CN113907048B - 一种重症肌无力eamg小鼠骨骼肌模型的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明创造提供了一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，本发明在人工合成AChR肽段免疫诱导C57BL/6小鼠的基础上，结合输注体外培养的高抗原提呈能力的树突状细胞，建立一种免疫强化的EAMG小鼠模型，同时对该模型进行全新多模态骨骼肌检测，本发明公开一种免疫强化重症肌无力小鼠模型，建立骨骼肌的评价新方法，该方法对受累骨骼肌实现量化分析、功能影像评价、组织靶点确定。本发明创造所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，缩短EAMG小鼠的成模时间以及提高成模率，有利于重症肌无力动物实验的开展，有利于减少重症肌无力动物实验耗时，有利于控制重症肌无力动物实验的成本。

Description

一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法
技术领域
本发明创造属于重症肌无力领域，尤其是涉及一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法。
背景技术
重症肌无力（MG）是以骨骼肌无力为主要表现的一种自身免疫性疾病。该疾病由细胞免疫介导自身抗体参与，致使神经肌肉接头处乙酰胆碱受体受累。其患病率为150-300人/100万人，其中抗乙酰胆碱受体阳性重症肌无力（AChR MG） 患病率为70-163/100万人。重症肌无力仍是难治性疾病。
重症肌无力与其它自身免疫性疾病或肿瘤相关性肌肉疾病单独发病或同时存在。虽然肌无力的精准免疫分型已在临床应用，但不同类型肌无力的靶点分型与干预，仍是相关研究和应用领域的重点工作。
实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠是研究此类疾病经典的动物模型。通过建立实验性重症肌无力动物模型, 探讨重症肌无力的发病机理及相关免疫治疗的靶点。模型制作有多种方法，其中人工合成的AChR免疫诱导C57BL/6小鼠制作EAMG小鼠模型是最常见的造模方式。
人工合成AchR诱发的免疫反应为主动免疫动物模型。在动物体内须经T细胞、DC细胞对抗原的处理呈递，由B细胞生成抗体，不断作用于靶组织器官致病。然而，这一过程相对较长，同时造成成模阳性率低、成模不稳定。
此外，目前对于重症肌无力动物模型的评价指标主要为临床肌力Lennon评分法、肌电图、血清anti-AChR抗体检测。然而现有的评价指标，前者评价的主观判断性强，后两者稳定性不足；对于重症肌无力骨骼肌的分级缺乏客观依据；对于特异性肌群靶点的关注、评价较少；对于重症肌无力发生发展的观察缺乏连续性；对于实验性的EAMG的靶器官组织肌肉的评价，局限于肌细胞的损伤和免疫炎性反应层面，对相关组织自身免疫性抗体关注较少。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，以解决临床肌力指标的主观性强、对特定肌群评价不足、缺乏有效的连续性观察指标的问题。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，包括如下步骤：S1：准备若干个小鼠，并饲养一段时间；
S2：配置用于诱导小鼠成模的免疫制剂；
S3：麻醉小鼠，给小鼠注射免疫制剂；
S4：成熟树突状细胞和胸腺瘤细胞系体外共同培养，获得高抗原提呈能力的树突状细胞；
S5：每间隔一段时间，给小鼠注射S4中得到的高抗原提呈能力的树突状细胞，连续注射若干次。
S6：第一次注射免疫制剂一段时间后，对所有小鼠进行最后Lennon评级，阳性者结束此次实验。
所述步骤S1中选取周龄6-8周的SPF级C57BL/6小鼠；
免疫制剂包括第一免疫制剂、第二免疫制剂，给小鼠注射第一免疫制剂，间隔一段时间后注射第二免疫制剂，间隔一段时间后再次注射第二免疫制剂；
所述步骤S3中第一免疫制剂包括抗乙酰胆碱受体（AChR）和弗氏完全佐剂（CFA），所述第二免疫制剂包括抗乙酰胆碱受体（AChR）和弗氏不完全佐剂（IFA）；
所述步骤S4中的胸腺瘤细胞系是胸腺瘤细胞系Thy0517；
所述步骤S5中每次每只小鼠输注细胞数量约为0.5×106~1×106；
所述步骤S6中的一段时间为98天。
所述步骤S4中高抗原提呈能力的树突状细胞的培养，包括如下步骤：
A1：取出在液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517，配置成细胞悬液，观察细胞活性；
A2：从胸腺瘤细胞系细胞中提取RNA，并将其逆转录为cDNA；通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；将获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染胸腺瘤细胞系细胞，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
A3：取出在液氮中保存的复苏人急性单核细胞白血病细胞，配置成细胞悬液，观察细胞活性；
A4：复苏人急性单核细胞白血病细胞在诱导树突状细胞成熟混合因子A和诱导树突状细胞成熟混合因子B的作用下，得到成熟树突状细胞；
A5：将步骤A2中得到的高自噬水平胸腺瘤细胞和A4中得到的成熟树突状细胞共同培养若干天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。
一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，包括以下方法中的一种或几种方法：
（1）使用CT扫描确定EAMG鼠脊柱弯曲角度；
（2）使用18F-FDG PET/CT扫描检测肌肉代谢功能情况；
（3）使用多重组织病理染色明确EAMG鼠肌肉分子靶点；
（4）对动物模型进行Lennon评分检测；
（5）对动物模型进行肌电图检测；
（6）对动物模型进行血清AChR抗体检查。
使用CT扫描确定EAMG鼠脊柱弯曲角度，包括如下步骤：
B1:将小鼠麻醉，然后转移至小动物PET/CT机检查床上；
B2：CT扫描软件准备，进行CT扫描，获得3D影像；
B3：确定脊柱弯曲成角，并测量脊柱弯曲成角角度；
B4：对实验小鼠脊柱弯曲角度结果进行统计学分析，结合Lennon评分法明确及量化EAMG小鼠骨骼肌模型的分级。
所述步骤B3中选取小鼠脊柱正位矢状面切面图像，依次连接小鼠第5-10胸椎的中点，根据中点连线做一条直线；再依次连接第1-4腰椎的中点，以小鼠腰椎中点做一条直线；延长两条直线，两直线相较于小鼠脊柱上方一点，此相交处的夹角即为所需脊柱弯曲角度；
通过CT骨扫描检测球形征小鼠的脊柱弯曲成角角度，随着Lennon评分法等级的加重，脊柱弯曲的角度随之减小，且随等级递进，可成为Lennon评分法的量化指标。
使用18F-FDG PET/CT扫描检测肌肉代谢功能情况，包括如下步骤：
C1：小鼠准备，小鼠检查前一天，禁食禁水；
C2:对小鼠进行喂糖，间隔一段时间后对小鼠麻醉；
C3：对有放射性的标记物质进行稀释，给小鼠经尾静脉注射有放射性的标记物质；
C4：放射性标记物质注射后，间隔一段时间后将小鼠转移至小动物PET/CT机检查床上，进行PET/CT扫描；
C5：扫描后对数据进行分析。
所述步骤C3中有辐射的标记物质为18F-FDG，所述放射性标志物浓度为：0.5-1.2μCi/μl，放射性标志物剂量 为75-250μCi；
所述步骤C4中打药后30-60min上机检测；
所述步骤C5中的数据分析为18F-FDG PET/CT功能显像检测相应的模型骨骼肌肌肉代谢SUVmean值比正常小鼠的SUVmean值低。
多重组织病理染色明确EAMG鼠肌肉分子靶点，包括如下步骤：
D1：取小鼠的髂腰肌和大腿肌群标本；
D2：将D1中的标本用盐水漂洗，然后固定；
D3：对小鼠的标本进行梯度乙醇脱水、浸泡透明、透蜡、石蜡包埋、切片、贴片；
D4：对小鼠标本进行烤片、水化、染色、脱水；
D5：然后封片观察，得出结论；
所述步骤D4中的染色方法包括HE染色、Masson染色与免疫组化染色；
所述步骤D5中在HE染色与Masson染色中可观察到，EAMG鼠骨骼肌肌纤维组织变得疏松散乱，纤维细胞出现空泡，细胞核数量减少，少数细胞核向肌纤维细胞内侧移行，少数肌纤维胞核体积变大，结构松散；在免疫组化染色中，可观察到EAMG鼠肌纤维细胞中Titin表达量增高，RYR表达量显著增高。
一种重症肌无力EAMG小鼠模型的建立方法，通过注射高抗原提呈能力树突状细胞，强化EAMG小鼠免疫，从而缩短EAMG鼠模型成模率、缩短成模时间，及通过骨CT扫描检测球型征小鼠的脊柱弯曲成角角度，PET/CT对小鼠髂腰肌肌群和大腿肌群功能代谢显像，结合两个部位的骨骼肌病理抗原表位HE和免疫组化染色，对其骨骼肌进行解剖机构、功能影像和组织病理多模态评价，应用于通过建立实验性重症肌无力动物模型，实现对模型的量化观察、无创的连续性动态观察，进一步探讨重症肌无力的发病机理及骨骼肌相关靶点。
本发明在人工合成AChR肽段免疫诱导C57BL/6小鼠的基础上，结合输注体外培养的高抗原提呈能力的树突状细胞，建立一种免疫强化的EAMG小鼠模型。同时进行全新多模态自身免疫性骨骼肌损伤的评价，本发明公开一种免疫强化重症肌无力小鼠模型，建立骨骼肌损伤的评价新方法，该方法实现对受累骨骼肌临床损伤程度量化分析、功能影像评价、组织靶点确定。
在注射人工合成AChR肽段诱导免疫小鼠的基础上，结合输注高抗原提呈能力的树突状细胞，该树突状细胞经成熟树突状细胞和胸腺瘤细胞系Thy0517体外共培养，能诱导小鼠体内免疫强化，可有效缩短成模周期12天，成模周期从110±3天有效缩短为98±3天，并提高模型成模率。
由人急性单核细胞白血病细胞THP-1，经诱导树突状细胞成熟混合因子培养，获得成熟的树突状细胞，再将成熟的树突状细胞与胸腺瘤细胞系Thy0517共培养，获得高抗原提呈能力；其高抗原提呈能力表现在，通过流式细胞学检测，该树突状细胞CD80、CD83、CD86的表达明显增强，提示抗原提呈能力增强。
通过骨CT扫描检测球型征小鼠的脊柱弯曲成角角度，18F-FDG PET/CT 对小鼠髂腰肌肌群和大腿肌群功能代谢显像，结合两个部位的骨骼肌病理抗原表位HE和免疫组化染色，对小鼠自身免疫受累骨骼肌进行解剖机构、功能影像和组织病理多模态评价。
通过CT骨扫描检测球形征小鼠的脊柱弯曲成角角度，将其弯曲成角角度与EAMG小鼠Lennon评分法进行对照，通过统计学验证，并成为量化指标。角度分级为：正常角度为：122°-138°，评分1级为：101°-114°，评分2级为：93°-99°。
18F-FDG PET/CT功能显像检测相应的损伤的骨骼肌肌肉肌肉代谢SUVmean值降低，其对照组髂腰肌正常范围为1.94±0.05，模型鼠髂腰肌范围为1.08±0.13；其对照组大腿肌群正常范围为1.88±0.08，模型鼠大腿肌群范围为1.15±0.08。有助于明确其诊断价值并达到动态评价。
通过对髂腰肌与大腿肌群的HE染色，Masson染色，可见EAMG小鼠肌肉组织出现病理变化，EAMG模型鼠骨骼肌肌纤维组织变得疏松散乱，细胞核数量减少，少数细胞核向肌纤维细胞内侧移行，甚至少数肌纤维胞核体积变大，结构松散。。通过免疫组化染色， EAMG小鼠骨骼肌肌细胞表面可见TITIN蛋白表达，而正常C57BL/6小鼠骨骼肌肌细胞表达不明显。正常C57BL/6小鼠骨骼肌肌细胞RyR抗体低量表达，而在EAMG小鼠骨骼肌肌细胞表面可见RyR抗体高表达。
相对于现有技术，本发明创造所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种重症肌无力EAMG模型小鼠的制备方法，通过与Thy0517共培养获得具有高抗原提呈能力的树突状细胞，再将获得的高抗原提呈能力的树突状细胞输注给EAMG模型小鼠，从而有效缩短了EAMG小鼠的成模时间，有效缩短成模天数约为12天，成模周期从110±3天有效缩短为98±3天。缩短EAMG小鼠的成模时间以及提高成模率，有利于重症肌无力动物实验的开展，有利于减少重症肌无力动物实验耗时，有利于控制重症肌无力动物实验的成本。
2、本发明首先通过对EAMG鼠模型进行CT骨扫描，计算脊柱弯曲成角角度，进而与Lennon评分法建立关联联系，进一步量化了Lennon评分分级标准。
3、本发明通过18F-FDG PET/CT显像，实现了对于EAMG模型鼠骨骼肌病理进展的连续性观察，同时区分了EAMG模型鼠不同部位骨骼肌的受累程度不同。
4、本发明通过对EAMG小鼠骨骼肌的不同病理染色，明确了EAMG小鼠骨骼肌靶点，为EAMG更进一步对于明确其机制机理的研究提供依据。
附图说明
图1为实施例2中的正常C57BL/6小鼠与EAMG成模小鼠的对比图（A为对照组正常小鼠，B为EAMG成模小鼠）；
图2为实施例3中实验组小鼠与对照组小鼠的AChR浓度；
图3为实施例3中小鼠 AchR 浓度标准曲线（R2 >0.99）；
图4为实施例4中对照组小鼠的CT图像；
图5为实施例4中的EAMG小鼠1级CT图像；
图6为实施例4中的EAMG小鼠2级CT图像；
图7为实施例5中EAMG鼠造模成功前对照组小鼠和实验组小鼠腿部肌群的代谢显像（A：对照组小鼠腿部肌群的代谢显像， B：实验组EAMG小鼠腿部肌群的代谢显像）；
图8为实施例5中EAMG鼠造模成功前对照组小鼠和实验组小鼠髂腰肌群的代谢显像（A：对照组小鼠髂腰肌群的代谢显像，B：实验组EAMG小鼠髂腰肌群的代谢显像）；
图9为实施例5中EAMG鼠造模成功后对照组小鼠和实验组小鼠腿部肌群的代谢显像（A：对照组小鼠腿部肌群的代谢显像， B：实验组EAMG小鼠腿部肌群的代谢显像）；
图10为实施例5中EAMG鼠造模成功后对照组小鼠和实验组小鼠髂腰肌群的代谢显像（C：对照组小鼠髂腰肌群的代谢显像， D：实验组EAMG小鼠髂腰肌群的代谢显像）；
图11为实施例6中HE和Masson的对照组正常小鼠的肌肉染色图和实验组EAMG小鼠的肌肉染色图；
图12为实施例6中的Titin和RyR的对照组正常小鼠的肌肉染色图和实验组EAMG小鼠的肌肉染色图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明创造。
实施例1
高抗原提呈能力DC细胞的制备及其抗原提呈能力的验证
（1）制备高自噬水平胸腺瘤细胞：
a、物品准备：质粒载体pc3.1(+)、人急性单核细胞白血病细胞THP-1（国家实验细胞资源共享服务平台）、胎牛血清（美国Clark生物公司 Cat#FB25015）、青链霉素混合液（美国Sigma-Aldrich公司 Cat#10378016）、β-巯基还原剂（中国索莱宝生物技术有限公司Cat#M8211）、1640基础培养基（美国Gibco公司、Cat#12633012）、DMEM高糖基础培养基（美国Gibco Cat#11965092）；
b、在37℃恒温水浴锅中复苏从液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517 CGMCCNo.9328（简称Thy0517），并将细胞移入细胞培养瓶中的DMEM完全培养基培养，将培养瓶放入37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中培养，24h后观察细胞生长状况并弃去原有的细胞培养基，用1×PBS（pH＝7，后面出现的1×PBS均为pH＝7的溶液）清洗细胞3次，再加入新的DMEM完全培养基，继续培养即可；
c、从Thy0517中提取RNA并逆转录为cDNA，通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；
d、将步骤b获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染Thy0517，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
上游引物见SEQ ID NO.1，下游引物见SEQ ID NO.2；
（2）高效培养成熟树突状细胞
a、复苏在37℃恒温水浴锅中将从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，并将细胞移入盛有THP-1专用培养基的细胞瓶中培养，在37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中，当细胞达1×106个/ml细胞悬液时开始刺激分化；
b、将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1.5ml，加入3μl诱导树突状细胞成熟混合因子A(实施例1制备)，混匀，培养42h；
c、各孔用1×PBS清洗细胞3次，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1.5mL，和20μl诱导树突状细胞成熟混合因子B，混匀，恒温培养箱中继续培养24h，得到成熟树突状细胞；
诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/u1的12-0-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/ul的重组人白细胞介素-4、终浓度40±10ng/ul的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成。
成熟混合因子B由终浓度7±3ng/ul的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/ul的重组人白细胞介素-6,余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成。
（3）高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养：
将步骤(1)获得的高自噬水平胸腺瘤细胞接种于Transwell细胞培养板的上层培养室，将步骤(2)获得的成熟树突状细胞接种于Transwell细胞培养板的层培养室，共培养2天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。
（4）流式细胞学对高抗原提呈能力树突状细胞的验证：
a、物品准备：流式细胞仪（美国BD公司）预热，准备CD80-PE、CD86-FITC、CD83-APC三种流式抗体（德国美天旎公司），准备PBS、1ml与100μL移液器、配套移液枪头若干；
b、细胞准备：在已消毒的超净工作台内，用移液枪小心吸出之前培养于6孔板中的高抗原提呈能力树突状细胞的细胞培养液，并弃去。各孔用 1×PBS轻柔清洗细胞2次，然后加入1ml胰蛋白酶-EDTA消化液，将细胞放入细胞培养箱中消化。将消化后的细胞收集入15ml EP管中以3000rpm离心5min，弃去上清，加入1×PBS重悬。重复用1×PBS清洗一次并调整细胞浓度为1×107个/ml。
c、流式细胞术：设置3组进行流式检测，每组3管。第一组为空白对照组，先在每个流式管中加入100µl 1×PBS细胞悬液，待30min后，再用 PBS 清洗两次，300µl 1×PBS重悬细胞后可直接上机。第二组在每个流式管中加入100µl 1×PBS细胞悬液，再向各管中加入流式抗体CD80-PE 2µl、CD86-FITC 2µl、CD83-APC 5µl，轻轻混匀，常温避光孵育30min，再用PBS 清洗两次，300µl 1×PBS重悬细胞后上机检测。第三组在每个流式管中加入 100µl1×PBS 细胞悬液，再向各管中加入流式抗体CD11c-PE 2µl,其余操作同第二组。
d、结果：具有高抗原提呈能力的树突状细胞可高表CD80、CD83、CD86。 由表1可见，与THP-1细胞相比该高抗原提呈能力细胞CD80、CD83、CD86的表达量均有显著升高。CD80、CD83、CD86与抗原提呈能力密切相关，表达量越高说明细胞抗原提呈能力越强，因此可认为该树突状细胞抗原提呈能力增强。
表1：流式细胞术检测两种细胞表面特征性分子的表达量
Figure 417324DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
免疫强化重症肌无力（EAMG）小鼠模型的建立
a、C57BL/6小鼠准备：准备SPF 级6-8 周龄雌性实验小鼠(C57BL/6) 30 只（由北京阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2020-0004）；
b、实验动物饲养：实验过程对动物的处置按照《实验动物管理条例》相关规定，符合动物伦理学管理标准。小鼠饲养在 SPF 级动物房中，动物实验室严格按照无菌操作，进入实验室之前打开空气层流开关，穿戴口罩、帽子、隔离衣、手套，通风十分钟后进入。进入后打开无菌工作台紫外灯照射 30min 以上方可使用，使用前用酒精擦拭，通风晾干。
c、实验动物分组：将30只C57BL/6小鼠随机分为DC实验组，常规模型组和对照组，每组各10只，对DC实验组与常规模型组小鼠进行多点皮下注射AChR+CFA/IFA，对对照组小鼠进行多点皮下注射PBS+CFA/IFA（注射时间、剂量、部位及免疫次数一致），以下实验方案为配置 ，使用以下方案配置10只小鼠的免疫剂量。
d、配置免疫制剂（AChR+CFA/IFA和PBS+CFA/IFA）：①在无菌 EP 管中用 1.5mlPBS 稀释 300µg 纯化的 AChR，并吸入一个5ml 注射器，连接注射器到乳化针头连接器（软管）的一端，驱散空气；②用移液枪头（避免气泡）吹打混合 CFA/IFA，并将 1.5ml 的 CFA/IFA 吸入到第二个 5ml 注射器，排出空气并将注射器连接到连接器的另一端，确保所有连接都紧密；③先通过连接器快速将 AChR 溶液推入含有 CFA/IFA 的注射器中，然后将溶液从一个注射器向前再向后推入另一个注射器，持续 5 分钟或者直到乳液变稠并且当注射器保持垂直时乳剂中的小气泡不向上移动；④用铝箔包裹注射器和连接器，并在 4°C 环境下冷却 30 分钟（冷却可以使乳液更加稠密）备用；
e、麻醉小鼠：在双蒸水中稀释50mg/ml戊巴比妥钠至1:10。使用1ml塑料注射器，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，每只小鼠注射65mg/kg。
f、第一次免疫：①通过连接器混合乳液，然后取一个空注射器，连接1ml 塑料注射器，并慢慢将乳化的 AChR 转移至注射器，然后连接针头；②小动物麻醉机以浓度为2%的异氟烷，气流速度为 1.5L/min对实验小鼠进行麻醉；③用酒精浸泡的纱布清洁注射部位，将AChR+CFA注射于DC实验组小鼠与常规模型组小鼠背部六处，将PBS+CFA注射于对照组小鼠背部六处，每处20ul，两后肢垫，每处20ul，尾巴基部，40ul，每只小鼠总共注射200ul,共计20µgAChR；
g、在第一次免疫后，间隔30天和60天后，分别使用AChR+IFA和PBS+IFA对DC实验组小鼠、常规模型组和对照组小鼠与第一次免疫的相同方式进行第二次和第三次免疫；
h、第三次免疫后，每间隔一周对DC实验组小鼠经尾静脉输注高抗原提呈能力的树突状细胞，对对照组小鼠经尾静脉注射等量的PBS，连续输注3次；每次每只实验组小鼠输注细胞数量约为1*106，用无菌PBS混匀得到约200μL的细胞悬液，对照组小鼠每次每只输注200ul的无菌PBS。
i、在第98时天结束观察，进行下一步实验。EAMG小鼠与对照组相比可见明显肌无力症状，如图1所示。
j、其中，常规成模组的EAMG小鼠成模周期平均天数为110±3天，DC实验组EAMG小鼠的成模周期为98±3天，可见经尾静脉注射DC细胞后，EAMG小鼠的成模时间明显缩短。
实施例3
小鼠Lennon评分及现有体系验证
一、EAMG小鼠Lennon评分
a、小鼠临床症状评分以Lennon评分法为标准，具体内容为：
观察小鼠活动情况，若活动具有活力，肌肉有力，则进行试验。将小鼠放在笼子的顶部网格上，使小鼠尾巴底部悬浮，反复拖拽20次，以此来刺激小鼠运动，然后允许他们自由爬行，通过观察小鼠是否有震颤、驼背姿势、肌肉力量和疲劳迹象，从而评估它们的肌肉无力：
0 级，正常的肌肉力量，即使运动后也没有肌肉无力；
1 级，测试前无临床体征，但运动后因疲劳出现虚弱，活动能力下降；
2 级，测试前即出现临床体征，弯腰弓背，握力薄弱，下巴在地板上，无法抬起头；
3 级，握力丧失，脱水，瘫痪（四肢瘫痪）或行动不便，接近于濒死状态；
4 级，死亡。
b、注意事项：该临床评分每周进行一次，当出现评分为1级的小鼠后，测试应每隔一天进行一次；当出现评分为2级的小鼠时，不宜再进行运动刺激，同时但应保持观察，积极记录症状变化；当出现评分为3级的小鼠时，应在24h内及早处理，积极留取标本，避免小鼠死亡，造成实验的损失；如果出现评分为4级的小鼠，应及时记录死亡时间，称重。
c、拖拽小鼠时，最终目的是为了将小鼠肌肉力量耗竭，所以，在运动刺激过程中，应避免暴力、拖拽过快，而应根据小鼠力量，施加恒定持续的力量与小鼠向前的力量进行对抗。
d、此次实验共30只C57BL/6鼠，对照组10只，DC实验组10只，常规模型组10只，其中DC实验组造模成功8只，常规模型组造模成功5只，其中评分1级5只，评分2级6只，评分3级2只。Lennon评分如下表：
表2：Lennon评分分级
Figure 911628DEST_PATH_IMAGE002
二、血清 AchR 浓度检测；
a、小鼠眼球取血：采用眼球取血法获得小鼠血液，获得小鼠采血量为0.6-1ml。器材准备：1.5mlEP离心管，弯头镊子，离心机，移液器，铝箔纸；左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出；用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用 1.5ml EP 管接住流出的血液。采血时应注意避免溶血，应该防止血液与小鼠的胡须接触，同时应使血液沿着管壁缓慢留下，避免血液从高空落下而摔碎红细胞造成溶血。
b、室温下静置30min后，或4℃冰箱静置保存4h后，使用离心机1500rpm离心15分钟，取上清，-20℃冰箱保存备用（避免反复冻融）；
c、从铝箔袋中取出所需板条室温静置 20min，剩余板条用自封袋密封放回 4℃（应密封保存，4℃保存应小于 1 周，-20℃保存不应超过一个月，-80℃保存不应超过 2 个月）。
d、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μl；
e、待测样本孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl；加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂；
f、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μl，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育 60min。；
g、小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（350μl），静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次。
h、每孔加入显色剂 A、B 各 50μl，轻微震荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。所述显色剂A为过氧化氢，B为含TMB的显色底物（TMB为四甲基联苯胺），使用的显色剂A和B为上海酶联的ml038000。
i、每孔加入终止液 50μl 终止反应（此时蓝色立即转为黄色），15min内，在 450nm波长处测定各孔的吸光度（OD 值）。
j、实验结果计算：以所测标准品的 OD 值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的 OD 值代入方程，计算出样品的浓度，如图3。
k、对实验小鼠和对照小鼠血清 AchR 浓度结果进行统计学分析，可见与对照组相比，实验组小鼠血清 AchR 浓度明显升高（图2）。所得结果如下表，P＜0.05：
表3：实验组与对照组血清AChR浓度
Figure 488103DEST_PATH_IMAGE003
三、肌电图
a、物品准备：5mg/ml戊巴比妥钠、肌电图与诱发电位仪（上海诺诚）、1ml、2ml不同规格的注射器若干；
b、小鼠准备：分别选取相同数量的实验组与对照组小鼠，进行肌电图检测；
c、小鼠麻醉：每只小鼠以65mg/kg的剂量，通过腹腔注射5mg/ml的戊巴比妥钠。腹腔注射时，抓持小鼠形成头低脚高位，注射器针头进入腹腔后，进针速度应缓慢，避免刺伤小鼠内脏；注射戊巴比妥钠之前，应回抽注射器，注意观察是否有回流，若有血液回流，说明针尖进入了血管；若有肠内容物回流，说明证件进入了肠管；此时稍微回退针尖，一般即可使针尖退回腹腔。
b、固定小鼠，将带有凝胶的电极放在鼠的胸部，将刺激（正极）电极插入坐骨切迹以刺激坐骨神经，将记录电极插入同一腿腓肠肌，将参比电极插入腓肠肌肌腱。刺激电极传递电刺激；记录电极和参考电极记录腓肠肌的复合肌肉动作电位。
c、分别用一组 10 个 3-Hz、5-Hz、10-Hz 的超长刺激刺激坐骨神经，同时记录诱发的复合肌肉动作反应。
d、通过比较第一诱发电位和第五诱发电位来评估对重复刺激的反应。如果第五个诱发动作电位与第一个诱发动作电位相比，振幅下降≥10%，则对超最大刺激有显著的正下降反应，提示肌电图阳性。
表4：两组小鼠肌电图不同频率衰减（P＜0.05）
Figure 961941DEST_PATH_IMAGE004
实施例4
确定EAMG小鼠Lennon评分与骨CT扫描脊柱弯曲成角角度的关联关系
一、CT骨显像检测小鼠脊柱弯曲成角
a、物品准备：小动物PET/CT机（NOVEL MEDICAL，北京永新设备有限公司）、小动物麻醉机（美国 Harvard Apparatus）、异氟烷；
b、设备预热：开启小动物PET/CT机，预热半小时，打开电脑配套软件，进行数据初始化；
c、麻醉小鼠：在小动物麻醉机气体挥发罐中加入适量异氟烷麻醉剂，调整挥发罐浓度，使其浓度为1.2%，调节氧流量为1.5L/min，打开麻醉诱导舱管路通道，将小鼠放入诱导舱内，关闭诱导舱，对小鼠进行诱导麻醉。当小鼠无活动、四肢瘫软、鼠尾伸直平放、呼吸平稳后表示诱导麻醉完成；
d、CT扫描准备：将小鼠转移至小动物PET/CT机检查床上，俯卧位，同时保持脊柱的中立位，四肢摊开，防止对脊柱的显影造成干扰。全程使用小动物麻醉机维持麻醉，调整此时麻醉机参数，挥发罐浓度调整至1.8%，调节氧流量为1.5L/min。该过程中应密切注意麻醉剂的浓度和氧流量的调节，尤其应根据小鼠的评分对麻醉剂量进行调整，重症肌无力EAMG小鼠呼吸机肌有可能受累、肌肉力量不足，对于麻醉机的耐受程度要低于正常普通小鼠，若麻醉剂浓度过高或气体流量过大，则可能造成检查过程中小鼠的死亡；但是另一方面，若麻醉剂浓度过低或气体流量不足，则可能造成检查过程中小鼠的苏醒，导致CT扫描成像失败。同时，最优的麻醉气体浓度可使小鼠呼吸平稳，提高CT扫描的成像质量；
e、设置扫描参数，CT 扫描采用电压：80 kV；电流：0.5mA；重建算法：CTFDK；进行扫描；
f、CT扫描后处理：扫描完成后，及时将小鼠取出，及时将小鼠放回装有垫料的笼内，待其自然复苏；该过程应注意保暖；
g、图像获取：CT扫描完成后，使用NMSoft-AIWS V1.6软件将数据重建获得图像，再通过CT VR程序获得3D影像，获得小鼠的整体脊柱图像；
h、脊柱弯曲成角确定：选取脊柱正位矢状面切面图像，依次连接小鼠第5-10胸椎的中点，根据中点连线做一条直线；再依次连接第1-4腰椎的中点，以小鼠腰椎中点做一条直线；延长两条直线，两直线相较于小鼠脊柱上方一点，此相交处的夹角即为所需脊柱弯曲角度；
i、脊柱弯曲成角角度测量：通过软件Image J角度测量工具，测量夹角处角度，此角度即为脊柱弯曲角度，如图4、图5、图6所示。
二、建立骨CT显像与Lennon评分分级的关系：
a、通过小鼠标记，明确每只EAMG小鼠脊柱弯曲成角角度；
b、对实验小鼠脊柱弯曲角度结果进行统计学分析，并根据小鼠重症肌无力Lennon评分，分别得到各个等级脊柱弯曲成角角度的平均数、方差等统计学数据，并推算置信区间。根据脊柱弯曲成角角度及EAMG小鼠Lennon评分之间的关系，明确及量化EAMG小鼠模型的骨骼肌损伤分级；
c、通过分析，得到的分级如下：
0 级，正常的肌肉力量，即使运动后也没有肌肉无力，CT示脊柱弯曲成角角度为：122°-138°；
1级，休息时正常，但运动后虚弱，下巴在地板上，无法抬起头，弯腰弓背，活动能力下降，CT示脊柱弯曲成角角度为：101°-114°；
2级，休息无力，出现 1 级症状，CT示脊柱弯曲成角角度为：93°-99°；
3级，严重无力，脱水，瘫痪（四肢瘫痪），体重减轻；
4 级，发现死在笼子里。
d、注释：其中临床评分3、4级EAMG小鼠症状明显，难以耐受麻醉，因此不进行CT脊柱弯曲成角角度检查；所得表格如下：
表5：EAMG小鼠Lennon评分与脊柱弯曲成角角度关系
Figure 215461DEST_PATH_IMAGE005
实施例5
EAMG鼠骨骼肌18F-FDG PET/CT 功能代谢显像连续观察
a、扫描时间：在最后一次注射高抗原提呈能力树突状细胞后1周，即实验开始后第12周，和造模完成后，即第98天后，分别2次对EAMG鼠DC实验组和对照组进行骨骼肌18F-FDGPET/CT 功能代谢显像；
b、物品准备：小动物PET/CT机（NOVEL MEDICAL，北京永新设备有限公司）、小动物麻醉机（Harvard Apparatus 美国）、异氟烷、18F-FDG （天津原子高科股份有限公司）、1ml注射器若干、胰岛素注射器若干；
c、小鼠准备：实验前一天先行挑出将要进行检查的小鼠，检查前12h禁食禁水，并将小鼠饲养于安静温暖的环境中；第二天进行PET/CT扫描前对小鼠进行称重。
d、喂糖：在注射18F-FDG前50min，经口喂食 10%葡萄糖溶液 100μL，以此刺激骨骼肌糖原摄取，使全身骨骼肌达到相同的糖原摄取能力，为接下来骨骼肌对18F-FDG的摄取能力进行调节。
e、麻醉：在注射18F-FDG前30min将小鼠放置于小动物麻醉机麻醉诱导盒中进行持续麻醉，从而减少小鼠活动。在小动物麻醉机气体挥发罐中加入适量异氟烷麻醉剂，调整挥发罐浓度，使其浓度为1.2%，调节氧流量为1.5L/min，打开麻醉诱导舱管路通道，将小鼠放入诱导舱内，关闭诱导舱，对小鼠进行诱导麻醉。当小鼠无活动、四肢瘫软、鼠尾伸直平放、呼吸平稳后表示诱导麻醉完成，该过程应格外注意保温，因为低温可能造成骨骼肌战栗，对PET扫描的最终结果产生干扰。
f、e、18F-FDG检查药剂的配置：取得18F-FDG原液后，测量18F-FDG放射活性，根据半衰期的特点，将18F-FDG分别使用18F-FDG淋洗液稀释后分装，保证最终注射18F-FDG体积为100μL，放射活性为150μCi。由于18F-FDG具有放射衰减的特点，经尾静脉注射的18F-FDG最好在使用前再进行配置，配置好的18F-FDG也应尽快经尾静脉输注入小鼠体内。由于该步骤使用药品具有放射性，操作全程都应穿戴好防辐射服，在放射性药物专用的通风橱内操作；同时应对身体接受的放射剂量进行测定，保证自身安全。
g、f、18F-FDG尾静脉注射：在预定的时间，即喂食葡萄糖溶液 1h 后，经小鼠尾静脉注射配置好的18F-FDG。拉直小鼠尾巴，小鼠的尾静脉共有3根，分别位于小鼠尾巴的两侧和顶侧，其中顶部的尾静脉走行较深，而两侧的尾静脉走行较浅，因此，进行尾静脉穿刺注射时，通常选取两侧的尾静脉。注射器针尖斜面朝上，针尖与尾静脉的夹角尽量小，以几近于平行的角度进针，轻轻回抽注射器，若有血液回抽进入注射器，则表明注射器针尖已经进入血管，固定住注射器，稳定缓慢向小鼠尾静脉内推注药物，此时注意不要移动针尖，避免针尖脱出，导致漏液，影响PET的扫描；此外，过快推注药物也有可能导致漏液，因此应该控制18F-FDG的推注速度。若回抽注射器不见回血，则说明注射器针头并没有进入血管，此时应退出针头，向鼠尾基底部方向移动，重新寻找穿刺部位。若回抽不见回血，坚决不应推注药物，以免药物被强行注入进入皮下组织，对PET的扫描造成影响。
h、准备上机：成功经尾静脉注入18F-FDG后，将小鼠重新放回麻醉诱导盒内维持麻醉，同时注意保暖，避免棕色脂肪代谢对PET扫描造成干扰。
i、PET扫描准备：经尾静脉注射 18F-FDG 40min后，将小鼠从诱导盒中转移至小动物PET/CT机检查床上，调整麻醉机气路通道，调节麻醉剂挥发罐浓度1.8%，氧流量调整为1.5 L/min，维持小鼠的麻醉状态。
j、PET/CT扫描软件准备：关闭检查床舱门，设置扫描条件，选择扫描模式：PET/CT扫描，实验动物种类：小鼠（mice）；
k、CT Scout Scan 定位相扫描条件：像素组合2×2，单帧采集时长2000ms，电压80kV，电流0.5mA，床位数2；
l、CT扫描条件：像素组2×2，总帧数360，电压80kV，电流0.5mA，步进角度1°，床位数1，层0.18mm，采集时间约为5min，矩阵512×512。
m、PET/CT扫描条件：床位数1，总计数500Kcts，相位数8，重建协议PET-OSEM，算法类型 ListMode，矩阵140×140，层厚0.8mm，迭代次数40。
n、扫描完成：PET/CT扫描完成后，自动将数据重建获得3D影像。将最终重建后的图像数据上传工作站，获取全身骨骼肌PET/CT代谢功能显像图片资料；
o、扫描后处理：一次完整的PET/CT扫描全过程耗时约60min，因此扫描完成后，应及时将小鼠取出，观察小鼠生命状态，观察呼吸是否稳定，若小鼠生命状态低下，则呼吸减缓，甚至出现深慢呼吸，此时及时恢复通气、或者给予一定氧气复苏，则生命状态能得到好转；若出现呼吸频率过低、瞳孔发白，四肢发凉，则表示此时小鼠为濒死状态，需及时处理，留取需要标本；若小鼠状态良好，呼吸平稳、四肢温热、身体柔软，则及时将小鼠放回装有垫料的笼内，待其自然复苏。该过程应注意保暖。此外：剩余的18F-FDG不能随意废弃，统一收集后应交由专门的放射性废料处理部门进行无害化处理。
p、数据处理及分析：获取扫描图像，使用同机NMSoft-AIWS V1.6软件进行图像分析，勾画腓肠肌、髂腰肌、心脏感兴趣区（ROI），如图7、图8、图9、图10所示，可见EAMG小鼠模型建立成功前， DC实验组的骨骼肌代谢能力与对照组正常小鼠无明显差异；而当模型建立成功后，可见EAMG小鼠相较于正常小鼠骨骼肌代能力降低，并测定评价标准化摄取值（MeanStandardized Uptake Value，SUVmean），见下表。结果判读由2位有经验的核医学科医师双盲法阅片。统计标准化摄取值，可见实验组SUV值低于对照组。
q、与CT扫描脊柱弯曲角度相比，可发现当脊柱弯曲角度变小时，PET/CT肌肉代谢SUV值也降低。
表6、两组小鼠髂腰肌、腿肌群18F-FDG 代谢 SUVmean 值（P＜0.05）
Figure 834661DEST_PATH_IMAGE006
实施例6
结合免疫抗原表位病理染色对 EAMG 小鼠骨骼肌损伤进行评价
（1）制备骨骼肌病理切片的准备；
a、取材：留取处死后EAMG小鼠的髂腰肌和大腿肌群标本，髂腰肌肌群为小鼠背部自胸椎以下，至骶骨处的肌群，取材时先将背部皮肤剪开，钝性分离完整暴露双侧髂腰肌群，小心将上下两端离断，剪断与脊柱的附着，从而获得髂腰肌肌群标本；小鼠的大腿肌群为包绕于小鼠股骨周围的肌群，取材时先剪去小鼠腿部皮肤，在骨盆深处找到髋关节，小心剪断，沿着股骨将大腿肌群与股骨小心分离，直至膝关节以下5mm左右，从而获得小鼠大腿肌群；
b、固定：将获得的EAMG小鼠双侧髂腰肌肌群与大腿肌群，用生理盐水漂洗后，立即用4%多聚甲醛固定，固定24小时后，取出组织放入包埋盒，根据EAMG小鼠的标号以及Lennon分级做好标记；为了能较好地在切片中展示肌肉的横切面以及纵切面，应当注意组织的摆放；
梯度乙醇脱水：70%酒精（30min）→80%酒精（30min）→90%酒精（30min）→90%酒精（30min）→100%酒精（30min）→100%酒精（30min）；
c、透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h，如果组织不够透亮，则应该在二甲苯中泡至切片透明；
d、透蜡：放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟；
e、石蜡包埋：在52~56℃的环境下将石蜡融化，将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块；
f、切片：将已固定和修好的石蜡块固定在在切片机的夹物台上，调整刀片角度，将刀片与蜡块贴紧，选取合适的位置，对蜡块进行连续切片，切片厚度为5um；
g、贴片：取干净清洁的载玻片，在中央滴一滴粘片剂，将切好的蜡带用镊子放在水面上，再贴于载玻片上，注意摆放位置，随后40-45℃的环境下将蜡片展平，贴上标签做好记号，置于37℃烤箱中烘干。
（2）HE染色：
a、烤片：将髂腰肌病理切片置于60℃恒温箱中烘烤2小时；
b、水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→90%酒精（3min）→80%酒精（3min）→70%酒精（3min）→60%酒精（3min）→蒸馏水（3min）；
c、染色：苏木素染色（10min）→蒸馏水冲洗（1min）→1%盐酸乙醇分化（10s）→蒸馏水冲洗（1min）→0.2%的氨水（30s）→水洗（1min）→伊红染色（5min）→水洗（1min）；
d、脱水：60%酒精（3min）→70%酒精（3min）→80%酒精（3min）→90%酒精（3min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→二甲苯Ⅱ（10min）→二甲苯Ⅰ（10min）；
e、封片观察。
（3）Masson染色：
a、烤片：将髂腰肌病理切片置于60℃恒温箱中烘烤2小时；
b、水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→90%酒精（3min）→80%酒精（3min）→70%酒精（3min）→60%酒精（3min）→蒸馏水（3min）；
c、染色：Weigert氏铁苏木素染色（5min）→蒸馏水冲洗（1min）→1%盐酸乙醇分化（15s）→蒸馏水冲洗（1min）→丽春红酸性品红染色（3min）→弱酸性工作液处理（1min）→磷钼酸水溶液染色（2min）→弱酸性工作液处理（1min）→苯胺蓝复染（1min30s）→弱酸性工作液处理（1min）；
d、脱水：95%酒精（3s-5s）→100%酒精Ⅲ（15s）→100%酒精Ⅱ（15s）→100%酒精Ⅰ（15s）→二甲苯Ⅱ（10min）→二甲苯Ⅰ（10min）
d、封片观察。
（4）免疫组化
a、烤片：将骨骼肌病理切片置于60℃恒温箱中烘烤30min；
b、水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→90%酒精（3min）→80%酒精（3min）→70%酒精（3min）→60%酒精（3min）→PBS缓冲液Ⅰ（3min）→PBS缓冲液Ⅱ（3min）→PBS缓冲液Ⅲ（3min）；
c、抗原修复：配置Tris-EDTA抗原修复液，将切片置于抗原修复液中，抗原修复液要完全没过组织，置于高压锅内抗原修复3min，随后取出切片冷却至室温；
d、去除过氧化物酶：使用免疫组画笔，圈出冷却至室温的切片上的组织，滴加适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS缓冲液漂洗3次，每次3分钟；
e、加入一抗：滴加100μL封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10min，随后甩干，注意该步骤不用PBS清洗，甩干后立马滴加一抗，即TITIN抗体与RYR抗体，室温孵育2h或4℃冰箱过夜，PBS缓冲液3次，每次3min；
f、加入二抗：滴加适量生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物室温孵育10min，PBS缓冲液3次，每次3min；
g、染色：滴加100μL新鲜配制的DAB显色液（8min）→流水冲洗（10min）→苏木素染色（1min）→蒸馏水洗（1min）→1%盐酸乙醇分化（15s）→蒸馏水冲洗（1min）→0.2%氨水反蓝（30s）→水洗（1min）；
d、脱水：95%酒精（3s-5s）→100%酒精Ⅲ（15s）→100%酒精Ⅱ（15s）→100%酒精Ⅰ（15s）→二甲苯Ⅱ（10min）→二甲苯Ⅰ（10min）
e、封片观察。
以上染色，每批次染色均维持环境、操作人员、时间、所用试剂及试剂浓度相同。
（5）结果分析
如图11、图12所示，在HE染色以及masson染色中可见，对照组正常C57BL/6小鼠骨骼肌排列紧密有序，细胞核排列于肌纤维外侧，而EAMG小鼠骨骼肌肌纤维组织变得疏松散乱，细胞核数量减少，少数细胞核向肌纤维细胞内侧移行，甚至少数肌纤维胞核体积变大，结构松散。
在免疫组化染色中，EAMG小鼠骨骼肌肌细胞表面可见Titin蛋白表达，而正常C57BL/6小鼠骨骼肌肌细胞表达不明显。
在免疫组化染色中， 正常C57BL/6小鼠骨骼肌肌细胞RYR抗体低量表达，而在EAMG小鼠骨骼肌肌细胞表面可见RYR抗体高表达。
联系PET/CT肌肉代谢显像与病理染色，可见在EAMG模型鼠中，PET/CT肌肉代谢SUV值减低的同时，病理染色出现细胞排列疏松，胞质空泡，胞核向细胞内移行。同时，当HE染色中出现细胞排列疏松，胞质空泡，细胞核向细胞内移行时，肌细胞表面Titin蛋白出现表达，RYR抗体表达增高。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 天津医科大学总医院空港医院
<120> 一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggatcccg atggcggagg agccgcagtc 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggaattccg tcatccccac gcctgagact tg 32

Claims (10)

1.一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：准备若干个小鼠，并饲养一段时间；
S2：给小鼠配置用于诱导小鼠成模的免疫制剂；
S3：麻醉小鼠，给小鼠注射免疫制剂；
免疫制剂包括第一免疫制剂、第二免疫制剂，给小鼠注射第一免疫制剂，间隔一段时间后注射第二免疫制剂，间隔一段时间后再次注射第二免疫制剂；
所述第一免疫制剂包括抗乙酰胆碱受体和弗氏完全佐剂，所述第二免疫制剂包括抗乙酰胆碱受体和弗氏不完全佐剂；
S4：成熟树突状细胞和胸腺瘤细胞系体外共同培养高抗原提呈能力的树突状细胞；
S5：每间隔一段时间，小鼠注射S4中得到的高抗原提呈能力的树突状细胞，连续注射若干次；
S6：第一次注射免疫制剂一段时间后，对所有小鼠进行最后Lennon评级，阳性者结束此次实验；
高抗原提呈能力的树突状细胞的制备包括：从胸腺瘤细胞系细胞中提取RNA，并将其逆转录为cDNA；通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；将获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染胸腺瘤细胞系细胞，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
所述步骤S4中的胸腺瘤细胞系是胸腺瘤细胞系Thy0517。
2.根据权利要求1所述的一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中选取周龄6-8周的SPF级C57BL/6小鼠；
所述步骤S5中每次每只小鼠输注细胞数量为0.5×106~1×106；
所述步骤S6中的一段时间为98天。
3.根据权利要求1所述的一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S4中高抗原提呈能力的树突状细胞的培养，包括如下步骤：
A1：取出在液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517，配置成细胞悬液，观察细胞活性；
A2：从胸腺瘤细胞系细胞中提取RNA，并将其逆转录为cDNA；通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；将获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染胸腺瘤细胞系细胞，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
A3：取出在液氮中保存的复苏人急性单核细胞白血病细胞，配置成细胞悬液，观察细胞活性；
A4：复苏人急性单核细胞白血病细胞在诱导树突状细胞成熟混合因子A和诱导树突状细胞成熟混合因子B的作用下，得到成熟树突状细胞；
A5：将步骤A2中得到的高自噬水平胸腺瘤细胞和A4中得到的成熟树突状细胞共同培养若干天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞；
诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/u1的12-0-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/ul的重组人白细胞介素-4、终浓度40±10ng/ul的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成；
诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7±3ng/ul的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/ul的重组人白细胞介素-6,余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成。
4.一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，根据权利要求1-3任一项所述的一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括以下方法中的一种或几种方法：
（1）使用CT扫描确定EAMG鼠脊柱弯曲角度；
（2）使用18F-FDG PET/CT扫描检测肌肉代谢功能情况；
（3）使用多重组织病理染色明确EAMG鼠肌肉分子靶点；
（4）对动物模型进行Lennon评分检测；
（5）对动物模型进行肌电图检测；
（6）对动物模型进行血清AChR抗体检查。
5.根据权利要求4所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，其特征在于：使用CT扫描确定EAMG鼠脊柱弯曲角度，包括如下步骤：
B1:将小鼠麻醉，然后转移至小动物PET/CT机检查床上；
B2：CT扫描软件准备，进行CT扫描，获得3D影像；
B3：确定脊柱弯曲成角，并测量脊柱弯曲成角角度；
B4：对实验小鼠脊柱弯曲角度结果进行统计学分析，结合Lennon评分法明确及量化EAMG小鼠骨骼肌模型的分级。
6.根据权利要求5所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，其特征在于：所述步骤B3中选取小鼠脊柱正位矢状面切面图像，依次连接小鼠第5-10胸椎的中点，根据中点连线做一条直线；再依次连接第1-4腰椎的中点，以小鼠腰椎中点做一条直线；延长两条直线，两直线相交于小鼠脊柱上方一点，此相交处的夹角即为所需脊柱弯曲角度；
通过CT骨扫描检测球形征小鼠的脊柱弯曲成角角度，随着Lennon评分法等级的加重，脊柱弯曲的角度随之减小，且随等级递进，成为Lennon评分法的量化指标。
7.根据权利要求4所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，其特征在于：使用18F-FDG PET/CT扫描检测肌肉代谢功能情况，包括如下步骤：
C1：小鼠准备，小鼠检查前一天，禁食禁水；
C2:对小鼠进行喂糖，间隔一段时间后对小鼠麻醉；
C3：对有放射性的标记物质进行稀释，给小鼠经尾静脉注射有放射性的标记物质；
C4：放射性标记物质注射后，间隔一段时间后将小鼠转移至小动物PET/CT机检查床上，进行PET/CT扫描；
C5：扫描后对数据进行分析。
8.根据权利要求7所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，其特征在于：所述步骤C3中有辐射的标记物质为18F-FDG，放射性标志物浓度为：0.5-1.2μCi/μl，放射性标志物剂量 为75-250μCi；
所述步骤C4中打药后30-60min上机检测；
所述步骤C5中的数据分析为18F-FDG PET/CT功能显像检测相应的模型骨骼肌肌肉代谢SUVmean值比正常小鼠的SUVmean值低。
9.根据权利要求4所述的一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，其特征在于：多重组织病理染色明确EAMG鼠肌肉分子靶点，包括如下步骤：
D1：取小鼠的髂腰肌和大腿肌群标本；
D2：将D1中的标本用盐水漂洗，然后固定；
D3：对小鼠的标本进行梯度乙醇脱水、浸泡透明、透蜡、石蜡包埋、切片、贴片；
D4：对小鼠标本进行烤片、水化、染色、脱水；
D5：然后封片观察，得出结论；
所述步骤D4中的染色方法包括HE染色、Masson染色与免疫组化染色；
所述步骤D5中在HE染色与Masson染色中可观察到，EAMG鼠骨骼肌肌纤维组织变得疏松散乱，纤维细胞出现空泡，细胞核数量减少，少数细胞核向肌纤维细胞内侧移行，少数肌纤维胞核体积变大，结构松散；在免疫组化染色中，可观察到EAMG鼠肌纤维细胞中Titin表达量增高，RYR表达量显著增高。
10.一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法的应用，根据权利要求4中所述的一种重症肌无力EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：通过注射高抗原提呈能力树突状细胞，强化EAMG小鼠免疫，从而提高EAMG鼠模型成模率、缩短成模时间，及通过骨CT扫描检测球形征小鼠的脊柱弯曲成角角度，CT对小鼠髂腰肌肌群和大腿肌群功能代谢显像，结合两个部位的骨骼肌病理抗原表位HE和免疫组化染色，对其骨骼肌进行解剖机构、功能影像和组织病理多模态评价，应用于通过建立实验性重症肌无力动物模型，实现对模型的量化观察、无创的连续性动态观察，探讨重症肌无力的发病机理及骨骼肌相关靶点。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008039472A (ja) * 2006-08-02 2008-02-21 Kanazawa Univ 胸腺腫合併重症筋無力症の診断方法
CN101897965A (zh) * 2010-06-29 2010-12-01 中国人民解放军第三军医大学 乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗
CN102234659A (zh) * 2010-04-27 2011-11-09 天津医科大学附属肿瘤医院 沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白b1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法
CN103068399A (zh) * 2010-06-30 2013-04-24 卡姆普根有限公司 用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的c1orf32
CN108524775A (zh) * 2018-07-13 2018-09-14 乞国艳 中药在制备治疗重症肌无力合并胸腺瘤的药物制剂中的应用
CN111944755A (zh) * 2020-09-01 2020-11-17 天津医科大学总医院 一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008039472A (ja) * 2006-08-02 2008-02-21 Kanazawa Univ 胸腺腫合併重症筋無力症の診断方法
CN102234659A (zh) * 2010-04-27 2011-11-09 天津医科大学附属肿瘤医院 沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白b1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法
CN101897965A (zh) * 2010-06-29 2010-12-01 中国人民解放军第三军医大学 乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗
CN103068399A (zh) * 2010-06-30 2013-04-24 卡姆普根有限公司 用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的c1orf32
CN108524775A (zh) * 2018-07-13 2018-09-14 乞国艳 中药在制备治疗重症肌无力合并胸腺瘤的药物制剂中的应用
CN111944755A (zh) * 2020-09-01 2020-11-17 天津医科大学总医院 一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Imbalance of Th17 and Tregs in thymoma may be a pathological;Peng Zhang;《Authorea》;20200525;第1-16页 *
探究Atg12介导的树突状细胞自噬在胸腺瘤合并重症肌无力中的免疫调控作用;杨照宇;《万方》;20210126;第1-118页 *

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