CN101897965B - 乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，包含步骤：构建HBcAg与Fc双基因共表达重组真核载体；将获得的双基因共表达重组真核载体加入皂苷Quil A，加入胆固醇及卵磷脂，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物为形成的免疫刺激复合物；获得的免疫刺激复合物活化刺激树突状细胞获得所述细胞治疗性疫苗。该疫苗通过高效转染树突状细胞，生成的融合蛋白通过Fc片段再次高效靶向树突状细胞，从而激活树突状细胞，促进乙肝病毒核心抗原特异性T细胞免疫应答，高效诱导免疫细胞的抗病毒复制的能力，可作为乙肝病毒治疗性疫苗。

Description

乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗

技术领域

本发明涉及一种治疗性疫苗及其制备方法，尤其涉及一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。为此，寻求理想的抗HBV药物一直是亟待解决的研究课题。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物进行治疗，应用的抗病毒药物主要有干扰素和核苷类药物如拉米夫定等，其中，干扰素的适应症有限，疗效较差，不良反应发生率较高，且价格昂贵；拉米夫定作为逆转录酶的强抑制剂，在控制慢性HBV感染方面具有确切的近期疗效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝细胞内HBV复制的来源，长期用药又存在耐药问题。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。

CD8+T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。HBV感染的慢性化主要是由于机体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一种结构蛋白，是机体CTL识别和攻击HBV感染细胞的主要靶抗原。因此，增强HBcAg特异性的CTL应答，有望终止慢性HBV感染。

但是，HBV的慢性患者存在免疫应答低，特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受等问题，在设计治疗性疫苗时需增强免疫系统对HBV的识别能力以激发有力的特异性细胞免疫。

树突状细胞(DC)是体内最强大的专职抗原递呈细胞，能够识别、捕获、加工、递呈抗原引发初始免疫反应。利用DC来改善病毒的免疫原性是治疗性疫苗设计的重要策略之一。DC显著的特点是：①为功能很强的专职APC；②可分泌极化信号诱导Th0细胞向Th1细胞分化；③可通过“交叉激活”途径激活CD8+T细胞。因此，若将抗原特异性地靶向DC，定能增强疫苗的疗效。DC表面具有Fc受体，为设计DC靶向性疫苗创造了条件。

免疫球蛋白G(IgG)Fc片段是抗体恒定区重要的结构域，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位，Fc能介导抗体的多种生物学功能。Fc不仅能够激活补体系统，而且还能介导抗原抗体复合物通过Fc受体与抗原呈递细胞结合，并在受体的介导下促进抗原呈递细胞对外来抗原的吞噬，进而激发机体对特定抗原的细胞免疫反应。由于Fc具有介导细胞的免疫应答反应，所以人们利用Fc片段与特异抗原蛋白进行融合，以促进抗原对抗原呈递细胞的靶向性，提高机体对特异抗原的免疫应答反应，特别是细胞免疫应答反应。研究已证明，在抗原呈递细胞中，通过Fc受体介导内吞的外来抗原，不仅可以大幅度(1 000～10 000倍)促进MHCII途径呈递抗原的活性而激活CD4+T细胞，而且还可以通过MHC I交叉呈递抗原作用激活CD8+T细胞。所以用Fc融合抗原可以刺激机体抗原特异性的淋巴细胞毒性反应，所以可被用于病毒的免疫治疗。

免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成的一种直径为30～40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈细胞的吞噬。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗。

本发明还提供上述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法，其主要包含步骤：

1)构建乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体；

2)制备免疫刺激复合物：将步骤1)中获得的乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的免疫刺激复合物；

3)步骤2)获得的免疫刺激复合物活化刺激树突状细胞获得所述细胞治疗性疫苗。

根据上述方法，步骤1)具体包括：将HBcAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将Fc全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，获得HBcAg和Fc双基因共表达重组真核载体。

其中，步骤1)中所述HBcAg全长cDNA经SEQ ID NO：3-4所示的引物扩增获得；所述免疫球蛋白G的Fc全长cDNA经SEQ IDNO：5-6所示的引物扩增获得。

步骤2)的免疫刺激复合物中，所述乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。

根据上述方法，所述表达载体优选为pT-Easy载体。

由上述方法制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其为免疫刺激复合物活化刺激树突状细胞所得的细胞治疗性疫苗，其中免疫刺激复合物主要由乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成。

所述乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBcAg全长cDNA和免疫球蛋白G的Fc全长cDNA而构成。

所述HBcAg全长cDNA经SEQ ID NO：3-4所示的引物扩增获得；所述免疫球蛋白G的Fc全长cDNA经SEQ ID NO：5-6所示的引物扩增获得。

所述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其中表达载体优选为pT-Easy载体。

所述免疫刺激复合物中，乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。

本发明的乙肝治疗性树突状细胞疫苗能够促进乙肝病毒核心抗原特异性T细胞免疫应答，高效诱导免疫细胞的抗病毒复制的能力，可用作制备乙肝病毒治疗性疫苗。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为PCR扩增HBcAg基因的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为PCR扩增Fc基因的琼脂糖凝胶电泳结果；

图3为透射电镜检测免疫复合物疫苗的结构；

图4为光镜下检测树突状细胞活化后的结构；

图5为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测乙肝治疗性树突状细胞疫苗激发T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力；

图6为HBV转基因小鼠血清ALT活性检测结果；

图7为HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备

1、HBcAg和Fc双基因共表达重组真核载体的构建

(1)HBcAg基因的克隆

根据GenBank登录号为NC 003977.1的HBcAg基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的HBcAg cDNA全长：F1：5’-aatctgcag ggcatggacatcgacccttat-3’(SEQ ID No：3)，下划线部分为Pst I酶切位点；R1：5’tacgaattcagttccccaccttatgagtc-3’(SEQ ID No：4)，下划线部分为EcoR I酶切位点；分离HBV转基因小鼠的肝脏细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×10⁷个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与p-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了HBcAg cDNA全长序列(SEQ ID No：1)的阳性克隆质粒命名为pT-HBcAg；

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。

(2)Fc全长cDNA的克隆

根据GenBank登录号为NM 000566的Fc基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的FC全长cDNA：上游引物F2：5’gatcggatccatgtggttcttgacaactct-3’(SEQ ID No：5)，下划线部分为BamH I酶切位点；下游引物R2：5’acgcgtcgacctacttggccccctg-3’(SEQ ID No：6)，下划线部分为Sal I酶切位点；按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，采用上下游引物F2和R2进行PCR扩增，PCR总体系为50μL，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了Fc全长cDNA序列(SEQ ID No：2)的阳性克隆质粒命名为重组载体pT-Fc。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约1200bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。

(3)HBcAg和Fc双基因共表达重组真核载体的构建

根据HBcAg和Fc全长cDNA两端所设计的酶切位点，先将HBcAg全长cDNA插入含有内部核糖体进入位点IRES的双基因共表达真核载体pStar的IRES上游，再将FC全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为：先将重组载体pT-HBcAg用Pst I和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为重组载体pStar-HBcAg；再将重组载体pT-FC用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBcAg连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为HBcAg和FC双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES-FC。

2、HBcAg-Fc双基因免疫刺激复合物ISCOM的制备

将HBcAg和Fc双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES-Fc用磷酸盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷QuilA，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和Fc双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的免疫刺激复合物ISCOM。

3、透射电镜分析

将新鲜制备的免疫刺激复合物ISCOM滴于200目铜网上，吸附3min。吸水纸吸干，晾干30s。以1％(W/V)水溶性醋酸铀负染30s，吸水纸吸干，晾干30s。80kV透射电镜观察，结果如图3，复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。

4、树突状细胞疫苗的制备

无菌条件下提取小鼠股骨骨髓细胞，放入PRMI1640培养液(含10％胎牛血清，0.1ml青-链霉素)中吹打混匀，3h后取贴壁细胞加入IL-4(终浓度为500U/ml)和GM-CSF(终浓度为1000U/ml)，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。每3天半量更换1次培养液，同时加入GM-CSF和IL-4，诱导树突状细胞的生成。并用0.1mg的免疫刺激复合物ISCOM与1×10⁶的树突状细胞共孵育，37℃，24h，所活化的树突状细胞即为树突状细胞疫苗，光镜观察结果如图4。

二、树突状细胞疫苗的抗病毒活性研究

效应细胞的制备：将30只6～8周龄雌性HBV转基因Babl/c小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组10只；将HBcAg-Fc双基因免疫刺激复合物ISCOM和HBcAg免疫刺激复合物ISCOM活化的树突状细胞1×10⁶于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。实验组以HBcAg-FC双基因免疫刺激复合物ISCOM活化的树突状细胞为免疫原，对照组以HBcAg免疫刺激复合物ISCOM活化的树突状细胞为免疫原，空白组以浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS为免疫原。

1、ELISPOT法检测树突状细胞激发CTL分泌IFN-γ的能力

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，作为效应细胞；采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-γ捕获抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-γ抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1∶5000)100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。

结果见图5，实验组的斑点数明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明的HBcAg-Fc双基因免疫刺激复合物ISCOM活化的树突状细胞具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。

2、HBV转基因小鼠血清ALT活性检测

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清ALT活性。

结果见图6，实验组的血清ALT活性明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明的HBcAg-Fc双基因免疫刺激复合物ISCOM活化的树突状细胞能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，从而导致血清ALT活性明显升高。

3、HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清HBV DNA抑制率。

结果见图7，实验组的血清HBV DNA抑制率明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明的HBcAg-Fc双基因免疫刺激复合物ISCOM活化的树突状细胞能够有效抑制HBV的复制，显著降低血清HBV DNA载量。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗

<130>10P99073-CN

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>552

<212>DNA

<213>HBcAg全长cDNA序列

atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct    60

tctgacttct ttccttccat tcgtgatctt ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag    120

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<210>2

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<212>DNA

<213>Fc全长cDNA序列

<400>2

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<210>3

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<212>DNA

<213>扩增HBcAg全长cDNA的引物

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<212>DNA

<213>扩增HBcAg全长cDNA的引物

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<212>DNA

<213>扩增Fc全长cDNA的引物

<400>5

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<210>6

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<212>DNA

<213>扩增Fc全长cDNA的引物

<400>6

acgcgtcgac ctacttggcc ccctg                                      25

Claims (9)

1. 一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，包含步骤：

1）构建乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体，构建载体包括：将HBcAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将Fc全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，获得HBcAg和Fc双基因共表达重组真核载体；

2）制备免疫刺激复合物：将步骤1）中获得的乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的免疫刺激复合物；

3）步骤2）获得的免疫刺激复合物活化刺激树突状细胞获得所述细胞治疗性疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述HBcAg全长cDNA经SEQ ID NO:3-4所示的引物扩增获得；所述免疫球蛋白G的Fc全长cDNA经SEQ ID NO:5-6所示的引物扩增获得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）的免疫刺激复合物中，所述乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5:10:1:1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pT-Easy载体。

5.由权利要求1所述的方法制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其特征在于，其为免疫刺激复合物活化刺激树突状细胞所得的细胞治疗性疫苗，其中免疫刺激复合物主要由乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成。

6.根据权利要求5所述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBcAg全长cDNA和免疫球蛋白G的Fc全长cDNA而构成。

7.根据权利要求6所述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其特征在于，所述HBcAg全长cDNA经SEQ ID NO:3-4所示的引物扩增获得；所述免疫球蛋白G的Fc全长cDNA经SEQ ID NO:5-6所示的引物扩增获得。

8.根据权利要求5-7任一项所述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其特征在于，所述表达载体为pT-Easy载体。

9.根据权利要求8所述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗，其特征在于，所述免疫刺激复合物中，乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5:10:1:1。

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