-3’；
所述的引物P4：5’-TTAAGATGAGCTCGGATTCTCAAATG-3’；
斜体下划线所述的GTCGAC为Sal I酶切位点；
斜体下划线所述的GCGGCCGC为Not I酶切位点。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所诉PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min 30sec，94℃ 45sec，51℃ 30sec，72℃ 2min，共35个循环，72℃再延伸10min；并且向反应体系中加入5％体积的DMSO。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所诉PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min 30sec，94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 1min，共30个循环，72℃再延伸10min。
6.权利要求1所述复合型治疗性乙肝基因疫苗的用途，其特征在于：用于预防和治疗乙型病毒型肝炎或其它病毒性疾病。
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| CN 201110244437 CN102949733A (zh) | 2011-08-24 | 2011-08-24 | 一种复合型治疗性乙肝基因疫苗及其构建方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105101995A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-11-25 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 具有生物分子佐剂的疫苗 |
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2011
- 2011-08-24 CN CN 201110244437 patent/CN102949733A/zh active Pending
Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN105101995A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-11-25 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 具有生物分子佐剂的疫苗 |
| EP2968530A4 (en) * | 2013-03-15 | 2016-04-06 | Univ Pennsylvania | VACCINES COMPRISING BIOMOLECULAR ADJUVANTS |
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