CN105101995A - 具有生物分子佐剂的疫苗 - Google Patents

Abstract

本文中公开了包含抗原和一种或多种生物分子佐剂的疫苗。本文中还公开了用于增强受试者的免疫应答的方法。所述方法可包括向有此需要的受试者施用所述疫苗。

Description

具有生物分子佐剂的疫苗

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/800,328的优先权，其全部内容在此通过引用并入。

政府利益的声明

本发明是在由美国国家卫生研究院授予的合同号5-P30-AI-045008-13下借助政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及包含抗原和一种或多种生物分子佐剂的疫苗以及施用这样的疫苗的方法。

背景

疫苗用于在个体中刺激免疫应答以提供抗特定疾病的保护作用和/或用于特定疾病的治疗。一些疫苗包含诱导免疫应答的抗原。一些抗原引发免疫应答而其它抗原引发弱免疫答应。针对所述抗原的弱免疫应答可通过在疫苗中包括佐剂来增强。佐剂有许多不同的形式，讲和如、铝盐、油、乳剂、细菌和/或病原体的无菌成分。

DNA疫苗诱导的免疫还可通过编码分子佐剂的合成基因的共递送来增强。这些佐剂中的许多佐剂已包括已被证明通过增加免疫应答和/或保护效力的量级或类型来增强疫苗诱导的免疫的细胞因子和趋化因子。通过使用分子佐剂，免疫应答可以是高度可定制的并且可针对抗特定病原体(即，感染因子)或非病原体(即，癌症)抗原的最佳功效而被功能定制。

除了这些分子佐剂以外，还可以以许多不同的方式(例如，注射、口服等)将疫苗施用进许多不同的组织(例如，肌内、皮内等)。并非所有递送方法是等同的并且在个体的群体内需要更大的顺应性，然而其它递送方法可影响疫苗的免疫原性和/或安全性。在本领域中存在对安全和更有效的佐剂(具体地，与特定递送方法组合以提供可定制的和针对抗病原性和非病原性抗原的最佳功效而功能定制的接种的分子佐剂)的开发的需要。

发明概述

本发明涉及包含抗原和选自Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING的一种或多种佐剂的疫苗。疫苗的抗原由第一核酸编码并且佐剂由第二核酸编码。可从表达载体表达疫苗的第一和第二核酸。疫苗的抗原选自人乳头状瘤病毒(HPV)抗原、HIV抗原、流感病毒抗原、恶性疟原虫抗原或其片段。HPV抗原可选自HPV16E6抗原、HPV16E7抗原及其组合。HIV抗原可选自EnvA、EnvB、EnvC、EnvD、BNef-Rev、Gag及其任意组合。流感病毒抗原选自H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原及其组合。恶性疟原虫抗原可包括环子孢子(CS)抗原。疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。

本发明还涉及用于增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用根据权利要求1所述的疫苗，其中施用所述疫苗包括肌内施用和皮内施用的至少一种。还可通过电穿孔施用所述疫苗。所述方法在受试者的皮肤组织和肌肉组织的至少一种组织中增加免疫应答的发生，并且使受试者的免疫应答增强约50％至约150％或90％至130％之间或105％。接种佐剂的方法可使有此需要的受试者的免疫应答增强至少约0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍或4.0倍。

附图简述

图1显示分子佐剂的构建以及表达和确认。(A)对小鼠RelA或T-bet的一级序列进行遗传优化，合成所述一级序列，随后将其亚克隆进经修饰的pVax1表达载体。优化使得必需包含在Kozak序列之后融合于N末端的IgE前导肽(IgE)。图显示用于亚克隆的限制性内切酶、翻译起始位点(前向箭头)、IgE前导肽(IgE；有阴影线的条块)、蛋白质长度(aa)和转基因(黑底白字)；(B)在用pRelA、pTbet或空载体对照(pVax1)转染HEK293T细胞后，利用蛋白质免疫印迹分析来自细胞核提取物的蛋白质表达。蛋白质的相对大小(kDa)通过使用如所指定的蛋白质特异性Ab的检测分析来进行测定；(C)RelA的过表达强效地诱导κB依赖性转录。用NF-κB-依赖性荧光素酶报告基因与编码RelA/p65的表达载体一起瞬时转染HeLa细胞。随后将共转染的细胞生长48小时，如实施例1中所述测定荧光素酶的活性；(D)T-bet的过表达刺激的IFN-γ的产生：用pT-bet或pVax1转染初始CD4T细胞，并用抗-CD3+抗-CD28进行刺激，随后利用如实施例1中描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的IFN-γ产量。IFN-γ水平表达为μg/mL。

图2显示以转录因子为佐剂的抗原特异性DNA疫苗增强T细胞免疫。(A)利用单独的HIV-1pGag或pEnv、与pRelA或pTbet共递送的pGag或pEnv以2周的间隔接种Balb/C小鼠(n＝4/组)3次。其它对照组为单独的pRelA或pTbet或pVax1对照。在第三免疫后1周通过IFN-γELISPOT分析T细胞应答(CD8+和CD4+)，并且在用亚型BHIV-1Env(B)或Gag(C)肽库再刺激后指示IFN-γ+斑点形成细胞(SFC)/106个MACS-纯化的T细胞的结果。以一式三份进行样品，误差条代表SEM，并且显示统计上显著的值；**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001，是指图中提供的指定的接种组之间的比较。独立地进行实验2次，所述实验具有相似的结果。

图3显示在DNA接种+pRelA的共施用后增强的T细胞增殖潜能。在利用单独的pEnv或pGag、具有pRelA分子佐剂的pEnv或pGag或单独的空载体对照pVax1的第三次接种后7天测量增殖反应。以不同的浓度：0.5(白色条块)、1.0(浅灰色条块)和5.0(深灰色条块)用重组HIV-1Env(A)或Gag(B)和随后以氚化的(3H)-胸苷进行脉冲孵育脾细胞24小时。掺入的胸苷表达为通过将Ag-刺激的孔的平均cpm(每分钟计数)除以非刺激的孔的平均cpm计算的刺激指数(SI)。展示了每一个浓度的Env(A，右图框)或Gag(B，右图框)的以pRelA为佐剂的小鼠的SI的倍数增加。以一式三份测试样品。误差条代表SEM，提供了图中显示的指定组的比较的统计上显著的值。****p<0.0001。

图4显示对于pEnv接种和共施用的转录分子佐剂的增强的B细胞应答。在利用单独的pEnv、与pRelA或pTbet组合的pEnv、单独的每一种分子佐剂或利用空载体对照质粒(pVax1)的第三免疫后7天在接种的小鼠(n＝4/组)的血清中评估B细胞/抗体应答。抗-Envp120抗体-结合滴度通过ELISA来测定。数据表示为平均终点滴度。指示了统计上显著的值；***p<0.001(单独的pEnv与pEnv+pRelA或pEnv+pT-bet之间的比较)和****p<0.0001(单独的pRelA与pEnv+pRelA或单独的pT-bet与pEnv+pT-bet之间的比较)。

图5显示分子佐剂在免疫的部位诱导增加的B细胞的群体。通过流式细胞术分析来自肌肉的细胞培养物的B220的表达。将分离的细胞在培养基中孵育3天，随后针对DC亚组(CD11c+/CD11b+)、B细胞(B220+)、T细胞(CD4+和CD8+亚组)对这些细胞进行染色，以分别区分单核细胞/树突状细胞、B细胞和T细胞。此类差异染色允许从随后的B220表达的分析排除树突状细胞和T细胞。柱状图显示仅使用特异性mAb以及作为对照的同种型匹配的无关mAb的B细胞上的B220+表达。在图框中还指示了用作对照(有阴影线的区域)的同种型匹配的无关Ab的特征谱。MFI＝与表达B220的B细胞的水平成比例的平均荧光强度。

图6显示转染的细胞的RelA蛋白的免疫染色。

图7显示将白细胞介素-2(IL-2)浓度针对抗原绘图的图表。

图8显示(A、B)以RelA为佐剂的小鼠的总的IgG产量；和(C、D)以T-bet为佐剂的小鼠的总的IgG产量。

图9显示将处理组针对相对表达(以百分比表示)绘图的图表。

图10显示举例说明免疫方案的示意图。

图11显示将处理组相对干扰素-γ(IFN-γ)斑点形成集落(SFC)/10⁶个脾细胞绘图的图表。

图12显示将处理组相对干扰素-γ(IFN-γ)斑点形成集落(SFC)/10⁶个脾细胞绘图的图表。

图13是将滴度倒数相对OD450nm绘图的图表。

图14显示(A)编码Eomes的质粒的示意图；和(B)蛋白质印迹的图像。

图15显示举例说明免疫方案的示意图。

图16显示将处理组相对干扰素-γ(IFN-γ)斑点形成集落(SFC)/10⁶个脾细胞绘图的图表。

图17显示蛋白质印迹。

图18显示举例说明免疫方案的示意图。

图19显示将肽库相对干扰素-γ(IFN-γ)斑点形成集落(SFC)/10⁶个脾细胞绘图的图表。

详细描述

本发明涉及可用于通过使用分子佐剂增强受试者的针对所述抗原的免疫应答的疫苗。所述分子佐剂可以是转录因子、共刺激分子、趋化因子或细胞因子。所述分子佐剂可以是Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL、STING或其组合。

在一些情况下，Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL或STING可用作通用佐剂，因为无论抗原的来源或施用的途径如何，相较于包含单独的抗原的疫苗，在受试者中引发更大的的免疫应答。Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL或STING还可增强对病毒和寄生虫抗原例如分别地人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原和恶性疟原虫抗原的免疫应答。在一些情况下，Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING还可在肌肉和皮肤组织中增强免疫应答，如通过增加的干扰素-γ(IFN-γ)产量证明的。

本发明的疫苗还可出乎意料地修饰或改变表位呈递以增强针对所述抗原的免疫应答。此类修饰可依赖于Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING。在一些情况下，Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING可指导免疫系统识别除了在Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING不存在的情况下被免疫系统识别的表位以外的抗原中的新表位。在其它情况下，Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING可重新划分免疫系统的表位识别景观以跨组织地并且与抗原的本体或来源无关地增强针对所述抗原的免疫应答。

1.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下文中描述了优选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。

如本文中所用，术语“包含/包括”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数参考物。本公开还涵盖“包含/包括”本文中提出的实施方案或组件、“由所述实施方案或组件组成”和“基本上由所述实施方案或组件组成”的其它实施方案，无论是否明确地显示。

如本文中所用的“佐剂”意指添加至本文中描述的疫苗以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。

如本文中所用，“互补”或“互补的”可意指可核酸，意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电-透化”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。

如本文中所用，“片段”或“免疫原性片段”意指编码能够引发和/或增强哺乳动物的免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的不同核苷酸序列的至少一个的DNA片段。片段可包含下文中所示的核酸序列的一个或多个的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，片段可包含下文所示的核酸序列的至少一个的至少20个核苷酸或更多个、至少30个核苷酸或更多个、至少40个核苷酸或更多个、至少50个核苷酸或更多个、至少60个核苷酸或更多个、至少70个核苷酸或更多个、至少80个核苷酸或更多个、至少90个核苷酸或更多个、至少100个核苷酸或更多个、至少150个核苷酸或更多个、至少200个核苷酸或更多个、至少250个核苷酸或更多个、至少300个核苷酸或更多个、至少350个核苷酸或更多个、至少400个核苷酸或更多个、至少450个核苷酸或更多个、至少500个核苷酸或更多个、至少550个核苷酸或更多个、至少600个核苷酸或更多个、至少650个核苷酸或更多个、至少700个核苷酸或更多个、至少750个核苷酸或更多个、至少800个核苷酸或更多个、至少850个核苷酸或更多个、至少900个核苷酸或更多个、至少950个核苷酸或更多个或至少1000个核苷酸或更多个核苷酸。

本文中描述的片段或免疫原性片段还意指能够引发和/或增强哺乳动物的免疫应答的多肽序列或其部分。所述片段可以是选自下文中所示的不同氨基酸序列的至少一个的多肽片段。片段可包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的下文中所示的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的蛋白质的至少一种的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多个、至少40个氨基酸或更多个、至少50个氨基酸或更多个、至少60个氨基酸或更多个、至少70个氨基酸或更多个、至少80个氨基酸或更多个、至少90个氨基酸或更多个、至少100个氨基酸或更多个、至少110个氨基酸或更多个、至少120个氨基酸或更多个、至少130个氨基酸或更多个、至少140个氨基酸或更多个、至少150个氨基酸或更多个、至少160个氨基酸或更多个、至少170个氨基酸或更多个、至少180个氨基酸或更多个、至少190个氨基酸或更多个、至少200个氨基酸或更多个、至少210个氨基酸或更多个、至少220个氨基酸或更多个、至少230个氨基酸或更多个或至少240个氨基酸或更多个氨基酸。

如本文中所用，“遗传构建体”或“构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达的形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。

如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)认为是等同的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST2.0来获得同一性。

如本文中所用，“免疫应答”意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，响应抗原的引入的激活。免疫应答可以以细胞应答或体液免疫应答的形式或这两种形式存在。

如本文中所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。

如本文中所用，“有效连接的”意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与该启动子与所述启动子所源自的基因之间的距离大致相同。如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。

如本文中所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指氨基酸的连接的序列，并且可以是天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。

如本文中所用，“启动子”意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶段，或响应外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地，或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的蛋白质或氨基酸序列的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白)切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在蛋白质的氨基末端上。

如本文中所用，“受试者”可意指想要或需要利用本文中描述的疫苗免疫的哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文中所用的“严格杂交条件”可意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)(诸如在核酸的复杂混合物中)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点(T_m)低约5-10℃作为严格条件。T_m可以是50％的与靶互补的探针在平衡(由于靶序列过量存在，因此在T_m下，50％的探针在平衡时被占据)时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)以及温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS在42℃下孵育，或者5xSSC、1％SDS在65℃下孵育，在65℃于0.2xSSC和0.1％SDS中洗涤。

如本文中所用的“基本上互补的”可意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。

如本文中所用，“基本上相同的”可意指如果第一序列与第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。基本上相同还可意指第一核酸序列与第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文中所用，“治疗”或“处理”可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。压制疾病包括在疾病临床表现后向动物施用本发明的疫苗。

如本文中针对核酸所用的，“变体”意指(i)参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

“变体”还可被定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特定抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性质(例如，疏水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathicindex)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。

变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列可在全长的基因序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。变体可以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所述氨基酸序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

如本文中所用，“载体”意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，和优选地是DNA质粒。载体可含有或包括一个或多个异源核酸序列。

对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.疫苗

本文中提供了包含抗原和佐剂的疫苗。所述疫苗可增强个体的抗原呈递和针对所述抗原的总体免疫应答。抗原和佐剂的组合比包含单独的抗原的疫苗更高效地诱导免疫系统。所述疫苗可进一步修饰抗原内的表位呈递以诱导比包含单独的抗原的疫苗更大的针对所述抗原的免疫应答。所述疫苗当被施用至不同的组织例如肌肉和皮肤时可进一步诱导免疫应答。

相较于不包含所述佐剂的疫苗，所述疫苗可诱导至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍的IFN-γ产生。

所述疫苗可在受试者中相较于不含所述佐剂的疫苗增强或加强细胞和/或体液免疫应答。所述疫苗可使针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答增强约75％至约200％。或者，所述疫苗相较于不含所述佐剂的疫苗可使针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答增强约90％至约130％。所述疫苗相较于不含所述佐剂的疫苗可使针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答增强约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

本发明的疫苗可具有有效疫苗所需的特性，诸如是安全的，以便疫苗本身不引起疾病或死亡；具有抵抗因对活病原体诸如病毒或细菌的暴露而导致的疾病的保护作用；诱导预防细胞的感染的中和抗体；诱导抗细胞内病原体的保护性T细胞；和提供施用的容易性、几乎无副作用、生物稳定性和每剂量的低成本。所述疫苗可通过将抗原与下文中论述的佐剂组合来实现这些特性的一些或全部特性。

a.佐剂

所述疫苗可包含佐剂。所述分子佐剂可以是转录因子、共刺激分子、趋化因子或细胞因子。所述分子佐剂可以是Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL、STING或其组合。

所述佐剂可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包含编码通过肽键连接于佐剂的接头或标签序列的附加序列。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

(1)REL-A

佐剂可以是转录因子Rel-A(RelA)。Rel-A和c-Rel具有转录激活能力。具体地，Rel-A为炎症和细胞存活中的至关重要的组分。体外实验显示Rel-A强效地激活κB-依赖性转录。该至关重要的转录因子调控多个炎症因子和存活因子的基因表达，所述因子可协调改善的适应性免疫。Rel-A(也称为p65)由人中的Rel-A基因编码。

Rel-A为NF-κB复合物的部分。NF-kB1(p50)或NF-κB2(p52)结合于c-Rel、Rel-A(也称为p65)或Rel-B以形成NF-κB复合物。该二聚体存在于细胞的细胞质内，结合于其抑制剂I-κB。外部刺激物诱导抑制剂的磷酸化和其遍在蛋白介导的通过26S蛋白酶体进行的降解。释放的NF-κB随后迁移进细胞核以诱导转录基因激活。

NF-κB是控制DNA的转录的二聚体转录因子。NF-κB在几乎所有哺乳动物细胞类型中被发现并且参与对刺激物诸如应激、细胞因子、自由基、紫外辐射、氧化的LDL以及细菌或病毒抗原的细胞应答。NF-κB在调控对感染的免疫应答中起着关键作用(κ轻链是免疫球蛋白的重要组分)。NF-κB的不正确调控与癌症、炎症和自身免疫性疾病、脓毒素性休克、病毒感染和不适当的免疫发展相关联。NF-κB还牵涉突触可塑性和记忆的过程。

Rel-A可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含Rel-A的疫苗，在疫苗中包含Rel-A可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含Rel-A的疫苗，在疫苗中包含Rel-A可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包含Rel-A的疫苗，在疫苗中包含Rel-A可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

Rel-A可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。Rel-A可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

Rel-A可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

Rel-A可增强或加强受试者的针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，Rel-A可使针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答增强约75％至约200％。或者，Rel-A可增强针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，Rel-A可增强针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，Rel-A可使对来自向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强至少0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。

在其它情况下，Rel-A可在个体的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰或改变抗原的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。至少一个表位的此类改变的识别可在被施予本文中描述的疫苗的受试者中诱导相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者更大的免疫应答。

Rel-A还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码Rel-A的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠(Musmusculus))、猕猴(普通猕猴(Macacacmulatta))和人(智人(Homosapiens))。可在密码子选择和对应的RNA转录物方面对编码Rel-A的核酸进行优化。编码Rel-A的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码Rel-A的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码Rel-A的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码Rel-A的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于Rel-A的5’。在一些实施方案中，编码Rel-A的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

Rel-A可以是优化的核酸序列SEQIDNO:1，其编码SEQIDNO:2。在一些实施方案中，Rel-A可以是在SEQIDNO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，Rel-A可以是编码在SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。Rel-A可以是在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:1的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:1。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:1的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:1具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:2的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:2。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:2的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:2具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Rel-A蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

(2)T-bet

佐剂可以是转录因子T-bet。T-框转录因子TBX21(也称为T-bet、T-PET、TBET和TBLYM)是在人中由TBX21基因编码的蛋白质。该基因是共享共同的DNA结合结构域T-框的基因的系统发育保守的家族的成员。T-框基因编码参与发育过程的调控的转录因子。T-bet是小鼠Tbx21/Tbet基因的人直系同源物。小鼠中的研究显示Tbx21蛋白是控制标志Th1细胞因子、干扰素-γ(IFN-γ)的表达的Th1细胞特异性转录因子。人直系同源物的表达还与Th1和天然杀伤细胞中的IFN-γ表达相关，这表明了该基因在从初始Th前体细胞起始Th1谱系发育中的作用。T-bet的异位表达反式激活IFN-γ基因和诱导内源IFN-γ的产生。T-bet通过激活Th1遗传程序以及通过抑制相反的Th2程序来从初始Thp细胞起始Th1谱系发育。

T-bet可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含T-bet可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含T-bet可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含T-bet可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

T-bet可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。T-bet可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

T-bet可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

T-bet可增强或加强受试者的针对所述抗原的免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，T-bet可使针对所述抗原的免疫应答增强约75％至约200％。或者，T-bet增强针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，T-bet可增强针对所述抗原的免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，T-bet可使对来自对向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

在其它情况下，T-bet可在个体的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰或改变抗原的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。至少一个表位的此类改变的识别可在有被施予本文中所述的疫苗的受试者中相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者诱导更大的免疫应答。

T-bet还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码T-bet的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠)、猕猴(普通猕猴)和人(智人)。可在密码子选择和对应的RNA转录物方面对编码T-bet的核酸进行优化。编码T-bet的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码T-bet的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码T-bet的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码T-bet的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于T-bet的5’。在一些实施方案中，编码T-bet的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

T-bet可以是优化的核酸序列SEQIDNO:3，其编码SEQIDNO:4。在一些实施方案中，T-bet可以是在SEQIDNO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，T-bet可以是编码在SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。T-bet可以是在SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:3的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:3。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:3的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:3具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的T-bet核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的T-bet核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的T-bet核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的T-bet核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:4的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:4。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:4的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:4具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的T-bet蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的T-bet蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的T-bet蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的T-bet蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

(3)脱中胚蛋白(Eomes)

佐剂可以是转录因子Eomes。Eomes具有反式激活蛋白能力。具体地，Eomes在不同的物种的发育过程中在中间祖细胞及其后代的增殖中起着关键作用。

Eomes可诱导细胞和/或体液免疫应答。具体地，体内实验显示Eomes作为抗病毒应答的部分在活化的CD8+T细胞中表达，并且随后调节成熟和效应子功能。Eomes还在免疫应答过程中参与CD8+T细胞的分化，其中Eomes调控裂解效应细胞的表达。具体地，Eomes可在CD8+T细胞和NK细胞中增加IFN-γ的产量。此外，许多研究表明除了IFN-γ调控以外，Eomes对于引发细胞裂解效应谱系的特征也是至关重要的。

Eomes可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含Eomes可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含Eomes的疫苗，在疫苗中包含Eomes可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包含Eomes的疫苗，在疫苗中包含Eomes可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

Eomes可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。Eomes可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

Eomes可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

Eomes可增强或加强受试者的针对所述抗原的免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，Eomes可使针对所述抗原的免疫应答增强约75％至约200％。或者，Eomes增强针对所述抗原的免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，Eomes可增强针对所述抗原的免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，Eomes可使对来自对向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

在其它情况下，Eomes可在个体的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰和改变抗原中的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者，所述至少一个表位的此类改变的识别可在被施予本文中描述的疫苗的受试者中诱导更大的免疫应答。

Eomes还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码Eomes的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠)、猕猴(普通猕猴)和人(智人)。可在密码子使用和对应的RNA转录物方面对编码Eomes的核酸进行优化。编码Eomes的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码Eomes的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码Eomes的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码Eomes的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于Eomes的5’。在一些实施方案中，编码Eomes的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

Eomes可以是优化的核酸序列SEQIDNO:5，其编码SEQIDNO:6。在一些实施方案中，Eomes可以是在SEQIDNO:5中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，Eomes可以是编码在SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。Eomes可以是在SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:5的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:5。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:5的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:5具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的Eomes核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Eomes核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Eomes核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Eomes核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:6的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:6。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:6的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:6具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的Eomes蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Eomes蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Eomes蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的Eomes蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

(4)FLT3L

佐剂可以是转录因子FLT3L。FLT3L是造血细胞因子。FLT3L是III类受体酪氨酸激酶家族的成员。FLT3L在骨髓基质细胞和髓样细胞中表达，所述两种细胞都具有B细胞和T细胞来源。

FLT3L在细胞和/或体液免疫应答的调控中起着关键作用。具体地，FLT3L显示在先天性免疫与适应性免疫之间的联系中的作用和在调节树突状细胞中的作用。具体地，FLT3L控制树突细胞的发育，其中FLT3L对于浆细胞样树突状细胞和CD8是重要的。此外，FLT3L在小鼠以及人中诱导髓样和淋巴样树突状细胞的大量扩增。

树突状细胞是IFN-γ的强效生产者。因此，FLT3L可在最低限度通过其对树突状细胞的调节来上调IFN-γ的表达。

FLT3L可诱导细胞和/或体液免疫应答。具体地，体内实验显示FLT3L作为抗病毒应答的部分在活化的CD8+T细胞中表达，并且随后调节成熟和效应子功能。FLT3L还在免疫应答过程中参与CD8+T细胞的分化，其中FLT3L调控裂解效应细胞的表达。具体地，FLT3L可在CD8+T细胞和NK细胞中增加IFN-γ的产量。此外，许多研究表明除了IFN-γ调控以外，FLT3L对于引发细胞裂解效应谱系的特征也是至关重要的。

FLT3L可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含FLT3L可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含FLT3L的疫苗，在疫苗中包含FLT3L可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包含FLT3L的疫苗，在疫苗中包含FLT3L可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

FLT3L可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。FLT3L可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

FLT3L可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

FLT3L可增强或加强受试者的针对所述抗原的免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，FLT3L可使针对所述抗原的免疫应答增强约75％至约200％。或者，FLT3L增强针对所述抗原的免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，FLT3L可增强针对所述抗原的免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，FLT3L可使对来自对向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

在其它情况下，FLT3L可在个体的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰和改变抗原中的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者，所述至少一个表位的此类改变的识别可在被施予本文中描述的疫苗的受试者中诱导更大的免疫应答。

FLT3L还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码FLT3L的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠)、猕猴(普通猕猴)和人(智人)。可在密码子使用和对应的RNA转录物方面对编码FLT3L的核酸进行优化。编码FLT3L的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码FLT3L的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码FLT3L的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码FLT3L的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于FLT3L的5’。在一些实施方案中，编码FLT3L的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

FLT3L可以是优化的核酸序列SEQIDNO:7，其编码SEQIDNO:8。在一些实施方案中，FLT3L可以是在SEQIDNO:7中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，FLT3L可以是编码在SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。FLT3L可以是在SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:7的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:7。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:7的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:7具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:8的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:8。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:8的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:8具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的FLT3L蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

(5)TWEAK

佐剂可以是TWEAK。TWEAK是肿瘤坏死家族的成员。TWEAK是多功能细胞因子并且其信号传导牵涉其与受体成纤维细胞生长因子可诱导的14kDa蛋白质Fn14/TWEAKR的高亲和力结合。具体地，TWEAK参与细胞功能包括，但不限于细胞分化的抑制、细胞运动性(例如迁移、侵入)、细胞萎缩、细胞增殖、细胞存活和炎症应答。

TWEAK在细胞和/或体液免疫应答的调控中起着关键作用。具体地，先天性免疫与适应性免疫应答的白细胞释放TWEAK。随后，TWEAK结合在受伤和/或患病组织中被上调的Fn14/TWEAKR。TWEAK与Fn14/TWEAKR的复合物随后调控如上文中所列的细胞应答。此外，TWEAK可参与树突状细胞存活以及树突状细胞和T细胞的活化。

TWEAK可被IFN-γ调节。研究显示被IFN-γ刺激的单核细胞导致TWEAK表达的显著增加。

TWEAK可诱导细胞和/或体液免疫应答。具体地，体内实验显示TWEAK作为抗病毒应答的部分在活化的CD8+T细胞中表达，并且随后调节成熟和效应子功能。TWEAK还在免疫应答过程中参与CD8+T细胞的分化，其中TWEAK调控裂解效应细胞的表达。具体地，TWEAK可在CD8+T细胞和NK细胞中增加IFN-γ的产量。此外，许多研究表明除了IFN-γ调控以外，TWEAK对于引发细胞裂解效应谱系的特征也是至关重要的。

TWEAK可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含TWEAK可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含TWEAK的疫苗，在疫苗中包含TWEAK可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包含TWEAK的疫苗，在疫苗中包含TWEAK可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

TWEAK可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。TWEAK可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

TWEAK可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

TWEAK可增强或加强受试者的针对所述抗原的免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，TWEAK可使针对所述抗原的免疫应答增强约75％至约200％。或者，TWEAK可增强针对所述抗原的免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，TWEAK可增强针对所述抗原的免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，TWEAK可使对来自对向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

在其它情况下，TWEAK可在个体的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰和改变抗原中的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者，所述至少一个表位的此类改变的识别可在被施予本文中描述的疫苗的受试者中诱导更大的免疫应答。

TWEAK还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码TWEAK的核酸可来自许多生物体，例如小鼠(小家鼠)、猕猴(普通猕猴)和人(智人)。可在密码子使用和对应的RNA转录物方面对编码TWEAK的核酸进行优化。编码TWEAK的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码TWEAK的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码TWEAK的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码TWEAK的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于TWEAK的5’。在一些实施方案中，编码TWEAK的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

TWEAK可以是优化的核酸序列SEQIDNO:9，其编码SEQIDNO:10。在一些实施方案中，TWEAK可以是在SEQIDNO:9中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，TWEAK可以是编码在SEQIDNO:10中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。TWEAK可以是在SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:9的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:9。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:9的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:9具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:10的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:10。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:10的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:10具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的TWEAK蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

(6)GITRL

佐剂可以是GITRL。GITRL是调节天然和获得性免疫应答的肿瘤坏死因子家族的成员。GITRL在巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞和B细胞的细胞表面上表达。GITRL与其同族受体GITR反应。

GITRL在细胞和/或体液免疫应答的调控中起着关键作用。具体地，GITRL在T细胞和NK细胞上表达，其中其在细胞活化后被上调。GITRL诱导的信号转导由ERK1/2介导，所述ERK1/2然后触发转录因子NF-κB的激活。NF-κB控制几种促炎调节剂包括趋化因子、MMP和细胞因子的表达。

GITRL可上调IFN-γ的表达。

GITRL可诱导细胞和/或体液免疫应答。具体地，体内实验显示GITRL作为抗病毒应答的部分在活化的CD8+T细胞中表达，并且随后调节成熟和效应子功能。GITRL还在免疫应答过程中参与CD8+T细胞的分化，其中GITRL调控裂解效应细胞的表达。具体地，GITRL可在CD8+T细胞和NK细胞中增加IFN-γ的产量。此外，许多研究表明除了IFN-γ调控以外，GITRL对于引发细胞裂解效应谱系的特征也是至关重要的。

GITRL可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含GITRL可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含GITRL的疫苗，在疫苗中包含GITRL可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包括GITRL的疫苗，在疫苗中包含GITRL可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

GITRL可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。GITRL可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

GITRL可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

GITRL可增强或加强受试者的针对所述抗原的免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，GITRL可使针对所述抗原的免疫应答增强约75％至约200％。或者，GITRLK增强针对所述抗原的免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，GITRL可增强针对所述抗原的免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，GITRL可使对来自对向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

在其它情况下，GITRL还可在个体的很多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰和改变抗原中的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者，所述至少一个表位的此类改变的识别可在被施予本文中描述的疫苗的受试者中诱导更大的免疫应答。

GITRL还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码GITRL的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠)、猕猴(普通猕猴)和人(智人)。可在密码子使用和对应的RNA转录物方面对编码GITRL的核酸进行优化。编码GITRL的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码GITRL的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码GITRL的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码GITRL的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于GITRL的5’。在一些实施方案中，编码GITRL的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

GITRL可以是优化的核酸序列SEQIDNO:11，其编码SEQIDNO:12。在一些实施方案中，GITRL可以是在SEQIDNO:11中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，GITRL可以是编码在SEQIDNO:12中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。GITRL可以是在SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:11的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:11。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:11的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:11具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的GITRL核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的GITRL核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的GITRL核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的GITRL核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:12的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:12。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:12的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:12具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的GITRL蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的GITRL蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的GITRL蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的GITRL蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

(7)STING

佐剂可以是STING。STING是在细胞和/或体液免疫应答中具有关键作用的跨膜蛋白。STING是当细胞遭遇dsDNA时被活化，从而导致在TLR不存在的情况下1型IFN的上调的DNA传感器。1型IFN是最佳DNA疫苗诱导的免疫所必需的，因为其刺激抗原特异性B细胞以及CD4+和CD8+T细胞。已显示STING是1型IFN的有效产生所必需的。

STING可上调IFN-γ的表达。

STING可诱导细胞和/或体液免疫应答。具体地，体内实验显示STING作为抗病毒应答的部分在活化的CD8+T细胞中表达，并且随后调节成熟和效应子功能。STING还在免疫应答过程中参与CD8+T细胞的分化，其中STING调控裂解效应细胞的表达。具体地，STING可在CD8+T细胞和NK细胞中增加IFN-γ的产量。此外，许多研究表明除了IFN-γ调控以外，STING对于引发细胞裂解效应谱系的特征也是至关重要的。

STING可通过不同的信号转导途径触发I型IFN、IFN-可诱导的趋化因子和促炎细胞因子诸如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的基因表达。相较于不包含T-bet的疫苗，在疫苗中包含STING可诱导IFN-γ的产生至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。相较于不包含STING的疫苗，在疫苗中包含STING可诱导IFN-γ的产生至少约2倍。相较于不包含STING的疫苗，在疫苗中包含STING可诱导IFN-γ的产生至少约3倍。

STING可经由更高的IL-2的产量刺激T细胞应答途径。STING可刺激T细胞的生长、增殖和分化以变成“效应”T细胞以及IL-2受体IL-2R的表达。IL-2/IL-2R相互作用随后刺激抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的生长、分化和存活。通过刺激IL-2，自体与非自体细胞之间的免疫系统调节得以实现，因为IL-2是区分自体与非自体所需要的。

STING可通过增加IgG的B细胞产生来进一步刺激适应性免疫系统。

STING可增强或加强受试者的针对所述抗原的免疫应答。所述抗原在下文中进行了更详细论述。在一些情况下，STING可使针对所述抗原的免疫应答增强约75％至约200％。或者，STING增强针对所述抗原的免疫应答，所述免疫应答可被增强约90％至约130％。在其它备选实施方案中，STING可增强针对所述抗原的免疫应答，相较于不含佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

在其它实施方案中，STING可使对来自对向有此需要的受试者施用的疫苗的特定抗原的免疫应答增强或加强0.5倍、1.0倍、1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。

在其它情况下，STING可在个体的很多组织例如皮肤组织和肌肉组织中修饰和改变抗原中的至少一个表位的免疫系统识别。所述抗原在下文中进行了更详细描述。相较于被施予包含单独的对应于所述抗原的核酸的疫苗的受试者，所述至少一个表位的此类改变的识别可在被施予本文中描述的疫苗的受试者中诱导更大的免疫应答。

STING还可例如通过使先前未被识别的表位被免疫系统识别，从而增强受试者针对所述抗原的免疫应答来修饰或改变抗原中的一个或多个表位的呈递。经修饰的呈递和从而增强的免疫应答可在受试者的许多组织例如皮肤组织和肌肉组织中发生。

编码STING的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠)、猕猴(普通猕猴)和人(智人)。可在密码子使用和对应的RNA转录物方面对编码STING的核酸进行优化。编码STING的核酸可以是针对表达优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码STING的核酸可包括提高翻译效率的Kozak序列(例如，GCCACC)。编码STING的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以提高翻译终止效率。编码STING的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可位于STING的5’。在一些实施方案中，编码STING的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。

STING可以是优化的核酸序列SEQIDNO:13，其编码SEQIDNO:14。在一些实施方案中，STING可以是在SEQIDNO:13中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，STING可以是编码在SEQIDNO:14中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。STING可以是在SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:13的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:13。在一些实施方案中，片段可包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:13的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:13具有95％或更大的同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的STING核酸序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的STING核酸序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的STING核酸序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的STING核酸序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:14的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQIDNO:14。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:14的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQIDNO:14具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的STING蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的STING蛋白质序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的STING蛋白质序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的STING蛋白质序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

b.抗原

疫苗可包含抗原或其片段或变体。所述抗原可以是诱导受试者的免疫答应的任何物质。纯化的抗原通常自身不是强免疫原性的，从而将其与如上所述的佐剂组合。当与佐剂组合时，由抗原诱导的免疫应答可被加强或增强。此类免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在一些实施方案中，佐剂和抗原的组合可加强或增强受试者的细胞免疫应答。

抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包括编码通过肽键连接于抗原的接头或标签序列的附加序列。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

抗原可被包含在来自许多生物体例如病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物的蛋白质、核酸或其片段或其变体中其组合中。抗原可与自身免疫性疾病、过敏症或哮喘相关联。在其它实施方案中，抗原可与癌症、疱疹、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相关联。优选地，抗原可与流感病毒或HIV相关联。

一些抗原可诱导强免疫应答。其它抗原可诱导弱免疫应答。当与如上所述的佐剂组合时，抗原可引发更大的免疫应答。

(1)病毒抗原

抗原可以是病毒抗原或其片段或其变体。所述病毒抗原可来自以下科的一个科的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒、嗜肝病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副粘液病毒科、细小病毒科、细小核糖核酸病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科。病毒抗原可来自乳头状瘤病毒例如人乳头状肉瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、天花病毒(大天花和小天花)、牛痘病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、多毛细胞白血病病毒(HTLV-Ⅱ)、加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉猪瘟病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹1(口腔疱疹)、单纯疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，又名，水痘)、巨细胞病毒(CMV)、例如人CMV、EB病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯雅病毒、拉沙病毒、沙粒病毒或致癌病毒。

(a)肝炎抗原

可将佐剂与肝炎病毒抗原(即，肝炎抗原)或其片段或变体结合或组合。肝炎抗原可以是来自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在一些实施方案中，肝炎抗原可以是异源核酸分子诸如质粒，其编码来自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的抗原的一种或多种抗原。肝炎抗原可以是全长或全长蛋白质的免疫原性片段。

肝炎抗原可以包含共有序列和/或一个或多个修饰以改善表达。可在经修饰的共有序列中包含遗传修饰，包括密码子优化、RNA优化和高效免疫球蛋白前导序列的添加(以增强构建体的免疫原性)。共有肝炎抗原可以包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG的信号肽，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。免疫原可被设计来引发比相应的密码子优化的免疫原更强和更广泛的细胞免疫应答。

肝炎抗原可以是来自HAV的抗原。肝炎抗原可以是HAV衣壳蛋白、HAV非结构蛋白、其片段、其变体或其组合。

肝炎抗原可以是来自HCV的抗原。肝炎抗原可以是HCV核壳体蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。

肝炎抗原可以是来自HDV的抗原。肝炎抗原可以是HDVδ抗原、其片段或其变体。

肝炎抗原可以是来自HEV的抗原。肝炎抗原可以是HEV衣壳蛋白、其片段或其变体。

肝炎抗原可以是来自HBV的抗原。肝炎抗原可以是HBV核心蛋白，HBV表面蛋白，HBVDNA聚合酶，由基因X编码的HBV蛋白，其片段，其变体或其组合。肝炎抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白质、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白质。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型A共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型B共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型C共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型D共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型E共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型F共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型G共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型H共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型A共有表面蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型B共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型C共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型D共有表面蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型E共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型F共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型G共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型H共有表面蛋白序列。

(b)人乳头状瘤病毒(HPV)抗原

可将佐剂与人乳头状瘤病毒(HPV)抗原或其片段或其变体结合或组合。HPV抗原可来自16、18、31、33、35、45、52和58型HPV，所述抗原引起宫颈癌、直肠癌和/或其它癌症。HPV抗原可以来自6型和11型HPV，其引起生殖器疣，并且已知是头颈部癌的病因。

HPV抗原可以是来自每一个HPV类型的HPVE6或E7结构域。例如，对于16型HPV(HPV16)，HPV16抗原可包括HPV16E6抗原、HPV16E7抗原、其片段、变体或组合。类似地，HPV抗原可以是HPV6E6和/或E7、HPV11E6和/或E7、HPV18E6和/或E7、HPV31E6和/或E7、HPV33E6和/或E7、HPV52E6和/或E7或HPV58E6和/或E7、其片段、变体或组合。

(c)RSV抗原

还可将佐剂与RSV抗原或其片段或其变体结合或组合。RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(在本文中也被称为“RSVF”、“RSVF蛋白”和“F蛋白”)或其片段或变体。人RSV融合蛋白在RSV亚型A与亚型B之间可以是保守的。RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23994.1)的RSVF蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSVA2菌株(GenBankAAB59858.1)的RSVF蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSVF蛋白的单体、二聚体或三聚体或其片段或变体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSVF氨基酸序列或其片段或变体。

RSVF的融合后形式在已被免疫的动物中引发高滴度中和抗体，并且保护所述动物免受RSV攻击。本发明利用所述疫苗中的该免疫应答。根据本发明，RSVF蛋白可以以融合前形式或融合后形式存在。

RSV抗原还可以是人RSV粘附糖蛋白(在本文中也被称为“RSVG”、“RSVG蛋白”和“G蛋白”)或其片段或变体。人RSVG蛋白在RSV亚型A与B之间是不同的。所述抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23993)的RSVG蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV亚型B分离株H5601、RSV亚型B分离株H1068、RSV亚型B分离株H5598、RSV亚型B分离株H1123的RSVG蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSVG氨基酸序列或其片段或变体。

在其它实施方案中，RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23987.1)的RSVNS1蛋白或其片段或变体。人RSV抗原还可以是RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23988.1)的RSVNS2蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV核壳体(“N”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23989.1)的RSVN蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23990.1)的RSVP蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白(“M”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23991.1)的RSVM蛋白或其片段或变体。

在其它实施方案中，RSV抗原可以是人RSV小疏水性(“SH”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23992.1)的RSVSH蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23995.1)的RSVM2-1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23997.1)的RSVM2-2蛋白或其片段或变体。人RSV抗原可以是RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong菌株(GenBankAAX23996.1)的RSVL蛋白或其片段或变体。

在其它实施方案中，RSV抗原可具有NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的优化的氨基酸序列。RSV抗原可以是人RSV蛋白或重组抗原，诸如由人RSV基因组编码的蛋白质的任一种蛋白质。

在其它实施方案中，RSV抗原可以是，但不限于来自RSVLong菌株的RSVF蛋白、来自RSVLong菌株的RSVG蛋白、优化的氨基酸RSVG氨基酸序列、RSVLong菌株的人RSV基因组、优化的氨基酸RSVF氨基酸序列、来自RSVLong菌株的RSVNS1蛋白、来自RSVLong菌株的RSVNS2蛋白、来自RSVLong菌株的RSVN蛋白、来自RSVLong菌株的RSVP蛋白、来自RSVLong菌株的RSVM蛋白、来自RSVLong菌株的RSVSH蛋白、来自RSVLong菌株的RSVM2-1蛋白、来自RSVLong菌株的RSVM2-2蛋白、来自RSVLong菌株的RSVL蛋白、来自RSV亚型B分离株H5601的RSVG蛋白、来自RSV亚型B分离株H1068的RSVG蛋白、来自RSV亚型B分离株H5598的RSVG蛋白、来自RSV亚型B分离株H1123的RSVG蛋白或其片段或其变体。

(d)流感病毒抗原

可将佐剂与流感病毒抗原或其片段或其变体结合或组合。流感病毒抗原是能够引发哺乳动物的抗一种或多种流感病毒血清型的免疫应答的那些抗原。所述抗原可包含全长翻译产物HA0、亚单位HA1、亚单位HA2、其变体、其片段或其组合。流感病毒血凝素抗原可以是来源于甲型流感病毒血清型H1的多个株的共有序列、来源于甲型流感病毒血清型H2的多个株的共有序列、含有来源于甲型流感病毒血清型H1的多个株的不同组的两个不同共有序列或来源于乙型流感病毒的多个株的共有序列的部分的杂交体序列。流感病毒血凝素抗原可来自乙型流感病毒。

流感病毒抗原还可含有至少一个抗原性表位，所述表位可有效抗可针对其诱导免疫应答的的特定流感病毒免疫原。所述抗原可提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的完整库。所述抗原可以是可从来自一个血清型的多个甲型流感病毒株诸如血清型H1或血清型H2的多个甲型流感病毒株的血凝素抗原序列衍生的共有血凝素抗原序列。所述抗原可以是可从组合两种不同的共有血凝素抗原序列或其部分衍生的杂交体共有血凝素抗原序列。两个不同的共有血凝素抗原序列的每一个可从不同组的一个血清型的多个甲型流感病毒株，诸如血清型H1的多个甲型流感病毒株衍生而来。所述抗原可以是可从来自多个乙型流感病毒株的血凝素抗原序列衍生的共有血凝素抗原序列。

在一些实施方案中，流感病毒抗原可以是H1HA、H2HA、H3HA、H5HA或BHA抗原。或者，流感病毒抗原可以是共有凝血素抗原，包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的蛋白质。共有凝血素抗原可以是包含两种不同的共有H1序列(其各自来源于彼此不同的组的序列)的部分的合成杂交体共有H1序列。作为合成杂交体共有H1蛋白的共有HA抗原的实例为包含U2氨基酸序列的蛋白质。共有凝血素抗原可以是从来自乙型流感病毒株的凝血素序列衍生的共有凝血素蛋白，诸如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。

共有血凝素抗原还可包含一个或多个另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原还可在其N末端包含IgE或IgG前导氨基酸序列。共有血凝素抗原还可包含免疫原性标签，其为可利用可容易获得的抗体检测的独特的免疫原性表位。此类免疫原性标签的实例是可被连接在共有血凝素C末端上的9个氨基酸的流感病毒HA标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原还可在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列，在其C末端上包含HA标签。

共有血凝素抗原可以是由共有流感病毒氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感病毒蛋白质序列和流感病毒蛋白质序列或其片段和变体的的共有血凝素蛋白。

共有H1蛋白的实例包括可由共有H1氨基酸序列组成的那些共有H1蛋白，或还包含另外的元件诸如IgE前导序列或HA标签或IgE前导序列和HA标签的那些共有H1蛋白。

共有H2蛋白的实例包括可由共有H2氨基酸序列组成的那些共有H2蛋白，或还包含IgE前导序列或HA标签或IgE前导序列和HA标签的那些共有H2蛋白。

杂交体共有H1蛋白的实例包括可由共有U2氨基酸序列组成的那些杂交体共有H1蛋白，或还包含IgE前导序列或HA标签或IgE前导序列和HA标签的那些杂交体共有H1蛋白。

杂交体共有乙型流感病毒血凝素蛋白的实例包括可由共有BHA氨基酸序列组成的那些杂交体共有乙型流感病毒血凝素蛋白，或其可包含IgE前导序列或HA标签或IgE前导序列和HA标签。

共有血凝素蛋白可由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是来源于来自不同株和变体的多个不同的血凝素序列的共有序列的共有血清凝蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可与用于编码共有血凝素蛋白序列可来源自其的多个不同血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些序列不同。可对共有核酸序列进行密码子优化和/或RNA优化有。共有血凝素核酸序列可在5’非翻译区中包含Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列位于血凝素编码序列的5'。N末端前导序列可促进分泌。N末端前导序列可以是IgE前导序列或为IgG前导序列。共有血凝素核酸序列可包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可在蛋白质的C末端上并且编码其的序列位于HA编码序列的3'。所述免疫原性标签提供了存在可容易获得的针对其的抗体的独特表位，以便此类抗体可在测定中被用于检测和确认蛋白质的表达。免疫原性标签可以是在蛋白质的C末端上的H标签。

(e)人免疫缺陷病毒(HIV)抗原

可将佐剂与HIV抗原或其片段或其变体结合或组合。HIV抗原可包括免疫原的经修饰的共有序列。可在经修饰的共有序列中包含遗传修饰(包括密码子优化、RNA优化、和高效免疫球蛋白前导序列的添加(以增强构建体的免疫原性))。新型的免疫原可被设计来引发比对应的密码子优化的免疫原更强和更广泛的细胞免疫应答。

在一些实施方案中，HIV抗原可以是亚型A共有包膜DNA序列构建体、连接于亚型A包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列或亚型A共有包膜蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是亚型B共有包膜DNA序列构建体、连接于亚型B包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列或亚型B共有包膜蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是亚型C共有包膜DNA序列构建体、连接于亚型C包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列或亚型C共有包膜蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是亚型D共有包膜DNA序列构建体、连接于亚型D包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列或亚型D共有包膜蛋白序列。

在一些实施方案中，HIV抗原可以是亚型BNef-Rev共有包膜DNA序列构建体、连接于亚型BNef-Rev蛋白的共有序列的IgE前导序列或亚型BNef-Rev共有蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是亚型A、B、C和D的DNA序列构建体的Gag共有DNA序列、连接于Gag共有亚型A、B、C和D蛋白的共有序列的IgE前导序列或共有Gag亚型A、B、C和D蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是MPolDNA序列或MPol蛋白序列。HIV抗原可以是EnvA、EnvB、EnvC、EnvD、BNef-Rev、Gag的核酸或氨基酸序列或其任意组合。

(2)寄生虫抗原

可将佐剂与寄生虫抗原或其片段或变体结合或组合。所述寄生虫可以是原生动物、蠕虫或体外寄生虫。蠕虫(即，蠕虫(worm))可以是一个扁虫(例如，吸虫和绦虫)、棘头虫或:蛔虫(例如，蛲虫)。体外寄生虫可以是虱、蚤、蜱和螨。

寄生虫可以是引起下列疾病的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、小袋虫病、浣熊蛔虫症、恰加斯病、恰加斯病、锥蝇病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、包虫病、象皮肿、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第虫病、腭口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、片山发热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病和鞭虫病。

寄生虫可以是棘阿米巴属、异尖属、蛔虫属蛔虫、马蝇、结肠小袋绦虫、臭虫、绦虫纲(绦虫)、恙螨属、嗜人锥蝇、溶组织内阿米巴、肝片吸虫、贾第鞭毛虫、钩虫、利什曼原虫、锯齿状舌形虫、肝吸虫、罗阿丝虫、并殖吸虫肺吸虫、蛲虫、恶性疟原虫、血吸虫、粪类圆线虫、螨虫、绦虫、弓形虫、锥虫属、鞭虫或班氏丝虫。

(a)疟疾抗原

可将佐剂与疟原虫抗原(即，PF抗原或PF免疫原)或其片段或其变体结合或组合。所述抗原可来自引起疟疾的寄生虫。引起疟疾的寄生虫可以是恶性疟原虫。恶性疟原虫抗原可包括环子孢子(CS)抗原。

在一些实施方案中，疟疾抗原可以是编码恶性疟原虫免疫原CS、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1的一种或多种的核酸分子诸如质粒。所述免疫原可以是全长的或全长蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原包含共有序列和/或修饰以改善表达。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是TRAP的共有序列，其也被称为SSP2，由GenBank数据库中的所有全长恶性疟原虫TRAP/SSP2序列(总共28个序列)的汇编设计。共有TRAP免疫原(即，ConTRAP免疫原)可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是CelTOS，其也被称为Ag2，并且是高度保守的疟原虫属抗原。共有CelTOS抗原(即，ConCelTOS免疫原)可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽诸如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是Ama1，其为高度保守的疟原虫属抗原。疟疾抗原还可以是Ama1(即，ConAmaI免疫原)的共有序列，其在一些情况下包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在一些实施方案中，疟疾抗原可以是共有CS抗原(即，共有CS免疫原)，其在一些情况下包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是包含本文中所示的PF蛋白的两种或更多种的组合的融合蛋白。例如，所述融合蛋白可包含彼此直接相邻连接的或通过其间的间隔子或一个氨基酸连接的共有CS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原和ConAma1免疫原的两种或更多种免疫原。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含2种PF免疫原；在一些实施方案中，所述融合蛋白包含3种PF免疫原，在一些实施方案中，所述融合蛋白包含4种PF免疫原，以及在一些实施方案中，融合蛋白包含5种PF免疫原。具有2种共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS和LSA1；CS和TRAP；CS和CelTOS；CS和Ama1；LSA1和TRAP；LSA1和CelTOS；LSA1和Ama1；TRAP和CelTOS；TRAP和Ama1；或CelTOS和Ama1。具有3种共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS、LSA1和TRAP；CS、LSA1和CelTOS；CS、LSA1和Ama1；LSA1、TRAP和CelTOS；LSA1、TRAP和Ama1；或TRAP、CelTOS和Ama1。具有4种共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS、LSA1、TRAP和CelTOS；CS、LSA1、TRAP和Ama1；CS、LSA1、CelTOS和Ama1；CS、TRAP、CelTOS和Ama1；或LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1。具有5种共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1。

在一些实施方案中，所述融合蛋白包含连接于N末端的信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含多个连接于每一种共有PF免疫原的N末端的信号肽。在一些实施方案中，间隔子可被包含在融合蛋白的PF免疫原之间。在一些实施方案中，融合蛋白的PF免疫原之间的间隔子可以是蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，间隔子可以是被在期望向对其施用疫苗和/或期望疫苗被其吸收的细胞中发现的蛋白酶识别的蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间，其中间隔子为被在期望向对其施用疫苗和/或期望疫苗被其吸收的细胞中发现的蛋白酶识别的蛋白水解切割位点，并且融合蛋白包含多个连接于每一种共有PF免疫原的N末端的信号肽，以便在切割后，每一种共有PF免疫原的信号肽将共有PF免疫原转运至细胞外部。

(3)细菌抗原

可将佐剂与细菌抗原或其片段或变体结合或组合。所述细菌可来自下列门中的任何一个：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、恐球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、养菌门(Synergistetes)、软壁菌门(Tenericutes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。

所述细菌可以是革兰阳性细菌或革兰阴性细菌。所述细菌可以是好气细菌或厌氧细菌。所述细菌可以是自养细菌或异养细菌。所述细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。

所述细菌可以是炭疽杆菌(anthraxbacterium)、抗生素抗性细菌、致病细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门菌属(Salmonella)细菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌或破伤风细菌。所述细菌可以是分枝杆菌属(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)或艰难梭菌(Clostridiumdifficile)。

(a)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)抗原

可将所述佐剂与结核分枝杆菌抗原(即，TB抗原或TB免疫原)或其片段或其变体结合或组合。TB抗原可来自TB抗原的Ag85家族，例如，Ag85A和Ag85B。TB抗原可来自TB抗原的Esx家族，例如，EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV和EsxW。

在一些实施方案中，TB抗原可以是异源核酸分子诸如质粒，其可编码来自Ag85家族和Esx家族的结核分枝杆菌免疫原的一种或多种免疫原。所述免疫原可以是全长的或全长蛋白质的免疫原性片段。所述免疫原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。共有免疫原可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

(4)真菌抗原

可将佐剂与真菌抗原或其片段或变体结合或组合。所述真菌可以是曲霉属(Aspergillus)种类、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、念珠菌酵母(例如、白色念珠菌(Candidaalbicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、加特隐球菌(Cryptococcusgattii)、皮癣霉菌(dermatophyte)、镰刀菌属(Fusarium)种类、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、毛霉菌亚门(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystisjirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)、突脐蠕孢属(Exserohilum)或枝孢属(Cladosporium)。

c.载体

所述疫苗包含一种或多种载体，所述载体包括一个或多个编码抗原和佐剂的异源核酸。所述一种或多种载体可以能够表达抗原和佐剂。所述一个或多个载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，由所述基因编码的蛋白质由细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生。所述质粒通常被工程化以含有充当增强子和启动子区域调控序列并导致表达载体上携带的基因的高效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。

所述载体可具有表达信号诸如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆的基因之间的距离的调整以及转录终止序列和PTIS(可携带的翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

所述载体可以是环状质粒或线性核酸。所述环状质粒和线性核酸能够在适当的主题细胞中指导特定异源核苷酸序列的表达。所述载体可具有有效地连接于编码抗原的核苷酸序列或编码佐剂的核苷酸序列的启动子，所述编码抗原的核苷酸序列可有效地连接于终止信号。所述载体还可含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其组件的至少一个对于其至少一个其它组件是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，仅当将宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时所述诱导型启动子才启动转录。在多细胞生物体的情况下，所述启动子还可于对特定的组织或器官或发育阶段是特异性的。

(2)环状和线性载体

所述载体可以是环状质粒，其可通过整合进细胞基因组转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起始点的自主复制质粒)。

所述载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原或佐剂的异源DNA并使得细胞能够将所述序列翻译成被免疫系统识别的抗原或佐剂的任何其它表达载体。

本文中还提供了能够经由电穿孔被有效地递送至受试者，并且表达一种或多种期望的抗原或一种或多种期望的佐剂的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。所述LEC可以是不存在任何磷酸主链的任何线性DNA。所述DNA可编码一种或多种抗原或一种或多种佐剂。所述LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。所述抗原或佐剂的表达可受启动子控制。所述LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。所述LEC可以不含与期望的抗原基因表达或期望的佐剂表达无关的其它核酸序列。

所述LEC可来源于任何能够被线性化的质粒。所述质粒可以能够表达抗原或佐剂。所述质粒可以能够表达佐剂Rel-A和/或T-bet。所述质粒可以是pNP(PuertoRico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。所述质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或任何其它能够表达编码所述抗原或编码所述佐剂的DNA并使得细胞能够将所述序列翻译成被免疫系统识别的抗原或佐剂的表达载体。

所述LEC可以是pcrM2。所述LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来源于pNP(PuertoRico/34)和pM2(NewCaledonia/99)。

(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

所述载体可具有启动子。所述启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，所述DNA依赖性RNA聚合酶转录本文中描述的抗原序列或佐剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于特定应用。可将启动子在载体中置于离转录起始位点与其在天然背景中离转录起始位点的距离大约相同的距离。然而，再不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。

所述启动子可有效地连接于编码所述抗原和转录物的高效多腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止的核酸序列。所述启动子可有效地连接于编码所述佐剂和转录物的高效多腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止的核酸序列。

所述启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对于在真核细胞中的表达是有效的另一种启动子。

所述载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。所述载体可含有在结构基因下游的转录终止区以提供高效终止。所述终止区可获自与启动子序列相同的基因或可获自不同的基因。

d.赋形剂和疫苗的其它组分

疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子诸如媒介物、除Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING外的佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freundsincompleteadjuvant)，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸盐可以以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透明质酸与基因构建体结合施用。所述DNA质粒疫苗还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中的转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。

所述药学上可接受的赋形剂可以是除了Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING以外的佐剂。所述佐剂可以是在可选择的质粒中表达的其它基因或作为疫苗中与上述质粒组合的蛋白质被递送。所述佐剂可选自α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括IL-15(缺失信号序列和任选地包含来自IgE的信号肽)。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

可用作除了Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING的佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

所述疫苗还可包含如1994年4月1日提交的美国序列No.021,579(其通过引用整体并入)中描述的基因疫苗促进剂。

可按照待使用的施用模式配制疫苗。可注射疫苗药物组合物可以是无菌、无热原和无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。所述疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗还可包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使得制剂在室温或环境温度长时间稳定，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.接种方法

本发明还涉及通过不同的施用途径利用所述疫苗增强受试者的免疫应答的方法。增强免疫应答可用于治疗和/或预防受试者的疾病。

所述方法可包括向受试者施用本文中公开的疫苗。被施予所述疫苗的受试者相较于被施予单独的抗原的受试者可具有增强的或加强的免疫应答。在一些实施方案中，被施予所述疫苗的受试者的免疫应答可被增强约18％至约650％。或者，被施予所述疫苗的受试者的免疫应答可被增强约45％至约260％。在其它备选实施方案中，被施予所述疫苗的受试者的免疫应答可被增强约93％至约130％。

在其它实施方案中，所施用的疫苗可使受试者的免疫应答增强或加强至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。

所述疫苗相较于不包含所述佐剂的疫苗可诱导IFN-γ的产量至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍和至少约10倍。

所述疫苗相较于不含所述佐剂的疫苗可增强或加强受试者的对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答。所述疫苗可使针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答增强约75％至约200％。或者，所述疫苗可增强针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答，相较于不含所述佐剂的疫苗，所述免疫应答被增强约90％至约130％。所述疫苗可增强针对所述抗原的细胞和/或体液免疫应答，相较于不含所述佐剂的疫苗，所述免疫应答可被增强约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。

疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，以及可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

a.施用

可按照制药领域内的技术人员公知的标准技术配制疫苗。可通过考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及施用途径的因素，利用医学领域内的技术人员公知的技术按剂量施用此类组合物。所述受试者可以是哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

可预防性或治疗性施用所述疫苗。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用所述疫苗。在治疗性应用中，以足以引发治疗作用的量向有此需要的受试者施用所述疫苗。足以实现该作用的量被定义为"治疗有效剂量"。对该用途有效的量将取决于例如所施用的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的一般健康状态以及处方医生的判断。

所述疫苗可通过如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(美国专利No.5,580,859，1996年12月3日授予的)；Felgner(美国专利No.5,703,055，1997年12月30日授予的)；和Carson等人(美国专利No.5,679,647，1997年10月21日授予的)(所有文献和美国专利的内容通过引用以其整体并入本文)中描述的本领域公知的方法来施用。可将所述疫苗的DNA复合成可以例如使用疫苗枪向个体施用的颗粒或珠粒。本领域技术人员将了解药学上可接受的载体，包括生理上可接受的化合物的选择取决于例如表达载体的施用途径。

可经由多种途径施用所述疫苗。典型的递送途径包括胃肠外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其它途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。具体地对于疫苗的DNA，可将所述疫苗递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等人，美国专利No.5,580,859和5,703,055，将所有所述美国专利的内容通过引用以其整体并入本文)。所述疫苗还可被施用至肌肉，或经由皮内或皮下注射，或经皮肤(诸如通过离子电渗疗法)进行施用。还可应用所述疫苗的表皮施用。表皮施用可包括机械或化学刺激表皮的最外层以刺激针对所述刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利No.5,679,647，其内容通过引用以其整体并入本文)。

还可将所述疫苗配制用以经由鼻道施用。适用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可包括具有例如在约10至约500微米范围内的粒度的粗粉，以其中采用从鼻中吸入，即，通过从拿至靠近鼻的粉剂的容器经鼻道快速吸入的方式来施用所述粗粉。所述制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或利用喷雾器的气溶胶施用。所述制剂可包含所述疫苗的水性或油性溶液。

所述疫苗可以是液体制剂诸如悬浮剂、糖浆剂或酏剂。所述疫苗还可以是用于胃肠外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，诸如无菌悬浮剂或乳剂。

可将所述疫苗掺入脂质体、微球或其它聚合物基质(Felgner等人，美国专利No.5,703,055；Gregoriadis,LiposomeTechnology，第I至III卷(第2版，1993)，其内容通过引用以其整体并入本文)。脂质体可由磷脂或其它脂质组成，并且可以是被相对简单地产生和施用的无毒、生理上可接受和可代谢的载体。

所述疫苗可经由电穿孔，诸如通过美国专利No.7,664,545(其内容通过引用并入本文)中描述的方法来施用。所述电穿孔可以是利用美国专利No.6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的方法和/或设备来进行。所述电穿孔可经由微创装置来进行。

微创电穿孔装置(“MID”)可以是用于将上述疫苗和相关流体注射进身体组织的设备。所述装置可包括空心针、DNA盒和流体递送装置，其中所述装置适合用于驱动使用的流体递送装置，以在将针插入所述身体组织过程中同时(例如，自动地)将DNA注射进身体组织。这具有在针被插入的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致流体在整个身体组织中的更均匀分布的有利方面。在注射过程中经历的疼痛可因被注射的DNA在更大面积上的分布而减弱。

MID可将疫苗注射进组织而无需使用针。MID可以以使疫苗穿透组织的表面并进入下面的组织和/或肌肉的力，以小流或射流的形式注射疫苗。小流或射流后方的力可通过膨胀压缩的气体(诸如二氧化碳)使其在几分之一秒内通过微孔来提供。微创电穿孔装置以及使用它们的方法的实例描述于公开的美国专利申请No.20080234655、美国专利No.6,520,950、美国专利No.7,171,264、美国专利No.6,208,893、美国专利No.6,009,347、美国专利No.6,120,493、美国专利No.7,245,963、美国专利No.7,328,064和美国专利No.6,763,264中，其每一个的内容通过引用并入本文。

MID可包含产生无痛穿透组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器是商购可得的。可在本文中使用的无针注射器的实例包括美国专利No.3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310(其每一个的内容通过引用并入本文)中描述的那些注射器。

适用于直接或间接电转运的期望的疫苗可使用无针注射器(通常通过使组织表面与注射器接触以以足以使疫苗穿透进组织的力驱动试剂射流的递送)来引入(例如，注射)待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则以足以使试剂穿透通过解质层和分别进入真皮层，或进入下面的组织和肌肉的力来朝向粘膜或皮肤表面注射所述试剂。

无针注射器特别适合用于将疫苗递送至所有类型的组织，特别地皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有疫苗的液体推进至表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽部、下喉咽部、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾脏、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任意组合。

MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如以矩形或正方形模式建立的)中的多对电极之间脉冲，提供了优于在一对电极之间脉冲的结果的改善的结果。例如在标题为"NeedleElectrodesforMediatedDeliveryofDrugsandGenes"的美国专利No.5,702,359中公开了其中可在治疗性治疗过程中对多对针对进行脉冲的针的阵列。在该申请(其通过引用并入本文，就如同充分列出一样)中，将针置于环状阵列中，但具有连接器和使得能够在相对的针电极对之间产生脉冲的转换设备。可使用一对用于将重组表达载体递送至细胞的针电极。这样的装置和系统在美国专利No.6,763,264(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。或者，可使用单针装置，所述装置允许注射DNA和利用与常规注射针相似的单针进行电穿孔，和施加具有比通过目前使用的装置递送的脉冲的电压更低的电压的脉冲，从而减轻患者经历的触电感。

MID可包含一个或多个电极阵列。所述阵列可包含两个或更多个具有相同直径或不同直径的针。可均匀或不均匀地间隔针。针可以为0.005英寸至0.03英寸、0.01英寸至0.025英寸、或0.015英寸至0.020英寸。针的直径可为0.0175英寸。针可相隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和两个或更多个-针式疫苗注射器组成，所述注射器在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机对脉冲和注射参数进行灵活编程，以及全面记录和存储电穿孔及患者的数据。脉冲发生器可在很短的时间中递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送在100ms持续时间中递送3个15伏的脉冲。这种MID的实例是由InovioBiomedicalCorporation提供的Elgen1000系统，其在美国专利No.7,328,064(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。

MID可以是CELLECTRA(InovioPharmaceuticals,BlueBellPA)装置和系统，其为标准电极系统，帮助将大分子诸如DNA引入体内或植物的选定组织的细胞内。标准电极系统可包含多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的传导连接的电连接器；和电源。操作员可握住固定在承载结构上的多个针电极并牢固地将其插入至体内或植物的选定组织。随后经由皮下针将大分子递送入选定组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器并将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒定电流电脉冲帮助将生物分子引入多个电极之间的细胞。通过借由恒定电流脉冲限制组织中的功耗来使因细胞的过热而引起的细胞死亡降至最低。Cellectra装置和系统在美国专利No.7,245,963(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。

MID可以是Elgen1000系统(InovioPharmaceuticals)。Elgen1000系统可包括提供空心针的装置；和流体递送装置，其中所述设备被适配成驱动使用的流体递送装置，以在将针插入所述身体组织的过程中同时(例如自动地)将流体(本文中描述的疫苗)注射至身体组织中。有利方面是在将针插入的同时逐渐注射流体的能力导致流体在整个身体组织中的更均匀分布。还相信在注射过程中经历的疼痛因被注射的流体的体积在更大区域中的分布而减轻。

此外，流体的自动注射帮助自动监测和记录注射的流体的实际剂量。如果需要，该数据可由控制单元存储以用于存档。

应理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且可在已将针插入通过待治疗的受试者的皮肤后以及当它们被进一步插入进身体组织时进行注射。

可利用本发明的设备向其中注射流体的适当的组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，还可以是肌肉组织。

所述设备还包含用于将针引导插入身体组织的针插入装置。流体注射速率受针插入的速率控制。这具有可控制针插入和流体注射以便插入的速率可匹配所需注射速率的有利方面。其还使得所述设备更容易被用户操作。如果需要，可提供用于自动地将针插入身体组织的装置。

用户可选择开始注射流体的时间。然而，理想地，当针尖已到达肌肉组织时开始注射，并且所述设备可包括用于感应针已插入对于开始流体的注射是足够的深度的装置。这意味着当针已到达所需深度(该深度通常为肌肉组织开始时的深度)时可提醒自动地开始注射流体。肌肉开始时的深度可以例如被采用来作为预设针插入深度，诸如被认为对于针穿过皮肤层是足够的4mm的值。

所述传感装置可包含超声探针。所述传感装置可包含用于感应阻抗或电阻的变化的装置。在该情况下，所述装置可能不这样记录针在身体组织中的深度，而是被适配成感应当针从不同类型的体身组织移动至肌肉中时阻抗或电阻的变化。这些备选装置的任一种提供了感应注射可开始的相对准确和简单的操作装置。如果需要，还可记录针插入的深度，并且可将所述深度用于控制流体的注射以便在记录针插入的深度的同时，确定待注射的流体的体积。

所述装置还可包含：用于支持针的基座；和用于在其中接受基座的壳体，其中所述基座相对于壳体是可移动的，以便当基座相对于壳体位于第一向后位置时将针在壳体内收回，以及当基座位于壳体内的第二向前位置时针伸出壳体。这对于用户是有利的，因为可将所述壳体在患者的皮肤上排成一列，随后可通过相对于基座移动壳体将针插入患者的皮肤。

如上所述，期望实现速率受控的流体注射，以便当将针插入皮肤时，流体在针的长度上均匀分布。所述流体递送装置可包含被适配成以受控速率注射流体的活塞驱动装置。活塞驱动装置可以例如通过伺服马达来驱动。然而，活塞驱动装置可通过相对于壳体在轴向方向上移动的基座来驱动。应理解，可提供用于流体递送的备选装置。因此，例如，可提供可被挤压以以受控或非受控速率进行流体递送的封闭容器来替代注射器和活塞系统。

上述设备可用于任何类型的注射。然而设想其在电穿孔领域中是特别有用的，因此其还可包含用于对针施加电压的装置。这使得针不仅能用于注射而且还可在电穿孔过程中用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场被施加至与注射流体相同的区域。历来存在关于电穿孔的问题，因为极难精确地将电极与先前注射的流体对齐，所以用户意欲在更大面积上注射比所需的体积更大的体积的流体，和在更高的区域上施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。通过使用本发明，可减小注射的流体体积和施用的电场的尺寸，同时实现电场与流体之间的良好拟合。

本发明具有通过下列非限定性实施例说明的多个方面。

4.实施例

实施例1

用于实施例2-4的材料和方法

质粒疫苗构建体。pRelA质粒DNA构建体分别编码全长小鼠NF-κB亚单位p65/RelA(GenBank#TF65_MOUSE)和1型反式激活蛋白T-bet(GenBank#TBX21_MOUSE)。此外，将Ig重链ε-1信号肽(GenBank#AAB59424)融合于每一个序列的N末端，从而替换N末端甲硫氨酸，这促进表达。可对每一个基因进行遗传优化(包括除用以增强蛋白质表达的专有修饰(GenScript,Piscataway,NJ,USA)外的密码子优化和RNA优化)以在小鼠中表达。随后将优化的基因亚克隆进经修饰的pVax1哺乳动物表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，所述基因处于巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子的控制之下。随后将这些试剂在本研究中用作分子佐剂。pGag和pEnv质粒分别表达HIV-1蛋白Gag和Env。

转染和蛋白质印迹分析。将人胚胎肾(HEK)293T细胞维持在补充有10％热灭活的胎牛血清(FCS)、100IU的青霉素/mL、100μg的链霉素/mL和2mML-谷氨酰胺的达尔伯克改良伊格尔培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中。简言之，按照制造商的说明书使用TurboFection8.0(OriGene,Rockville,MD,USA)转染细胞，随后将其孵育24–48小时。利用冰冷的PBS收获细胞，将其离心和洗涤，随后沉淀以用于蛋白质免疫印迹分析。制备细胞核提取物(10⁷个细胞)。随后将来自转染的细胞的核蛋白溶解于含有0.4MNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1mMDTT、1mMPMSF和蛋白酶抑制剂的混合物(PromegaCorp,Madison,WI,USA)的20mMHepes(pH7.9)中。每一种提取物的蛋白质浓度通过Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)来测量，并将提取物在-70℃贮存直至使用。进行标准蛋白质印迹分析。用补充有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂混合片剂；Roche,Indianapolis,IN,USA)的蛋白质裂解缓冲液(0.01MTris-HCl缓冲液pH7.4，含有1％TritonX-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)处理细胞。随后使用12％SDS-PAGE分离裂解物中的蛋白质。将针对RelA和T-bet的蛋白质特异性检测抗体(CellSignalingTechnology,Danvers,MA,USA)与印迹一起孵育，使用增强化学发光(ECL)蛋白质印迹检测系统(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)来使表达可视化。

通过荧光素酶报告基因测定和IFN-γ的产生确认RelA/p65和T-bet的转录活性。在将共表达荧光素酶的表达RelA/p65的载体(pNF-κB-Luc)用于“有佐剂的”疫苗研究之前，将其用于确认所必需的RelA/p65的功能性。进行荧光素酶报告基因测定。简言之，将293T细胞(10⁵个细胞/孔)接种在96孔板中进行24小时。随后用表达RelA/p65Luc的质粒转染细胞，随后孵育6小时。孵育后，除去细胞培养基，用新鲜培养基进行替换。转染后2天，用20ng/mL的重组TNF-α处理细胞6小时，随后通过使用Microlumatplus照度计(LUMATLB9501,BertholdTechnologies,OakRidge,TN,USA)测量荧光素酶活性。为了确认pT-bet功能，测量来自pT-bet转染的CD4+T细胞的IFN-γ的产量。测量IFN-γ的动力基于证明T-bet与IFN-γ的产生之间的直接相关性的先前公开的研究。简言之，在该分析中，使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyibiotec,SanDiego,CA,USA)纯化从Balb/C小鼠的脾分离的初始CD4+T细胞。将这些细胞维持在补充有10％FBS、100U/mL青霉素和200μg/mL链霉素的RPMI培养基中，随后用pT-bet或pVax1(作为阴性对照)进行转染。转染后2天，用抗-CD3+抗-CD28Ab(1μg/mL)刺激细胞过夜。随后通过标准ELISA测量从培养的CD4+T细胞收集的上清液中的IFN-γ水平。.

分析和接种方案。成年雌性BALB/cJ(H-2d)小鼠购自Jackson实验室(BarHarbor,ME,USA)。通过用针将重悬浮于25μLPBS中的25μg质粒注射进左大腿四头肌中来肌内(i.m.)免疫小鼠。接种后，立即在相同的部位进行EP，以2周的间隔进行重复。为了进行EP介导的递送，使用由InovioPharmaceuticals,Inc.(BlueBell,PA,USA)提供的三叉式自适应恒流微创装置(MID)。具体地，通过由26规固体不锈钢电极组成的三角形3-电极阵列(插入皮内2mm)递送方波脉冲，以间隔1秒的延迟的52msec/脉冲递送2个0.1Amp的恒流脉冲。在接种/分子佐剂施用方案过程中，以及直至研究结束，每3天监测所有小鼠的潜在副作用的发展。

脾细胞、T细胞的分离和细胞因子的定量。在第三免疫后7-8天收获脾。简言之，将脾置于补充有10％FBS、1X抗真菌的抗生素(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)和1×β-ME(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)的RPMI1640培养基(Mediatech,Manassas,VA,USA)中。使用Stomacher机器(SewardLaboratorySystems,Bohemia,NY,USA)通过机械破裂脾脏来分离脾细胞，使用40μm的细胞过滤器(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)过滤所得的产物。随后用用于裂解RBC的ACK裂解缓冲液(Lonza,Walkersville,MD,USA)处理细胞5分钟，于PBS中进行洗涤，随后重悬浮于RPMI培养基中以用于ELISPOT测定。使用初始CD4+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,Auburn,CA,USA)从脾纯化CD4初始T细胞。将这些细胞维持在补充有10％FBS、100U/mL青霉素、200μg/mL链霉素的RPMI培养基中，用抗-CD3+抗-CD28(各自1μg/mL)进行刺激。在用抗-CD3+抗-CD28抗体刺激后，培养细胞的培养上清液中的细胞因子产生水平通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检查。

ELISPOT分析。将标准IFN-γELISPOT测定用于本研究。简言之，用抗-小鼠IFN-γ捕捉抗体涂覆96孔板(Millipore,Billerica,MA,USA)，将板在4℃孵育24小时(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。第二天，用PBS洗涤板，随后用封闭缓冲液(PBS中的1％BSA和5％蔗糖)孵育2小时。从脾细胞MACS-纯化(Miltenyibiotec,SanDiego,CA,USA)CD4+或CD8+T细胞(一式三份以5×105个细胞/孔涂板的)，随后用HIV-1Gag(共有亚型B)或Env(亚型B(MN))肽(交叠11个氨基酸、横跨它们各自蛋白质的长度的15聚体(NIHAIDSReagentProgram,Bethesda,MD,USA)进行刺激。在18-24小时的于37℃、5％CO2中的刺激过夜后，在PBS中洗涤板，随后在4℃用购自R&D系统(Minneapolis,MN,USA)的生物素化抗-小鼠IFN-γ单克隆抗体(mAb)将所述板孵育另外24小时。随后再次于PBS中洗涤板，将链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(MabTech,NackaStrand,Sweden)添加至每一个孔，并在室温下孵育2小时。最后，将板在PBS中再次洗涤，随后用BCIP/NBTPlus底物(MabTech,Cincinnati,OH,USA)孵育5–30分钟。在完成基于目测观察的斑点显影(spotdevelopment)后，用蒸馏水洗涤板，随后在室温下干燥过夜。使用自动化ELISPOT读数器(CellularTechnology,ShakerHeights,OH,USA)计数斑点。

T细胞增殖测定。增殖反应通过在重组HIV-1IIIBpr55(Gag)(NIHAIDSReagentProgram,Bethesda,MD)或HIV-1MNIIIBgp160(Env)(ProteinSciences,Meriden,CT,USA)的系列稀释物(5、1和0.1μg/mL)存在的情况下，在96孔U型底板中每孔于培养基中孵育(在37℃用5％CO2进行孵育)105个脾细胞来进行体外测量。氚化的(3H)-胸苷的掺入通过在0-24小时的时期中用1μCi/孔的(3H)-胸苷进行脉冲来测量。随后收获板，在β板读数器(Wallac,Waltham,MA,USA)中测量掺入的3H-胸苷。将增殖反应表达为刺激指数(SI)，通过将Ag-刺激的孔的平均cpm(每分钟的计数)除以非刺激的孔的平均cpm。

ELISA。通过ELISA测试第三次接种后7天收获的来自接种的小鼠的血清的抗重组HIV-1Env(NIHAIDSReagentProgram)的抗体应答。简言之，用重组HIV-1Env蛋白(ProteinSciences)涂覆96孔ELISA板，并在4℃进行孵育，随后用PBS和0.1％Tween-20进行洗涤。随后用PBS和0.2％Tween-20封闭板2小时。在除去封闭溶液后，添加100μL预稀释的(1:50、1:100、1:500、1:1000)小鼠血清，并孵育1小时。随后洗涤板4次，用过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgGmAb(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)进行孵育。最后，再次洗涤板，随后每孔添加200μl的底物溶液(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。随后在15分钟的孵育后测量(OD405nm)处的光密度。以一式三份进行所有测定。

流式细胞术。无菌地取出肌肉组织(即，从注射/接种的部位)，将其在汉克斯平衡盐溶液(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中进行漂洗，切碎成约1×2-mm的方块，在偶尔搅拌的条件下，在37℃于20mL的胶原酶A(1mg/mL,LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中消化45分钟。将细胞消化物通过无菌31μm尼龙网进行过滤，以400g离心10分钟，于10％FCS-DMEM中洗涤2次。随后将细胞沉淀重悬浮于4mL的10％FCS-DMEM中。

为了进行流式细胞术分析，将10⁶个来自免疫的小鼠的细胞的细胞用冰冷缓冲液A(PBS/0.1％BSA/0.01％NaN3)进行悬浮洗涤，在4℃用50μL的1:100稀释的荧光标记的特异性抗体孵育20分钟。所使用的荧光缀合的Ab为FITC-CD11c、PE-CD4、PE-Cy7-CD45R(B220)(eBioscience,SanDiego,CA,USA)、AlexaFluor-750-CD8α和PerCP-Cy5.5-CD11b(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)。将细胞洗涤2次，并立即在流式细胞仪(BectonDickinsonFACS,SanJose,CA,USA)上进行分析。所有孵育和洗涤均用冰冷缓冲液A在4℃进行洗涤。针对单重态和活细胞门控细胞。使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR,USA)分析流式细胞分析数据。

统计分析。通过匹配、双尾未配对t检验来完成组分析，所有值表示为平均值±SEM。将Mann-Whitney分析用于测定统计差异。使用Prism软件(GraphPadPrism5)分析所有数据。(GraphPadPrism,LaJolla,CA,USA)。组之间的统计上显著的差异被定义为*p<0.1、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。

实施例2

佐剂构建和表达

pRelA和pTbet质粒分别编码全长小鼠NF-κB亚单位p65/RelA和1型反式激活蛋白T-bet。每一种质粒被遗传优化，合成并被克隆进经修饰的pVax1哺乳动物表达载体(图1A)。为了测试这些质粒的表达，用每一种质粒转染HEK293T细胞，并且通过标准蛋白质免疫印迹评估蛋白质产量。在转染后24小时和48小时收获的细胞裂解物中，使用特异性Ab检测对应于RelA的约65kDa的蛋白质(图1B)。同样地，通过使用抗-T-betAb，T-bet被检测为约56kDa的蛋白质。结合对于它们各自的蛋白质是特异性的，因为都不结合于来自用空载体对照质粒pVax1转染的细胞的裂解物。这些数据表明在HEK293T细胞的体外转染后，每一种分子佐剂表达它们各自编码的蛋白质。此外，在HeLa细胞荧光素酶表达细胞系统(图1C)中评估IκB-依赖性转录以确认RelA(p65)的激活。以剂量依赖性的方式观察到如通过相对荧光素酶活性测量的RelA表达的增加。即，将质粒从3μg增加至5μg或10μg导致约1.5或2.5倍的相对荧光素酶活性的增加。在T细胞和NK细胞中T-bet表达与IFN-γ表达相关，从而在该测定中IFN-γ用作T-bet的功能性表达的替代物(图1D)。

此外，在用pRelA质粒转染HeLa细胞并用抗-NF-κB(p65)抗体染色后RelA蛋白表达的亚细胞定位的免疫荧光分析(IFA)示于图6中。该IFA进一步确认RelA从pRelA质粒的表达。

实施例3

增强的细胞免疫

随后在增强疫苗诱导的免疫方面评估pRelA和pTbet的贡献。在利用或不利用25μg的pRelA或pTbet的情况下用25μg的pEnv或pGag、用单独的25μg的pRelA或pTbet或利用25μg的对照载体(pVax1；图2)接种Balb/C小鼠(n＝4只/组)3次。通过体内EP在25μLPBS中递送疫苗和佐剂。在第35天(即，第三次接种后7天)处死动物，随后分离脾细胞以用于通过IFN-γELISpot进行免疫分析。在该测定中，HIV-1Env或Gag肽混合物被用于刺激MACS-纯化的CD4+或CD8+T细胞，并且IFN-γELISpot结果示于图2中。观察到CD4+和CD8+T细胞应答在用pEnv和共施用的pRelA接种的小鼠中相较于用单独的pEnv接种的小鼠得以显著增强。同样地，利用pEnv和共施用的pTbet相较于单独的pEnv的免疫显示CD4+和CD8+T细胞应答的显著增强(图2B)。

对于不同的Ag，为了确认这两种佐剂对T细胞IFN-γ产生的增强作用，我们还类似地如上文中所进行的，在使用或不使用pRelA或pTbet的情况下用HIV-1Gag接种动物。与pEnv组类似，当与利用单独的pGag免疫的动物相比较时，CD4+T细胞应答在利用pGag+共施用的pRelA免疫的动物中得以增强(图2C)。相较于利用单独的pGag的免疫，在利用pGag和共施用的pRelA接种的小鼠中存在甚至更大的CD8+T细胞应答的增强(图2C)。此外，当与利用单独的pGag的免疫相比较时，利用HIV-1Gag连同伴随施用的pTbet的免疫显示增强的CD8+T细胞应答(图2C)。然而，CD4+T细胞应答未获得与对于pRelA的共递送观察到的一样的显著增强。同样地，单独的pRelA或pTbet的施用未显著激活抗Gag或Env的CD4+或CD8+T细胞，如通过IFN-γ的产量测量的。因此，这些数据表明转录因子佐剂的共施用促进增强的抗两种单独的抗原的T细胞应答，数据表明通过免疫佐剂的施用刺激了疫苗引发的细胞免疫应答的宽度扩展。

由于观察到RelA分子佐剂尤其地增强T细胞应答，因此评价pRelA存在或不存在的情况下免疫的细胞的增殖潜能。在第三次免疫后7天收获来自接种的动物的脾细胞，随后用它们的同源Ag即HIV-1Env或Gag刺激所述脾细胞(图3)。在pEnv接种的小鼠中，当与未施予佐剂的动物相比较时，在也接受pRelA佐剂的小鼠中在所有Ag剂量上存在朝向增强的增殖的倾向(图3A)。也在pGag接种的动物中观察到该倾向，其中当共递送pRelA时总的刺激指数更高(图3B)。同样地，在图3A、B中，除了总的刺激指数以外，还包括倍数增加的图表，所述“倍数”值为pEnv+pRelA或pGag+pRelA组的刺激指数除以单独的pEnv或pGag组的刺激指数的比率。因此，通过包含pRelA佐剂，pEnv和pGag接种的动物的刺激指数在所有测试的疫苗剂量上得以增加。这些应答对于HIVAg是特异性的，因为在来自接受单独的pRelA佐剂的动物的脾细胞中观察到最低程度的增殖。综上所述，这些结果表明pRelADNA佐剂增强抗两种单独的特定抗原的Ag特异性T细胞增殖应答。

此外，图7显示来自用包含或不包含佐剂RelA的疫苗免疫的小鼠的以pg/mL表示的白细胞介素-2(IL-2)的浓度。这些数据表明在疫苗中包含RelA使IL-2的产量显著增加约3倍。

实施例4

通过有佐剂的接种增强抗体应答

基于观察到的佐剂介导的T细胞IFN-γ和增殖反应的增加，评价这些分子佐剂对B细胞诱导的作用。在第三次接种后7天，在接种的动物的血清中测量HIV-1Env特异性IgG。如所指示的，小鼠接受具有或不具有共施用的pRelA或pTbet的pEnv、单独的pRelA或pTbet或pVax1对照质粒(图4)。利用单独的pEnv以在1:50至1:500的范围内的稀释度诱导可测量的IgG应答，但在1:1,000的稀释度上不再是可测量的。当与单独的pEnv组相比较时，通过包含pRelA或pTbet佐剂，这些应答在所有稀释度上得以增强。具体地，在1:50的血清稀释度上观察到差异，其中pRelA和pTbet的施用显著增强HIV-1Env特异性IgG应答的诱导(分别为p＝0.0388和p＝0.0062)。增强的IgG应答对于Env是特异性的，因为在来自被施予单独的pRelA或pTbet佐剂的小鼠的血清中观察到最低程度的抗体应答。这些数据表明两种转录因子佐剂都引发与在用pRelA或pTbet接种后观察到的升高的IFN-γ水平和T细胞增殖反应类似和一致的增强的体液免疫应答。

图8A显示利用pRelA共免疫的Balb/C小鼠的增强的体液免疫应答。来自用编码pVax1、pEnv或pEnv+pRelA的质粒DNA免疫的小鼠的血清的ELISA分析。通过ELISA测量抗来自DNA接种的小鼠的血清中的gp120的IgG抗体反应性。免疫小鼠3次或1次。OD405，405nm处的光密度。图8B显示RelA对至IgG亚类的同种型转换的差异作用。测定表达总的IgG1和IgG2的脾Env和Env+RelA细胞。值代表5个独立实验的平均值±SEM。值代表3个独立实验的平均值±SEM。

图8C显示利用pRelA共免疫的Balb/C小鼠的增强的体液免疫应答。来自用编码pVax1、pEnv或pEnv+pT-bet的质粒DNA免疫的小鼠的血清的ELISA分析。通过ELISA测量抗来自DNA接种的小鼠的血清中的gp120的IgG抗体反应性。免疫小鼠3次或1次。OD405，405nm处的光密度。图8D显示T-bet对至IgG亚类的同种型转换的差异作用。测定表达总的IgG1和IgG2的脾Env和Env+T-bet细胞。值代表5个独立实验的平均值±SEM。值代表3个独立实验的平均值±SEM。

转录因子增强抗体应答的一个可能机制可以完全是活化的B细胞的数量的增加。为了评估这是否发生，在用共施用的pRelA进行pEnv免疫后3天在接种部位对施予pRelA的肌肉进行活组织检查，随后定量注射部位的B220+B细胞数量。图9显示相对表达(以百分比表示)。结果表明单独的pRelA和pEnv仅引起相较于单独的pVax1施用B细胞至注射部位的运输的微小增加(图5)。这通过单个FACS扫描中显示的MFI(平均荧光强度)值来表示，其与B220+B细胞的水平成正比。然而，与pEnv疫苗组合的pRelA佐剂的添加进一步增加注射部位的B细胞数量。

总之，实施例2-4中的数据表明细胞转录因子RelA和T-bet作为用于增强DNA疫苗诱导的免疫的分子佐剂的用途。当通过体内电穿孔(EP)与原型DNA疫苗一起共递送时，这些佐剂的任一种刺激增强的抗原特异性T和B细胞应答，如通过增加的T细胞数量和IFN-γ产量，以及通过抗体水平的升高指示的。与pEnv或pGag疫苗结合的pRelA或pTbet的共施用显著增强T细胞免疫，如通过INF-γ产量(通过ELISpot)和增殖测量的。同样地，B细胞/抗体水平得以升高，如通过B细胞数量以及抗原特异性抗体滴度的增加指示的。与这些发现一致，在共施用表达所述转录因子的质粒后血清中的抗原特异性IgG的总量得以增加。

实施例5

利用TWEAK或GITRL作为佐剂的细胞应答

通过优化编码全长TWEAK的核苷酸序列的密码子使用来构建pTWEAK质粒。随后将该优化的核苷酸序列在BamHI和EcoRI限制位点克隆进pVAX1表达载体。

通过优化编码全长GITRL的核苷酸序列的密码子使用来构建pGITRL质粒。随后将该优化的核苷酸序列在BamHI和EcoRI限制位点克隆进pVAX1表达载体。

所述研究中包括10组小鼠。每组有4只小鼠，每组中的小鼠为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。用单独的抗原(即，15μg的编码HIV-1Env的DNA)免疫一个组，用15μg的编码HIV-1Env的DNA和7.5μg的pTWEAK(“T”)免疫一个组，用15μg的编码HIV-1Env的DNA和10μg的pTWEAK(“T”)免疫一个组，用15μg的编码HIV-1Env的DNA和7.5μg的pGITRL(“G”)免疫一个组，以及用15μg的编码HIV-1Env的DNA和10μg的pGITRL(“G”)免疫一个组。

肌内(IM)进行免疫，随后用MID-EP系统进行电穿孔。具体地，对于每一次免疫，使用具有29规针的胰岛素注射器注射25μg的DNA。在每一次免疫后1周，通过眶后放血对小鼠进行取血。

在图10中示意性显示了免疫方案。在第0天给予小鼠启动免疫，随后在第14天和第28天给予小鼠加强免疫。在第35天处死小鼠以收获最终的取血用于ELISA分析和收获脾细胞用于ELSspot分析。

TWEAK和GITRL的ELISspot分析的结果分别示于图11和12中。这些数据表明TWEAK相较于不存在TWEAK的疫苗增强针对所述抗原的细胞免疫应答(如通过升高的IFN-γ水平证明的)。这些数据还表明GITRL相较于不存在GITRL的疫苗增强针对所述抗原的细胞免疫应答(如通过升高的IFN-γ水平证明的)。因此，TWEAK和GITRL用作相较于不存在TWEAK或GITRL(作为佐剂)的相同疫苗升高IFN-γ水平和增强针对所述抗原的细胞免疫应答的佐剂。

实施例6

利用TWEAK或GITRL作为佐剂的体液免疫应答

当将TWEAK或GITRL在疫苗中用作佐剂时，检查体液免疫应答。将在上述实施例5中描述的和图10中显示的安排的免疫用于本研究中。经由ELISA测量体液应答，其中在OD450测量光密度。所有实验组相对于首次接触实验的小鼠在达到约158的滴度稀释度倒数上都显示光密度的显著增加。具体地，10μg剂量的GITRL在50的滴度稀释度倒数上显示体液应答的最显著增强，光密度增加至3倍。当使稀释度增加高于5000时，实验组相对对照的差异得以减小。

实施例7

利用EOMES作为佐剂的细胞应答

通过优化编码EOMES的核苷酸序列的密码子使用来构建pEOMES质粒。随后将该优化的核苷酸序列在BamHI和EcoRI限制位点克隆进pVAX1表达载体。IgE前导序列和Kozak序列也位于编码EOMES的核苷酸序列的5’。所述构建体的示意图示于图14A中。

通过用pEOMES质粒和pVAX1质粒(阴性对照)转染细胞来确认EOMES从pEOMES质粒的表达。如图14B中所示，EOMES在用pEOMES转染的细胞中表达，但在用pVAX1转染的细胞中不表达。转染后2天通过裂解物的蛋白质印迹分析表达，其中细胞已用10μg的DNA转染。

在所述研究中包含小鼠的组。每组5只小鼠，并且每组的小鼠为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。用pVAX1(阴性对照)免疫一个组的小鼠，用单独的抗原(即，编码HIVEnv的DNA，质粒被称为pHIV-Env)免疫一个组，以及用pHIV-Env和pEOMES免疫一个组。

进行肌内(IM)免疫，随后利用MID-EP系统进行电穿孔。具体地，对于每一次免疫，使用具有29规针的胰岛素注射器注射25μg的DNA。在每一次免疫后1周，通过眶后放血对小鼠进行取血。

免疫方案示意性显示于图15中。在第0周给予小鼠启动免疫，随后在第2周和第4周给予小鼠加强免疫。在第5周处死小鼠以收获脾细胞用于ELSspot分析。

ELISspot分析的结果示于图16中。这些数据表明EOMES相较于不存在EOMES的疫苗增强针对所述抗原的细胞免疫应答(如通过升高的IFN-γ水平证明的)。因此，EOMES用作相较于不存在EOMES(作为佐剂)的相同疫苗升高IFN-γ水平和增强针对所述抗原的细胞免疫应答的佐剂。

实施例8

利用STING作为佐剂的细胞应答

通过优化编码STING的核苷酸序列的密码子使用来构建pSTING质粒。随后将该优化的核苷酸序列克隆进pVAX1表达载体。

通过用pSTING质粒和pVAX1质粒(阴性对照)转染293T细胞来确认STING从pSTING质粒的表达。如图17中所示，STING在用pSTING转染的细胞中表达，但在用pVAX1转染的细胞中不表达。转染后2天通过裂解物的蛋白质印迹分析表达，其中细胞已用10μg的DNA转染。

在所述研究中包含小鼠的组。每组4只小鼠，并且每组的小鼠为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。用pVAX1(阴性对照)免疫一个组的小鼠，用单独的抗原(即，编码HIVEnv的DNA，质粒被称为pHIV-Env)免疫一个组，以及用pHIV-Env和pSTING(20μg)免疫一个组，以及用pHIV-Env和pSTING(50μg)免疫一个组。

进行肌内(IM)免疫，随后利用MID-EP系统进行电穿孔。具体地，对于每一次免疫，使用具有29规针的胰岛素注射器注射DNA。每一次免疫后一周，通过眶后放血对小鼠进行取血。

免疫方案示意性示于图18中。在第0周给予小鼠启动免疫，随后在第2周和第4周给予加强免疫。在第5周处死小鼠以收获脾细胞用于ELSspot分析。

ELISspot分析的结果示于图19中。这些数据表明STING相较于不存在STING的疫苗，增强针对所述抗原的细胞免疫应答(如通过升高的IFN-γ水平证明的)。因此，STING用作相较于不存在STING(作为佐剂)的相同疫苗升高IFN-γ水平和增强针对所述抗原的细胞免疫应答的佐剂。

应理解，前文详述和所附实施例仅是例举性的并且无意被视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同物确定。

对公开的实施方案的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。可在不背离其精神和范围的情况下进行这样的改变和改进，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和改进。

Claims (23)

1.一种包含抗原和一种或多种佐剂的疫苗，所述佐剂选自Rel-A、T-bet、Eomes、FLT3L、TWEAK、GITRL和STING。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述一种或多种佐剂由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13中所示的核苷酸序列或其组合编码。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述一种或多种佐剂包含编码SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：12.SEQIDNO：14中所示的氨基酸序列或其组合的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原由第一核酸编码并且所述佐剂由第二核酸编码。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其还包含具有与根据权利要求4所述的抗原相同的编码的核酸序列的抗原肽，和具有与根据权利要求4所述的佐剂相同的编码的核酸序列的佐剂肽。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述抗原选自人乳头状瘤病毒(HPV)抗原、HIV抗原、流感病毒抗原、恶性疟原虫抗原及其片段。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其中所述HIV抗原选自EnvA、EnvB、EnvC、EnvD、BNef-Rev、Gag及其任意组合。

8.根据权利要求6所述的疫苗，其中所述流感病毒抗原选自H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原及其任意组合。

9.根据权利要求6所述的疫苗，其中所述恶性疟原虫抗原包括环子孢子(CS)抗原。

10.根据权利要求6所述的疫苗，其中所述HPV抗原选自HPV16E6抗原、HPV16E7抗原及其组合。

11.根据权利要求1所述的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。

12.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述第二核酸还包含表达载体。

13.一种用于增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用根据权利要求1、2或3中任一项所述的疫苗。

14.根据权利要求13所述的方法，其中施用所述疫苗包括肌内施用和皮内施用的至少一种。

15.根据权利要求13所述的方法，其中施用所述疫苗包括电穿孔。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者的免疫应答被增强约50％至约150％。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者的免疫应答被增强约90％至约130％。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者的免疫应答被增强约105％。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者的免疫应答被增强至少约2.5倍。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者的免疫应答被增强至少约1.5倍。

21.一种包含一个或多个核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列选自：SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、与SEQIDNO:1具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:3具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:5具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:7具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:9具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:11具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:13具有95％或更大的同一性的核苷酸序列及其组合。

22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述核酸分子是质粒。

23.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述核酸分子是一个或多个质粒。